CN116751280A - 一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用 - Google Patents

一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用 Download PDF

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Abstract

一种特异性识别SARS‑CoV‑2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体，包括α链可变区和β链可变区；α链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的互补决定区ACDR1，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR2，以及如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR3；β链可变区包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR1、如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR2以及如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR3。还提供了上述T细胞受体的制备方法。还提供了上述的T细胞受体在制备用于检测或诊断新冠病毒SARS‑CoV‑2的产品中的应用、用于治疗或预防新冠病毒SARS‑CoV‑2所引起疾病的药物中的应用。

Description

一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受 体及制备和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽，具体来说是一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用。
背景技术
适应性免疫系统可以通过抗体和T细胞来清除病毒。中和抗体可以结合病毒S蛋白上的受体结合位点(RBD)或周围区域，进而影响病毒与细胞上的受体血管紧张素转化酶-2(ACE2)结合，从而阻止SARS-CoV-2病毒入侵细胞。但随着感染人群的不断扩大，SARS-CoV-2病毒也不断进化，从原始株到Delta、Omicron和XBB毒株，病毒已经产生了多轮突变。RBD区域的突变使得抗体无法识别的突变体，更容易入侵细胞从而成为新的优势毒株。且SARS-CoV-2病毒入侵到胞内，抗体也难以发挥作用。这些突变使得以激活抗体应答为目标的新冠预防性疫苗，以及以治疗为目标的中和抗体，难以发挥保护或治疗作用。
新冠病毒SARS-CoV-2已经在全球大规模流行并出现大量突变株，作为抵抗病原体的免疫功能分子抗体可以阻断病毒和细胞受体来阻断病毒入侵，但大量的突变株能逃避抗体的识别，且抗体无法清除入侵胞内的病毒。
T细胞也是获得性免疫反应中最重要的组成。体内存在T细胞受体(T-cellreceptor，TCR)多样的T细胞库，一旦细胞发生感染，胞内的蛋白酶体可部分降解病毒蛋白为肽段(即表位肽)，肽段与MHC-1类分子形成复合物迁移到细胞表面，进而被TCR特异性的CD8+T细胞识别。T细胞上的TCR由异源二聚体α和β两条链组成，每条链又各自包含恒定区(C区)和可变区(V区)，可变区由骨架区和三个超变区，即CDR1、CDR2和CDR3组成。CDR1和CDR2通常被认为结合MHC分子，而CDR3则结合MHC递呈的抗原肽段。人群中MHC-1类分子具备多态性，其中最广泛的MHC-1型别之一为HLA-A*0201型，人群中约占比约40％。
不同于中和抗体识别病毒S蛋白的RBD区域，CD8+T细胞TCR识别的肽段序列通常与病毒的入侵无直接关系，因此，这些肽段的序列更保守，不易受病毒突变的影响。而且T细胞可以通过TCR来识别已感染SARS-CoV-2的靶细胞，并利用颗粒霉素和穿孔素等直接杀伤已感染细胞，或通过细胞因子等非杀伤性机制来清除感染细胞中的病毒。为了获得不易受病毒突变影响，且能清除感染细胞胞内病毒的新冠治疗策略，本发明筛选到一对HLA-A*0201限制的TCR Vα和Vβ，可用于新冠患者的治疗。
HLA-A*0201是世界各人群中均高频表达的HLA等位基因。发现和筛选HLA-A*0201限制性SARS-CoV-2病毒S抗原特异性T细胞受体TCR，获取其编码基因并表达成可溶性TCR蛋白后，使这些蛋白具有HLA-A*0201限制性模式下，清除胞内SARS-CoV-2病毒的能力。由于HLA-A*0201表达的高频性，使得这种方法可以应用于较多的人群，具有很高的应用价值。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用，所述的这种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体及制备和应用要解决现有技术中以激活抗体应答为目标的新冠预防性疫苗，以及以治疗为目标的中和抗体，难以发挥保护或治疗作用的技术问题。
本发明提供了一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体(TCR)，包括α链可变区和β链可变区；其中，
所述α链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR1，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR2，以及如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR3；
所述β链可变区包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR1、如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR2以及如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR3。
