CN115785478A - 一种双网络纤维蛋白凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种双网络纤维蛋白凝胶，它是结构中同时存在三维立体的纤维蛋白交联网络和三维立体的席夫碱凝胶网络的固态水凝胶，且所述的纤维蛋白交联网络和席夫碱凝胶网络形成互穿网络结构。本发明还提供用于制备所述的双网络纤维蛋白凝胶的原料组合物和试剂盒。本发明所述原料组合物直接应用在出血伤口上时，可即刻形成纤维蛋白凝块，初步封堵伤口；同时高效促凝血；所述原料组合物中的胺类化合物和醛类化合物交联形成具有强湿组织粘附力的席夫碱凝胶，强化封闭伤口效果，从而可带来优异的快速凝止血效果。本发明还提供制备所述原料组合物及凝胶的方法。

Description

一种双网络纤维蛋白凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药材料领域，尤其涉及用于意外创伤和手术出血的双网络纤维蛋白凝胶粘合剂，及其制备方法和应用。

背景技术

创伤后或手术期间发生的无法控制的出血是全球死亡的主要原因，每年造成超过200万人死亡。手术和创伤环境中不受控制的出血通常会致并发症和不良的结果。因此，控制出血量是降低并发症和死亡率、改善患者预后的重要措施。

目前已经开发了一些生物粘合剂作为外科手术医疗器械的组成部分获得极大的关注。这些粘合剂被广泛用作为组织密封剂和止血剂，来辅助控制手术过程中的出血，以减少手术出血，缩短手术时间。纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯类化合物是极具代表性的两类临床上使用的粘合剂。纤维蛋白胶来源于浓缩的纤维蛋白原和凝血酶酶交联反应，具有较好的生物相容性和生物降解性，可辅助各种外科手术中的止血，通过模拟凝血级联反应，在出血部位原位形成纤维蛋白凝块，封堵出血。然而纤维蛋白胶的粘附强度较低，且在受到持续的组织张力和血液的影响而降低，易被血流冲走，不利于发挥其止血性能，且其在湿态组织上的粘附差而限制了其止血效果。氰基丙烯酸酯类粘合剂能提供更强的组织粘附力，但此类粘合剂因能通过放热反应释放热量和分解成有毒物质(如氰乙酸酯，甲醛等)而致严重的组织刺激和炎症，并且难以去除，这些不利因素限制了其在创伤修复中的应用。因此，迫切需要开发具有优异湿粘合性和生物相容性的组织粘合剂。

基于席夫碱键的水凝胶目前应用于许多生物医学领域，例如组织工程、药物输送和伤口愈合。多糖，如壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠，能够通过氧化等多种修饰沿其主链产生大量的伯胺和醛基，然后在生理条件下与其他多糖或含有胺、或醛基的合成聚合物反应，形成自愈水凝胶。席夫碱反应由于其简单、可逆性和生物相容性而在生物医学领域具有极好的前景。通过席夫碱反应可使水凝胶粘合剂的制备条件更加温和，不需要交联剂和其他引发条件，且具有较高的组织粘附性和结构完整性。这种水凝胶可以通过普通注射器将预制好的水凝胶直接注射到伤口区域，然后通过自愈形成完整的水凝胶，适用于不规则形状和深部伤口。但基于席夫碱反应的水凝胶较少参与凝血反应，尽管壳聚糖及其衍生物中游离氨基等官能团可以聚集血小板并激活红细胞，但不参与体内凝血反应，且基于席夫碱反应水凝胶的凝胶时间长，不能满足大出血时的快速凝血需求。Xia等人将羧甲基壳聚糖和氧化透明质酸通过席夫碱反应形成自愈性水凝胶，该报道中凝胶的止血时间为39s左右，与纤维蛋白胶无差异(Lixin Xia,Shuo Wang，et al.Hemostatic performance of chitosan-based hydrogel and its study on biodistribution and biodegradability inrats.CarbohydrPolym.2021.15；264:117965)。该研究中的出血模型为：SD大鼠肝脏表面做1.5cm切口，该模型中出血量小，不足以模拟创伤或手术中的出血情况；此外，该凝胶不参与体内的凝血反应过程，不具有促凝血作用，一定程度上限制了其止血效果。Rajalekshmi R等人构建了纤维蛋白原-海藻酸二醛-明胶溶液，海藻酸二醛中的醛基是反应性的，可以与明胶和纤维蛋白原中的氨基形成共价键，从而形成凝胶，同时凝血酶充当纤维蛋白原的交联剂，提供了快速凝胶形成，用来作为肝组织工程的有效3D支架系统(Rajalekshmi R,KaladeviShaji A,et al.Scaffold for liver tissue engineering:Exploring thepotential of fibrin incorporated alginate dialdehyde-gelatin hydrogel.Int JBiol Macromol.2021.166:999-1008.)。在该研究构建的纤维蛋白原-海藻酸二醛-明胶溶液中，低浓度凝血酶(15IU/mL)作为纤维蛋白原交联剂，促进凝胶快速形成，但促凝血功能较弱，且低浓度凝血酶与血液中低浓度纤维蛋白原(2～4g/L)形成的纤维蛋白交联不足以封堵伤口，这在很大程度上限制了其止血效果。

总之，现有技术中，虽然纤维蛋白胶具有很短的凝胶时间(1～2s内)，但机械强度差和在湿态组织上的粘附差而限制了其止血效果。基于席夫碱反应的水凝胶虽然具有强湿组织粘附力，但凝胶时间长且不参与体内凝血级联反应，不能满足大出血时的快速凝血需求。那么，将纤维蛋白胶与席夫碱反应的水凝胶结合，有望提高凝胶的止血性能。但是，理论上，席夫碱体系的醛类化合物会与纤维蛋白胶体系中凝血酶中的胺基发生反应，导致凝血酶失去催化活性，无法高效形成纤维蛋白网络。目前，也未见将两种凝胶结合用于止血应用的文献。因此如何将纤维蛋白胶的促凝血功能和快速封堵优势，与席夫碱凝胶体系的强粘附功能结合是一个挑战。

