CN115778944A - 蛇床子素在制备改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蛇床子素的药用新用途，具体涉及蛇床子素在制备预防、改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途。本发明研究发现蛇床子素能够使认知功能障碍模型大鼠的记忆能力得到改善，逃避潜伏期明显缩短，本发明为研究认知功能障碍或神经退行性疾病的治疗策略提供了理论依据，为制备新的改善或治疗认知功能障碍或神经退行性疾病的药物提供了一个嵌入点。

Description

蛇床子素在制备改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及蛇床子素的药用新用途，具体涉及蛇床子素在制备预防、改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途。

背景技术

术后认知功能障碍(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)是手术后常见的神经系统并发症。POCD的主要临床症状有术后记忆力减退、注意力不集中和定向力下降等，其发病机制尚不明确。

现有技术公开了一些POCD的治疗策略，例如CN110101845A公开了鸢尾素在制备防治术后认知功能障碍以及血脑屏障受损所介导脑病的药物中的应用，所述鸢尾素通过抑制CNS中小胶质细胞的活化，减少由于麻醉手术等引起的氧化应激的发生，减少炎性因子的表达，抑制核转录因子NF-κB核移位，进而降低下游炎性分子的表达，降低神经元细胞的焦亡、凋亡和坏死，降低微循环中白细胞的滚动和粘附贴壁，从而实现抗炎、保护血脑屏障和改善术后认知功能障碍的作用。例如CN106822079A公开了乙酰半胱氨酸在制备预防、治疗术后认知功能障碍和血脑屏障受损所介导脑病药物中的应用，所述乙酰半胱胺酸提前在手术麻醉前应用，可以显著减轻麻醉和手术后与海马相关的恐惧记忆能力、新物体识别能力的降低。这种作用具体是通过乙酰半胱胺酸抑制外周基质金属蛋白酶-9的水平，从而保护血脑屏障功能，并降低海马炎症因子上调水平而实现的。但目前关于如何防治POCD的治疗手段还比较有限。

丙泊酚是临床静脉麻醉中最常用的药物，它的麻醉药效是通过激活γ氨基丁酸受体而起作用的，丙泊酚目前被广泛用于麻醉的诱导、维持和ICU镇静。使用丙泊酚能较快速地看到麻醉效果，它的诱导期短暂且比较稳定，且术后易恢复，恶心呕吐等并发症的发生率很低，丙泊酚在临床上主要应用于麻醉和维持重症患者的镇静等。

近年来有研究显示，丙泊酚也有可能影响患者的认知功能，可能会引起遗忘，甚至导致记忆能力受损。过去有研究发现，神经炎症尤其是中枢神经系统的炎症反应和POCD的发生有明显相关性。丙泊酚的使用会促使炎症因子分泌增加，分泌的炎症因子可能会跨过血脑屏障进入中枢神经系统，引起中枢炎症反应，释放IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子，促进氧化应激反应，使神经元和神经突触受到损害，如此周而复始，最后导致神经炎症反应的恶性循环，最终引起神经退行性疾病的发生。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供蛇床子素的药用新用途，具体提供蛇床子素在制备预防、改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供蛇床子素在制备预防、改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途。

蛇床子素(osthole，OST)又名甲氧基欧芹酚(C15H1603)，是伞形科植物蛇床子的活性单体，属于香豆素类化合物，其核心结构由苯环和吡喃酮环及异丙烯结构组成(如下所示)。现有研究发现OST具有抗骨质疏松，抗心律失常，抗衰老及促进学习记忆，扩张血管、降低血压，抗肿瘤，镇静、镇痛及抗炎，抗凝血，抗茵、杀虫等作用。

本发明提供了蛇床子素的药用新用途，本发明创造性地发现蛇床子素具有显著地改善或治疗认知功能障碍的作用，本发明研究发现其能够使丙泊酚诱导麻醉的大鼠记忆能力得到改善，逃避潜伏期明显缩短，本发明采用丙泊酚腹腔注射给药诱导大鼠产生认知功能障碍，通过应用Morris水迷宫实验，包括定位航行和空间探索两部分对大鼠的学习和记忆能力进行测试。结果显示，治疗组大鼠的逃避潜伏期明显缩短，治疗组大鼠穿过平台区域时间和次数则显著高于模型组，这些结果表明蛇床子素对丙泊酚麻醉诱导的大鼠认知功能障碍具有改善作用，该结果也表明蛇床子素在神经退行性疾病的发展中具有一定的保护作用。本发明为研究认知功能障碍或神经退行性疾病的治疗策略提供了理论依据，为制备新的改善或治疗认知功能障碍或神经退行性疾病的药物提供了一个嵌入点。

