CN115774327A - 一种集成照明调制和瞳孔调制的定量差分相衬显微镜 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种集成照明调制和瞳孔调制的定量差分相衬显微镜，可选择照明调制和瞳孔调制两种成像模式。选择照明调制时，采用1/2环形彩色复用照明，采集1幅彩色图像，通过颜色补偿后计算上、下、左、右4幅半环形照明图像，并计算2幅相位梯度图像和对应的相位传递函数，再通过反卷积和正则化定量恢复样品相位；选择瞳孔调制模式时，采用旋转半圆形掩膜片的方法，采集2幅轴对称图像，并计算1幅相位梯度图像和对应的相位传递函数，再通过反卷积和正则化定量恢复样品相位。本发明可以实现1/2相干衍射极限的各向同性横向分辨率、实时成像效率、<1％的轴向相位恢复误差、高稳定性的定量相位成像。

Description

一种集成照明调制和瞳孔调制的定量差分相衬显微镜

技术领域

本发明属于光学显微成像、定量相位成像、计算光学成像，特别是一种集成照明调制和瞳孔调制的定量差分相衬显微镜，可以实现薄、透明样品，尤其是微生物、组织和细胞的无标记、实时、高精度、稳定的定量相位显微成像。

背景技术

生物医学在近百年来蓬勃发展，其中微生物学贯穿了整个人类文明社会，被应用于食品、药品、化肥、医疗等各个方面，为人类的发展与进步做出了巨大贡献。长远来看，人类目前对微生物的应用已经比较熟悉，但进一步研究微生物的作用机理，特别是微生物亚结构的形态与功能，将使人类对生物医学的认识有巨大的进步；就近来看，人类当下正面临极其严重的传染病威胁，研究高效、稳定的病原微生物(直径约为0.3-100μm)成像、检测、计数等方法，对传染病的诊断、防治有重大作用。不仅如此，最近的临床研究还表明，生物组织中肿瘤小泡(直径约为1-10μm)的数量检测对癌症诊断有巨大作用。

普通明场显微镜采集到的都是样品的振幅信息，针对微生物、细胞和组织等生物(相位型)样品，普通光学显微镜不能准确表达它们的微观信息，这导致了在不同的应用场景，需要不同的成像手段去满足各种需求。然而，目前生物医学专家仍然大量采用荧光标记或相衬显微镜用于观测组织和细胞，这样的观测方法能获取直观的生物样品形态，但不能获取准确的深度信息，且荧光标记操作复杂，对样品的光毒性也限制了它在活细胞领域的应用。在亚细胞领域(纳米尺度)，研究者们大多采用电子显微镜，它不仅价格昂贵、操作复杂，还需要样品处于真空之中，同样无法观测活生物样品。近年来，定量相位成像成为一种活生物样品成像的热门方法，它包括数字全息成像、傅里叶叠层成像、基于GS算法、TIE算法及其改进算法的无透镜成像、差分相衬成像等。然而，现在的定量相位成像并不能满足日益增长的微生物检测需求：数字全息成像对环境要求高，噪声扰动大；傅里叶叠层成像效率低下，无法满足活(运动)生物样品成像需求；无透镜成像同样效率低下，且成像精度较低；差分相衬成像可以达到1/2相干光学衍射极限的横向分辨率，但分辨率存在各向异性，且弱相位近似导致了轴向相位恢复误差随样品相位的增大而增大。综合来看，目前生物医学专家急需一个操作简单、横向分辨率高、轴向相位恢复精度高、成像速度快、系统稳定的定量相位显微镜，所以发展无标记、高分辨、实时成像、鲁棒性强的定量相位显微成像技术对生物医学的研究和发展具有重大意义。

发明内容

为了满足当下的生物样品定量显微成像需求，本发明提出一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜。

本发明采用如下技术方案：一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，集成了照明调制和瞳孔调制两种照明模式：选择照明调制时可以实现高分辨、高效率的定量相位成像；选择瞳孔调制时可以获取完全各向同性的横向分辨率。

进一步地，选用照明调制模式时，采用了1/2环形彩色复用照明，这种照明方法包括三种形式，分别为R/G-B、R/B-G、G/B-R，三种形式都可以解释为上半环颜色/左半环颜色-全圆环颜色，这三种照明形式都有各自的优缺点，但1/2环形彩色复用照明相比之前的三等分环形复用照明，单帧照明下拥有更弱的横向分辨率各向异性与更高的补偿前轴向相位恢复精度。

