CN115770249A - 治疗大肠癌的药物组合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗大肠癌的药物组合物，其组分及其重量百分比分别为澳洲茄胺5‑95％、大黄素5‑95％。该药物组合物用于治疗大肠癌治疗可以抑制细胞增殖和肿瘤生长，诱导细胞凋亡，抑制血管生成和转移的作用，并可协同手术、放化疗、靶向治疗及生物与免疫治疗用于大肠癌的治疗。本发明药物组合物可以是颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、口服液、注射液或汤剂等剂型。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗大肠癌的药物组合物。
背景技术
大肠癌是常见恶性肿瘤，晚期可见淋巴结、肝、肺、骨等部位转移。
根据病情的不同，大肠癌可以采用手术、放化疗以及靶向治疗等治疗，但远期疗效有待进一步提高。中医药是我国重要的生物医药资源，在大肠癌的治疗中发挥了重要的作用，但比较缺乏组方合理、疗效肯定的中药组方(组合)；研发可以治疗大肠癌的中药组方具有重要的意义。
本发明人经多年研究，结合中医肿瘤基础与临床进展，科学配伍抗癌中药资源，发明了一种治疗大肠癌的药物组合物；该药物组合物具有解毒、散结、抗癌的功效，用于治疗大肠癌治疗可以抑制细胞增殖和肿瘤生长，诱导细胞凋亡，抑制血管生成和转移的作用，并可协同手术、放化疗、靶向治疗及生物与免疫治疗用于大肠癌的治疗。
发明内容
针对现有技术的上述不足，根据本发明的实施例，希望提供一种治疗大肠癌的药物组合物，该药物组合物对大肠癌具有多重作用，可以联合手术、化疗、放疗和靶向治疗等现代治疗大肠癌，也可以单独用于大肠癌的治疗。
根据实施例，本发明提供的一种治疗大肠癌的药物组合物，其组分及其重量百分比分别为澳洲茄胺5-95％、大黄素5-95％，优选地，澳洲茄胺10-90％、大黄素10-90％。
根据一个实施例，本发明前述治疗大肠癌的药物组合物，可与药学上可接受的载体或辅料混合，制备成制剂，所述制剂优选颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或注射液。
本发明前述治疗大肠癌的药物组合物中，澳洲茄胺(Solasodine，Purapuridine，Solancarpidine，Solasodin，SLSD)分子式：C27H43NO2，CAS号；126-17-0，是一种类固醇生物碱，存在于多种茄科植物中，如龙葵(茄科茄属植物龙葵Solanum nigrum L.)。
大黄素(Emodin，Frangula emodin，EMD)分子式：C15H10O5，CAS号：518-82-1，是一种蒽醌衍生物；存在于多种中药，如藤梨根(猕猴桃科植物猕猴桃根Actinidia chinensisPlanch.，或猕猴桃科植物软枣猕猴桃根Actinidia arguta(Zucc.)Planch.ex Miq.)，大黄(蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.，唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Balf，或药用大黄Rheum officinale Baill)。
本发明前述治疗大肠癌的药物组合物，其制备方法并无特别之处，按重量百分比分别称取澳洲茄胺和大黄素，混合均匀，与药学上可接受的载体或辅料混合，制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或注射液。
随后的实施例和试验例将证明，本发明药物组合物用于大肠癌的治疗可以抑制细胞增殖和肿瘤生长，诱导细胞凋亡，抑制血管生成和转移的作用，并可协同手术、放化疗、靶向治疗及生物与免疫治疗用于大肠癌的治疗。
附图说明
图1澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116细胞增殖作用效果图(A为澳洲茄胺对HCT116 细胞增殖的作用，B为大黄素对HCT116细胞增殖的作用，C为澳洲茄胺联合大黄素对HCT116 细胞增殖的作用)。
图2澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116细胞凋亡作用效果图(A为流式细胞仪检测， B为细胞凋亡分析)。
图3澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116细胞Caspases作用效果图(A为Caspase-3，B为Caspase-8，C为Caspase-9)。
图4澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116肿瘤生长作用效果图(A为肿瘤体积，B为肿瘤质量)。
图5澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌转移作用效果图(A为转移结节，B为肺质量)。