第二方面，本发明提供蛇床子素在制备预防、改善或治疗丙泊酚所致认知功能障碍的药物中的用途。

第三方面，本发明提供蛇床子素在制备预防、改善或治疗术后认知功能障碍的药物中的用途。

在上述应用中，所述认知功能障碍的临床症状包括记忆力减退、注意力不集中或定向力下降中的任意一种或至少两种的组合。

在上述应用中，所述药物抑制小胶质细胞的活化。

在上述应用中，所述药物抑制海马组织中炎症因子的表达。

神经炎症是致使术后认知功能障碍(POCD)发生的一个重要因素，在中枢神经系统中，小胶质细胞是其主要的免疫细胞，起着调节神经炎症的作用。小胶质细胞可以分泌促炎因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-12等)，促炎因子会加剧神经炎症反应。因此，通过抑制小胶质细胞过度活化而产生的炎症反应，是一种有效的用于治疗和减轻神经退行性疾病及脑部损伤的方法。在本发明中，丙泊酚麻醉诱导的模型组大鼠海马中炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达水平增高，而给予蛇床子素治疗的大鼠海马组织中炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达水平降低。结果表明，蛇床子素通过抑制小胶质细胞的活化，减少了IL-1β和TNF-α炎症因子的分泌释放，缓和了脑组织的神经炎症，从而改善大鼠的认知功能。

在上述应用中，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或溶液剂。

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述辅料包括稀释剂、调味剂、粘合剂、填充剂、增稠剂、崩解剂、助溶剂、助悬剂、润滑剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

第四方面，本发明提供蛇床子素在制备小胶质细胞活化抑制剂中的用途。

本发明还提供蛇床子素以非疾病预防或治疗为目的的在制备小胶质细胞活化抑制剂中的用途。根据本发明的研究结果，蛇床子素具有显著地抑制小胶质细胞活化的特性，该结果表明蛇床子素可以作为一种体外制剂，用于科学基础研究，例如用于小胶质细胞生理代谢行为的理论研究。

第五方面，本发明提供蛇床子素在制备海马组织中炎症因子表达抑制剂中的用途。

本发明还提供蛇床子素以非疾病预防或治疗为目的的在制备海马组织中炎症因子表达抑制剂中的用途。根据本发明的研究结果，蛇床子素具有显著地抑制海马组织中炎症因子IL-1和TNF-α表达的特性，该结果表明蛇床子素可以作为一种体外制剂，用于科学基础研究，例如用于神经炎症生理机制的理论研究。

第六方面，本发明还提供一种抑制小胶质细胞活化的方法，所述方法包括：将小胶质细胞与有效剂量的蛇床子素混合孵育。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了蛇床子素的药用新用途，本发明创造性地发现蛇床子素具有显著地改善或治疗认知功能障碍的作用，本发明研究发现其能够使丙泊酚诱导麻醉的大鼠记忆能力得到改善，逃避潜伏期明显缩短，本发明采用丙泊酚腹腔注射给药诱导大鼠产生认知功能障碍，通过应用Morris水迷宫实验，包括定位航行和空间探索两部分对大鼠的学习和记忆能力进行测试。结果显示，治疗组大鼠的逃避潜伏期明显缩短，治疗组大鼠穿过平台区域时间和次数则显著高于模型组，这些结果表明蛇床子素对丙泊酚麻醉诱导的大鼠认知功能障碍具有改善作用，该结果也表明蛇床子素在神经退行性疾病的发展中具有一定的保护作用。本发明为研究认知功能障碍或神经退行性疾病的治疗策略提供了理论依据，为制备新的改善或治疗认知功能障碍或神经退行性疾病的药物提供了一个嵌入点。

附图说明

图1是各组大鼠定位航行试验中代表性游泳轨迹图(a：空白组；b：模型组；c：治疗组)；

图2是各组大鼠空间探索试验中代表性游泳轨迹图(a：空白组；b：模型组c：治疗组)；

图3是各组大鼠的海马组织形态图；

图4是各组大鼠的Western blot结果图；

图5是各组大鼠海马组织中炎症因子表达量的统计结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所涉及的材料来源如下：