进一步地，选用瞳孔调制模式时，采用了频谱中心半通过型瞳孔调制方式，这种方式相比之前的频谱中心全通过型瞳孔调制方式，拥有更好的轴向相位恢复精度与完美的横向分辨率各向同性，还使用了边缘置零的方式来记录和消除背景误差，使瞳孔调制模式下的定量差分相衬成像结果背景噪声更小，更适合于精密检测。

进一步地，成像过程步骤为：

步骤一，选择照明模式：选用照明调制模式时，采用1/2环形彩色复用照明，选择瞳孔调制模式时，采用中心灯珠同轴白光照明；

步骤二，决定是否采用半圆形旋转掩膜片：当选用照明调制模式时，不使用半圆形旋转掩膜片，当选用瞳孔调制模式时，使用半圆形旋转掩膜片；

步骤三，采集图像：选用照明调制模式时只需采集1幅彩色图像，选用瞳孔调制模式时需要旋转半圆形掩膜片采集2幅轴对称图像；

步骤四，计算相位阶梯图像和对应的相位传递函数：选用照明调制时需要进行颜色补偿，分别提取1幅彩色图像的三个颜色通道，然后计算上、下、左、右4幅半圆形照明图像，并以此计算2幅相位阶梯图像，最后计算半环形照明调制相位传递函数；选用瞳孔调制时直接利用2幅图像计算1幅相位阶梯图像，再计算半圆形瞳孔调制相位传递函数；

步骤五，通过反卷积和正则化定量恢复样品相位：选用照明调制和瞳孔调制都分别用各自的相位阶梯图像和对应的相位传递函数计算得出样品相位。

进一步地，进行了弱相位近似误差补偿：通过数学计算和仿真分析得出[0,π]相位范围内样品实际相位和恢复相位之间的函数关系，并用这个函数关系补偿实际的恢复结果，使轴向相位恢复误差降低到1％以下。

进一步地，一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜包括照明、4f成像系统、4f中继系统、瞳孔调制、彩色图像传感器。所述照明用于产生不同形状与颜色的照明，产生自定义的照明调制效果；所述4f成像系统用于确定微小物体图像的放大倍数，确保显微镜的横向测量精度；所述4f中继系统用于将物镜后焦面从物镜内部传递至物镜外部；所述瞳孔调制用于产生不同角度的半圆形频谱调制，实现自定义的瞳孔调制效果；所述图像传感器用于记录与传输采集的图像，交由计算机开展进一步计算。所有模块均集成于由传统光学显微镜的镜座、镜架、镜臂等组成的主体结构中，形成一个功能性整体装置。相较于数字全息定量相位显微镜或者荧光标记显微镜，本发明装置仅在传统光学显微镜的基础上增添了可编程的LED照明和半圆形旋转掩膜片，就能实现实时、横向分辨率高、轴向恢复精度高、鲁棒性强的定量相位成像，保证了装置的高效、精确和稳定。并且在数据处理时采用了弱相位近似误差补偿算法，能使相位范围在[0,π]内的样品轴向尺寸测量误差<1％，极大地提升了定量差分相衬显微镜的轴向测量精度。

进一步地，照明为一可编程的LED光源，LED灯珠呈环形分布，可以实现R/G/B/W颜色可选的明暗，满足不同照明形状与颜色需求。本发明的照明调制模式采用特有的1/2环形彩色复用照明，可以实现更高的轴向相位恢复精度与更弱的横向分辨率各向异性；本发明的瞳孔调制模式采用中心灯珠同轴白光照明。

进一步地，4f成像系统为传统光学显微镜基本框架，包括物镜和管状透镜，在固定距离的情况下可以获取一个固定的放大倍率，确保成像的横向分辨率。

进一步地，4f中继系统为新增模块，包括两个傅里叶透镜，在合理的固定方式下可以将物镜后焦面从物镜内部传递到物镜外部，便于进行频谱面的半圆形调制。

进一步地，瞳孔调制为一个可旋转的半圆形掩膜片，固定在4f中继系统的后焦面上，可以实现任意角度的半圆形瞳孔调制。本发明采用特有的频谱中心半通过型调制方法，搭配边缘置零方法记录和消除背景误差，轴向相位恢复精度更高。

