CN115785116B

CN115785116B - 三个新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法与应用

Info

Publication number: CN115785116B
Application number: CN202210157832.9A
Authority: CN
Inventors: 陈德力; 马国需; 杨云; 王灿红; 魏建和; 许旭东
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2022-02-21
Filing date: 2022-02-21
Publication date: 2024-03-22
Anticipated expiration: 2042-02-21
Also published as: CN115785116A

Abstract

本发明提供三个新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法，从黄槿茎中提取得到化合物1‑3，化合物1‑3结构为骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体，所述化合物1‑3可应用于制备治疗乳腺癌和肝癌的药物中，所述化合物2可应用于制备镇静安神的药物中。

Description

三个新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法与应用

技术领域

本发明涉及医药制备技术领域，特别涉及三个新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法与应用。

背景技术

黄槿（Hibiscus tiliaceus）属锦葵科（Malvaceae）木槿属（Hibiscus），是一种具有重要药用、生态和观赏价值的半红树植物，广泛分布于中国、越南、柬埔寨、缅甸、印度、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾及老挝等热带地区，我国主产于海南、广西壮族自治区、台湾、广东、福建等省区，现以广泛种植栽培。因其既能在潮间带生存，并可在滩涂上成为优势种，又能在陆地环境自然繁殖的两栖木本植物，有独特的生境适应性和结构新颖奇特的芳香分子，具有重要的药用研究价值。据《全国中草药汇编》记载，黄槿具有清热止咳、解毒消肿等功效，在海南沿海居民地区作为药物用于毒蛇咬伤、痈疮肿毒、支气管炎等。在国外热带沿海地区，如巴西等地，也会将黄槿作为治疗高血压、发热、肝脏疾病的传统民间药物在使用。化学成分研究表明，黄槿中含有三萜、黄酮、酰胺、倍半萜等类型的物质。根据现代药理学的研究，黄槿具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等多种生物活性。而我们从病原菌诱导的黄槿病变组织中挖掘出系列骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体，具有抗肿瘤，抗菌等药理活性。

发明内容

鉴以此，本发明提出三个新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法。

本发明的技术方案是这样实现的：

三个新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法，所述化合物1-3的结构式如式Ⅰ-Ⅲ所示：

。

进一步的，所述的三个新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法，包括以下步骤：

（1）将黄槿茎粉末用二氯甲烷提取，收集提取液，减压浓缩得到黄槿粗提物；

（2）黄槿粗提物经硅胶柱层析，使用体积比为100:0-0:100的石油醚和二氯乙烷、或体积比为50:1-1:1的二氯甲烷和甲醇混合洗脱，收集洗脱液，洗脱液采用薄层色谱法分析，得到组分1；

（3）组分1使用硅胶柱层析，使用体积比为1:1-0:100的石油醚和二氯甲烷，或体积比为40:1-1:1的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱，得到组分2；

（4）组分2使用硅胶柱层析，使用体积比为4:1-0:100的石油醚和二氯甲烷，或体积比为99:1-1:1的二氯甲烷和甲醇混合液洗脱，得到组分3；

（5）组分3采用半制备高效液相色谱法分离，以甲醇溶液为流动相，使用SB-phenyl柱进行分离，得到化合物1-3。

进一步的，步骤（1）中，所述黄槿茎粉末和二氯甲烷质量比为1:5-15，提取时间为65-75h。

进一步的，步骤（2）中，所述薄层色谱展开剂为体积比2:4-9:5.5-6.5石油醚、二氯甲烷和甲醇混合液。

进一步的，步骤（5）中，所述流动相为体积浓度为85%的甲醇溶液。

进一步的，步骤（5）中，所述化合物1保留时间为35.0min，化合物2保留时间为23.9min，化合物3保留时间为30.9min。

进一步的，步骤（5）中，所述高效液相色谱洗脱流速为2ml/min。

进一步的，所述骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体化合物1-3应用于制备治疗乳腺癌和肝癌药物中。

进一步的，所述化合物2应用于制备镇静安神药物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

本发明从黄槿中提取得到3种骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体化合物，本发明所述的新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体具有抗肝癌和乳腺癌的作用，所述化合物2具有镇静安神的作用。

附图说明

图1 化合物1结构式

图2 化合物1的主要HMBC（）和¹H-¹H COSY（/>）相关

图3 化合物1的X-ray ORTEP图

图4化合物1的ECD光谱图

图5 化合物2结构式

图6 化合物2的主要HMBC（）和¹H-¹H COSY（/>）相关

图7 化合物2的X-ray ORTEP图

图8化合物2的ECD光谱图

图9 化合物3结构式

图10 化合物3的主要HMBC（）和¹H-¹H COSY（/>）相关

图11 化合物3¹³C NMR化学位移的回归分析

图12化合物3的ECD光谱图

具体实施方式

为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。

本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1 新颖骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法