具体的，所述的特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体α链可变区中互补决定区ACDR1、ACDR2、ACDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；β链可变区中互补决定区BCDR1、BCDR2、BCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6所示，β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
进一步地，所述TCR的α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或与其相似性不小于80％的氨基酸序列，所述TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与其相似性不小于80％的氨基酸序列。
可理解的是的，上述TCR由α链序列和与之对应的β链序列组成，α链和β链的可变区都决定其结合识别和特异性，TCR的特异性取决于其结合位点和抗原肽/HLA复合物决定区间的结构互补，TCR结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成，而CDR间可通过插入框架区(FR)进行连接，在获知CDR的氨基酸序列后，本领域的技术人员可轻易确定框架区。因此，只要发现的α链序列和β链序列的CDR序列不变，都能够基本实现本发明TCR的功能和应用。因此，本发明的TCR，其具体序列不仅限于以上具体的α链序列可变区和β链序列可变区，以上具体序列的α链序列可变区和β链序列可变区只是本发明的一种实现方式中具体采用的TCR序列。
由与参照序列“至少80％一致性”的氨基酸序列组成的蛋白与参照序列相比可包含突变如缺失、插入和/或取代。在取代的情况中，由与参照序列至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列组成的蛋白可对应源自不同于参照序列的物种的同源序列。“氨基酸取代”可以是保守或非保守的。优选地，取代为保守取代，其中一个氨基酸由具有相似结构和/或化学性质的另一氨基酸取代。具体地，α链或β链可变区的序列与参照序列区别仅在于保守氨基酸取代。
本发明还提供了一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体的制备方法，包括：选取HLA-A*0201阳性样本，分离外周血单个核细胞，加入5μ/ml新冠抗原S蛋白、N蛋白和Orf1来源的肽段刺激培养7至10天，利用荧光标记的肽/HLA-A*0201四聚体流式分选出具备结合能力的T细胞，通过PCR扩增出配对的TCRα和β可变区序列，将α和β可变区序列通过linker连接，经293T培养表达纯化，得到可溶性TCR蛋白，把可溶性TCR蛋白加到新冠病毒感染系统中，筛选到能抑制病毒的TCR克隆。
本发明还提供了上述任一所述的T细胞受体克隆相关的生物材料，所述生物材料选自下述(A)～(C)中的一种：
(A)编码上述T细胞受体的核苷酸序列的核酸分子；
(B)含有(A)中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组原代细胞或者重组细胞系；
(C)所述T细胞受体的蛋白或细胞衍生体。
进一步地，编码所述ACDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述ACDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码所述ACDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码所述BCDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码所述BCDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码所述BCDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
进一步地，编码所述α链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码所述β链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
本发明还提供了一种载体，其包含编码权利要求1所述T细胞受体的核苷酸序列的核酸分子。
本发明还提供了一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的载体。
可理解的是，以上具体的核酸序列只是本发明的一种实现方式中具体采用的核酸序列，根据密码子的简并性，在保障编码序列不变的情况下，除了以上限定的核酸序列以外，可以编码出相同α链可变区序列或β链可变区序列的若干种核酸序列(例如保守核苷酸序列变体源于遗传密码简并和沉默的变体，核苷酸的替代、缺失和增加也包含在内)，都在本发明的保护范围内。
上述生物材料中，含有编码TCR的核酸分子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达所述TCR克隆的DNA，该DNA不但可包括启动所述TCR基因转录的启动子，还可包括终止所述TCR基因转录的终止子。
上述生物材料中，载体是可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具，载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件得以表达，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中，宿主细胞指的是导入载体的细胞，包括原核细胞、真菌细胞、昆虫细胞、动物细胞、原代细胞等，例如大肠杆菌、酵母细胞、S2果蝇细胞、BHK细胞、CHO细胞、HEK 293细胞、以及T细胞等各类免疫细胞。上述表达盒、重组载体、重组细胞均可采用本领域常规方法制备。
上述生物材料中，发明涉及的TCR克隆衍生体包括各类蛋白片段或其融合蛋白等，上述衍生体均可采用本领域常规方法制备。