理想的止血材料应该不依赖于机体凝血机制，甚至当机体凝血障碍时亦可发挥止血作用，同时兼具较好的湿润组织粘附能力和理想的凝血止血速度。因此，发明一种可以解决现有止血材料所存在的湿态组织粘附差和止血效果局限的新型止血材料显得尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术中存在的上述缺点，本发明的首要目的在于：提供一种可快速止血、快速凝胶化、具有高粘附性的粘合剂，以期可同时达到促凝血和强粘附效果。

本发明另一个目的在于：提供制备所述粘合剂的方法。

本发明再一个目的在于：提供使用所述粘合剂止血的方法。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种双网络纤维蛋白凝胶，即一种纤维蛋白粘合剂，它是一种由具有封闭功能的网络结构和具有粘附功能的网络结构组成的固态水凝胶；所述的具有封闭功能的网络结构是三维立体的纤维蛋白网络，所述的具有粘附功能的网络结构是三维立体的席夫碱凝胶网络，即所述的纤维蛋白粘合剂结构中同时存在三维立体的纤维蛋白交联网络和三维立体的席夫碱凝胶网络的固态水凝胶，且所述的纤维蛋白交联网络和席夫碱凝胶网络形成互穿网络结构。所述的纤维蛋白网络先于席夫碱凝胶网络形成。所述的纤维蛋白网络可以和席夫碱凝胶网络发生二次化学交联。所述的席夫碱凝胶网络可以与组织上的胺基发生化学交联。

本发明所述的席夫碱凝胶网络是指基于席夫碱键交联形成的凝胶网络，通常由胺类化合物与醛类化合物以脱水反应形成席夫碱键的方式交联得到。

本发明所述的双网络纤维蛋白凝胶由包括组合物A和组合物B的原料制备得到；所述的组合物A包括胺类化合物、酶和水溶性无机钙盐，所述的组合物B包括醛类化合物和纤维蛋白原。在应用所述原料制备所述的凝胶时，将组合物A和组合物B混合，混合时组合物A中的酶和组合物B中的纤维蛋白原先发生反应形成纤维蛋白交联网络，之后，组合物A中的胺类化合物和组合物B中的醛类化合物通过席夫碱反应形成席夫碱凝胶。纤维蛋白交联网络的先形成可避免组合物A中的酶活性被组合物B中的醛类化合物反应失活。

本发明所述的双网络纤维蛋白凝胶中，所述的席夫碱凝胶网络主要起到提供凝胶的强度和组织粘附力的作用，随着席夫碱凝胶网络在所述固态水凝胶中比例的升高，固态水凝胶的组织粘附力也升高，但胶凝时间也会延长、凝胶的孔隙会变小、且促凝血功能会降低。所述的三维立体的纤维蛋白交联网络作为支架，可起到增强凝胶的强度的作用，并且其形成过程可将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而起到初步封堵伤口的作用，随着纤维蛋白交联网络比例的升高，固态水凝胶的胶凝时间会缩短、组织粘附力会降低，但凝胶孔隙会变大、且促凝血功能会升高。鉴于上述两种网络对凝胶整体止血性能带来的影响不同，本发明通过实验进一步优化了凝胶中两种网络的比例，优选的双网络纤维蛋白凝胶中，所述的三维立体的纤维蛋白交联网络与所述的三维立体的席夫碱凝胶网络的体积比为0.5～3；优选0.5～2；最优选1。在这些优选的体积比下，两种网络能够为凝胶整体带来更优的止血性能，尤其是纤维蛋白交联网络和席夫碱凝胶网络的体积比到达1:1时，凝胶的止血性能可达到最佳，即可在提高凝胶强度和粘附力的同时又达到快速促凝血功能。

本发明所述的双网络纤维蛋白凝胶中，所述的席夫碱凝胶网络可以由现有的多种可发生席夫碱反应的胺类化合物和醛类化合物交联形成。

所述的胺类化合物可选自天然高聚物；所述的天然高聚物可进一步选自羧甲基壳聚糖、聚I-谷氨酸、聚L-赖氨酸、胶原蛋白或明胶中的一种或多种。这类天然高聚物的分子量范围通常在3～10000kDa。

所述的醛类化合物可选自含有醛基的天然高聚物、合成高聚物或合成交联剂中的一种或多种；所述的含有醛基的天然高聚物可进一步选自醛化羟乙基淀粉、氧化葡聚糖、氧化纤维素、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠或氧化果胶中的一种或多种。这类含有醛基的天然高聚物的分子量范围通常在1～2000kDa。

本发明所述的双网络纤维蛋白凝胶中，所述的纤维蛋白交联网络可以由纤维蛋白原通过酶交联形成。所述的纤维蛋白原可以是人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。

第二方面，本发明还提供一种用于制备权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶的原料组合物，包括组合物A和组合物B；所述的组合物A包括胺类化合物、酶和水溶性无机钙盐，所述的组合物B包括醛类化合物和纤维蛋白原；所述的组合物A与所述的组合物B质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1；所述的胺类化合物中胺基和所述的醛类化合物中醛基的摩尔比为1:10-10:1；优选1：5～5：1；更优选1：3～3：1；最优选1:1。本发明优选的原料组合物中，所述的组合物A中的胺类化合物、组合物B中的醛类化合物和组合物B中的纤维蛋白原之间的质量比为：1～5:3～10:3～5；进一步优选1～5:5～10:3～5；最优选3～5:10:3～5。