（1）将黄槿茎粉末用二氯甲烷提取，所述黄槿茎粉末和二氯甲烷质量比为1:10，提取时间为72h，收集提取液，减压浓缩得到黄槿粗提物；

（2）黄槿粗提物经硅胶柱层析，使用体积比为100:50的石油醚和二氯乙烷混合洗脱，收集洗脱液，洗脱液采用薄层色谱法分析，所述薄层色谱展开剂为体积比2:7:5.5石油醚、二氯甲烷和甲醇混合液，得到组分1；

（3）组分1使用硅胶柱层析，使用体积比为1:50的石油醚和二氯甲烷混合液洗脱，得到组分2；

（4）组分2使用硅胶柱层析，使用体积比为4:20的石油醚和二氯甲烷混合液洗脱，得到组分3；

（5）组分3采用半制备高效液相色谱法分离，以体积浓度为85%甲醇溶液为流动相，使用SB-phenyl柱进行分离，洗脱流速为2ml/min，得到化合物1-3，所述化合物1保留时间为35.0min，化合物2保留时间为23.9min，化合物3保留时间为30.9min。

试验例1

将实施例1制得的化合物1-3使用X-ray、ECD和NMR进行表征分析。

表1 化合物1-3的核磁数据 (600 MHz for¹H NMR and 150 MHz for¹³C NMR inCDCl₃)

参见图1至4结合表1进行分析化合物1，无色晶体（甲醇-水），易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，甲醇等有机试剂。[α]25.2 D-150.0 (c0.1, MeOH)；HR-ESI-MS显示其分子离子峰m/z559.2297 [M + Na]⁺(理论计算值：559.2308)，结合其一维氢谱（¹H NMR）和碳谱（¹³C NMR）数据，推断其分子式为C₃₁H₃₆O₈，不饱和度为14。红外光谱（IR）显示其存在羟基（νmax 3420, 2959 cm^-1），α, β-不饱和酮或醛基（νmax1693, 1625 cm^-1）以及醚键（νmax1225, 1198, 1141 and 1100 cm^-1）等官能团。¹H NMR（表1）光谱显示存在2个芳香质子信号[H-3’ (δ_H6.96, 1H, s)]和[H-5’ (δ_H7.61, 1H, s)]，2个亚甲基质子信号[H-3 (δ_H2.46,2H, dd,J= 5.4, 12.6 Hz)]和[H-5 (δ_H2.12, 1H, m; δ_H1.31, 1H, m)]，6个次甲基质子信号[H-4 (δ_H1.93, m), H-6 (δ_H2.19, m), H-10 (δ_H2.73, m), H-11 (δ_H2.03, m), H-14(δ_H5.95, s) and H-11’ (δ_H3.63, m)]，1个甲氧基质子信号[14-OCH₃(δ_H3.36, s)]，6个甲基质子信号[H-12 (δ_H0.90, d,J= 6.6 Hz), H-13 (δ_H0.99, d,J= 6.6 Hz), H-15 (δ_H1.13, d,J= 6.6 Hz), H-12’ (δ_H1.37, dd,J= 1.8, 6.6 Hz), H-13’ (δ_H1.37, dd,J=1.8, 6.6 Hz) and H-15’ (δ_H2.44, s)]以及1个醛基质子信号（δ_H10.96, s）。¹³C NMR（表1）光谱显示结构中存在31个碳信号，根据HSQC相关二维光谱图（图2），将碳信号分别归属为1个羰基碳信号（δ_C195.0），1个醛基碳信号（δ_C198.1），12个季碳信号（δ_C166.4-95.7），8个次甲基碳信号（δ_C48.9, 34.7, 34.1, 27.3, 108.0, 114.5, 120.2, 29.6），2个亚甲基碳信号（δ_C38.1, 35.7），1个甲氧基碳信号（δ_C56.7）以及6个甲基碳信号（δ_C16.5, 21.4, 12.8,23.3, 23.4, and 16.5）。综合2D NMR光谱数据（图2），提示核磁信号归属为两个片段：UnitA和Unit B。1D NMR数据提示，片段Unit A为一个典型的两个六元双环还原为萘环的杜松烷型倍半萜骨架。结合HMBC相关谱图，δ_H10.96与δ_C111.4 (C-1’)和166.4 (C-2’)相关，δ_H14.20与C-1’, C-2’和C-3’ (δ_C114.5)相关，表明醛基和羟基分别连接在C-1’和C-2’位；同理，通过HMBC相关以及¹H-¹H COSY谱图（图2）中δ_H3.63 与δ_H1.37的相关性，推断异丙基取代于C-4’位；δ_H2.44与δ_C120.2 (C-5’), 124.4 (C-6’), 和140.4 (C-7’)存在HMBC相关，推断C-6’存在甲基取代。除此之外，在HMBC谱图（图2）中，还存在H-3与C-1 (δ_C135.1), C-2 (δ_C195.0), C-3 (δ_C38.1)和C-4 (δ_C48.9)相关，H-4与C-2, C-10 (δ_C34.1)和C-11 (δ_C27.3)相关，H-5与C-10和C-15 (δ_C12.8)相关，H-15与C-5 (δ_C35.7), C-6 (δ_C34.7)和C-7 (δ_C95.7)相关，H-14与C-8 (δ_C102.6)和C-9 (δ_C160.7)相关，OCH₃-14 与C-14 (δ_C108.0)相关；结合¹H-¹H COSY谱图中存在H-3与H-4，H-4与H-10, H-11，H-10与H-5，H-15与H-5相关以及1DNMR数据，推断片段Unit B为稠合呋喃的三环杜松烷型骨架。然而，片段Unit A和Unit B连接性的关键HMBC相关在谱图中的缺失，无法准确判断片段Unit A和Unit B的连接方式。我们推测片段Unit A和Unit B之间可能存在的氧桥环连接方式，超出了¹H-¹³C多键相关的关联范围。结合化合物1的分子量及2D NMR光谱图，推测片段Unit A中的C-7’/C-8’位与片段Unit B中的C-7/C-8位之间以氧桥的形式连接，形成1个独特的1, 4-二氧六元桥环。