图6澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌LOX表达作用效果图(A为Western blot检测，B为免疫组织化学染色检测，C为蛋白表达分析)。
图7澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌FAK和Src表达与磷酸化作用效果图(A为Western blot检测，B为蛋白表达与磷酸化分析)。
图8澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌HIF-1α和VEGFA表达作用效果图(A为Westernblot检测，B为蛋白表达分析)。
图9澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌血管生成作用效果图(A为免疫组织化学染色检测，B为血管生成分析)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修改同样落入本发明权利要求所限定的范围。
本发明以下实施例和试验例中，澳洲茄胺和大黄素均为市售纯度98％的标准品。
试验例1(澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116细胞增殖作用)
将5×103大肠癌HCT-116细胞分别接种于96孔板内，等待细胞完全贴壁(24h)后分别加入澳洲茄胺(8-48μM)或大黄素(10-320μM)，对照组加入等体积DMSO，每组3 个复孔；作用48h后，加入10μl CCK-8试剂，培养箱中孵育2h，酶标仪(450nm)检测OD值，依照公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(实验组OD/对照组OD)×100 (图1A和B)。
联合用药试验例中分别加入澳洲茄胺(20μM)或/和大黄素(80μM)或等体积DMSO，作用24-96小时，加入10μl CCK-8试剂，培养箱中孵育2h，酶标仪(450nm)检测OD 值，依照公式计算细胞存活率：细胞存活率(％)＝(实验组OD/对照组OD)×100(图1C)。
实验结果如图1所示，澳洲茄胺和大黄素可抑制HCT116细胞增殖，两药联合可协同抑制HCT116细胞增殖。
试验例2(澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116细胞凋亡作用)
2.5×105HCT-116细胞接种于6孔板中，培养箱孵育24h贴壁后，每组3个复孔，分别加入澳洲茄胺(20μM)或/和大黄素(80μM)或等体积DMSO。培养箱孵育48h后收集培养基及细胞，PBS离心洗涤一次，使用稀释后结合缓冲液150μl重悬细胞。避光条件下，每样本5μlAnnexinV-FITC标记15min，加1ml结合缓冲液1400rpm离心4min，去上清液，加150ul缓冲液重悬，继与5μl PI孵育5min，后加150μl缓冲液重悬细胞，流式细胞仪检测细胞凋亡。
实验结果如图3所示，澳洲茄胺和大黄素可诱导HCT116细胞凋亡，两药联合可增强对HCT116细胞凋亡的作用。
试验例3(澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116细胞Caspases作用)
以Ac-DEVD-pNA、Ac-IETD-pNA、Ac-LEHD-pNA为底物，检测澳洲茄胺和/或大黄素作用后HCT-116细胞Caspase-3、8和9活性。2.5×105HCT-116细胞接种于6孔板中，培养箱孵育24h贴壁后，每组3个复孔，分别加入澳洲茄胺(20μM)或/和大黄素(80μM) 或等体积DMSO作用48h，收集HCT-116细胞，加入裂解液冰浴15min，4℃离心机，19000rpm 离心15min，Bradford法测定蛋白浓度；依次加入测定缓冲液、样品、底物，分别为40 μl，50μl，10μl，轻轻混匀(注意避免出现气泡)，37℃孵育2h后，酶标仪检测405nm OD值，结合蛋白浓度计算Caspases活性。
实验结果如图3所示，澳洲茄胺和大黄素可活化Caspase-3、8和9，两药联合可增强对Caspase-3、8和9活性的作用。
试验例4(澳洲茄胺和大黄素对大肠癌HCT116肿瘤生长作用)
常规培养HCT-1160细胞，计数后，调细胞浓度为3×107个/ml，予以每只BALB/c裸小鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，肿瘤生长至可触及后，将裸小鼠随机分为：对照组、澳洲茄胺组、大黄素组、澳洲茄胺+大黄素组，每组10只；分别给予灭菌水(含等体积DMSO)、澳洲茄胺(1mg/0.2ml)或/和大黄素(1mg/0.2ml)治疗，每天灌胃一次；每三天测量小鼠体重及肿瘤大小；治疗21天后处死小鼠，取裸鼠肿瘤，称重。肿瘤体积(mm3)＝π/6 ×长径×短径2。
实验结果如图4所示，澳洲茄胺和大黄素可抑制大肠癌肿瘤生长，两药联合可增强对肿瘤生长的抑制作用。
