CN115786272A - 靶向SARS-Cov-2的TCR-T的制备方法及其应用 - Google Patents

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王科嘉
梁青
张茜
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Abstract

靶向SARS‑Cov‑2的TCR‑T的制备方法及其应用，1)合成SARS‑Cov‑2抗原肽XG2；2)对HLA‑A*02:01的志愿者外周血进行抗原肽刺激，获得SARS‑Cov‑2特异性T细胞；3)提取SARS‑Cov‑2特异性T细胞总RNA，逆转录获得cDNA，多重PCR后NSG测序获得免疫组库；4)对免疫组库生信分析，获得特异性CDR3序列；5)使用所述特异性CDR3序列克隆构建TCR‑T慢病毒载体，应用于靶向识别受SARS‑Cov‑2感染的细胞并对其进行杀伤作用。

Description

靶向SARS-Cov-2的TCR-T的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种能够靶向识别来自严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-Cov2)Spike蛋白的CDR3序列及其在TCR-T上的应用。
背景技术
SARS-CoV-2是2019年新型冠状病毒(Coronavirus disease 2019，COVID-19)大流行的致病病原体。宿主感染SARS-CoV-2后，会对包括肺、肝脏、大脑、肾脏和肠道在内的多种器官造成对应的损伤。若感染SARS-Cov-2的患者存在基础性疾病，即使积极进行有效的抗病毒治疗，也极大几率发展成为重症，严重威胁生命安全。
随着SARS-CoV-2B.1.1.7(alpha)、B.1.351(beta)、P.1(gamma)、B.1.617.2(delta)和B.1.1.529(omicron)等突变株的出现，由于其潜伏期限制性与症状的不明显性，被感染者不能及时有效的被隔离，传染性大大增强。
目前，针对SARS-Cov-2感染的患者治疗方案单一，多为抗病毒药物的常规使用，预后状态很大程度上取决于宿主免疫系统的功效。因为，急需一种可以强化SARS-Cov-2的特异性T细胞靶向杀伤SARS-Cov-2的功能的治疗产品。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种可以靶向SARS-Cov-2spike蛋白的CDR3序列以及其对应的TCR-T慢病毒载体的构建方法和应用，解决现有技术中抗病毒药物不能有效杀伤SARS-Cov-2感染细胞的问题。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
靶向SARS-Cov-2spike蛋白的CDR3序列的获取方法包括以下步骤：
1)合成SARS-Cov-2抗原肽XG2；
2)对HLA-A*02:01的志愿者外周血进行抗原肽刺激，获得SARS-Cov-2特异性T细胞；
3)提取SARS-Cov-2特异性T细胞总RNA，逆转录获得cDNA，多重PCR后NSG测序获得免疫组库；
4)对免疫组库生信分析，获得特异性CDR3序列。
Alpha chain CDR3氨基酸序列:CILQIYNFNKFYF
Beta chain CDR3氨基酸序列:CASKDSDGIYGYTF
Alpha chain CDR3核苷酸序列:
TGCATCCTCCAGATATACAACTTCAACAAATTTTACTTT
Beta chain CDR3核苷酸序列:
TGTGCCAGTAAAGACTCGGACGGGATCTATGGCTACACCTTC
靶向SARS-Cov-2spike蛋白的TCR-T构建及杀伤检测包括以下步骤：
1)使用所述特异性CDR3序列克隆构建TCR-T慢病毒载体；
2)提取无内毒素质粒；
3)包装慢病毒，感染健康志愿者PBMC，检测该TCR-T对SARS-CoV-2感染的细胞的杀伤功能。
本发明在使用来源SARS-CoV-2的抗原肽XG2刺激后获得的免疫组库中显示，此alpha chain CDR3序列频率高达34.9％，beta chain CDR3序列频率高达28.7％。基于此，可使用此CDR3序列构建靶向SARS-CoV-2的TCR-T慢病毒载体的构建以及后续应用。
相对于现有技术，本发明技术方案取得的有益效果是：
本发明将靶向SARS-Cov-2spike的TCR序列构建于慢病毒载体中进而转入到患者T细胞中，使基因修饰的T细胞可以靶向识别受SARS-Cov-2感染的细胞并对其进行杀伤作用，实现了良好的抗病毒效果。
附图说明
图1为合成带目的TCR的质粒以及慢病毒载体质粒双酶切图。
图2为TCR-T载体质粒图谱。
图3为本发明TCR-T对靶细胞的杀伤效果图。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明做进一步详细说明。
第一部分：
说明本发明所述的特异性SARS-Cov-2 TCR的获取方法
1、前期准备
(1)Ficoll分离接种疫苗后HLA-A*02:01健康志愿者的外周单核细胞；
(2)合成SARS-CoV-2Spike蛋白937-945的氨基酸SLSSTASAL，命名为XG-2，为本发明使用的抗原肽段。
2、抗原特异性T细胞获取
(1)使用上述终浓度为10μg/mL SARS-CoV-2XG2抗原肽段体外培养COVID-19疫苗捐献者PBMCs 7天，刺激其中的SARS-CoV-2特异性细胞毒性T细胞增殖；
(2)收集细胞进行流式分析并分选SARS-CoV-2特异性CD3+或CD8+T细胞；
(3)提取SARS-CoV-2特异性T细胞的mRNA，逆转录为cDNA后通过多重PCR方式获取TCRα链和β链的PCR产物，进行NGS测序。
第二部分：
说明本发明所述的特异性SARS-Cov-2 TCR-T慢病毒载体的构建方法
1、原料
原始载体pCDH-EF1a-spike
Xba I和BspE I内切酶：购自New England Biolabs(Beijing)LTD。
2、载体的构建
(1)将可识别SARS-Cov-2特异性T细胞的TCRα和β链的核苷酸序列使用P2A进行连接，合成融合基因，合成这段基因时在两端分别包含Xba I和BspE I酶切位点，并装载在pUC57载体上；
(2)将合成质粒及原始载体质粒进行Xba I和Sal I双酶切，合成质粒回收目的片段，原始载体质粒回收载体片段，如图1所示；
(3)使用T4 DNA连接酶将回收的目的片段以及载体片段进行连接，即可获得慢病毒载体，该质粒图谱如图2所示。
第三部分：
说明本发明所述的特异性SARS-Cov-2 TCR-T对于SARS-Cov-2的杀伤作用
对制成的TCR-T细胞与外周血淋巴细胞进行杀伤对比，具体实验步骤如下：
(1)使用4μM CFSE 37℃、5％CO2培养靶细胞15min，清洗后待用；
(2)将标记好的靶细胞按照1*105个/孔铺入96孔板中，按照适当的E:T比例加入TCR-T细胞或外周血淋巴细胞，每组3个副孔；
(3)37℃、5％CO2培养4h后，PI(1mg/ml)染色10min，通过流式细胞仪分析靶细胞被裂解的百分比，得到的结果如图3所示。