二维片段NOESY谱图显示，δ_H2.19 (H-6)与δ_H2.29 (H-10)相关，δ_H1.93 (H-4)与δ_H2.03 (H-11)有NOE效应，表明这些质子氢在空间中共平面。为了确定该化合物的绝对构型，我们对该化合物进行了X-单晶衍射，幸运的是我们获得了该化合物的晶体结构（图3）[Flack parameter: 0.02(6)]，确定了化合物1的绝对构型为4S, 6S, 7S, 8S, 10S, 14R-1。为了核实其绝对构型，通过电子圆二色谱（ECD）实验测定与量子计算比较，发现实验ECD光谱图与计算ECD光谱的高度一致性（图4），验证其绝对构型。

综上，化合物1的鉴定结构为如图1所示，经Scifinder检索，该化合物为新化合物，命名为hibisceusone A（黄槿酮A）。

参见图5至图8结合表1，化合物2为无色晶体（甲醇-水），易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，甲醇等有机试剂。[α]25.2 D-209.0 (c0.1, MeOH)；HR-ESI-MS显示化合物2的分子离子峰m/z559.2311 [M + Na]⁺(理论计算值：559.2308)，结合其一维氢谱（¹H NMR）和碳谱（¹³C NMR）数据（表1），推断其分子式为C₃₁H₃₆O₈，不饱和度为14。综合比较其1D NMR光谱数据和2D光谱图（图6），发现化合物2与1的核磁数据高度相似，仅在C-7’/C-8’/C-9’位的化学位移存在显著差异。与化合物1中的碳化学位移C-7’ (δ_C140.4), C-8’ (δ_C133.4) and C-9’ (δ_C123.1)相比较，化合物2中的碳化学位移δ_C142.9 (C-7’), 143.5 (C-8’) and 133.6(C-9’)向低场迁移，表明片段Unit A和Unit B的C-6/7/8键位的绝对构型不同于1，导致2中苯环的空间屏蔽效应不同，从而影响其关键碳位的化学位移。为了明确化合物2的空间绝对构型，我们对其进行了单晶培养，幸运的是我们获得了其晶体结构（图7）[Flackparameter: 0.09(8)]，确定其绝对构型为4S, 6R, 7R, 8S, 10S, 14R-2。同时，通过ECD实验测定与量子计算比较，发现实验ECD光谱图与计算ECD光谱的高度一致性（图8），验证其绝对构型。综上，化合物2的鉴定结构为如图所示，为1的非对映异构体，经Scifinder数据库检索，该化合物为新化合物，命名为hibisceusone B（黄槿酮B）。