上述单TCR克隆的α链和β链的可变区氨基酸序列及其编码核苷酸序列如下表1所示：
表1–序列信息表
本发明还提供一种如本发明的第一个方面中任一所述的TCR克隆、或如本发明的第二个方面中任一所述的生物材料的应用，所述应用选自以下应用中的至少一种：在制备用于检测或诊断新冠病毒SARS-CoV-2的产品中的应用、在制备用于治疗或预防新冠病毒SARS-CoV-2所引起疾病的药物中的应用。
进一步地，所述检测诊断产品用于检测不同新冠病毒株SARS-CoV-2的S蛋白或其突变体。待检样品涵盖从受试者获得的多种样品类型且可在诊断或检测中使用，包括但不限于血液和其他生物来源的液体样品、固体组织样品，涵盖临床样品、培养基中的细胞、细胞上清、细胞裂解物、血清、血浆、生物液体和组织样品等。
进一步地，所述治疗或预防药物用于不同新冠病毒株SARS-CoV-2的感染导致的各类疾病。治疗方式涵盖药物、药物组合以及治疗技术，可为任何合适的途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺、粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)或技术人员了解的其他方式，这是本领域众所周知的。
本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。免疫系统中另一类高效特异的抵抗病原体的机制是具备抗原特异性的T细胞，它可以通过TCR靶向已感染的宿主细胞，通过杀伤或非杀伤的机制清除胞内的病原体，且其识别的病毒表位更保守，不易突变。本发明的TCR可识别感染SARS-CoV-2的肺细胞系内源性递呈的S蛋白肽段YLQPRTFLL与HLA-A*0201的复合物，可通过构建TCR-T细胞或可溶性TCR形式蛋白，用于清除已感染细胞中的SARS-CoV-2病毒。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。下述实施例中未注明出处的实验材料，均为市售原料。下述实施例中的各步骤中采用的设备均为常规设备。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为质量百分比。除非另有定义或说明，本发明中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为本发明的限定。
附图说明
图1是本发明实施例1的TCR克隆筛选和蛋白表达实验结果图。
图2是本发明实施例2的TCR蛋白抑制新冠病毒复制的实验结果图。
图3是本发明实施例3的TCR蛋白抑制胞内和上清中病毒的实验结果图。
具体实施方式
实施例1：新冠病毒SARS-CoV-2蛋白特异性TCR的制备
筛选HLA-A*0201阳性的新冠SARS-CoV感染康复者(图1A)，获取外周血全血，利用ficoll试剂密度梯度离心分离单个核淋巴细胞，体外加入5μ/ml新冠抗原S蛋白269-277位置肽段YLQPRTFLL(SEQ ID No.17)或N蛋白、Orf1来源的肽段加10ng/ml的重组IL-2刺激培养7至10天。利用荧光标记的偶联肽段的HLA-A*0201四聚体孵育染色，流式分选出新冠病毒特异性TCR的CD8+T细胞(图1B)。根据TCRα和β链可变区的两端保守区设计引物，进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增出Vα和Vβ基因(图1C)，送测序获得基因序列，在www.imgt.org/网站上比对确认为TCR可变区基因(图1D)。分别获得到针对新冠病毒S、N和Orf1三个蛋白表位肽的TCR克隆各3个(共9个)，每个克隆均包含各自的Vα和Vβ可变区序列。将上述克隆中配对的Vα和Vβ基因之间通过三组GGGGS linker序列连接，并构建到带His标签的pcDNA3.1真核表达载体上，以lipo2000转染293T细胞系，3天后收取293T细胞上清，亲和纯化，获得包含TCR Vα和Vβ的可溶性蛋白(图1E)。
其中，本发明涉及的CoV19S_TCR-2号克隆可变区α和β的PCR扩增引物如表2所示。并将得到的CoV19S_TCR-2可变区序列(表1)，在www.imgt.org/网站上比对分析，确认CoV19S_TCR-2序列α链可变区中互补决定区ACDR1、ACDR2、ACDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；确认其β链可变区中互补决定区BCDR1、BCDR2、BCDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5、SEQ ID NO.6所示，β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
表2–CoV19S_TCR-2可变区引物序列信息表
名称 具体序列
TCR Vα上游引物 5’-gtgatcctgtggcttcagtt-3’(SEQ ID No.18)
TCR Vα下游引物 5’-cacaggaactttctgg-3’(SEQ ID No.19)
TCR Vβ上游引物 5’-cgatgagcaccaggcttctct-3’(SEQ ID No.20)
TCR Vβ下游引物 5’-aagccacagtctgctc-3’(SEQ ID No.21)
实施例2：抑制细胞内新冠病毒复制
利用N蛋白缺失的新冠病毒SARS-CoV-2感染稳转人HLA-A*0201和ACE2的A549细胞，建立复制子系统，并通过荧光素酶Luciferase报告系统，检测新冠病毒复制水平。在感染2小时后，按照2μg/ml浓度加入实施例1中获得的针对新冠病毒S、N和Orf1表位肽的9个克隆的TCR蛋白，包括Orf1_TCR-1、Orf1_TCR-2、Orf1_TCR-3、N_TCR-1、N_TCR-2、N_TCR-3、S_TCR-1、S_TCR-2、S_TCR-3，以及5μg/ml的对应的S蛋白、N蛋白和Orf1来源的肽段，24小时后加入荧光素酶底物测定荧光素酶活性，确定病毒复制水平。
在加入对应肽段的系统中TCR蛋白对病毒复制的调节作用如图2A所示，对比PBS对照组，Orf1_TCR-1、Orf1_TCR3、N_TCR-3和S_TCR-2均表现出对病毒复制的抑制作用。