SD大鼠，雄性，无特定病原体(SPF)级，体重(350±20)g，购于卡文斯百格(苏州)模式动物研究有限公司(质量合格证：SCXK(苏)2018-0002)，大鼠专用动物房中饲养，室内温度为22℃，相对湿度55％，12h的光照条件下，大鼠能自由摄食和饮水。

蛇床子素(OST)，麦克林(上海)生化科技有限公司，CAS号：484-12-8，纯度：99％，批号：O815127，双蒸水及吐温80溶解得到4mg/ml的OST溶液，4℃储存备用。

力蒙欣丙泊酚乳状注射液，西安力邦制药有限公司，国药准字：H19990282，产品批号：22012221-2，规格：20ml:0.2g。0.9％氯化钠注射液(中国大冢制药有限公司)，产品批号：0C75A2。

吐温80(国药集团化学试剂有限公司)；磷酸盐缓冲溶液PBS(美国Thermo FisherScientific公司)；RIPA裂解液、PMSF(碧云天生物技术)、SDS-PAGE凝胶快速配胶试剂盒(碧云天生物技术)；10％ APS(碧云天生物技术)；异丙醇(杭州青辰化学试剂)；PVDF膜(默克密理博)；甲醇(国药集团化学试剂有限公司)；TBST、Western半干法转膜液、Western一抗稀释液、Western二抗稀释液、Western封闭液及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(碧云天生物技术)；IL-1β抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司，批号：ab254360)；TNF-α抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司，批号：ab215188)；β-actin抗体(艾博抗(上海)贸易有限公司，批号：ab8226)；特超敏ECL化学发光试剂盒(碧云天生物技术)。Morris水迷宫检测系统(众实迪创科技(北京)发展有限责任公司)；超纯水系统(杭州景元科技有限公司)；高速冷冻离心机(德国Andreas Hettich公司)。

实施例

本实施例探究蛇床子素对认知功能障碍模型大鼠的影响，具体内容如下：

1、分组和给药方式：

将大鼠随机分为空白组、模型组和治疗组，每组6只。通过丙泊酚腹腔注射建立大鼠认知功能障碍模型，空白组的大鼠腹腔注射同丙泊酚注射液等量的生理盐水。模型组及治疗组大鼠均用100mg/kg丙泊酚注射液腹腔注射，每只注射4ml丙泊酚，大鼠维持麻醉4h后苏醒，治疗组自麻醉苏醒后灌胃给药10mg/kg的OST溶液，每只灌胃1ml，同时空白组及模型组灌胃同治疗组等量的1ml生理盐水，每天一次，连续给药14天。

2、试验内容：

(1)Morris水迷宫测试

将各组大鼠分别进行Morris水迷宫实验，实验包括定位航行和空间探索两部分。

(1.1)定位航行试验：定向航行实验是从池壁四个起始点的任一点将大鼠面向池壁放入水池，自由录像系统记录大鼠找到平台的时间，即逃避潜伏期(s)，若120s内找不到平台，则逃避潜伏期记为120s，由实验者将大鼠拿上平台，在平台上休息15s，再进行下一次实验。实验开始前，将水池蓄满水，水温保持在22℃，再将大鼠放入未放平台的水池中自由游泳2min，使其熟悉水迷宫环境，减少应激现象。待大鼠适应水迷宫环境后，将平台置于水池第三象限的水下2cm处，之后进行定位航行实验，每天将大鼠于第一象限入水点，面向池壁轻轻放入水池中，然后记录大鼠的逃避潜伏期，实验共进行5天。

(1.2)空间探索试验：在最后一次定位航行试验的第二天进行，撤除原平台，将大鼠任选一个入水点放入水中，所有大鼠必须为同一入水点，记录大鼠在120s内穿过第三象限所花的时间和进入第三象限的次数。

(2)Western Blot

上述实验结束后，将大鼠脱颈椎处死，打开颅骨，取出脑组织，再从脑中小心分离出海马组织(图3所示)。将海马组织放置于离心管中，再加入RIPA裂解液(RIPA:PMSF:磷酸酶抑制剂＝100:1:1)于冰上裂解5min，充分裂解后，于高速冷冻离心机中1200r/min离心10min，吸取离心管中的上清液。在上清液中加入25μl上样缓冲液混匀后，在95℃金属浴中加热5min，然后置于冰上，使蛋白变性，于4℃保存。取20μg蛋白质上样，进行SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白质，将凝胶上的蛋白质转至PVDF膜，于室温下用封闭液封闭2H，用一抗(β-actin，1:5000；IL-1β，1:5000；TNF-α，1:500)在4℃下孵育12h，一抗孵育后膜需用1XTBST洗涤5次，每次10min。用对应的二抗在20℃下孵育1h。孵育完二抗的膜用1×TBST洗膜3次，每次10min。TBST漂洗后用ECL显色、发光和观察。