试验例5(澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌转移作用)
常规培养大肠癌CT26细胞，计数后，调细胞浓度为3×107个/ml，予以每只BALB/c裸小鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，随机分组：对照组、澳洲茄胺组、大黄素组、澳洲茄胺 +大黄素组，每组10只；分别给予灭菌水(含等体积DMSO)、澳洲茄胺(1mg/0.2ml)或/ 和大黄素(1mg/0.2ml)治疗，每天灌胃一次；治疗15天后处死小鼠，取肺称重、计数肺表面转移结节，-80℃保存肺组织备用。
实验结果如图5所示，澳洲茄胺和大黄素可抑制大肠癌转移，两药联合可增强对大肠癌转移的抑制作用。
试验例6(澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌LOX表达作用)
Western blot检测蛋白表达。常规培养大肠癌CT26细胞，计数后，调细胞浓度为3×107个/ml，予以每只BALB/c裸小鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，随机分组：对照组、澳洲茄胺组、大黄素组、澳洲茄胺+大黄素组，每组10只；分别给予灭菌水(含等体积DMSO)、澳洲茄胺(1mg/0.2ml)或/和大黄素(1mg/0.2ml)治疗，每天灌胃一次；治疗15天后处死小鼠，取肺,RIPA裂解液裂解蛋白，BCA试剂盒定量，蛋白在100℃沸水中煮沸5min变性，在10％的凝胶中电泳；半干法转印蛋白至PVDF膜，200mA恒流转膜60min，放入5％脱脂奶粉室温封闭2h，与LOX抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜，洗3次每次5min，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，TBST洗膜，每次5min洗3次，化学发光检测试剂ECL反应2min，保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用x胶片感光、显影、定影，分析蛋白表达。
免疫组化法检测蛋白表达。常规培养大肠癌CT26细胞，计数后，调细胞浓度为3×107个/ml，予以每只BALB/c裸小鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，随机分组：对照组、澳洲茄胺组、大黄素组、澳洲茄胺+大黄素组，每组10只；分别给予灭菌水(含等体积DMSO)、澳洲茄胺(1mg/0.2ml)或/和大黄素(1mg/0.2ml)治疗，每天灌胃一次；治疗15天后处死小鼠，取肺,石蜡包埋肺组织，4μm切片，置于烘箱中60℃1h，柠檬酸钠抗原修复液，煮沸热修复4.3％H2O2孵育15min，血清封闭，LOX抗体4℃孵育过夜，PBS冲洗3次，二抗37℃孵育30min，二氨基联苯胺(Diaminobenzidine，DAB)为底物显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，水洗，梯度酒精脱水，树脂封片，显微镜下观察、拍照，用Image Pro 6.0软件分析蛋白表达。
实验结果如图6所示，澳洲茄胺和大黄素可抑制大肠癌LOX表达，两药联合可增强对 LOX表达的抑制作用。
试验例7(澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌FAK和Src表达与磷酸化作用)
Western blot检测蛋白表达。常规培养大肠癌CT26细胞，计数后，调细胞浓度为3×107个/ml，予以每只BALB/c裸小鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，随机分组：对照组、澳洲茄胺组、大黄素组、澳洲茄胺+大黄素组，每组10只；分别给予灭菌水(含等体积DMSO)、澳洲茄胺(1mg/0.2ml)或/和大黄素(1mg/0.2ml)治疗，每天灌胃一次；治疗15天后处死小鼠，取肺,RIPA裂解液裂解蛋白，BCA试剂盒定量，蛋白在100℃沸水中煮沸5min变性，蛋白在8-10％的凝胶中电泳；半干法转印蛋白至PVDF膜，200mA恒流转膜60min，放入5％脱脂奶粉室温封闭2h，与特异一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，洗3次每次5min，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，TBST洗膜，每次5min洗3次，化学发光检测试剂 ECL反应2min，保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用x胶片感光、显影、定影，分析蛋白表达和磷酸化。