进一步地，彩色图像传感器记录1幅彩色图像或2幅轴对称图像，并将其传输至计算机作为相位梯度图像和相位恢复算法的输入。

进一步地，在推导出的相位传递函数作为相位恢复算法的基础上，增添了弱相位近似误差补偿算法，能使轴向相位恢复误差降至1％以下。由于照明调制与瞳孔调制采用了完全相同的弱相位近似方法，本发明通过补偿瞳孔调制中由弱相位近似带来的误差，来近似补偿照明调制中由弱相位近似带来的误差，使瞳孔调制的轴向相位恢复误差<0.1％，照明调制的轴向相位恢复误差<1％。

综上所述，与现有技术相比，由于采用了上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

1.照明调制和孔径调制两种模式可选，针对不同类型的样品本发明中的显微镜都能精确恢复轴向相位；

2.选择照明调制时，由于采用了本发明中特有的1/2环形彩色复用照明，可以通过采集1幅图像实现定量相位恢复，此时横向分辨率的各向异性很弱，但横向分辨率可以达到1/2相干光学衍射极限；

3.选择瞳孔调制时，由于采用了本发明中特有的频谱中心半通过型频谱滤波方法，可以通过旋转半圆形掩膜片采集2幅图像实现定量相位恢复，此时的横向分辨率为各向同性，横向分辨率为相干光学衍射极限；

4.由于采用了本发明中特有的弱相位近似误差补偿算法，无论是照明调制还是瞳孔调制都可以极大地降低由弱相位近似造成的误差。

与其它定量相位显微镜相比，本发明中的照明调制与瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜可以有实时的成像效率、1/2相干光学衍射极限的各向同性横向分辨率、在[0,π]相位范围内<0.1％的轴向相位恢复误差。

附图说明

图1为本发明一种集成照明调制和瞳孔调制的定量差分相衬显微镜的工作原理流程图。

图2为本发明一种集成照明调制和瞳孔调制的定量差分相衬显微镜的系统结构原理图。

图3为本发明的1/2环形彩色复用照明调制的三种形式原理示意图。

图4为本发明的频谱中心半通过型瞳孔调制的原理示意图。

图5为本发明的照明调制模式下，选择20×0.4NA物镜，小鼠肾脏细胞切片和小鼠红细胞的定量相位成像结果。

图6为本发明的瞳孔调制模式下，选择20×0.4NA物镜，小鼠肾动脉横切面与载玻片杂质的定量相位成像结果。

具体实施方式

为了更好的理解本发明的应用方法，以下结合附图做进一步的详细描述。

如图1所示，本发明提出了一种集成照明调制和瞳孔调制的定量差分相衬显微镜。两种模式的照明都采用可编程LED阵列，选择照明调制模式时，根据不同物镜的数值孔径需求，让不同的LED放置距离和不同直径的环亮起，但都采用1/2环形彩色复用照明模式，此时半圆形掩膜片处于闲置状态；选择瞳孔调制模式时，LED阵列的中心灯珠常量白光，此时照明为同轴光照明，半圆形掩膜片处于工作状态。首先，图像传感器分别采集对应照明或瞳孔调制模式下的图像，并通过式(1)与式(2)分别计算照明和瞳孔调制的相位梯度图像：

式(1)中，I_SDPC,lr与I_SDPC,tb分别代表半圆环照明对称轴竖直与水平情况下的相位梯度图像，I_B与I_R分别代表半圆环照明对称轴竖直与水平情况下采集的图像，I_G代表全圆环照明采集的图像。式(2)中，I_AMDPC,lr与I_AMDPC,tb分别代表半圆形瞳孔滤波对称轴竖直与水平情况下的相位梯度图像，I_L、I_R、I_T、I_B分别代表上、下、左、右半圆形瞳孔滤波采集的图像。再通过式(3)分别计算二者的相位传递函数：

