CN115768873A - 用于生物合成乳制品的活细胞构建体、及其相关产品和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体、组合物以及制备活细胞构建体以在培养中生产乳汁的方法、在培养中生产乳汁的方法、和用于本发明的活细胞构建体及其他方法的经过修饰的原代乳腺细胞或永生化乳腺上皮细胞的制备方法，其中该组合物包括由活细胞构建体生产的乳制品。

Description

用于生物合成乳制品的活细胞构建体、及其相关产品和方法
技术领域
本发明涉及活细胞构建体，及使用该活细胞构建体以在体外和/或间接体外从培养的乳腺细胞中生产乳汁的方法。
背景技术
乳汁是婴儿时期和整个生命中人类的主要饮食。美国儿科学会(AmericanAcademy of Pediatrics)和世界卫生组织(World Health Organization)建议，婴儿出生后的6个月应当完全母乳喂养，婴儿之后食用的乳制品是人类营养的主要来源，这代表着全球7000亿美元的产业。然而，哺乳是一个生理需求和代谢密集的过程，这可能会给哺乳的母亲带来生物学和实践上的挑战，而在农业环境下，乳制品与环境、社会、和动物保护相关。
近年来，利用哺乳动物细胞培养来生产食物的可能性获得了越来越多的兴趣，通过培养肌肉和脂肪细胞成功开发出几种肉类食品和海洋食品的原型(Stephens等人，2018年，食品科技的趋势(Trends Food Sci Technol)，78:155-166)。此外，正在努力利用微生物表达系统使鸡蛋和乳蛋白的生产商业化。然而，这种以发酵为基础的方法依赖于单个成分的基因工程表达和纯化，且无法重现乳汁或乳制品的完整分子图谱。
本发明通过提供活细胞构建体及使用该活细胞构建体来以在体外和/或间接体外从培养的乳腺细胞中生产乳汁的方法，克服现有技术的缺陷。
发明内容
本发明在一定程度上基于包括乳腺细胞的活细胞构建体的发展，活细胞构建体划分为细胞营养摄取和乳汁分泌。
因此，本发明的一个方面涉及活细胞构建体，其包括具有上表面和下表面的支架，以及在支架上表面的(a)活的原代乳腺上皮细胞、(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体、和/或(c)活的永生化的乳腺上皮细胞的连续单层；(a)活的原代乳腺上皮细胞、(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体、和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层具有顶面和底面(例如，这些细胞形成极化且汇合的细胞单层)，其中该构建体包括顶隔室和底隔室，顶隔室位于(a)活的原代乳腺上皮细胞、(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体、和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层的顶面之上并与其相邻，底隔室位于支架的下表面之下并与其相邻。
本发明的另一个方面提供一种在培养中生产乳汁的方法，该方法包括培养本发明的活细胞构建体，从而在培养中生产乳汁。
本发明的另一个方面提供一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括(a)从乳腺组织的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)在支架上培育(b)中的混合群体，支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面之上生产混合群体的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的极化且连续(即汇合)单层，其中极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
本发明的另一方面涉及一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括：a)从乳腺组织(例如胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)对原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞群体；以及(d)在支架上培育原代乳腺上皮细胞群体，该支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上生产原代乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
本发明的另一方面涉及一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括：(a)培养永生化的乳腺上皮细胞，来生产更多的永生化的乳腺上皮细胞；(b)在支架上培育(a)中的永生化的乳腺上皮细胞，该支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上生产永生化的乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中该极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
本发明的另一方面涉及一种在培养中生产乳汁的方法，包括培养活细胞构建体，该活细胞构建体包括(a)支架，该支架包括上表面、下表面以及活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)且极化的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续且极化的单层，和/或活的永生化的乳腺上皮细胞的连续且极化的单层，活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)且极化的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续且极化的单层，和/或活的永生化的乳腺上皮细胞的连续且极化的单层具有顶面和底面，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续且极化的单层、由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续且极化的单层，和/或活的永生化的乳腺上皮细胞的连续且极化的单层位于支架的上表面；(b)顶隔室和底隔室，其中，支架的下表面紧邻底隔室，并且活的原代乳腺上皮细胞单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的单层和/或活的永生化的乳腺上皮细胞的单层的顶面紧邻顶隔室，其中活的原代乳腺上皮细胞的单层，活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体的单层或永生化的乳腺上皮细胞的单层的活的原代乳腺上皮细胞通过其顶面分泌乳汁到顶隔室，从而在培养中生产乳汁。
本发明的另一个方面涉及一种生产经过修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的方法，其中，该方法包括向细胞引入：(a)编码催乳素受体的多核苷酸，该多核苷酸包括经过修饰的胞内信号域，可选择地，其中催乳素受体包括截断片段，其中第10外显子在第154位拼接至第11外显子的3’序列上；(b)编码与配体连接的嵌合催乳素受体的多核苷酸，其能够在没有催乳素的情况下激活乳汁合成；(c)编码组成性激活或条件性激活的催乳素受体蛋白的多核苷酸，可选择地，其中该多核苷酸编码组成性激活的人催乳素受体蛋白，该受体蛋白缺失氨基酸第9-187；(d)编码经过修饰(重组)的催乳素蛋白效应物的多核苷酸，其包括(i)融合至STAT5酪氨酸激酶域的JAK2酪氨酸激酶域；和/或(ii)融合至JAK2酪氨酸激酶域的催乳素受体胞内域；(e)引入昼夜节律相关的基因PER2(周期昼夜节律蛋白同源物2)的功能缺失突变；和/或(f)编码一种或多种葡萄糖转运基因GLUT1和/或GLUT12的多核苷酸，从而在经过修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的细胞的单层的底面增加营养吸收的速率。
本发明的另一方面涉及包含由本文中所述活细胞构建体生产的生物合成乳制品的组合物和由本文所述方法生产的生物合成乳制品的组合物。
本发明在一定程度上基于培养在中空纤维生物反应器中的原代的人乳腺上皮细胞(HUMECs)成功生产生物合成的人乳制品。
因此，本发明的另一方面涉及活细胞构建体，其包括泌乳原代的人乳腺上皮细胞(HMECs)，在定义有毛细管内(IC)空间和毛细管外(EC)空间的管状筒内，以平行阵列布置的多个中空毛细管上形成连续的单层，每个中空毛细管由半渗透膜制造，该半透膜限定了与IC空间相邻的内表面和与EC空间相邻的外表面，其中每个中空毛细管的外表面涂覆有IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的混合物，HUMEC单层与涂覆的表面接触；并且其中添加有催乳素的细胞生长培养基填充IC空间。在实施例中，半渗透膜由聚偏二氟乙烯(PVDF)或聚砜制备而成，和/或半渗透膜的截留分子量(MWCO)在5-80千道尔顿(kDa)之间。
本发明的另一个方面涉及包括生物合成人乳制品的组合物，该生物合成人乳制品由活细胞构建体生产，且该活细胞构建体包括多个中空毛细管。
