CN115786437A - 一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，包括以下步骤：(1)取碱性蛋白酶对天然蛋白进行酶解，酶解结束后，离心分离沉淀，取上清液备用；(2)将步骤(1)所得上清液置于超声波仪中超声震荡，再在超声震荡中加入锌/钙溶液，保温处理，得到混合溶液；(3)往步骤(2)所得混合溶液中加入乙醇，获得沉淀，干燥，即得到目标产物。与现有技术相比，本发明制备的肽锌/钙螯合物分子量控制在1000以下，金属锌/钙被包裹在肽分子内部，不受胃肠道中的植酸等影响，水解肽对人体无毒无害，不会产生氨基酸失衡，体外实验表明，有较高的锌/钙吸收率。

Description

一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法。

背景技术

多肽锌/钙络合物有望成为新一代补锌剂，由于采用天然蛋白水解物作为肽源，这使得多肽锌/钙络合物作为补锌剂时对人体无毒无害，并且不受胃肠道中植酸等的影响，提高了锌的吸收率，这使其有成为新一代补锌剂的潜力。

钙、锌是人体必需的矿物质营养素。钙在人体的骨骼生长，血液凝固，细胞人代谢，神经传导和肌肉收缩中起着非常重要的作用，钙摄入或吸收不足会导致如骨质酥松症、高血压，结肠癌、肥胖症和肾结石等许多疾病，婴儿钙摄入不足容易引起生长发育迟缓、反复呼吸道感染、佝偻病等；妊娠期妇女钙元素缺乏容易引起妊娠高血压综合征以及影响胎儿生长发育等；老年人缺钙则容易引起骨质疏松症。缺锌将导致众多的慢性疾病，包括生长迟缓，免疫缺陷等。目前我国市场上钙制剂分为无机钙、有机酸钙、氨基酸钙几种类型，补锌剂主要为无机锌盐和简单有机锌，它们共同特点是吸收率不高，尤其受膳食中植物性食物中含有的植酸、草酸的严重影响，导致吸收效率低下，甚至产生结石隐患。肽锌/钙络合物类具有吸收效果好的特点，日益受到人们的重视。

通过查问相关文献，我们发现有许多报道采用大豆蛋白酶催化水解制备蛋白肽钙、肽锌螯合物。文献1(王俊强(江南大学食品学院),孔祥珍,华欲飞.大豆肽钙螯合物的制备、稳定性及表征[J].中国油脂,2019,44(10):46-50)和2(东北农业大学.一种具有增强骨密度低分子量大豆肽-钙螯合物的制备方法:CN201410320336.6[P].2014-11-26)采用通过醇洗、酸沉、水解工艺制备大豆肽，并与钙离子进行螯合反应，肽的相对分子量主要集中在小于lkDa；文献3(财团法人食品工业发展研究所.大豆胜肽-钙螯合物的制备方法:CN201110387656.X[P].2013-04-17)采用不同的酶水解分解大豆；文献4(广州金酮医疗科技有限公司.一种蛋白肽及其钙螯合物与制备方法:CN201610641164.1/P1.2016-12-21)采用碱性蛋白酶与风味蛋白酶组成的复合酶,大豆蛋白粉配制成质量分数为4％的溶液并采用超声等不同条件的预处理；文献5(漯河永瑞生物科技有限公司.一种花生肽-钙、锌螯合物的制备方法:CN202210146884.6[P].2022-05-13)和6(江南大学.稳定型钙离子螯合肽的制备方法与应用:CN202010931192.3[P]2020-12-18.)采用其他植物蛋白源花生蛋白、黑豆蛋白为原料酶催化水解，水解液制备时提到超声处理；文献7(郑英敏(广州大学化学化工学院),袁杨,苏东晓,等.大豆多肽-锌螯合物的制备工艺优化及其结构表征[J].食品工业科技,2020.41(14):160-165.)和8(叶美俊.多肽-锌配合物的制备及其生物活性探究[D].2021.学位授予单位:广州大学)以及9(安徽珠峰生物科技有限公司.一种大豆源锌螯合肽、肽锌螯合物的制备方法及其用途:CN201710321375.1[P].2017-09-15.)大豆源蛋白酶水解，酶解成分子量小的活性肽、锌盐反应生成肽锌螯合物，采用了如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶及其复合酶酶解。上述报道显示制备研究主要集中大豆催化水解中酶的选择及优化条件，少数文献提到采用水解液的超声处理，对于在超声波辅助下的蛋白肽与金属锌或者钙络合反应研究未见报道。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种基于超声微波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法。多肽锌/钙螯合物指的是多肽锌螯合物或多肽钙螯合物。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种基于超声微波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，包括以下步骤：