但该复制子系统中缺少N蛋白，所以外源添加的肽段是调节TCR蛋白发挥功能的重要因素，因此我们去掉了外源肽段，仅加入TCR蛋白。此时TCR蛋白仅识别HLA-A*0201/ACE2/A549细胞通过HLA-A*0201分子递呈的SARS-CoV-2蛋白内源性降解肽段。如图2B所示，Orf1_TCR-1、Orf1_TCR3和N_TCR-3都失去了抑制病毒复制的能力，仅S_TCR-2仍具备抑制病毒复制的能力。我们将S_TCR-2重新命名为CoV19S_TCR-2
通过测序，得到CoV19S_TCR-2的α链可变区_DNA、β链可变区_DNA序列如下所示。
实施例3：抑制感染系统中新冠病毒的扩增
本发明中使用的SARS-CoV-2真病毒nCoV-SH01(GenBank:MT121215.1)在复旦大学上海医学院的生物安全水平3(BSL-3)实验室从感染的患者中分离。SARS-CoV-2病毒在VeroE6细胞中繁殖。将浓缩的病毒贮液分装后储存在液氮中。一个等份的细胞系传代的SARS-CoV-2真病毒，最初来自患者血清并在-80℃下储存，经融化用于体外细胞感染实验，感染实验在BSL-3实验室完成。
将1×104/孔的HLA-A*0201/ACE2/A549细胞接种到96孔板中。培养24小时后，将MOI＝0.5的SARS-CoV-2真病毒加入培养的细胞中。在感染2小时后加入2μg/ml实施例2中获得的能在外源肽存在时抑制病毒复制的4种TCR蛋白：Orf1_TCR-1、Orf1_TCR3、N_TCR-3和S_TCR-2，以及未表现抑制出功能的S_TCR-3蛋白作为对照。这5种TCR蛋白的制备方式如实施例1所示。未加入外源病毒肽段的条件下进一步培养2天，收集上清液用于定量反转录PCR，并通过免疫荧光分析细胞。
对于免疫荧光，将细胞在4％多聚甲醛/PBS中固定20分钟，用PBS洗涤和用0.1％Triton X-100/PBS在室温下透化。用3％ BSA封闭后，将细胞与N蛋白抗体以1:1000的稀释度在4℃下孵育过夜，并用红色荧光PE偶联的驴抗小鼠IgG可视化。细胞核用DAPI染色。细胞使用Eclipse Ti-S倒置荧光显微镜进行观察成像。
对于定量反转录PCR，使用Trizol LS从收集的上清液提取病毒RNA，并用作模板用于按照制造商的指示通过One-Step PrimeScrip RT-PCR Kit进行定量PCR分析。定量反转录PCR的程序如下进行：95℃5分钟；95℃10秒、50℃30秒、72℃30秒的40个循环。
免疫荧光实验结果如图3A和图3B所示，在Orf1_TCR-1、Orf1_TCR3、N_TCR-3和S_TCR-3处理组HLA-A*0201/ACE2/A549胞内的新冠N蛋白并未发生明显变化，CoV19S_TCR-2处理组N蛋白显著降低。PBS对照组N蛋白阳性细胞成片聚集，CoV19S_TCR-2处理组阳性细胞成点状分布，出现弱阳性细胞，且细胞核形态完整，并未出现细胞损伤(图3C)。与之类似，定量反转录PCR结果显示CoV19S_TCR-2处理组细胞培养上清中的病毒下降约10倍(图3D)。
由上述实施例可知，本发明筛选获得的TCR克隆CoV19S_TCR-2可不依赖外源肽识别HLA-A2*0201递呈的内源性S蛋白肽段YLQPRTFLL，用于抑制新冠病毒感染后的复制，降低胞内和上清中的病毒滴度。
以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。以上所述仅为本发明的部分实施例，并非因此限制本发明的实施方式及保护范围，对于本领域技术人员而言，应当能够意识到凡运用本发明说明书及图示内容所作出的等同替换和显而易见的变化所得到的方案，均应当包含在本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体，包括α链可变区和β链可变区；其特征在于：
所述α链可变区包含如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR1，如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR2，以及如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列组成的α链互补决定区ACDR3；
所述β链可变区包含如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR1、如SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR2以及如SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列组成的β链互补决定区BCDR3。
2.根据权利要求1所述的一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体，其特征在于：所述T细胞受体的α链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或与其相似性不小于80％的氨基酸序列，所述TCR的β链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与其相似性不小于80％的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体，其特征在于：编码所述ACDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述ACDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码所述ACDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码所述BCDR1的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，编码所述BCDR2的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码所述BCDR3的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示。