另一方面，本发明涉及生物合成的人乳组合物，其包括脂类成分、蛋白质成分和碳水化合物成分，其中脂类成分、蛋白质成分和碳水化合物成分分别由人脂类、人蛋白质或多肽、和人碳水化合物组成，并且该组合物不包含致病菌、细胞毒素和转基因分子或基因工程分子。在本文中，“人”成分指由人体细胞生产并自然形成在人体中的脂类、蛋白质、和碳水化合物。在一方面，组合物不包含的病原体包括细菌、病毒和真菌。在一方面，组合物没有进行巴氏杀菌。在一方面，脂类成分包括1％-5％的组合物；蛋白质成分包括0.5％-1％的组合物；并且碳水化合物成分包括6％-8％的组合物。在一方面，脂类成分包括棕榈酸、油酸和一种或多种生物活性的脂肪酸脂类介质。在一方面，一种或多种生物活性的脂肪酸脂类介质是抗炎化合物。在一方面，一种或多种生物活性的脂肪酸脂类介质选自由环氧十八碳烯酸(EpOME)；环氧二十碳三烯酸(EpETrE)；环氧二十碳四烯酸(EpETE)；环氧二十二碳五烯酸(EpDPE)；二羟基十八碳烯酸(DiHOME)；二羟基二十碳三烯酸(DiHETrE)；二羟基二十碳四烯酸(DiHETE)；羟基十八碳二烯酸(HODE)；羟基二十碳三烯酸(HETrE)；羟基二十碳四烯酸(HETE)；羟基十八碳三烯酸(HOTrE)；羟基二十碳五烯酸(HEPE)；羟基二十二碳六烯酸(HdoHE)；以及白三烯所构成的组。在一方面，蛋白质成分包括一种或多种选自由α-乳清蛋白、胆盐激活脂肪酶(BSAL)、嗜乳脂蛋白、酪蛋白、脂肪酸合成酶、胰岛素、乳凝集素、乳铁蛋白、乳转铁蛋白、溶菌酶、粘蛋白-1、骨桥蛋白、围脂滴蛋白-2、血清白蛋白、黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶所构成的组的蛋白质或多肽。在一方面，蛋白质成分包括BSAL、溶菌酶、和乳铁蛋白。在一方面，碳水化合物成分包括乳糖、2’-墨角藻糖基乳糖、肌醇、乳糖-N-新四糖(LNnT)、6’-唾液乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖、I型乳糖-N-岩藻五糖(LNFP)、II型乳糖-N-岩藻五糖(LNFP)、和二唾液-乳糖-N-四糖的一种或多种。
在另一方面中，本发明涉及制备生物合成乳制品的方法，该方法包括在包含IV型胶原蛋白的底物上的生长培养基中扩增人乳腺上皮细胞(HUMECs)的群体；将扩增的HUMECs群体从底物中移出，并将移出的HUMECs接种在中空纤维生物反应器中，该中空纤维生物反应器包含预涂有IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的混合物的毛细管；培养HUMECs一段时间，直到HUMECs汇合；以及通过将所述HUMECs与催乳素接触来刺激生物合成乳制品的生产，将所述HUMECs与催乳素接触所使用的方法包括用100ng/ml催乳素接触细胞一段时间，接着200ng/ml催乳素接触细胞第二段时间。在一方面，HUMECs选自原代细胞、原代永生细胞、或重组细胞。在一方面，该方法还包括步骤：在接种HUMECs之前制备生物反应器，其中制备生物反应器包括在生物反应器内创造负压，并将磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的1:1混合物涂覆于中空纤维。在一个方面，涂覆IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的混合物是使用插入生物反应器端口的注射器完成的。
本发明的这些或其他方面在下文对本发明的描述中进行了更详细的阐述。
附图说明
图1显示了从分隔培养装置中生长为汇合单层的乳腺上皮细胞中收集用于营养用途的乳汁的实例，在该分隔培养装置中，将新鲜或回收的培养基提供给底隔室，并从顶隔室收集乳汁。TEER,跨膜电阻。
图2A-B的附图A显示了极化吸收营养物和穿过底面固定在支架上的乳腺上皮细胞的汇合单层分泌乳汁的实例；附图B显示微影图案化支架提供增加的表面积用于乳腺上皮细胞汇合单层分开吸收营养物和分泌乳汁的实例。
图3A-C显示中空纤维生物反应器的三视图，该三视图包括一束毛细管(A)，每个毛细管具有外表面和内表面，每个表面限定第一内腔室(毛细管内空间，或IC)和第二外腔室(毛细管外空间，或EC)。乳腺上皮细胞可在毛细管的外表面(B)或内表面(C)上形成汇合单层，提供定向且分区的营养物质吸收以及乳汁分泌。
图4显示在中空纤维生物反应器中培养的HUMECs在接种到实施例2所述的生物反应器中之后，随着时间的推移，对葡萄糖的利用(mg/天)。箭头表示在第11天(100ng/ml)、第26天(200ng/ml)、第32天(100ng/ml)添加催乳素。
图5显示在实施例2所述的中空纤维生物反应器中培养的HMECS的催乳素刺激导致分泌蛋白质的急剧增加。图表显示生物反应器接种后的一段时间(天)内添加的催乳素(100ng/ml或200ng/ml)以及在同样的时间周期内的总分泌性蛋白质。
图6A-C显示在实施例2所述的中空纤维生物反应器中培养的HMECs随着时间(天)推移而产生的乳糖(A)和2’-墨角藻糖基乳糖(B)(微摩尔，μM)。图表还显示添加催乳素的时间和量，如箭头指示,从第11天开始添加100ng/ml；从第26天开始添加200ng/ml；从第32天开始添加100ng/ml。图6C显示在HMEC培养基(从底线1)、ECS捕获(线2)、存储库(线3)、以及人乳(线4)中乳糖和2’-墨角藻糖基乳糖的一些特征峰的核磁共振(NMR)谱。前三个核磁共振谱比例相同，人乳核磁共振图谱进行了缩小以供展示。
图7显示在实施例2所述的中空纤维生物反应器中培养的HMECs随着时间(天)推移而生产的酪蛋白。从左起，第1通道包括分子量标识，第2通道包括人乳，第3-7通道包括在生物反应器接种后的第22、25、26、27和29天从ECM捕获分离的蛋白质。
图8显示考马斯染色的SDS-PAGE凝胶图像，示出了与人乳中存在的蛋白质相比，在实施例2中所述的中空纤维生物反应器中培养的HMECs生产的蛋白质。从左起，第1-4通道和第5-8通道分别包含在生物反应器接种后的第31、32、33、36天从存储库和ECM捕获中分离的蛋白质。
图9显示从实施例2中所示的中空纤维生物反应器中培养的HUMECS中捕获的蛋白质。
图10显示实施例2中生产的生物合成乳制品的样品的HPLC色谱图。图中标注了与一些重要乳蛋白的相对应的峰。全样本光谱显示为浅灰色。深色线表示分离出的蛋白质分布。
具体实施方式
下面将更详细地说明本发明。本文不意图成为本发明可能实现的所有不同方式的详细目录，也不打算成为可能添加到当前发明中的所有特征的详细目录。例如，可以将相对于一个实施例而说明的特征合并到其他实施例中，并且可以从那个实施例中删除相对于特定实施例而说明的特征。此外，对本领域技术人员而言，根据不背离当前发明的当前披露，本文所建议的各种实施例的许多变化和添加是显而易见的。因此，下面的描述旨在说明本发明的一些特定实施例，而不是详尽地说明其所有排列、组合和变化。
除非上下文另有指示，具体来说，本文所述的本发明的各种特征可以用于任何组合。此外，本发明还考虑在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。举例来说，如果说明书描述了复合物包括A、B和C，那么具体来说，A、B或C中的任何一个，或它们的组合，都可以单独地或组合地被省略和否认。
除非另有定义，本文中所使用的所有技术术语和科学术语与本发明所属的本领域普通技术人员的一般理解具有相同的含义。在本文中，本发明说明书中所使用的专用术语的目的是仅仅用于描述特定的实施例并非意图限制本发明。
除非另有特别说明，否则本文中仅以从左至右为5’至3’方向的单链呈现核苷酸序列。本文中核苷酸和氨基酸按照IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUB BiochemicalNomenclature Commission)推荐的方式表示，或者(对于氨基酸)按照37C.F.R.§1.822和惯用法使用单字母编码或三字母编码表示。
除非另有指示，可以使用本领域技术人员已知的标准方法来生产重组合成的多肽、抗体或其抗原结合片段，处理核苷酸序列，生产转化细胞，构建病毒载体构建体，瞬时转染和稳定转染包装细胞。这些技术都是本领域技术人员已知的。参见：例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual 2nd ED(Cold Spring Harbor,NY,1989)；F.M.Ausubel等人.Current Protocols In Molecular Biology(Green PublishingAssociates,Inc.and John Wiley&Sons,Inc.,New York)。
本文中提到的所有出版物、专利申请、专利、核苷酸序列、氨基酸序列及其他参考文献均通过引入全面地并入，用于教导该参考文献所呈现的相关句子和/或段落。
定义
除非上下文另有明确指示，否则如本发明的说明书和所附的权利要求书中使用的，单数形式“个”、“一个”和“该”意图也包括复数形式。
如本文中所使用的，“和/或”涉及并包含一个或多个相关列出项目的任一个和所有可能的组合，在理解为替代(“或”)时缺乏组合。
此外，本发明还考虑在本发明的一些实施例中，可以排除或省略本文所述的任何特征或特征的组合。
此外，当涉及测量值，如本发明的化合物或制剂的数量、剂量、时间、温度等，本文中使用的术语“约”意味着并包括定量的±10％、±5％、±1％、±0.5％甚至±0.1％的变化。