本发明通过实验发现，所述的原料组合物中，所述的组合物A与组合物B的质量比与双网络纤维蛋白凝胶的初步封堵伤口效果和粘附强度有关：当组合物A与组合物B质量比在1.4:10～1.4:1的范围内时，随着组合物A的比例升高，双网络纤维蛋白凝胶的促凝血功能提高，初步封堵伤口效果升高，且粘附强度增大；当组合物A与组合物B质量比在1.4:1～14:1的范围内时，随着组合物A的比例升高，双网络纤维蛋白凝胶的促凝血功能、初步封堵伤口效果及粘附强度并未进一步升高。这意味着当组合物A与组合物B质量比为1.4:1时，可取得最佳止血效果，并达到材料最佳利用率。该比例下，交联产生的两种网络的体积比可以达到1:1左右，能够为制得的凝胶带来最优的促凝血功能和粘附强度。

本发明所述的原料组合物中，所述的胺类化合物可选自天然高聚物；所述的天然高聚物可进一步选自羧甲基壳聚糖、聚I-谷氨酸、聚L-赖氨酸、胶原蛋白或明胶中的一种或多种。这类天然高聚物的分子量范围通常在3～10000kDa。最优选羧甲基壳聚糖。

所述的醛类化合物可选自含有醛基的天然高聚物、合成高聚物或合成交联剂中的一种或多种；所述的含有醛基的天然高聚物可进一步选自醛化羟乙基淀粉、氧化葡聚糖、氧化纤维素、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠或氧化果胶中的一种或多种。这类含有醛基的天然高聚物的分子量范围通常在1～2000kDa。进一步优选的醛类化合物为醛化羟乙基淀粉、氧化透明质酸或氧化葡聚糖中的任意一种；最优选醛化羟乙基淀粉。

本发明优选的原料组合物中，所述的酶可以选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。

本发明优选的原料组合物中，所述的纤维蛋白原可选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。

本发明优选的所述的原料组合物中，所述的水溶性无机钙盐优选氯化钙、硝酸钙或硫酸钙；最优选氯化钙。

本发明所述的原料组合物，可以是制药或临床上可接受的多种具体形式，例如可以是冻干粉剂、注射剂、海绵或颗粒。

第三方面，本发明还提供一种制备本发明第一方面所述的双网络纤维蛋白凝胶的试剂盒，包括相互独立包装的第一前体试剂、第二前体试剂；按重量份计，所述的第一前体试剂含有10～50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂包括30～100份醛类化合物和30～50份纤维蛋白原；所述的第一前体试剂与所述的第二前体试剂质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。

本发明优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有10～50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有50～100份醛类化合物和30～50份纤维蛋白原。

本发明更优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有30～50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有100份醛类化合物和30～50份纤维蛋白原。

本发明最优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有100份醛类化合物和50份纤维蛋白原。

本发明所述的试剂盒中，所述第一前体试剂含有的胺类化合物可选自天然高聚物；所述的天然高聚物可进一步选自羧甲基壳聚糖、聚I-谷氨酸、聚L-赖氨酸、胶原蛋白或明胶中的一种或多种。这类天然高聚物的分子量范围通常在3～10000kDa。最优选羧甲基壳聚糖。

本发明所述的试剂盒中，所述的第二前体试剂含有的所述的醛类化合物可选自含有醛基的天然高聚物、合成高聚物或合成交联剂中的一种或多种；所述的含有醛基的天然高聚物可进一步选自醛化羟乙基淀粉、氧化葡聚糖、氧化纤维素、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠或氧化果胶中的一种或多种。这类含有醛基的天然高聚物的分子量范围通常在1～2000kDa。进一步优选的醛类化合物为醛化羟乙基淀粉、氧化透明质酸或氧化葡聚糖中的任意一种；最优选醛化羟乙基淀粉。

本发明优选的试剂盒中，所述的第一前体试剂含有的酶可以选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。

本发明优选的所述试剂盒中，第一前体试剂含有的所述的水溶性无机钙盐可选自氯化钙、硝酸钙或硫酸钙；最优选氯化钙。

本发明优选的试剂盒中，所述的第二前体试剂含有的纤维蛋白原可选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。

本发明优选的试剂盒中，所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂中还包含辅料和/或添加剂。所述的辅料选自甘氨酸、盐酸精氨酸、枸橼酸钠、蔗糖、氯化钠中的一种或两种以上。所述的添加剂选自生长因子、白细胞介素、维生素、银离子中的一种或两种以上；所述的生长因子可进一步选自血小板生长因子、表皮生长因子或成纤维细胞生长因子中的一种或多种；所述的白细胞介素可进一步选自白细胞介素2、白细胞介素6或白细胞介素8中的一种或多种；所述的维生素可进一步选自维生素B、维生素C、维生素E或维生素K中的一种或多种。

本发明所述的试剂盒中，所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂可以是制药或临床上可接受的多种具体剂型，可以是冻干粉剂、海绵或颗粒。

本发明所述的试剂盒中，还可以进一步包括独立包装的配置用溶剂，所述的配置用溶剂可选为磷酸缓冲盐溶液、HEPES生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液、去离子水中的任意一种或几种的混合物。所述配置用溶剂的剂型优选注射剂。

本发明所述的试剂盒中，还可以进一步包括说明书，用于说明所述试剂盒的使用方法。

第四方面，本发明还提供制备本发明第一方面所述的双网络纤维蛋白凝胶的方法，包括：

1)制备溶剂中溶解有胺类化合物的第一溶液，将所述的第一溶液与含有凝血酶和钙离子的溶液混合得到第一前体溶液，控制所述第一前体溶液中胺类化合物、酶和钙离子的浓度比为10～50:0.14～0.28:1.11～8.88；

2)制备溶剂中溶解有醛类化合物的第二溶液，将所述的第二溶液与含有纤维蛋白原的溶液混合得到第二前体溶液，控制所述第二前体溶液中醛类化合物和纤维蛋白原的浓度比为30～100:30～50；