3、统计学处理：

用SPSS 17.0软件进行统计学分析，计量资料以

表示，两组间比较用t检验，多组间比较用One-way ANOVA，以P<0.05为差异具有显著性，有统计学意义。

4、试验结果：

(1)蛇床子素对大鼠水迷宫实验逃避潜伏期的影响：

大鼠定位航行试验中代表性游泳轨迹(a：空白组；b：模型组；c：治疗组)如图1所示，随着实验天数增加，各组大鼠的逃避潜伏期均逐渐缩短。各组大鼠定位航行实验的逃避潜伏期(s)统计结果如表1所示，在定位航行实验的五天时间内，与空白组大鼠相比，腹腔注射过丙泊酚的模型组大鼠记忆能力下降，逃避潜伏期显著延长(P<0.05)；与模型组相比，灌胃蛇床子素的治疗组大鼠记忆能力得到改善，逃避潜伏期显著缩短(P<0.05)。

表1

注：与空白组比较，^aP<0.05；与模型组比较，^bP<0.05

(2)蛇床子素对大鼠水迷宫实验中穿过平台区域次数和时间的影响：

各组大鼠空间探索试验中代表性游泳轨迹(a：空白组；b：模型组c：治疗组)如图2所示，各组大鼠空间探索试验中穿过平台区域次数和时间统计结果如表2所示，与空白组大鼠相比，模型组大鼠穿过平台区域时间明显缩短，穿过平台所在区域次数明显减少(P<0.05)；与模型组相比，治疗组大鼠穿过平台区域时间明显延长，穿过平台所在区域次数明显增加(P<0.05)。

表2

注：与空白组比较，^aP<0.05；与模型组比较，^bP<0.05

(3)Western Blot测定大鼠海马组织中IL-1β、TNF-α的蛋白表达：

Western blot结果如图4所示，统计结果如图5所示，与空白组大鼠相比，丙泊酚诱导的模型组大鼠海马组织中炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达都有所增加；与模型组大鼠相比，给予蛇床子素灌胃治疗的治疗组大鼠海马组织中炎症因子IL-1β和TNF-α蛋白表达都有所降低。

综上可知，Morris水迷宫的结果显示，与空白组相比，模型组大鼠记忆能力下降，逃避潜伏期明显延长；与模型组相比，治疗组大鼠记忆能力得到改善，逃避潜伏期明显缩短。Western blot结果分析发现，与空白组大鼠相比，模型组大鼠海马组织中IL-1β和TNF-α蛋白表达均增加，治疗组大鼠海马组织中上述蛋白表达均降低。表明蛇床子素可改善丙泊酚诱导麻醉大鼠引起的认知功能障碍，其作用机制可能与降低大鼠海马组织中炎症因子IL-1β和TNF-α的表达有关。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的蛇床子素在制备改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (10)

1.蛇床子素在制备预防、改善或治疗认知功能障碍的药物中的用途。

2.蛇床子素在制备预防、改善或治疗丙泊酚所致认知功能障碍的药物中的用途。

3.蛇床子素在制备预防、改善或治疗术后认知功能障碍的药物中的用途。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述认知功能障碍的临床症状包括记忆力减退、注意力不集中或定向力下降中的任意一种或至少两种的组合。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物抑制小胶质细胞的活化。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物抑制海马组织中炎症因子的表达。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其特征在于，所述药物的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂或溶液剂；

优选地，所述药物还包括药学上可接受的辅料；

优选地，所述辅料包括稀释剂、调味剂、粘合剂、填充剂、增稠剂、崩解剂、助溶剂、助悬剂、润滑剂或缓冲剂中的任意一种或至少两种的组合。

8.蛇床子素在制备小胶质细胞活化抑制剂中的用途。

9.蛇床子素在制备海马组织中炎症因子表达抑制剂中的用途。

10.一种抑制小胶质细胞活化的方法，其特征在于，所述方法包括：将小胶质细胞与有效剂量的蛇床子素混合孵育。

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