如本文中所使用的，过渡短语“主要由……组成”应被解释为包括所述材料或步骤以及那些对所要求的发明的基本和新特性没有实质性影响的材料或步骤。因此，这里使用的术语“主要由……组成”一词不应被解释为等同于“由……组成”。
除非另有说明，如本文中所使用的，术语“多肽”包括多肽和蛋白质。在本文所述的生物合成人乳制品的上下文中，术语“蛋白质成分”包括多肽、胜肽和蛋白质。
如适用于本发明的多核苷酸和/或多肽，术语“实质性改变”(或语法上的等效物，例如“经修饰的”)指的是多核苷酸和/或多肽的成分和/或基因组位点从原生形式被人为故意干预而发生实质性改变。
如本文中所使用的，通过“分离”(或语法上的等效物，如“提取”)产品，意味着该产品至少部分地从起始材料中的至少一些其他成分中分离。
通过“实质保留”性质，是指至少保留约75％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％的性质(例如，活性或其他测量的特性)。
本文中使用的针对细胞和/或细胞单层的术语“极化的”指的是细胞的空间状态，其中有两个不同的细胞表面，例如顶面和底面，它们可能不同(例如可能包括不同的表面和/或跨膜受体和/或其他结构)。在连续的单层中的单个极化细胞可能具有类似取向的顶面和底面，并且可能在单个细胞之间具有交流结构(例如紧密的连接)，从而允许单个细胞之间的相互交流，并产生顶隔室(例如，在顶面上方且与其相邻的内腔)和底隔室(例如，在底面下方且与其相邻的内腔)的分隔(区室化)。
如本文中所使用的，术语“催乳的”是指刺激乳汁生产和/或分泌的能力。催乳的产品可能是基因、蛋白质(如催乳素)或其他天然产品和/或合成产品。包含催乳特性的培养基(例如，含有催乳素，从而刺激与该培养基接触的细胞产生乳汁)可称为“催乳的培养基”。
如本文中所使用的，术语“食品级”指的是被认为无毒和安全的食用材料(例如，人和/或其他动物食用)，例如，根据美国食品和药物管理局制定的标准所规定的材料。
如本文中所使用的，术语“转基因分子或基因工程分子”包括由重组技术产生的分子。
如本文中所使用的，“生物合成奶”的上下文中的术语“生物合成”是指由体外培养的细胞分泌的乳制品或组合物，不包括含有哺乳动物在体内生产的乳汁的乳制品或组合物，哺乳动物在体内生产的乳汁包括人类供体乳汁和人类母亲的乳汁。
活细胞构建体
本发明涉及活细胞构建体，制造该活细胞构建体的方法以及使用该活细胞构建体以在体外和/或间接体外从培养的乳腺细胞中生产乳汁的方法。乳汁是一种复杂的大分子分泌物，由乳腺内腔上皮细胞产生的蛋白质、脂类和碳水化合物组成。已在先前被证实，培养的乳腺上皮细胞显示的组织和行为与体内观察到的那些相似(Arevalo等人，2016Am JPhysiol Cell Physiol.310(5):C348-356；Chen等。2019Curr Protoc Cell Biol.82(1):e65)。特别是，当在合适的细胞外基质上生长并受到催乳素刺激时，培养的乳腺上皮细胞会组织成极化结构并分泌乳汁成分(Blatchford等人1999Animal Cell Technology:Basic&Applied Aspects 10:141-145)。然而，由于之前的研究集中在基础研究和生物医学研究上，体外生产的乳汁的营养应用尚未探索，也没有尝试从培养细胞的培养基中单独收集乳汁。
因此，本发明的一个方面涉及活细胞构建体，其包括具有上表面和下表面的支架；以及在支架上表面的(a)活的原代乳腺上皮细胞、(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体、和/或(c)活的永生化的乳腺上皮细胞的连续单层；该(a)活的原代乳腺上皮细胞、(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体、和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层具有顶面和底面(例如这些细胞形成极化且汇合的细胞单层)，其中该构建体包括顶隔室和底隔室，顶隔室位于(a)活的原代乳腺上皮细胞、(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体、和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层的顶面之上并与其相邻，底隔室位于支架的下表面之下并与其相邻。
乳腺组织的活的原代培养可能包括生产乳汁的乳腺上皮细胞、收缩肌上皮细胞和/或可同时产生乳腺上皮细胞和乳腺收缩肌上皮细胞的祖细胞。乳腺上皮细胞是唯一生产乳汁的细胞。活的原代乳腺上皮细胞,由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体,和/或永生化的乳腺上皮细胞可以来自任何哺乳动物,例如,灵长类动物(如黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩、猴(例如,旧大陆、新大陆)、狐猴、人类)、狗、猫、兔子、小鼠、老鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、牛(例如,牛属(Bos spp.))、猪、鹿、麝、牛科动物、鲸鱼、海豚、河马、大象、犀牛、长颈鹿、斑马、狮子、猎豹、老虎、熊猫、小熊猫和水獭。在一些实施例中，活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体和/或永生化的乳腺上皮细胞可能来自濒危物种，例如，濒危哺乳动物。在一些实施例中，活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体和/或永生化的乳腺上皮细胞可能来自人类。在一些实施例中，活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体和/或永生化的乳腺上皮细胞可能来自牛科动物(例如，奶牛)。
在一些实施例中，由原代乳腺上皮细胞(例如，来自分离的活的原代乳腺上皮细胞的原代乳腺上皮细胞，和/或来自活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞组成的混合群体的原代乳腺上皮细胞)或永生化的乳腺上皮细胞生产的乳汁可通过细胞的顶面分泌到顶隔室中。
在一些实施例中，底隔室可以包括基本培养基，该基本培养基可以与活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体和/或永生化的乳腺上皮细胞的底面接触。
在一些实施例中，本发明的基本培养基可包括碳源、化学缓冲系统、一种或多种必需氨基酸、一种或多种维生素和/或辅助因子以及一种或多种无机盐。
在一些实施例中,基本培养基可能包含碳源，且碳源的量约为1g/L至约15g/L的基本培养基(例如，约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L或其中任何值或范围),或者约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L或6g/L到7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L的基本培养基。碳源的非限制性实例包括葡萄糖和/或丙酮酸盐。例如，在一些实施例中，基本培养基可包括葡萄糖，且葡萄糖的量约为1g/L至约12g/L的基本培养基，例如约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、或12g/L或其中的任何值或范围的基本培养基。在一些实例中，基本培养基中可能含有葡萄糖，且葡萄糖的量约为1g/L至6g/L，约为4g/L至12g/L，约为2.5g/L至10.5g/L，约为1.5g/L至11.5g/L，或约为2g/L至10g/L的基本培养基。在一些实例中，基本培养基可包括葡萄糖，且葡萄糖的量从约1g/L、2g/L、3g/L或4g/L到约5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L或12g/L，或从约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、或6g/L到约7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L或12g/L。在一些实例中，基本培养基可包括丙酮酸盐，且丙酮酸盐的量约为5g/L到约15g/L的基本培养基，例如，约5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L或其中的任何值或范围。在一些实例中，基本培养基中丙酮酸盐的量约为5g/L至约14.5g/L，约为10g/L至约15g/L，约为7.5g/L至约10.5g/L，约为5.5g/L至约14.5g/L，或约为8g/L至约10g/L的基本培养基。在一些实例中，基本培养基可能包含丙酮酸盐，且丙酮酸盐的量从约5g/L、6g/L、7g/L或8g/L到约9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L，或从约5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L或10g/L到约11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L。