Claims (3)

1.靶向SARS-Cov-2的TCR-T的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)合成SARS-Cov-2抗原肽XG2；
2)对HLA-A*02:01的志愿者外周血进行抗原肽刺激，获得SARS-Cov-2特异性T细胞；
3)提取SARS-Cov-2特异性T细胞总RNA，逆转录获得cDNA，多重PCR后NSG测序获得免疫组库；
4)对免疫组库生信分析，获得特异性CDR3序列；
Alpha chain CDR3氨基酸序列:CILQIYNFNKFYF
Beta chain CDR3氨基酸序列:CASKDSDGIYGYTF
Alpha chain CDR3核苷酸序列:
TGCATCCTCCAGATATACAACTTCAACAAATTTTACTTT
Beta chain CDR3核苷酸序列:
TGTGCCAGTAAAGACTCGGACGGGATCTATGGCTACACCTTC
5)使用所述特异性CDR3序列克隆构建TCR-T慢病毒载体。
2.靶向SARS-Cov-2的TCR-T的应用，其特征在于：靶向识别受SARS-Cov-2感染的细胞并对其进行杀伤作用。
3.如权利要求2所述的靶向SARS-Cov-2的TCR-T的应用，其特征在于：
1)提取无内毒素质粒；
2)包装慢病毒，感染健康志愿者PBMC，检测该TCR-T对SARS-CoV-2感染的细胞的杀伤功能。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116751280A (zh) * 2023-05-17 2023-09-15 复旦大学附属中山医院 一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116751280A (zh) * 2023-05-17 2023-09-15 复旦大学附属中山医院 一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用
CN116751280B (zh) * 2023-05-17 2024-01-26 复旦大学附属中山医院 一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用

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