3)将1)所得的第一前体溶液与2)所得的第二前体溶液按照1:10～10:1的体积比混合，并控制所述第一前体溶液中的胺类化合物的胺基和所述第二前体溶液中醛类化合物中醛基的摩尔比为1:10-10:1；即可得到本发明第一方面所述的双网络纤维蛋白凝胶。

本发明优选的制备方法中，1)所述的第一前体溶液中胺类化合物、酶和钙离子的浓度比为30～50:0.14～0.28:1.11～8.88；更优选30～50:0.14～0.28:3.33～5.55。

本发明优选的制备方法中，2)所述的第二前体溶液中醛类化合物和纤维蛋白原的浓度比为50～100:30～50；更优选100:30～50。

本发明优选的制备方法中，3)中将1)所得的第一前体溶液与2)所得的第二前体溶液按照1:3-3:1的体积比混合；最优选按照1:1的体积比混合。

本发明优选的制备方法中，3)中控制所述第一前体溶液中的胺类化合物的胺基和所述第二前体溶液中醛类化合物中醛基的摩尔比为1:5-5:1，更优选1:3-3:1，最优选1:1。

本发明所述的制备方法中，1)所述的含有酶和钙离子的溶液，优选按照以下方法制备：将溶剂和水溶性无机钙盐溶液加入酶中，完全溶解后得到含Ca²⁺的酶溶液，控制所得溶液中酶活力为500IU～2000IU/ml、Ca²⁺浓度为60～100mmol/L。

本发明所述的制备方法中，2)所述的含有纤维蛋白原的溶液中，纤维蛋白原的浓度优选为5％～10％(w/v)。

本发明优选的制备方法中，1)中控制所述的第一前体溶液中胺类化合物浓度不低于1％(w/v)，更优选在1％～5％(w/v)，进一步优选5％(w/v)。

本发明优选的制备方法中，1)中控制所述的第一前体溶液中酶活力不低于200IU/ml，优选不低于500IU/ml；更优选不低于1000IU/ml。

本发明优选的制备方法中，1)中控制所述的第一前体溶液中钙离子浓度不低于20mmol/L，更优选不低于30mmol/L，进一步优选不低于40mmol/L。

本发明优选的制备方法中，2)控制所述的第二前体溶液中纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，更优选3％-5％(w/v)。

第五方面，本发明还提供制备本发明第三方面所述的试剂盒的方法，包括：将第四方面制备的第一前体溶液和第二前体溶液分别进行冷冻干燥，得到第一前体试剂和第二前体试剂；将第一前体试剂和第二前体试剂以1.4:10～14:1的质量比，优选1.4:1的质量比，分别独立包装；将配置用的溶剂独立包装；最后将独立包装的第一前体试剂、第二前体试剂和配置用溶剂组合包装得到本发明第三方面所述的试剂盒。

本发明所述的制备方法中，所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂是冻干剂、海绵或颗粒；所述的配置用溶剂为注射剂。

本发明所述的制备方法中，所述的胺类化合物可选自天然高聚物；所述的天然高聚物可选自羧甲基壳聚糖、聚I-谷氨酸、聚L-赖氨酸、胶原蛋白或明胶中的一种或多种。所述的天然高聚物的分子量范围为3～10000kDa。所述的醛类化合物可选自含有醛基的天然高聚物、合成高聚物或交联剂中的一种或多种；所述的醛类化合物可选自含有醛基的天然高聚物中的一种或多种；所述的天然高聚物可选自醛化羟乙基淀粉、氧化葡聚糖、氧化纤维素、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠、氧化果胶中的一种或多种。所述的含有醛基的天然高聚物的分子量范围为1～2000kDa。所述的胺类化合物与醛类化合物的席夫碱反应中，胺类化合物中胺基和醛类化合物中醛基的摩尔比范围为1：10-10：1；优选1：1。所述的酶选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种；所述的纤维蛋白原选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种；所述的辅料可选自甘氨酸、盐酸精氨酸、枸橼酸钠、蔗糖氯化钠中的一种或两种以上；所述的添加剂选自生长因子、白细胞介素、维生素、银离子中的一种或两种以上；所述的生长因子可进一步选自血小板生长因子、表皮生长因子或成纤维细胞生长因子中的一种或多种；所述的白细胞介素可进一步选自白细胞介素2、白细胞介素6或白细胞介素8中的一种或多种；所述的维生素可进一步选自维生素B、维生素C、维生素E或维生素K中的一种或多种；所述的配置用溶剂选自磷酸缓冲盐溶液、HEPES生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液、去离子水中的任意一种或几种的组合。

第六方面，本发明还提供本发明所述的原料组合物或试剂盒在制备原位快凝止血材料中的应用。

所述的原料组合物应用包括：将所述的原料组合物中的组合物A和组合物B分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，可在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

所述的试剂盒的应用包括：利用配置用溶剂将所述的第一前体试剂和第二前体试剂分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，可在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

所述的出血伤口包括由于意外创伤导致或手术中发生的器官出血；所述的器官可以是肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、心脏或皮肤。

本发明所述的应用中，在出血伤口注射所述的试剂盒时，(1)可瞬间(1s左右)在伤口表面形成纤维蛋白凝块，起到初步封堵伤口的作用，阻挡血液流出，从而弥补席夫碱反应完成前水凝胶的弱封堵作用；(2)同时，纤维蛋白凝块中的酶将血液中的纤维蛋白原转化为凝块，起到高效促凝血功能；(3)同时的，席夫碱反应水凝胶形成，提供强粘附。席夫碱键水凝胶具有较快的凝胶形成速度和较强的粘附力，可以抵挡血流的冲击并保护纤维蛋白交联网络免被血液冲走。因此本发明结合纤维蛋白交联的即刻发生和席夫碱键凝胶的强粘附力，设计了双网络纤维蛋白凝胶，该双网络纤维蛋白凝胶同时具有纤维蛋白交联网络和席夫碱凝胶网络结构。