在一些实施例中，基本培养基可包括化学缓冲系统，且化学缓冲系统的量约为1g/L至约4g/L的基本培养基(例如，约1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L或4g/L或其中的任何值或范围)，或约10mM到约25mM的基本培养基(例如，约10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM或25mM或其中的任何值或范围)。在一些实施例中，化学缓冲系统可以包括但不限于碳酸氢钠和/或4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙基磺酸(HEPES)。例如，在一些实施例中，基本培养基可包括碳酸氢钠，且碳酸氢钠的量约为1g/L至约4g/L的基本培养基，例如，约为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L或4g/L或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基中可能包括碳酸氢钠且碳酸氢钠的量约为1g/L至约3.75g/L，约为1.25g/L至约为4g/L，约为2.5g/L至约3g/L，约为1.5g/L至约4g/L，或约为2g/L至约3.5g/L的基本培养基。在一些实施例中，基本培养基可包括约10mM至约25mM的HEPES，例如，约10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM或25mM或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可包括HEPES，其含量约为11mM至约25mM，约10mM至约20mM，约12.5mM至约22.5mM，约15mM至约20.75mM，或约10mM至约20mM。
在一些实施例中，基本培养基可包括一种或多种必需氨基酸，其含量约为0.5mM至约5mM(例如，约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM或其中的任何值或范围)，或约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM至约2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。在一些实施例中，一种或多种必须氨基酸可能是，例如精氨酸和/或半胱氨酸。例如，在一些实施例中，基本培养基可能包括精氨酸，其含量约为0.5mM至约5mM，例如约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可包括精氨酸，其含量为约0.5mM至约4.75mM，约2mM至约3.5mM，约0.5mM至约3.5mM，约1mM至约5mM，约3.5mM至约5mM。例如，在一些实施例中，基本培养基可包括半胱氨酸，其含量为约0.5mM至约5mM，例如约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括半胱氨酸，其含量为约0.5mM至约4.75mM，约2mM至约3.5mM，约0.5mM至约3.5mM，约1mM至约5mM，约3.5mM至约5mM。
在一些实施例中，基本培养基可能包括一种或多种维生素和/或辅助因子，且一种或多种维生素和/或辅助因子的含量为约0.01μM至约50μM(例如，约0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、46μM、47μM、48μM、49μM、49.025μM、49.05μM、49.075μM、或50μM，或其中的任何值或范围)，或从约0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、或0.9μM至约1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、3μM、4μM、5μM、6μM，或从约0.02μM、0.025μM、0.05μM、0.075μM、1μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM至约12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、46μM、47μM、48μM、49μM、49.025μM、49.05μM、49.075μM、或50μM。在一些实施例中，一种或多种维生素和/或辅助因子可包括但并不限于硫胺素和/或核黄素。例如，在一些实施例中，基本培养基可能包括硫胺素，其含量为约0.025μM至约50μM，例如约0.025μM、0.05μM、0.075μM、1μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、46μM、47μM、48μM、49μM、49.025μM、49.05μM、49.075μM、或50μM，或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括硫胺素，其含量为约0.025μM至约45.075μM，约1μM至约40μM，约5μM至约35.075μM，约10μM至约50μM，约0.05μM至约45.5μM.在一些实施例中，基本培养基可能包括核黄素，其含量为约0.01μM至约3μM，例如约0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、或3μM，或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括核黄素，其含量为约0.01μM至约2.05μM，约1μM至约2.95μM，约0.05μM至约3μM，约0.08μM至约1.55μM，约0.05μM至约2.9μM。
在一些实施例中，基本培养基可能包括一种或多种无机盐，其含量约为100mg/L至约150mg/L的基本培养基(例如，约100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L、或150mg/L，或其中的任何值或范围)，或约为100mg/L至约150mg/L(例如，约100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L、或150mg/L，或其中的任何值或范围)的基本培养基。在一些实施例中，一种或多种无机盐可能包括但并不限于钙和/或镁。例如，在一些实施例中，基本培养基可能包括钙，其含量约为100mg/L至约150mg/L的基本培养基，例如，约100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L、或150mg/L，或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括精氨酸，其含量为从约100mg/L至约125mg/L，从约105mg/L至约150mg/L，从约120mg/L至约130mg/L，或从约100mg/L至约145mg/L的基本培养基。在一些实施例中，基本培养基可能包括镁，其含量为约0.01mM至约1mM，例如,约0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、0.91mM、0.92mM、0.93mM、0.94mM、0.95mM、0.96mM、0.97mM、0.98mM、0.99mM、或1mM，或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括镁，其含量为约从0.05mM至约1mM，从约0.01mM至约0.78mM，从约0.5mM至约1mM，或从约0.03mM至约0.75mM，或从约0.25mM至约0.95mM。
在一些实施例中，碳源、化学缓冲系统、一种或多种必需氨基酸、一种或多种维生素和/或辅助因子和/或一种或多种无机盐可以是食品级的。在一些实施例中，基本培养基可以是催乳培养基，例如，基本培养基可以进一步包括催乳素(例如，哺乳动物催乳素，例如，人催乳素)。例如，在一些实施例中，基本培养基可包含催乳素(或可添加催乳素)，其含量约为20ng/mL至约200ng/mL的基本培养基，例如，约20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL，或其中的任意值或范围。在一些实施例中，基本培养基中可能含有催乳素(或可添加催乳素)，其含量约为20ng/mL至195ng/mL，约50ng/mL至150ng/mL，约25ng/mL至175ng/mL，约45ng/mL至200ng/mL，或约75ng/mL至190ng/mL的基本培养基。在一些实施例中，基本培养基可能进一步包括其他因素以提高效率，包括但不限于胰岛素、表皮生长因子和/或氢化可的松。
在一些实施例中，本发明的支架可以制成二维表面、三维微图案化表面和/或可以组装成束的圆柱形结构。二维表面支架的非限性制实例包括Transwell过滤器。三维微图案化表面的非限制性实例包括微结构生物反应器、脱细胞组织(例如，脱细胞乳腺)和/或可以组装成束的圆柱形结构(例如，中空纤维生物反应器)。在一些实施例中，本发明的支架可以是多孔的。