(1)取碱性蛋白酶对天然蛋白进行酶解，酶解结束后，离心分离沉淀，取上清液备用；

(2)将步骤(1)所得上清液置于超声波清洗仪中，先超声震荡，再在超声震荡中加入锌/钙溶液，保温处理，得到混合溶液；

(3)往步骤(2)所得混合溶液中加入乙醇，获得沉淀，干燥，即得到目标产物。

进一步的，步骤(1)中，所述碱性蛋白酶为酶活力20万u/g的碱性蛋白酶。

进一步的，步骤(1)中，所述天然蛋白为大豆蛋白、酪蛋白或玉米蛋白。

进一步的，步骤(1)中，酶解过程中pH值被调节至8。

进一步的，步骤(1)中，酶解的温度为40-60℃，时间为2-5h。

进一步的，步骤(1)中，碱性蛋白酶与天然蛋白的添加量满足：酶底比为1:10。

进一步的，酶解前，还按照天然蛋白：水的质量比为1：18-22往天然蛋白中加入水。

进一步的，步骤(1)中的上清液放入500Da-800Da透析袋中，再放入透析液中，进行透析24-48h，每隔12h更换一次透析液，收集好透析液，进行下一步反应。

进一步的，步骤(2)中，超声震荡的时间为20min。

进一步的，步骤(2)中，所述锌/钙溶液为硫酸锌/钙溶液、氯化锌/钙溶液、葡萄糖酸锌/钙溶液或氨基酸锌/钙溶液。此处的“锌/钙溶液”指的是锌溶液或钙溶液。

进一步的，步骤(2)中，锌/钙元素与所加入上清液中的肽的质量比为1:4～1:10。此处的锌/钙元素指的是锌元素或钙元素。此处的所用的肽的数均分子量为400到1000之间。

本发明采用超声波辅助处理，有效展开肽的卷曲构象，使之与金属络合，降温后肽分子构象恢复，从而把金属包裹在肽分子内部，避免消化液对肽锌/钙的分解作用，提高有效吸收率。本发明所得螯合物中，金属锌/钙被包裹在肽分子内部，可有效抵御消化液分解。

进一步的，步骤(2)中，保温处理的温度为40-50℃，时间为1.5-2.5h。

本发明创新之一是使用超声波技术将肽的构象打开，变为开链结构，有利于锌/钙离子与肽链上的螯合位点结合，在螯合反应结束后，恢复构象，将锌或者钙离子包裹在肽链中间，避免了金属离子在肠道吸收时的竞争拮抗，减少了许多生化过程，提高了人体对锌/钙的吸收率。本发明创新之二是锌/钙与肽链是以螯合的形式进行络合，产物更稳定。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(Ⅰ)本发明对天然蛋白进行水解，采用水解工艺直接决定了水解肽的分子大小以及相应的构象结构。

(Ⅱ)本发明采用天然蛋白水解物作为肽源，相较于现有的补锌/钙剂，对人体无毒无害，有效提高人体对锌/钙的吸收率。

(Ⅲ)本发明合成多肽锌/钙络合物的络合过程，采用了半透膜技术对所获得天然蛋白水解物进行筛选，优选小分子肽进行螯合。

(Ⅳ)本发明合成多肽锌/钙络合物的络合过程，采用了微波技术，使锌离子与肽链螯合。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

以下各实施例中，如无特别说明的原料或处理技术，则表明其为本领域的常规市售原料或常规处理技术。

实施例1：

称取2g大豆分离蛋白，按照质量比1:20加水配成溶液，用1.0mol/L NaOH溶液调节pH到8，在50℃的环境下，加入碱性蛋白酶，酶底比为1:10。加热搅拌水解5h之后，升温至95℃下进行灭活，维持15min。所获得的大豆分离蛋白水解物进行离心，8000r/min进行20min。取上层清液，密封保存。对上清液进行筛选。将上清液放入650Da的透析袋中，将透析袋放置于透析液，透析24-48h。每12h更换一次透析液。收集好透析液，密封保存。

将透析液稀释至0.25mg/-mL左右，超声振荡20min。配置硫酸锌/或氯化钙溶液，按照肽(分子量为400到1000之间)-锌/钙质量比为10:1配制溶液，在超声振荡的环境下，把超声处理好的肽溶液在油浴中加热至60℃，缓慢加入锌/钙溶液，在30min内将温度缓慢降低至40℃，保温2h，反应结束后混合物置于冰水中使反应停止。反应结束后，将溶液取出，加入无水乙醇，使肽锌螯合物析出。抽干液体，使用研钵将剩余固体磨碎，烘干称重。