针对于背景技术中无法将具有封闭功能的网络结构(纤维蛋白胶)和粘附功能的网络结构(席夫碱凝胶)结合的技术难点，本发明通过创新设计纤维蛋白凝胶的原料组合物，将其分为组合物A和组合物B，意外发现将所述的组合物A(包括胺类化合物、酶和水溶性无机钙盐)和所述的组合物B(包括醛类化合物和纤维蛋白原)按特定比例混合后，可以实现纤维蛋白交联网络(即纤维蛋白凝胶)的高效形成，并且在形成纤维蛋白凝胶后继续形成具有粘附功能的席夫碱凝胶网络体系。

相对于现有技术，本发明的优点在于：快速凝胶化、固化速度快、强湿组织粘附力、止血效果佳：

(1)本发明的双网络纤维蛋白凝胶可即刻(1s左右)发生纤维蛋白交联，起到初步封堵作用，阻挡血流冲击。

(2)本发明的双网络纤维蛋白凝胶中的酶可将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白交联，具有高效促凝血能力。

(3)本发明的双网络纤维蛋白凝胶中的席夫碱反应不需要任何交联剂或额外刺激，可在20秒内发生席夫碱反应，形成自愈水凝胶，提供强湿组织粘附力，可保护纤维蛋白交联免被血流冲走；

正是由于本发明提供的双网络纤维蛋白凝胶具有很好的促凝血功能、固化速度、湿组织粘附力和快速止血效果，因此可用于意外创伤或手术中的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胃肠和皮肤出血的止血应用。

附图说明

图1是对比例1的纤维蛋白交联的SEM图。

图2是对比例2的前体溶液羧甲基壳聚糖和醛化羟乙基淀粉交联的SEM图。

图3是实施例1的双网络纤维蛋白凝胶的SEM图。

图4体现了实施例1及对比例1～4在止血时间上的比较。

图5体现了实施例1及对比例1～4在失血量上的比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明要解决的技术问题、技术方案和有益效果进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前体下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明提供一种双网络纤维蛋白凝胶，它是一种纤维蛋白粘合剂，是结构中同时存在三维立体的纤维蛋白交联网络和三维立体的席夫碱凝胶网络的固态水凝胶，且所述的纤维蛋白交联网络和席夫碱凝胶网络形成互穿网络结构。所述的三维立体的纤维蛋白交联网络与所述的三维立体的席夫碱凝胶网络的体积比为0.5～3；优选0.5～2；最优选1。

所述的席夫碱凝胶网络是指基于席夫碱键交联形成的凝胶网络，通常由胺类化合物与醛类化合物以脱水反应形成席夫碱键的方式交联得到。

所述的纤维蛋白交联网络可以由纤维蛋白原在酶的作用下通过酶交联反应形成。

所述的双网络纤维蛋白凝胶原料组合物可按照以下方法制备得到：

(1)组合物A溶液的制备：将含钙离子的酶溶液加入溶解有胺类化合物的溶液中，均匀混合后，得到组合物A溶液，包含胺类化合物和酶；控制所得组合物A溶液中胺类材料浓度不低于1％(w/v)，优选为1％-10％(w/v)；同时控制酶活力不低于200IU/mL，优选不低于500IU/mL，更优选不低于1000IU/mL。

(2)组合物B溶液的制备：将纤维蛋白原溶液加入溶解有醛类化合物的溶液中，均匀混合后，得到组合物B溶液：包含醛类化合物和纤维蛋白原。控制所得组合物B溶液中醛类化合物浓度不低于1％(w/v)，优选1％-10％(w/v)；同时控制纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，优选3％-5％(w/v)。

(3)储存方法：将得到的组合物A溶液和组合物B溶液按体积比为1：10～10：1分别进行冷冻干燥，成为海绵状后进行储存。

(4)使用上述冻干海绵制备双网络纤维蛋白凝胶：将海绵状A组分和海绵状B组分分别溶于溶剂中，得到可注射溶液状A组分和B组分。将等体积的A组分溶液和B组分溶液均匀的注射/喷涂于出血部位，可在出血部位原位快速形成固态水凝胶。作为优选方案，所述的可注射溶液在使用时的注射工具为双联注射器、注射器、巴氏吸管。

上述制备方案中，所述的溶剂可选为磷酸缓冲盐溶液、HEPES生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液、去离子水中的任意一种或几种的组合，且其使用量没有特别限制，可以根据实际需要浓度进行配制。

基于上述实施方式，本发明进一步列举以下实施例予以说明。

实施例1

制备一种双网络纤维蛋白凝胶，具体原料及步骤如下：

(1)羧甲基壳聚糖溶液的制备：将羧甲基壳聚糖在磁力搅拌下溶解于0.9％氯化钠溶液中，得到质量体积百分比(w/v)为10％(w/v)的羧甲基壳聚糖溶液；醛化羟乙基淀粉溶液的制备：将醛化羟乙基淀粉在磁力搅拌下溶解于0.9％氯化钠溶液中，得到质量体积百分比(w/v)为20％(w/v)的醛化羟乙基淀粉溶液；

(2)凝血酶溶液的制备：将所需体积和所需浓度的氯化钙溶液注射入凝血酶中，完全溶解后，得到凝血酶活力为2000IU/mL的凝血酶溶液，其中Ca²⁺浓度为80mmol/L；

(3)纤维蛋白原溶液的制备：取所需重量的纤维蛋白原，缓慢置于预热的0.9％氯化钠溶液中，完全溶解后，得到质量体积百分比(w/v)为10％(w/v)的纤维蛋白原溶液。