在一些实施例中，支架的上表面可以包覆一种或多种细胞外基质蛋白。细胞外基质蛋白的非限制性实例包括胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白和/或纤维连接蛋白。在一些实施例中，支架可包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽和/或从其任何组合衍生的复合材料。在一些实施例中，对本发明有用的天然聚合物可能包括但不限于胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、海藻酸盐、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白和/或透明质酸。在一些实施例中，对本发明有用的生物相容性合成聚合物可以包括但不限于聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。
方法
本发明还提供了一种制备活细胞构建体的方法、在培养中生产乳汁的方法和/或生产经过修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的方法，例如，用于本发明。
因此，在一些实施例中，本发明提供了在培养中生产乳汁的方法，该方法包括培养本发明的活细胞构建体，从而在培养中生产乳汁。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括(a)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)在支架上培育(b)的混合群体，支架具有上表面和下表面，以在支架上表面之上生产混合群体的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中该极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括:(a)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；(c)对原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞的群体；以及(d)在支架上培育原代乳腺上皮细胞的群体，该支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面之上生产乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中该极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
在一些实施例中，本发明提供了一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括(a)培养永生化的乳腺上皮细胞，来生产更多的永生化的乳腺上皮细胞；(b)在支架上培育(a)中的永生化的乳腺上皮细胞，该支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面之上生产永生化的乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中该极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
在一些实施例中，乳腺组织可能来自哺乳动物的胸部组织、乳房组织和/或乳头组织。乳腺组织可能从任何哺乳动物,例如,灵长类动物(如黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩、猴(例如,旧大陆、新大陆)、狐猴、人类)、狗、猫、兔子、小鼠、老鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、牛(例如,牛属)、猪、鹿、麝、牛科动物、鲸鱼、海豚、河马、大象、犀牛、长颈鹿、斑马、狮子、猎豹、老虎、熊猫、小熊猫和水獭。在一些实施例中，乳腺组织可能来自濒危物种，例如，濒危哺乳动物。在一些实施例中，乳腺组织可能来自人类。在一些实施例中，乳腺组织可以来自牛科动物(例如，奶牛)。
在一些实施例中，培养和/或培育在约35℃至约39℃的温度下进行(如温度约为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃或约39℃，或其中的任何值或范围，如约35℃至约38℃、约36℃至约39℃、约36.5℃至约39℃、约36.5℃至约37.5℃、或约36.5℃至约38℃)。在一些实施例中，本发明的方法可以进一步包括所述培养在约37℃的温度下进行。
在一些实施例中，培养和/或培育是在大气中CO2浓度约为4％至约6％的情况下进行的，例如，大气中CO2浓度约为4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6％或其中的任何值或范围，例如，约为4％至约5.5％、约为4.5％至约6％、约为4.5％至约5.5％或约为5％至约6％)。在一些实施例中，本发明的方法可以进一步包括所述培养是在大气中CO2浓度约为5％的情况下进行。
在一些实施例中，培养和/或培育可能包括在约每天至约每10天进行更换的培养基中进行培养和/或培育，(例如,每1天,每2天,每3天,每4天,每5天,每6天,每7天,每8天,每9天,每10天,或其中的任何值或范围,例如,约每天至约每3天,约每3天至约每10天,约每2天至约每5天)。在一些实施例中,培养和/或培育可能进一步包括在约每天至约每隔几小时至约每10天进行更换的培养基中进行培养,例如,从约每1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、或24小时至约每1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天或其中任何值或范围。例如，在一些实施例中，培养和/或培育可进一步包括在约每12小时至约10天、约每10小时至约5天或约每5小时至约每3天进行更换的培养基中进行培养和/或培育。
在一些实施例中，通过本发明的方法制备的用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体的单层可与支架的上表面相邻。
在一些实施例中，通过本发明的方法制备的用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体可以进一步包括与单层的顶面相邻的顶隔室。
在一些实施例中，通过本发明的方法制备的用于在培养中生产乳汁的活活细胞构建体可以包括与支架的下表面相邻的底隔室。
在一些实施例中，在培养永生化乳腺上皮细胞之前，在本发明制备活细胞构建体以用于在培养中生产乳汁的方法可以进一步包括:(i)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；(ii)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体；(iii)对原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞组成的混合群体进行分类(例如，选择原代乳腺上皮细胞)，以生产原代乳腺上皮细胞的群体；以及(iv)用(1)一个或多个编码人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的核酸或猿猴病毒40(SV40)稳定地引入(例如，转到/转染)(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞或，或用小发卡RNA(shRNA)稳定地引入(例如，转染/转导)(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞至p16(细胞周期依赖性激酶抑制剂4)(p16(INK4))和细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c-MYC)，以生产永生化的乳腺上皮细胞。在一些实例中，永生化的细胞系可以被稳定地引入(例如，转染/转导)(1)一个或多个编码hTERT的核酸或SV40，和/或被稳定地引入(例如，转染/转导)(2)小发卡RNA(shRNA)到p16(细胞周期依赖性激酶抑制剂4)(p16(INK4))和细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c-MYC)。
在一些实施例中，一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法可以进一步包括在支架上培养之前，存储本发明的细胞或细胞群(例如，活的原代乳腺上皮细胞，由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或永生化乳腺上皮细胞)，可选择地，其中在冰箱或液氮中进行存储。储存温度可能取决于所需的存储时长。例如,如果细胞在6个月内(例如，在1、2、3、4、5或6个月内)使用，可使用冰箱温度，例如,存储的温度约为0℃到约-80℃或更低,例如,约0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃、或其中的任何值或范围。例如，对于长期存储(例如，存储6个月或更长，例如，6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月，或12个月，或1年、2年、3年、4年、5年、6年或更多年)，可以使用液氮(例如，存储在-100℃或更低的温度下(例如，约-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃、-200℃、或更低)。