实施例2

操作如同实施例1，仅将锌/钙溶液换成氯化锌溶液，螯合率81.2％。

实施例3

操作如同实施例1，仅将锌/钙溶液换成醋酸锌溶液，螯合率83.42％。

实施例5

操作如同实施例1，仅将锌/钙溶液换成葡萄酸锌溶液，螯合率84.32％。

实施例6

操作如同实施例1，仅将锌/钙溶液换成七水硫酸锌溶液，螯合率为86.21％。

实施例7

操作如同实施例1，仅将锌/钙溶液换成氯化钙溶液，螯合率80.21％。

实施例8

操作如同实施例1，仅将锌/钙溶液换成氨基酸钙溶液，螯合率81.24％。

实施例9

操作如同实施例1，仅将锌/钙溶液换成葡萄酸钙溶液，螯合率80.12％。

对比例1

与实施例1相比，绝大部分都相同，撤去超声振荡。螯合率为43.2％。

对比例2

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了将超声震荡替换为常规机械震荡。螯合率为60.17％。

实施例10

称取2g酪蛋白，按照质量比1:25加水配成溶液，用1mol/L NaOH溶液调节pH到8，在40℃的环境下，加入碱性蛋白酶，酶底比为1:10。加热搅拌水解4h之后，升温至95℃下进行灭酶，维持15min。冷却后调节pH为5,所获得的酪蛋白水解物进行离心，4000r/min进行15min。取上层清液，密封保存。对上清液进行筛选。将上清液放入500-800Da的透析袋中，将透析袋放置于透析液，透析24-48h。每12h更换一次透析液。收集好透析液，密封保存。

将上清液稀释至4mg/mL，超声振荡20min。配置锌溶液，以七水合硫酸锌为原料，按照肽-锌质量比为4:1配制溶液，在超声振荡的环境下，把超声处理好的肽溶液在油浴中加热至40℃，缓慢加入锌溶液，保温20min，反应结束后在冰水中使反应停止。反应结束后，将溶液取出，加入无水乙醇，使肽锌螯合物析出。抽干液体，使用研钵将固体磨碎，烘干称重。螯合率为85.7％

对比例3

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了将超声震荡替换为常规机械震荡。螯合率为58.3％。

对比例4

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了将超声震荡撤去。螯合率为32.1％。

实施例11

操作如同实施例6，仅将锌溶液换成氯化钙溶液，螯合率83.74％。

实施例12

称取2g玉米蛋白，按照质量比2:25加水配成溶液，用1mol/L NaOH溶液调节pH到10，在50℃的环境下，加入碱性蛋白酶，酶底比为1:20。加热搅拌水解2h之后，升温至100℃下进行灭酶，维持15min。冷却后调节pH为5,所获得的酪蛋白水解物进行离心，5000r/min进行15min。取上层清液，密封保存。对上清液进行筛选。将上清液放入500-800Da的透析袋中，将透析袋放置于透析液，透析24-48h。每12h更换一次透析液。收集好透析液，密封保存。

将透析液稀释至1mg/mL，超声振荡20min。配置锌溶液，以七水合硫酸锌为原料，按照肽-锌摩尔比为2:1配制溶液，在超声振荡的环境下，把超声处理好的肽溶液在油浴中加热至63℃，缓慢加入锌溶液，保温90min，反应结束后在冰水中使反应停止。反应结束后，将溶液取出，加入大量无水乙醇，使肽锌螯合物析出。用液氮冷阱大致上抽干液体，使用研钵将固体磨碎，烘干称重。

对比例5

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了将超声震荡替换为常规机械震荡。螯合率为63.4％。

对比例6

与实施例1相比，绝大部分都相同，除了将超声震荡撤去。螯合率为24.1％。

实施例13

操作如同实施率10，仅将锌溶液换成氯化钙溶液，螯合率84.4％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取蛋白酶对天然蛋白进行酶解，酶解结束后，离心分离沉淀，取上清液备用；

(2)将步骤(1)所得上清液置于超声波仪中超声震荡，再在超声震荡中加入锌/钙溶液，保温处理，得到混合溶液；

(3)往步骤(2)所得混合溶液中加入乙醇，获得沉淀，干燥，即得到目标产物。

2.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述蛋白酶为酶活力20万u/g的碱性蛋白酶。

3.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述天然蛋白为大豆蛋白、酪蛋白或玉米蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，酶解过程中pH值被调节至8。

5.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，酶解的温度为40-60℃，时间为2-5h。

6.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(1)中，碱性蛋白酶与天然蛋白的添加量满足酶底比为1:10；

酶解前，还按照天然蛋白：水的质量比为1：18～22往天然蛋白中加入水。

7.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，超声震荡的时间为20min。

8.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述锌/钙溶液为硫酸锌/钙溶液、氯化锌/钙溶液、葡萄糖酸锌/钙溶液或氨基酸锌/钙溶液。

9.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，锌/钙元素与所加入上清液中小分子肽的质量比为1:4～1:10。

10.根据权利要求1所述的一种基于超声波技术合成多肽锌/钙螯合物的方法，其特征在于，步骤(2)中，保温处理的温度为40-50℃，时间为1.5-2.5h。