(4)A组分溶液的制备：将步骤(2)得到的凝血酶溶液加入步骤(1)得到的10％(w/v)羧甲基壳聚糖溶液中，均匀混合后，得到A组分溶液：5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶的混合溶液；

(5)B组分溶液的制备：将步骤(3)得到的纤维蛋白原溶液加入步骤(1)得到的20％(w/v)醛化羟乙基淀粉溶液中，均匀混合后，得到B组分溶液：10％(w/v)醛化羟乙基淀粉-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液；

(6)储存：将得到的A组分溶液和B组分溶液按照体积比为1:1的比例分别进行冷冻干燥，以海绵状进行储存；

(7)使用方法：将海绵状A组分和B组分按照1:1的体积份额比例分别溶于含有0.9％氯化钠溶液中，得到可注射溶液状的A组分和B组分。将A组分溶液和B组分溶液等体积的装入双联注射器，A组分溶液和B组分溶液通过喷头注射/喷涂在出血部位，即可原位转变为固态水凝胶。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联网络与席夫碱凝胶网络的体积比例为1:1。

(8)所述的固态水凝胶结构如图3所示：具有纤维蛋白交联的三维网状结构和席夫碱反应交联的三维多孔网络结构，且形成的纤维蛋白交联网络和席夫碱反应交联的多孔网络结构互相穿插。

实施例2

制备浓度为3％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液；制备10％(w/v)醛化羟乙基淀粉-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与大体实施例1相同，不同之处在于：A组分溶液的羧甲基壳聚糖浓度为3％(w/v)。

实施例3

制备浓度为1％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)醛化羟乙基淀粉-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A组分溶液的羧甲基壳聚糖浓度为1％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与席夫碱反应交联的体积比例为2：1。

实施例4

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液，制备5％(w/v)醛化羟乙基淀粉-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：B组分溶液的醛化羟乙基淀粉浓度为5％(w/v)。

实施例5

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-500IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)醛化羟乙基淀粉-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A组分溶液的凝血酶活力为500IU/ml。

实施例6

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)醛化羟乙基淀粉-3％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：B组分溶液的纤维蛋白原浓度为3％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与席夫碱反应交联的体积比例为1：2。

实施例7

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备5％(w/v)氧化透明质酸-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：B组分中的醛类化合物为氧化透明质酸，且B组中的醛类化合物浓度为5％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和席夫碱反应交联的体积比为1：1。

实施例8

制备浓度为3％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备5％(w/v)氧化透明质酸-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：A组分溶液的羧甲基壳聚糖浓度为3％(w/v)。

实施例9

制备浓度为1％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备5％(w/v)氧化透明质酸-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：A组分溶液的羧甲基壳聚糖浓度为1％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与席夫碱反应交联的体积比例为2：1。

实施例10

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备3％(w/v)氧化透明质酸-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：B组分溶液的氧化透明质酸浓度为3％(w/v)。

实施例11

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-500IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备5％(w/v)氧化透明质酸-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：A组分溶液的凝血酶活力为500IU/mL。

实施例12

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备5％(w/v)氧化透明质酸-3％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：B组分溶液的纤维蛋白原浓度为3％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与席夫碱反应交联的体积比例为1：2。

实施例13

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备10％(w/v)氧化葡聚糖-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：B组分中的醛类化合物为氧化葡聚糖，且B组中的醛类化合物浓度为10％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和席夫碱反应交联的体积比为1：1。

实施例14

制备浓度为3％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备10％(w/v)氧化葡聚糖-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：A组分溶液的羧甲基壳聚糖浓度为3％(w/v)。

实施例15

制备浓度为1％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备10％(w/v)氧化葡聚糖-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：A组分溶液的羧甲基壳聚糖浓度为1％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与席夫碱反应交联的体积比例为2：1。

实施例16

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备5％(w/v)氧化葡聚糖-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：B组分溶液的氧化葡聚糖浓度为5％(w/v)。

实施例17

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-500IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备10％(w/v)氧化葡聚糖-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：A组分溶液的凝血酶活力为500IU/ml。

实施例18

制备浓度为5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶混合溶液作为A组分溶液；制备10％(w/v)氧化葡聚糖-3％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其组成、制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：B组分溶液的纤维蛋白原浓度为3％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与席夫碱反应交联的体积比例为1：2。

对比例1

外用冻干纤维蛋白粘合剂(护固莱士，购于上海莱士)，包括酶试剂和纤维蛋白原试剂。将酶试剂和纤维蛋白原试剂按其说明书分别配制成溶液，混合后约1s完成酶交联得到纤维蛋白粘合剂，该粘合剂微观结构如图1所示。

对比例2

分别制备5％(w/v)羧甲基壳聚糖和10％(w/v)醛化羟乙基淀粉溶液，其制备方法与实施例1步骤(1)相同，其使用方法和实施例1的步骤(7)相同。

对比例3

制备5％(w/v)羧甲基壳聚糖-1000IU/mL凝血酶的混合溶液，组分和制备方法与实施例1的步骤(4)相同。

对比例4

制备10％(w/v)醛化羟乙基淀粉-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液，组分和制备方法与实施例1的步骤(5)相同。

性能测试

为验证实施例1～18得到的双网络纤维蛋白凝胶及对比例1～4水凝胶的性能，下面分别对其进行胶凝时间性能测试、粘附强度测试和动物止血实验。

胶凝时间测试

检测对象：

本发明实施例1～18，以及对比例1-4；

检测方法：

对实施例1～18及对比例1～4进行流变学分析，来比较其胶凝时间，其结果见表1。具体操作方法：使用具有平行板(P20 TiL，20-mm直径)几何结构的HAAKE RS6000光流变仪在37℃下进行动态流变实验。实施例1～18和对比例1～4水凝胶的时间扫描振荡测试在5％应变、1Hz频率下进行300秒。对预凝胶溶液进行应变扫描以验证线性响应。凝胶点在扭转模量(G’)超过损耗模量(G”)时确定。