在一些实施例中，一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法可以包括，其中分离和分类是通过荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选和/或微流控细胞分选进行。
在一些实施例中，本发明提供了一种在培养中生产乳汁的方法，其包括培养活细胞构建体，该活细胞构建体包括(a)支架，支架包括上表面和下表面，以及活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层，活的原代乳腺上皮细胞的连续极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层具有顶面和底面，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层位于支架的上表面之上；(b)底隔室和顶隔室，其中支架的下表面与底隔室相邻，并且活的原代乳腺上皮细胞的连续极化单层，由活的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层的顶面与顶隔室相邻，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层的活的原代乳腺细胞，和/或永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层，通过其顶面分泌乳汁到顶隔室，从而在培养中生产乳汁。
在一些实施例中，用于在培养中生产乳汁的方法的活细胞构建体的单层可以与支架的上表面相邻。
在一些实施例中，用于在培养中生产乳汁的方法的活细胞构建体可以进一步包括与所述单层的顶面相邻的顶隔室。
在一些实施例中，用于在培养中生产乳汁的方法的活细胞构建体可以包括与支架的下表面相邻的底隔室。
在一些实施例中，本发明的在培养中生产乳汁的方法可以进一步包括包含基本培养基的底隔室，基本培养基可以与原代乳腺上皮细胞的连续极化单层的底面接触，与混合群体的连续极化单层的底面接触，或与活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层的底面接触。基本培养基可包括碳源、化学缓冲系统、一种或多种必需氨基酸、一种或多种维生素和/或辅助因子以及一种或多种无机盐。
在一些实施例中,基本培养基可能包含碳源，且碳源的量为约1g/L至约15g/L的基本培养基(如约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L或其中任何值或范围),或者约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L或约6g/L到约7g/L、8g/L、9g/L、或10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L的基本培养基。在一些实施例中，碳源可以包括但不限于葡萄糖和/或丙酮酸盐。例如，在一些实施例中，基本培养基可包括葡萄糖，且葡萄糖的量约为1g/L至约12g/L的基本培养基，例如约1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、或12g/L或其中的任何值或范围。在一些实例中，基本培养基中可能含有葡萄糖，且葡萄糖的量约为1g/L至约6g/L，约为4g/L至约12g/L，约为2.5g/L至约10.5g/L，约为1.5g/L至约11.5g/L，或约为2g/L至约10g/L的基本培养基。在一些实施例中，基本培养基可包括丙酮酸盐，其含量约为5g/L至约15g/L的基本培养基，例如，约为5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L或15g/L或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可包括丙酮酸盐，且其含量约为5g/L至14.5g/L，约为10g/L至15g/L，约为7.5g/L至10.5g/L，约为5.5g/L至14.5g/L，或约为8g/L至10g/L的基本培养基。
在一些实施例中，基本培养基可包括化学缓冲系统，且化学缓冲系统的量约为1g/L至约4g/L(例如，约1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L或4g/L或其中的任何值或范围)的基本培养基，或约10mM到约25mM(例如，约10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM或25mM或其中的任何值或范围)。在一些实施例中，化学缓冲系统可以包括但不限于碳酸氢钠和/或HEPES。例如，在一些实施例中，基本培养基可包括碳酸氢钠，其量约为1g/L至约4g/L的基本培养基，例如，约为1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L或4g/L或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可包括碳酸氢钠，其含量约为1g/L至3.75g/L，约为1.25g/L至约为4g/L，约为2.5g/L至约3g/L，约为1.5g/L至约4g/L，或约为2g/L至约3.5g/L的基本培养基。在一些实施例中，基本培养基可包括约10mM至约25mM的HEPES，例如，约10mM、11mM、12mM、13mM、14mM、15mM、16mM、17mM、18mM、19mM、20mM、21mM、22mM、23mM、24mM或25mM或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可包括HEPES，其含量约为11mM至约25mM，约10mM至约20mM，约12.5mM至约22.5mM，约15mM至约20.75mM，或约10mM至约20mM。
在一些实施例中，基本培养基可包含一种或多种必需氨基酸，其含量约为0.5mM至约5mM(例如，约为0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM或其中的任何值或范围)，或约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM至约2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。在一些实施例中，示范性的一种或多种必需氨基酸可为精氨酸和/或半胱氨酸。例如，在一些实施例中，基本培养基可包含精氨酸，其量约为0.5mM至约5mM，例如约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM或其中的任何值或范围。在一些实施例中,基本培养基可能包括精氨酸，其含量为约0.5mM至约4.75mM，约2mM至约3.5mM，约0.5mM至约3.5mM，约1mM至约5mM，约3.5mM至约5mM。例如,在一些实施例中，基本培养基可能包括半胱氨酸，其含量为约0.5mM至约5mM,例如,约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可包括半胱氨酸，其含量约为0.5mM至约4.75mM，约为2mm至约3.5mM，约为0.5mM至约3.5mM，约为1mM至约5mM，或约为3.5mM至约5mM。
在一些实施例中,基本培养基可能包括一种或多种维生素和/或辅助因子，一种或多种维生素和/或辅助因子的含量为约0.01μM至约50μM(例如，约0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、46μM、47μM、48μM、49μM、49.025μM、49.05μM、49.075μM、或50μM，或其中的任何值或范围)，或从约0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM或0.9μM至约1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、3μM、4μM、5μM、6μM，或从约0.02μM、0.025μM、0.05μM、0.075μM、1μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM至约12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、46μM、47μM、48μM、49μM、49.025μM、49.05μM、49.075μM、或50μM。在一些实施例中，一种或多种维生素和/或辅助因子可包括但并不限于硫胺素和/或核黄素。例如，在一些实施例中，基本培养基可能包括硫胺素，其含量为约0.025μM至约50μM，例如约0.025μM、0.05μM、0.075μM、1μM、1.5μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、12.5μM、15μM、17.5μM、20μM、25μM、30μM、35μM、40μM、45μM、46μM、47μM、48μM、49μM、49.025μM、49.05μM、49.075μM、或50μM，或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括硫胺素，其含量为约0.025μM至约45.075μM，约1μM至约40μM，约5μM至约35.075μM，约10μM至约50μM，约0.05μM至约45.5μM.在一些实施例中，基本培养基可能包括核黄素，其含量为约0.01μM至约3μM，例如约0.01μM、0.02μM、0.03μM、0.04μM、0.05μM、0.06μM、0.07μM、0.08μM、0.09μM、0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、1.1μM、1.2μM、1.3μM、1.4μM、1.5μM、1.6μM、1.7μM、1.8μM、1.9μM、2μM、2.1μM、2.2μM、2.3μM、2.4μM、2.5μM、2.6μM、2.7μM、2.8μM、2.9μM、或3μM，或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括核黄素，其含量为约0.01μM至约2.05μM，约1μM至约2.95μM，约0.05μM至约3μM，约0.08μM至约1.55μM，或约0.05μM至约2.9μM。