其中，

与

分别代表对称轴竖直与水平情况下的相位传递函数，

分别代表左、右、上、下半圆环照明(或半圆形瞳孔滤波)下频谱面的相位分布，

分别代表左、右、上、下半圆环照明(或半圆形瞳孔滤波)下频谱面的背景光强分布，

分别代表左、右、上、下半圆环照明(或半圆形瞳孔滤波)下频谱面的吸收分布。

其次，根据TV正则化，照明调制与瞳孔调制的差分相衬图像均可以根据各自的相位传递函数，通过式(5)进行一步反卷积来定量恢复样品相位：

式(4)中，

与

分别代表式(1)中的I_SDPC,lr与I_SDPC,tb，或式(2)中的I_AMDPC,lr与I_AMDPC,tb的傅里叶变换，

代表傅里叶逆变换，α代表一个极小值，避免分母为0放大误差。

最后，通过对弱相位近似的仿真计算，得出真实相位与恢复相位之间的函数关系k：

k＝Δφ_r/Δφ_i (5)

式(5)中，Δφ_r与Δφ_i分别代表实际恢复的相位与真实相位。并通过k来补偿弱相位近似带来的误差。请注意，这里是对每一个像素点采用函数关系k来进行补偿，而不是图像整体获取一个固定的放大倍数。

如图2所示，本发明包括照明、物镜与管状透镜组成的4f成像系统、两个傅里叶透镜组成的4f中继系统、半圆形旋转掩膜片、彩色图像传感器等部分。照明部分中包含了可编程LED阵列与K1000-C控制器，用于产生照明调制模式中的1/2环形彩色复用照明和瞳孔调制模式中的同轴白光照明；物镜与管状透镜组成的4f成像系统用于产生固定的放大倍数和稳定的横向分辨率；两个傅里叶透镜组成的4f中继系统，用于将物镜后焦面从物镜内传输至物镜外，方便在频谱面进行半圆形滤波；半圆形旋转掩膜片用于产生不同方向的频谱中心半通过型频谱滤波；彩色图像传感器用于采集图像，并传输至计算机开展进一步计算。

如图3所示，本发明中的1/2环形彩色复用照明包含3种类型，分别为R/G-B、R/B-G、G/B-R，每种类型都可以分解为4个部分。R/B-G中第一象限为黄色(红色+绿色)，第二象限为白色(红色+绿色+蓝色)，第三象限为青色(绿色+蓝色)，第四象限为绿色。通过采集1幅图像并提取三个颜色通道，得到的分别为上半环照明(红色通道)、整环照明(绿色通道)、左半环照明(蓝色通道)，此时可以通过整环照明减去上半环照明得到下半环照明，通过整环照明减去左半环照明得到右半环照明。G/B-R中第一象限为黄色(红色+绿色)，第二象限为白色(红色+绿色+蓝色)，第三象限为品红色(红色+蓝色)，第四象限为红色。通过采集1幅图像并提取三个颜色通道，得到的分别为上半环照明(绿色通道)、整环照明(红色通道)、左半环照明(蓝色通道)，此时可以通过整环照明减去上半环照明得到下半环照明，通过整环照明减去左半环照明得到右半环照明。R/G-B中第一象限为品红色(红色+蓝色)，第二象限为白色(红色+绿色+蓝色)，第三象限为青色(绿色+蓝色)，第四象限为蓝色。通过采集1幅图像并提取三个颜色通道，得到的分别为上半环照明(红色通道)、整环照明(蓝色通道)、左半环照明(绿色通道)，此时可以通过整环照明减去上半环照明得到下半环照明，通过整环照明减去左半环照明得到右半环照明。因此，通过采集1幅环形彩色复用照明图像，就可以得到上、下、左、右半环形照明得到的图像，以此计算相位梯度图像和相位传递函数就可以进行轴向相位恢复。

如图4所示，2个傅里叶透镜组成的4f中继系统将物镜中的频谱面传递到后焦面上，此时将高精度激光加工的半圆形掩膜片装配在旋转件中并放置在后焦面上，就可以实现任意角度的频谱中心半通过型瞳孔调制，当选用照明调制时，直接将旋转件移除即可。特别注意，图4中右上侧为频谱中心全通过型瞳孔调制方法，图4中右下侧为频谱中心半通过型瞳孔调制方法，前者为传统方法，将以频谱中心点(灰色正方形)作为圆心，半径4个像素的圆完全通过，后者为本发明特有方法，将频谱中心点(灰色正方形)所在的列完全打开。本发明的瞳孔调制方法可以有更高的轴向相位恢复精度。