粘附强度测试

本发明实施例1～18，以及对比例1～4；

检测方法：

具体操作：将猪皮切成40毫米×20毫米的长方形，两片猪皮间用500μl的实施例1～18及对比例1～4进行粘合。之后以1mm/min的应变速率进行粘合强度的测试。对比例2的前体溶液交联后形成的凝胶微观结构如图2所示；实施例1的A组分溶液和B组分溶液混合交联后形成的凝胶微观结构如图3所示。记录凝胶从猪皮脱落时的读数，即为粘附强度(Kpa)。检测结果见表1。

止血效果测试

检测对象：

本发明实施例1、实施例7、实施例13，以及对比例1～4；

检测方法：

兔肝表面1cm切口出血模型：将新西兰大白兔麻醉后，暴露腹部，固定在手术台，腹部正中切口，暴露肝脏，在肝脏上造1cm*0.5cm的出血模型；分别用已称重的滤纸、本发明各实施例(实施例1、7、13)的A组分和B组分的混合溶液、以及对比例1～4的前体溶液作为止血材料覆盖在出血部位，直至出血停止，记录出血时间和失血量，其结果见表1、图4和图5。

表1

止血时间和失血量的数值用(均值±标准差)来表示。

结果分析：

由图1可知，对比例1的纤维蛋白胶粘合剂原料只能获得纤维蛋白交联得到的网状结构。由图2可知，对比例2前体溶液仅由羧甲基壳聚糖和醛化羟乙基淀粉交联呈多孔结构。由图3可知，本发明实施例1的A、B组分溶液混合交联后可同时具有维蛋白交联的网状结构和席夫碱反应交联的多孔结构，且这两种交联结构相互穿插。

由表1可知，实施例1～18的胶凝时间范围为1～2s，在胺类化合物和醛类化合物种类相同的情况下，凝胶的胶凝时间随着纤维蛋白交联比例的降低、胺类化合物和醛类化合物浓度升高而延长，但实施例1～18所选择的所有种类的胺类化合物和醛类化合物在特定的混合比例下，胶凝时间均显著低于对比例2-4的胶凝时间(对比例2的胶凝时间为10s，对比例3的胶凝时间为50s，对比例4的胶凝时间为62s)。

由表1可知，实施例1～18的粘附强度范围为21～56kPa，在胺类化合物和醛类化合物种类相同的情况下，凝胶的粘附强度会随着胺类化合物和醛类化合物浓度的降低而减小，但实施例1～18所选择的所有种类的胺类化合物和醛类化合物在特定的混合比例下，粘附强度均高于各对比例的粘附强度(对比例1的粘附强度为6kPa，对比例2的粘附强度为45kPa，对比例3的粘附强度为9kPa，对比例4的粘附强度为5kPa)。虽然本发明部分实施例的粘附强度低于对比例2的粘附强度，但是对应的胶凝时间显著低于对比例2。

由表1和图4、图5可知，本发明实施例1、实施例7、实施例13制备的凝胶的止血时间为9～34s，均显著低于对比例1、3、4的止血时间。实施例1、实施例7、实施例13制备的凝胶的的平均失血量在22～95ml，均低于对比例1、3、4的90ml以上的平均失血量。虽然实施例1、实施例7、实施例13的凝胶在止血时间和失血量方面有可能与对比文件2的凝胶相当，但是实施例1、实施例7、实施例13的凝胶在胶凝时间上都显著低于对比文件2，能够更快速地对伤口进行封堵。

总之，本发明的制备双网络纤维蛋白凝胶的原料组合物，应用在出血伤口时，可即刻(1s左右)形成纤维蛋白凝块，起到“初步”封堵伤口作用，阻挡血液流出；同时，纤维蛋白凝块中的酶将血液中的纤维蛋白原转化凝块，起到高效的促凝血效果；进一步的，胺类化合物和醛类化合物脱水反应，形成席夫碱凝胶，席夫碱凝胶具有强湿组织粘附力，起到“强”封闭伤口效果。纤维蛋白交联和席夫碱凝胶结构共同作用，使本发明的水凝胶兼具初步封堵伤口和强组织粘附功能，从而达到优异的止血效果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细介绍。需要理解的是，本发明并不局限于特定实施方式，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何变形或修改、等同替换和改进等，并不影响本发明的实质内容，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (26)

1.一种双网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：它是一种由具有封闭功能的网络结构和具有粘附功能的网络结构组成的固态水凝胶；所述的具有封闭功能的网络结构是三维立体的纤维蛋白交联网络，所述的具有粘附功能的网络结构是三维立体的席夫碱凝胶网络，且所述的纤维蛋白交联网络和席夫碱凝胶网络形成互穿网络结构。

2.权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的纤维蛋白交联网络先于所述的席夫碱凝胶网络形成。

3.权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的纤维蛋白交联网络可以和所述的席夫碱凝胶网络发生二次化学交联。

4.权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的席夫碱凝胶网络可以与组织上的胺基发生化学交联。

5.权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的三维立体的纤维蛋白交联网络与所述的三维立体的席夫碱凝胶网络的体积比为0.5～3；优选0.5～2；最优选1。

6.权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的席夫碱凝胶网络由胺类化合物和醛类化合物交联形成；优选地，所述的胺类化合物选自羧甲基壳聚糖、聚I-谷氨酸、聚L-赖氨酸、胶原蛋白或明胶中的一种或多种天然高聚物；优选地，所述的醛类化合物选自含有醛基的天然高聚物、合成高聚物或合成交联剂中的一种或多种；更优选地，所述的含有醛基的天然高聚物进一步选自醛化羟乙基淀粉、氧化葡聚糖、氧化纤维素、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠或氧化果胶中的一种或多种。