在一些实施例中,基本培养基可能包括一种或多种无机盐，其含量约为100mg/L至约150mg/L的基本培养基(例如，约100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L、或150mg/L，或其中的任何值或范围)，或约100mg/L至约150mg/L的基本培养基(例如，约100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L、或150mg/L，或其中的任何值或范围)。在一些实施例中，示范性的一种或多种无机盐可以是钙和/或镁。例如，在一些实施例中，基本培养基可能包括钙，其约为100mg/L至约150mg/L的基本培养基，例如，约100mg/L、105mg/L、110mg/L、115mg/L、120mg/L、125mg/L、130mg/L、135mg/L、140mg/L、145mg/L、或150mg/L，或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可能包括精氨酸，其含量约为100mg/L至125mg/L，约为105mg/L至150mg/L，约为120mg/L至130mg/L，或约为100mg/L至145mg/L的基本培养基。在一些实施例中，基本培养基可能包括镁，其含量约为0.01mM至约1mM，例如，约为0.01mM、0.02mM、0.03mM、0.04mM、0.05mM、0.06mM、0.07mM、0.08mM、0.09mM、0.1mM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、0.91mM、0.92mM、0.93mM、0.94mM、0.95mM、0.96mM、0.97mM、0.98mM、0.99mM或1mM或其中的任何值或范围。在一些实施例中，基本培养基可包括镁，其含量约为0.05mM至约1mM，约0.01mM至约0.78mM，约0.5mM至约1mM，约0.03mM至约0.75mM，或约0.25mM至约0.95mM。
在一些实施例中，碳源、化学缓冲系统、一种或多种必需氨基酸、一种或多种维生素和/或辅助因子和/或一种或多种无机盐可以是食品级的。
在一些实施例中，基本培养基可以是催乳培养基，例如，基本培养基可以进一步包括催乳素(例如，哺乳动物催乳素，例如，人催乳素)。例如，在一些实施例中，基本培养基可包含催乳素(或可添加催乳素)，其含量约为20ng/mL至约200ng/mL的基本培养基，例如约20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、100ng/mL、110ng/mL、120ng/mL、130ng/mL、140ng/mL、150ng/mL、160ng/mL、170ng/mL、180ng/mL、190ng/mL或200ng/mL或其中任意值或范围。在一些实施例中，基本培养基中可能含有催乳素(或可添加催乳素)，其含量约为20ng/mL至195ng/mL，约50ng/mL至150ng/mL，约25ng/mL至175ng/mL，约45ng/mL至200ng/mL，或约75ng/mL至190ng/mL的基本培养基。在一些实施例中，本发明的方法还包括向基本培养基中添加催乳素，从而提供一种催乳培养基。在一些实施例中，所述催乳素可由表达重组催乳素(例如，包含在催乳素基因第179位置的丝氨酸残基被天门冬氨酸替代的催乳素(S179D)，例如S179D-催乳素)的微生物细胞和/或人类细胞产生。在一些实施例中，向基本培养基中添加催乳素可包括通过培养表达和分泌催乳素的细胞而对基本培养基进行调节，并将含有催乳素的调节的基本培养基应用于原代乳腺上皮细胞单层的底面、混合群体单层的底面或活的永生化乳腺上皮细胞单层的底面。
在一些实施例中，基本培养基可能进一步包括其他因子以提高效率，包括但不限于胰岛素、表皮生长因子和/或氢化可的松。在一些实施例中，本发明的方法可以进一步包括向基本培养基中添加其他因子(例如，胰岛素、表皮生长因子和/或氢化可的松)，例如，以提高效率。
在一些实施例中，本发明的方法可以包括监测基本培养基和/或催乳培养基中的葡萄糖浓度和/或葡萄糖消耗速率。在一些实施中，可以在基本培养基中葡萄糖消耗速率处于稳定状态时添加催乳素。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可以包括在约35℃至约39℃的温度下进行培养(例如，温度约为35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃或约39℃，或其中的任何值或范围，例如约35℃至约38℃，约36％至约39℃，约36.5℃至约39℃，约36.5℃至约38℃，或约36.5℃至约37.5℃)。在一些实施例中，可在约37℃的温度下进行培养。
在一些实施例中，培养中生产乳汁的方法可以包括在大气中CO2浓度约为4％至约6％的情况下进行培养，例如，大气中CO2浓度约为4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6％或其中的任何值或范围，例如，约为4％至约5.5％、约为4.5％至约6％、约为4.5％至约5.5％或约为5％至约6％)。在一些实施中，可以在大气中CO2浓度约为5％的情况下进行培养。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可以包括监测溶解的O2和CO2的浓度。在一些实施例中，溶解的O2的浓度可维持在约10％至约25％之间或其中的任何值或范围(例如，约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25％)。例如，在一些实施例中，可将溶解的O2的浓度维持在约12％至约25％之间、约15％至约22％之间、约10％至约20％之间、约15％、约20％或约22％。在一些实施例中，CO2的浓度可维持在约4％至约6％之间，例如，CO2的浓度约为4％、4.25％、4.5％、4.75％、5％、5.25％、5.5％、5.75％或6％或其中的任何值或范围，如约4％至约5.5％、约4.5％至约6％、约4.5％至约5.5％或约5％至约6％)。在一些实施例中，CO2的浓度可以维持在5％左右。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可进一步包括应用跨膜电阻(TEER)来测量上皮细胞单层的维持情况。TEER测量两个隔室(例如，顶隔室和底隔室)中液体(例如介质)之间的电压差，其中，如果隔室之间的屏障失去完整性，两个隔室中的液体可能会混合。当有液体混合时，不会有电压差；电压差表明屏障是完整的。一旦TEER检测到电压损失，支架(例如，Transwell过滤器、微结构生物反应器、脱细胞组织、中空纤维生物反应器等)可以与额外的细胞重新接种，并允许时间在恢复本发明的方法(例如，乳汁生产)之前重建屏障(例如，汇合连续单层)。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可以进一步包括在支架上进行培养之前，存储本发明的细胞或细胞群体(例如，活的原代乳腺上皮细胞，由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或永生化乳腺上皮细胞)，可选择地，其中在冰箱或液氮中进行存储。存储温度可能依赖于所需的存储时长。例如,如果细胞在6个月内(例如，在1、2、3、4、5或6个月内)使用，可使用冰箱温度，(例如,存储的温度为0℃至-80℃或更低,例如,约0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃、-100℃、或其中的任何值或范围)。例如，对于长期存储(例如，存储6个月或更长时间，例如，6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月，或12个月，或1年、2年、3年、4年、5年、6年或更多年)，可以使用液氮(例如，存储在-100℃或更低的温度下(例如，约-100℃、-110℃、-120℃、-130℃、-140℃、-150℃、-160℃、-170℃、-180℃、-190℃、-200℃、或更低温度下)。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可以进一步包括从顶隔室收集乳汁以生产收集的乳汁。在一些实施例中，可以通过端口、通过重力和/或通过真空进行收集。在一些实施例中，可以将真空连接到端口上。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可进一步包括冷冻收集的乳汁以生产冷冻乳汁和/或冻干收集的乳汁以生产冻干乳汁。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可进一步包括将收集的乳汁、冷冻乳汁和/或冻干乳汁封装到容器中。