本发明的工作原理是：K1000-C控制器使可编程环形LED阵列产生照明。选择照明调制模式时，采用1/2环形彩色复用照明，此时彩色CCD采集1幅图像即可作为上、下、左、右半环照明得到的4幅图像，此时可旋转掩膜片处于闲置状态；选择瞳孔调制模式时，采用LED阵列中心灯珠亮白光作为同轴光照明，此时可旋转掩膜片处于工作状态，彩色CCD分别采集可旋转掩膜片在左半圆、右半圆时的2幅图像。随后可以分别计算两种模式下的相位梯度图像，并根据对应的相位传递函数进行轴向相位恢复。其中瞳孔调制模式采用了边缘置零法，将样品边缘置零用于记录系统带来的背景误差，消除此误差后再通过仿真得出的弱相位近似补偿函数来补偿相位，使两种模式下的轴向相位恢复误差<1％。照明调制模式适用于轴向尺寸渐变、横向尺寸形状偏向水平与竖直的样品，成像效率快，横向分辨率高，但横向分辨率存在微弱的各向异性，针对中心对称样品的三维形貌测量畸变较大；瞳孔调制模式适用于轴向尺寸突变、横向尺寸形状偏向中心对称的样品，成效效率稍慢，横向分辨率稍低，但横向分辨率完全各向同性，轴向相位恢复精度高。

为了验证本发明中的照明调制与瞳孔调制的成像效果，在20×0.4NA物镜下，对小鼠肾脏细胞切片、小鼠红细胞进行照明调制的定量差分相衬成像，对小鼠肾动脉横切面、载玻片表面杂质进行瞳孔调制的定量差分相衬成像，结果分别如图5、图6所示。

图5(a1)-(a3)为载玻片表面杂质，图5(b1)-(b3)为小鼠肾脏细胞，图5(c1)-(c3)为小鼠红细胞。可以发现，照明调制模式下横向分辨率高，图5(b2)小方框中的丝状物质的横向距离仅为0.5μm左右，此时成像系统的横向分辨率为482nm，物镜的理论横向分辨率为964nm，这说明了本发明中照明调制模式确实达到了1/2相干衍射极限的横向分辨率。不仅如此，通过图5(a1)-(a3)中的杂质微球，可以发现1/2环形彩色复用照明的横向分辨率各向异性很弱，理论上这是所有彩色复用的差分相衬显微成像中各向异性最弱的成像方式。通过图5(c1)-(c3)，可以发现小鼠红细胞的三维结果精确直观，应用面广。

图6(a1)-(a3)为小鼠肾动脉横切面，相位对比度强，背景噪声低。图6(b1)-(b3)为载玻片表面杂质，相位对比度强，拥有完美各向同性的横向分辨率。

Claims (10)

1.一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：集成了照明调制和瞳孔调制两种照明模式：选择照明调制时可以实现高分辨、高效率的定量相位成像；选择瞳孔调制时可以获取完全各向同性的横向分辨率。

2.根据权利要求1所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：选用照明调制模式时，采用了1/2环形彩色复用照明，这种照明方法包括三种形式，分别为R/G-B、R/B-G、G/B-R，三种形式都可以解释为上半环颜色/左半环颜色-全圆环颜色，这三种照明形式都有各自的优缺点，但1/2环形彩色复用照明相比之前的三等分环形复用照明，单帧照明下拥有更弱的横向分辨率各向异性与更高的补偿前轴向相位恢复精度。

3.根据权利要求1所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：选用瞳孔调制模式时，采用了频谱中心半通过型瞳孔调制方式，这种方式相比之前的频谱中心全通过型瞳孔调制方式，拥有更好的轴向相位恢复精度与完美的横向分辨率各向同性，还使用了边缘置零的方式来记录和消除背景误差，使瞳孔调制模式下的定量差分相衬成像结果背景噪声更小，更适合于精密检测。