实验结果如图7所示，澳洲茄胺和大黄素可抑制大肠癌FAK和Src磷酸化，两药联合可增强对FAK和Src磷酸化的抑制作用。
试验例8(澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌HIF-1α和VEGFA表达作用)
Western blot检测蛋白表达。常规培养大肠癌CT26细胞，计数后，调细胞浓度为3×107个/ml，予以每只BALB/c裸小鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，随机分组：对照组、澳洲茄胺组、大黄素组、澳洲茄胺+大黄素组，每组10只；分别给予灭菌水(含等体积DMSO)、澳洲茄胺(1mg/0.2ml)或/和大黄素(1mg/0.2ml)治疗，每天灌胃一次；治疗15天后处死小鼠，取肺,RIPA裂解液裂解蛋白，BCA试剂盒定量，蛋白在100℃沸水中煮沸5min变性，蛋白在8-10％的凝胶中电泳；半干法转印蛋白至PVDF膜，200mA恒流转膜60min，放入5％脱脂奶粉室温封闭2h，与HIF-1α或VEGFA抗体4℃孵育过夜，TBST洗膜，洗3次每次5min，辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h，TBST洗膜，每次5min洗3次，化学发光检测试剂ECL反应2min，保鲜膜包好PVDF膜，暗室中用x胶片感光、显影、定影。
实验结果如图8所示，澳洲茄胺和大黄素可抑制HIF-1α和VEGFA表达，两药联合可增强对HIF-1α和VEGFA表达的抑制作用。
试验例9(澳洲茄胺和大黄素对CT26大肠癌血管生成作用)
以CD31为标志蛋白，免疫组化检测血管生成。常规培养大肠癌CT26细胞，计数后，调细胞浓度为3×107个/ml，予以每只BALB/c裸小鼠皮下注射0.1ml细胞悬液，随机分组：对照组、澳洲茄胺组、大黄素组、澳洲茄胺+大黄素组，每组10只；分别给予灭菌水(含等体积DMSO)、澳洲茄胺(1mg/0.2ml)或/和大黄素(1mg/0.2ml)治疗，每天灌胃一次；治疗15天后处死小鼠，取肺,石蜡包埋肺组织,4μm切片，置于烘箱中60℃1h，柠檬酸钠抗原修复液，煮沸热修复4.3％H2O2孵育15min，血清封闭，CD31抗体4℃孵育过夜， PBS冲洗3次，二抗37℃孵育30min，DAB显色，苏木素复染，盐酸酒精分化，水洗，梯度酒精脱水，树脂封片，显微镜下观察、拍照，用Image Pro 6.0软件分析血管生成。
实验结果如图9所示，澳洲茄胺和大黄素可抑制抑制大肠癌血管生成，两药联合可增强对大肠癌血管生成的抑制作用。
实施例1(颗粒剂的制备)
称取澳洲茄胺10g、大黄素11g，加入适当辅料，制粒，整粒，成颗粒剂。
实施例2(胶囊剂的制备)
称取澳洲茄胺12g、大黄素10g，加入适当辅料，制粒，整粒，装入胶囊，制成。
实施例3(片剂的制备)
称取澳洲茄胺8g、大黄素15g，加入适当辅料，压片，包衣，即得。
实施例4(丸剂的制备)
称取澳洲茄胺16g、大黄素18g，加入适当辅料，制丸，即得。
实施例5(口服液的制备)
称取澳洲茄胺6g、大黄素9g，加入适当辅料，制成口服液。
实施例6(注射剂的制备)
称取澳洲茄胺8g、大黄素5g，加水溶解，加入适当辅料，粗滤，精滤，灌装，熔封，制成注射剂。
此外，本发明所述的药物组合物还可按常规方法制成汤剂、酒剂、散剂、膏剂等药学上可接受的剂型。
Claims (8)
1.一种治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于，其活性组分为澳洲茄胺和大黄素。
2.根据权利要求1所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于，活性组分的重量百分比分别为澳洲茄胺5-95％、大黄素5-95％。
3.根据权利要求1所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于，活性组分的重量百分比分别为澳洲茄胺10-90％、大黄素10-90％。
4.根据权利要求1所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于，活性组分的用量分别为澳洲茄胺8-48μM、大黄素10-320μM。
5.根据权利要求1所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于，活性组分的用量分别为澳洲茄胺1mg/0.2ml、大黄素1mg/0.2ml。
6.如权利要求1-5中任何一项所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于，其与药学上可接受的载体或辅料混合，制备成制剂。
7.如权利要求6所述的治疗大肠癌的药物组合物，其特征在于，所述制剂为颗粒剂、片剂、胶囊剂、丸剂、口服液或注射液。
8.权利要求1-7中任何一项所述的药物组合物在制备防治大肠癌的药物中的用途。
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