参见图9至图12结合表1和表2，无色晶体（甲醇-水），易溶于二氯甲烷，乙酸乙酯，丙酮，甲醇等有机试剂。[α]25.2 D-110.0 (c0.1, MeOH)；HR-ESI-MS显示化合物3的分子离子峰m/z559.2300 [M + Na]⁺(理论计算值：559.2308)，结合其一维氢谱（¹H NMR）和碳谱（¹³C NMR）数据（表1），推断其分子式为C₃₁H₃₆O₈，不饱和度为14。综合比较1D和2D NMR谱图（图10），发现与1和2的核磁数据高度相似，且具有相同的分子量和分子式，表明化合物3是1和2的同分异构体，具有相同或相近的平面结构。由于化合物3晶体培养的失败，为了进一步明确其平面结构和相对构型，我们结合量子化学计算的原理，在GAUSSIAN 09 B3LYP/6-31G*水平，利用密度泛函理论（DFT）方法进行计算，比较其实验和计算的¹³C NMR数据（表2）；在B3LYP/6-311+G(2d,p)水平，利用GIAO方法计算化合物3的¹³C NMR屏蔽常数；最后根据计算得到的¹³C NMR数据与实验数据，进行线性回归分析（图11），发现计算的碳谱数据与实验数据吻合度较好，相关系数R= 0.9970，支持通过1D和2D NMR数据鉴定的结构。其绝对构型由ECD方法计算确定，计算得到的(4S, 6S, 7S, 8R, 10S, 14S)-3ECD光谱图与实验ECD光谱显示出高度的相似（图12），由此明确化合物3的结构如图9所示。据此，化合物3的结构确定1和2的非对映异构体，经Scifinder数据库检索，该化合物为新化合物，命名为hibisceusone C（黄槿酮C）。

表 2化合物3的实验和计算¹³C NMR数据（150 MHz，CDCl₃，δ in ppm）

试验例2 化合物1-3的应用

1、抑制乳腺癌、肝癌细胞生长试验

（1）细胞培养于75cm²培养瓶中，密度超过80%，使用胰酶消化细胞，获得细胞悬液，加培养基稀释到每毫升3×104个细胞，接种于96孔板中，每孔200μL，即每孔6000个细胞。

（2）背景对照孔不接种细胞。

（3）培养箱中培养24h，细胞融合率达70%以上，吸出培养基，加入含有不同浓度药物（100，50，25，12.5，6.25，3.12，1.56μg/mL）的无血清培养基100μL，每个浓度设置3个复空。背景对照孔加不含药物无血清培养基。孵育24h后，每孔加入20μL MTT溶液（20mg/mL），继续孵育4h，于570nm处测定吸光度。

（4）按照下公式计算各孔细胞存活率：细胞存活率=（加药孔OD值-背景孔OD值）/（空白对照孔OD值-背景孔OD值）×100%，所述细胞抑制百分率=1-细胞存活率

表3 化合物1-3抑制乳腺癌、肝癌细胞生长实验结果

实验结果表明，本发明制得的化合物1-3对乳腺癌、肝癌细胞生长有明显的抑制作用，其中化合物1的抑制乳腺癌、肝癌细胞效果更佳。

2、镇静安神测试

将 ICR 雄性小鼠随机分为6 组，每组 10 只，正常组(灌胃蒸馏水，给药体积为10 mL·kg^-1)，地西泮组（灌胃给药2 mg·kg^-1)，化合物2（灌胃给药2 mg·kg^-1），每天1次，连续两周，最后一次给药 30 min 后，记录小鼠的最长睡眠时间和睡眠只数。

表4 镇静安神测试结果

由表4可知，相比正常组，本申请所述的化合物2对小鼠均具有很好的安神作用，并均能延长小鼠的睡眠时间，说明化合物2具有镇静安神的作用。

3、神经递质GABA_A水平

上述睡眠实验结束后，摘眼球取血后处死小鼠。在冰盒上，解剖摘取小鼠的大脑，迅速剥离海马组织。按照m:v=1:9的比例，充分匀浆组织，取上清液。根据试剂盒操作要求，检测海马组织匀浆上清中GABA_A水平。

表5 神经递质GABA_A水平检测结果

由表5可知，相比正常组，本申请所述的化合物2可升高抑制性神经递质GABA_A水平，表现它们均有较好的镇静作用，说明化合物2具有镇静促睡眠的作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.三个骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体，其特征在于，所述化合物1-3的结构式如式Ⅰ-Ⅲ所示：

。

2.如权利要求1所述的三个骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：

3.如权利要求1所述的三个骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的应用，其特征在于，所述骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体化合物1-3在制备治疗乳腺癌和肝癌药物中的应用。

4.如权利要求1所述的三个骨架杜松烷型倍半萜氧桥二聚体的应用，其特征在于，所述化合物2在制备镇静安神药物中的应用。