4.根据权利要求1所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：成像过程步骤为：

步骤一，选择照明模式：选用照明调制模式时，采用1/2环形彩色复用照明，选择瞳孔调制模式时，采用中心灯珠同轴白光照明；

步骤二，决定是否采用半圆形旋转掩膜片：当选用照明调制模式时，不使用半圆形旋转掩膜片，当选用瞳孔调制模式时，使用半圆形旋转掩膜片；

步骤三，采集图像：选用照明调制模式时只需采集1幅彩色图像，选用瞳孔调制模式时需要旋转半圆形掩膜片采集2幅轴对称图像；

步骤四，计算相位阶梯图像和对应的相位传递函数：选用照明调制时需要进行颜色补偿，分别提取1幅彩色图像的三个颜色通道，然后计算上、下、左、右4幅半圆形照明图像，并以此计算2幅相位阶梯图像，最后计算半环形照明调制相位传递函数；选用瞳孔调制时直接利用2幅图像计算1幅相位阶梯图像，再计算半圆形瞳孔调制相位传递函数；

步骤五，通过反卷积和正则化定量恢复样品相位：选用照明调制和瞳孔调制都分别用各自的相位阶梯图像和对应的相位传递函数计算得出样品相位。

5.根据权利要求1所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：进行了弱相位近似误差补偿：通过数学计算和仿真分析得出[0,π]相位范围内样品实际相位和恢复相位之间的函数关系，并用这个函数关系补偿实际的恢复结果，使轴向相位恢复误差降低到1％以下。

6.根据权利要求1所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：包括照明、4f成像系统、4f中继系统、瞳孔调制、彩色图像传感器；所述照明用于产生不同形状与颜色的照明，产生自定义的照明调制效果；所述4f成像系统用于确定微小物体图像的放大倍数，确保显微镜的横向测量精度；所述4f中继系统用于将物镜后焦面从物镜内部传递至物镜外部；所述瞳孔调制用于产生不同角度的半圆形频谱调制，实现自定义的瞳孔调制效果；所述图像传感器用于记录与传输采集的图像，交由计算机开展进一步计算；所有模块均集成于由传统光学显微镜的镜座、镜架、镜臂等组成的主体结构中，形成一个功能性整体装置；相较于数字全息定量相位显微镜或者荧光标记显微镜，照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜仅在传统光学显微镜的基础上增添了可编程的LED照明和半圆形旋转掩膜片，就能实现实时、横向分辨率高、轴向恢复精度高、鲁棒性强的定量相位成像，保证了装置的高效、精确和稳定；并且在数据处理时采用了弱相位近似误差补偿算法，能使相位范围在[0,π]内的样品轴向尺寸测量误差<1％，极大地提升了定量差分相衬显微镜的轴向测量精度。

7.根据权利要求6所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：照明为一可编程的LED光源，LED灯珠呈环形分布，可以实现R/G/B/W颜色可选的明暗，满足不同照明形状与颜色需求；照明调制模式采用特有的1/2环形彩色复用照明，可以实现更高的轴向相位恢复精度与更弱的横向分辨率各向异性；瞳孔调制模式采用中心灯珠同轴白光照明。

8.根据权利要求6所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：4f成像系统为传统光学显微镜基本框架，包括物镜和管状透镜，在固定距离的情况下可以获取一个固定的放大倍率，确保成像的横向分辨率。

9.根据权利要求6所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：4f中继系统为新增模块，包括两个傅里叶透镜，在合理的固定方式下可以将物镜后焦面从物镜内部传递到物镜外部，便于进行频谱面的半圆形调制。

10.根据权利要求1所述的一种照明调制和瞳孔调制可选的定量差分相衬显微镜，其特征在于：瞳孔调制为一个可旋转的半圆形掩膜片，固定在4f中继系统的后焦面上，可以实现任意角度的半圆形瞳孔调制；采用特有的频谱中心半通过型调制方法，搭配边缘置零方法记录和消除背景误差，轴向相位恢复精度更高；

彩色图像传感器记录1幅彩色图像或2幅轴对称图像，并将其传输至计算机作为相位梯度图像和相位恢复算法的输入；

在推导出的相位传递函数作为相位恢复算法的基础上，增添了弱相位近似误差补偿算法，能使轴向相位恢复误差降至1％以下，由于照明调制与瞳孔调制采用了完全相同的弱相位近似方法，通过补偿瞳孔调制中由弱相位近似带来的误差，来近似补偿照明调制中由弱相位近似带来的误差，使瞳孔调制的轴向相位恢复误差<0.1％，照明调制的轴向相位恢复误差<1％。

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