7.权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的纤维蛋白交联网络由纤维蛋白原通过酶交联形成；所述的纤维蛋白原是人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种；所述的酶选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。

8.一种用于制备权利要求1所述的双网络纤维蛋白凝胶的原料组合物，包括组合物A和组合物B；所述的组合物A包括胺类化合物、酶和水溶性无机钙盐，所述的组合物B包括醛类化合物和纤维蛋白原；所述的组合物A与所述的组合物B质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1；所述的胺类化合物中胺基和所述的醛类化合物中醛基的摩尔比为1:10-10:1；优选1:5-5:1；更优选1:3-3:1；最优选1:1。

9.权利要求8所述的原料组合物，其特征在于：所述的组合物A中的胺类化合物、组合物B中的醛类化合物和组合物B中的纤维蛋白原之间的质量比为：1～5:3～10:3～5；进一步优选1～5:5～10:3～5；最优选3～5:10:3～5。

10.权利要求8所述的原料组合物，其特征在于：所述的胺类化合物选自羧甲基壳聚糖、聚I-谷氨酸、聚L-赖氨酸、胶原蛋白或明胶中的一种或多种天然高聚物；所述的醛类化合物选自含有醛基的天然高聚物、合成高聚物或合成交联剂中的一种或多种；优选地，所述的含有醛基的天然高聚物进一步选自醛化羟乙基淀粉、氧化葡聚糖、氧化纤维素、氧化透明质酸、氧化海藻酸钠或氧化果胶中的一种或多种；所述的酶选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种；所述的纤维蛋白原选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种；所述的水溶性无机钙盐优选氯化钙、硝酸钙或硫酸钙；最优选氯化钙。

11.权利要求8所述的原料组合物，其特征在于：所述组合物是冻干粉剂、注射剂、海绵或颗粒。

12.一种可制备权利要求1-7任意一项所述的双网络纤维蛋白凝胶的试剂盒，包括相互独立包装的第一前体试剂、第二前体试剂；按重量份计，所述的第一前体试剂含有10～50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂包括30～100份醛类化合物和30～50份纤维蛋白原；所述的第一前体试剂与所述的第二前体试剂质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。

13.权利要求12所述的试剂盒，其特征在于：按重量份计，所述的第一前体试剂含有10～50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有30～100份醛类化合物和30～50份纤维蛋白原；优选地，所述的第一前体试剂含有30～50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有50～100份醛类化合物和30～50份纤维蛋白原；更优选地，所述的第一前体试剂含有50份胺类化合物、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有100份醛类化合物和50份纤维蛋白原。

14.权利要求12～13任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂是冻干粉剂、海绵或颗粒。

15.权利要求12～13任意一项所述的试剂盒，其特征在于：还进一步包括独立包装的配置用溶剂，所述的配置用溶剂为磷酸缓冲盐溶液、HEPES生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液、去离子水中的任意一种或几种的混合物。

16.权利要求12～13任意一项所述的试剂盒，其特征在于：还进一步包括说明书，用于说明所述试剂盒的使用方法。

17.制备权利要求1～7任意一项所述的双网络纤维蛋白凝胶的方法，包括：

1)制备溶剂中溶解有胺类化合物的第一溶液，将所述的第一溶液与含有凝血酶和钙离子的溶液混合得到第一前体溶液，控制所述第一前体溶液中胺类化合物、酶和钙离子的浓度比为10～50:0.14～0.28:1.11～8.88；优选的胺类化合物、酶和钙离子的浓度比为30～50:0.14～0.28:1.11～8.88；更优选30～50:0.14～0.28:3.33～5.55；

2)制备溶剂中溶解有醛类化合物的第二溶液，将所述的第二溶液与含有纤维蛋白原的溶液混合得到第二前体溶液，控制所述第二前体溶液中醛类化合物和纤维蛋白原的浓度比为30～100:30～50；优选的醛类化合物和纤维蛋白原的浓度比为50～100:30～50；更优选100:30～50；

3)将1)所得的第一前体溶液与2)所得的第二前体溶液按照1:10～10:1，优选按照1:1的体积比混合，并控制所述第一前体溶液中的胺类化合物的胺基和所述第二前体溶液中醛类化合物中醛基的摩尔比为1:10-10:1，优选1:1；即可得到所述的双网络纤维蛋白凝胶。

18.权利要求17所述的方法，其特征在于：2)所述的含有纤维蛋白原的溶液中，纤维蛋白原的浓度为5％～10％(w/v)。

19.权利要求17所述的方法，其特征在于：1)中控制所述的第一前体溶液中胺类化合物浓度不低于1％(w/v)，更优选在1％～5％(w/v)，进一步优选5％(w/v)。

20.权利要求17所述的方法，其特征在于：1)中控制所述的第一前体溶液中酶活力不低于200IU/ml，优选不低于500IU/ml；更优选不低于1000IU/ml。

21.权利要求17所述的方法，其特征在于：1)中控制所述的第一前体溶液中钙离子浓度不低于20mmol/L，优选不低于30mmol/L，更优选不低于40mmol/L。

22.权利要求17所述的方法，其特征在于：2)中控制所述的第二前体溶液中纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，更优选3％-5％(w/v)。

23.权利要求8所述的原料组合物或权利要求12所述的试剂盒在制备原位快凝止血材料中的应用。

24.权利要求23所述的应用，其特征在于：所述的原料组合物的应用包括将所述的原料组合物中的组合物A和组合物B分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，可在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

25.权利要求23所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒的应用包括利用配置用溶剂将所述的第一前体试剂和第二前体试剂分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，可在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

26.权利要求24～25任意一项所述的应用，其特征在于：所述的出血伤口包括由于意外创伤导致或手术中发生的器官出血；所述的器官是肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、心脏或皮肤。

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