4.根据权利要求1所述的一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体，其特征在于：编码所述α链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码所述β链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。
5.权利要求1所述的一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体的制备方法，其特征在于：包括选取HLA-A*0201阳性样本，分离外周血单个核细胞，加入5μ/ml新冠抗原S蛋白、N蛋白和Orf1来源的肽段刺激培养7至10天，利用荧光标记的肽/HLA-A*0201四聚体流式分选出具备结合能力的T细胞，通过PCR扩增出配对的TCRα和β可变区序列，将α和β可变区序列通过linker连接，经293T培养表达纯化，得到可溶性TCR蛋白，把可溶性TCR蛋白加到新冠病毒感染系统中，筛选到能抑制病毒的T细胞受体克隆。
6.一种生物材料，其特征在于：所述生物材料选自下述(A)～(C)中的一种，
(A)编码权利要求1所述T细胞受体的核苷酸序列的核酸分子；
(B)含有(A)中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组原代细胞、或者重组细胞系；
(C)权利要求1所述T细胞受体的蛋白或细胞衍生体。
7.权利要求1所述的一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体在制备用于检测或诊断新冠病毒SARS-CoV-2的产品中的应用。
8.权利要求1所述的一种特异性识别SARS-CoV-2新冠病毒S蛋白抗原肽的T细胞受体在制备用于治疗或预防新冠病毒SARS-CoV-2所引起疾病的药物中的应用。
9.权利要求6所述的一种生物材料在制备用于检测或诊断新冠病毒SARS-CoV-2的产品中的应用。
10.权利要求6所述的一种生物材料在制备用于治疗或预防新冠病毒SARS-CoV-2所引起疾病的药物中的应用。
11.一种载体，其包含编码权利要求1所述T细胞受体的核苷酸序列的核酸分子。
12.一种宿主细胞，其包含如权利要求11所述的载体。
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021178416A1 (en) * 2020-03-02 2021-09-10 Heat Biologics, Inc. Immune-mediated coronavirus treatments
WO2021217181A1 (en) * 2020-04-21 2021-10-28 Tempus Labs, Inc. Tcr/bcr profiling
WO2022020319A2 (en) * 2020-07-24 2022-01-27 Tscan Therapeutics, Inc. Binding proteins recognizing sars-cov-2 antigens and uses thereof
CN114230658A (zh) * 2022-01-24 2022-03-25 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
WO2022150610A2 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 The Johns Hopkins University Sars-cov-2-specific t cell receptors and related materials and methods of use
WO2022241110A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 La Jolla Institute For Immunology Coronavirus t cell epitopes, megapools and uses thereof
CN115786272A (zh) * 2023-01-05 2023-03-14 厦门大学 靶向SARS-Cov-2的TCR-T的制备方法及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021178416A1 (en) * 2020-03-02 2021-09-10 Heat Biologics, Inc. Immune-mediated coronavirus treatments
WO2021217181A1 (en) * 2020-04-21 2021-10-28 Tempus Labs, Inc. Tcr/bcr profiling
WO2022020319A2 (en) * 2020-07-24 2022-01-27 Tscan Therapeutics, Inc. Binding proteins recognizing sars-cov-2 antigens and uses thereof
WO2022150610A2 (en) * 2021-01-08 2022-07-14 The Johns Hopkins University Sars-cov-2-specific t cell receptors and related materials and methods of use
WO2022241110A1 (en) * 2021-05-13 2022-11-17 La Jolla Institute For Immunology Coronavirus t cell epitopes, megapools and uses thereof
CN114230658A (zh) * 2022-01-24 2022-03-25 卡瑞济(北京)生命科技有限公司 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
CN115786272A (zh) * 2023-01-05 2023-03-14 厦门大学 靶向SARS-Cov-2的TCR-T的制备方法及其应用

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