在一些实施例中，在培养中生产乳汁的方法可以进一步包括从所收集的乳汁中提取一种或多种成分。来自收集的乳汁的成分的非限制性实例包括乳蛋白、脂类、碳水化合物、维生素和/或矿物质含量。在一些实施例中，可以冻干和/或浓缩来自收集的乳汁的成分，以生产冻干或浓缩的乳汁成分产品。在一些实施例中，来自收集的乳汁的成分可以通过，例如，膜过滤和/或反渗透浓缩。在一些实施例中，冻干或浓缩的乳汁成分产品可以封装在容器中，可选择地，该容器是无菌和/或食品级容器。在一些实施例中，容器可以是真空密封的。在一些实施例中，容器可以是筒、罐、瓶、袋、盒或包。
本发明还提供了一种生产经过修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的方法，其中所述方法包括向细胞中引入:(a)编码包含经过修饰的胞内信号域的催乳素受体的多核苷酸，可选择地，所述催乳素受体包括将第10外显子的第154位拼接至第11外显子的3’序列上的截断片段；(b)编码与配体结合的嵌合催乳素受体的多核苷酸，其能够在缺乏催乳素的情况下激活乳汁合成；(c)编码组成性激活或条件性激活的催乳素受体蛋白的多核苷酸，可选择地，该多核苷酸编码组成性激活的人催乳素受体蛋白，该组成性活性的人催乳素受体蛋白缺失第9-187的氨基酸(例如，缺失第9-187氨基酸，其中编号基于确定为SEQID NO:1的人催乳素受体的参考氨基酸序列)；(d)编码经过修饰(例如，重组)的催乳素蛋白效应物的多核苷酸，其包括(i)janus激酶-2(JAK2)酪氨酸激酶域，可选择地，其中该JAK2酪氨酸激酶域融合至信号传导及转录激活子-5(STAT5)酪氨酸激酶域(例如，编码JAK2酪氨酸激酶域的多核苷酸连接到编码STAT5酪氨酸激酶域的多核苷酸的3'端)；和/或(ii)融合至JAK2酪氨酸激酶域的催乳素受体胞内域；(e)引入昼夜节律相关的基因PER2(周期昼夜节律蛋白同源物2)的功能缺失突变；和/或(f)编码一种或多种葡萄糖转运基因GLUT1和/或GLUT12的多核苷酸，从而在单层的底面增加营养吸收的速率。
在一些实施例中，组成性激活的人催乳素受体蛋白可能缺失氨基酸第9到187，其中编号是基于被识别为SEQ ID NO:1的人催乳素受体的参考氨基酸序列。
SEQ ID NO:1:人催乳素受体(GenBank accession number AAD32032.1)
Figure BDA0003837973560000271
在一些实施例中，组成性激活的人催乳素受体蛋白可能包括以下氨基酸的缺失:VFTLLLFLNTCLLNGQLPPGKPEIFKCRSPNKETFTCWWRPGTDGGLPTNYSLTYHREGETLMHECPDYITGGPNSCHFGKQYTSMWRTYIMMVNATNQMGSSFSDELYVDVTYIVQPDPPLELAVEVKQPEDRKPYLWIKWSPPTLIDLKTGWFTLLYEIRLKPEKAA(例如，SEQ ID NO:1的第9-187位置的氨基酸)。
在一些实施例中，引入昼夜节律相关基因PER2的功能缺失突变可能包括PER2中从第348到434位置的87个氨基酸缺失，其中的编号是基于被识别为SEQ ID NO:2的人类PER2的参考氨基酸序列。
SEQ ID NO:2:人类周期昼夜节律蛋白同源物2(GenBank accession number NM_ 022817)
Figure BDA0003837973560000281
在一些实施例中，引入昼夜节律相关基因PER2的功能缺失突变可能包括以下氨基酸的缺失:
CLFQDVDERAVPLLGYLPQDLIETPVLVQLHPSDRPLMLAIHKKILQSGGQPFDYSPIRFRARNGEYITLDTSWSSFINPWSRKISFIIGRHKV(例如，SEQ ID NO:2的第348到434位氨基酸位置)。
在一些实施例中，编码催乳素受体的多核苷酸包括经过修饰的胞内信号域，可选择地，其中催乳素受体包括截断片段，其中第10外显子的第154位拼接至第11外显子的3'序列，可以编码被识别为SEQ ID NO:3的下列氨基酸序列。
SEQ ID NO:3:人类第4亚型催乳素受体(GenBank accession number AF416619； Trott et al.2003J.Mol.Endocrinol.30(1):31-47)
Figure BDA0003837973560000291
在一些实施例中，编码经过修饰的催乳素蛋白(例如，重组)效应物的多核苷酸包括(i)janus激酶-2(JAK2)酪氨酸激酶域，可选择地，其中JAK2酪氨酸激酶域可被融合到信号传导和转录激活子5(STAT5)酪氨酸激酶域(例如，编码JAK2酪氨酸激酶域的多核苷酸连接到编码STAT5酪氨酸激酶域的多核苷酸的3'端)可能编码以下氨基酸序列，该氨基酸序列被识别为SEQ ID NO:4。加粗的氨基酸与参考的人类JAK2氨基酸序列的第757至1129氨基酸位置的JAK2激酶域相对应。
SEQ ID NO:4.STA5A人类信号传导和转录激活子5在3’端融合至JAK2人酪氨酸蛋 白激酶的氨基酸第757-1129
Figure BDA0003837973560000292
示范性实施例如下:
1.活细胞构建体，包括，
支架，其具有上表面和下表面；以及
在支架上表面之上的(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)活的永生化的乳腺上皮细胞的连续单层；(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的所述连续单层具有顶面和底面(例如细胞形成极化且汇合的细胞单层)，其中该构建体包括顶隔室和底隔室，顶隔室位于(a)活的原代乳腺上皮细胞、(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体、和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层的顶面之上并与其相邻，底隔室位于支架的下表面之下并与其相邻。
2.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中由原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞产生的乳汁通过这些细胞的顶面分泌到顶隔室。
3.权利要求1或权利要求2所述的活细胞构建体，其中，底隔室包括基本培养基，该基本培养基与活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体和/或永生化乳腺上皮细胞的底面接触。
4.根据权利要求3所述的活细胞构建体，其中基本培养基包括碳源、化学缓冲系统、一种或多种必需氨基酸、一种或多种维生素和/或辅助因子以及一种或多种无机盐。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的活细胞构建体，其中基本培养基是催乳培养基，还包括催乳素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的活细胞构建体，其中支架被制成二维表面(例如，Transwell过滤器)、三维微图案化表面(例如，微结构生物反应器，脱细胞组织)、或能够组装成束的圆柱形结构(例如，中空纤维生物反应器)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的活细胞构建体，其中支架的上表面包覆一种或多种细胞外基质蛋白。
8.根据权利要求6所述的活细胞构建体，其中一种或多种细胞外基质蛋白为胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白和/或纤维连接蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的活细胞构建体，其中所述支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽和/或从其任何组合衍生的复合材料。
10.根据权利要求9所述的活细胞构建体，其中天然聚合物为胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、海藻酸盐、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白和/或透明质酸。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的活细胞构建体，其中生物相容性合成聚合物可以是聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。
12.根据权利要求1到9中任一项所述的活细胞构建体，其中所述的支架是多孔的。
13.根据权利要求1至13中任一项所述的活细胞构建体，其中活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或永生化乳腺上皮细胞来自哺乳动物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的活细胞构建体，其中哺乳动物是灵长类动物(如黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩、猴(例如,旧大陆,新大陆)、狐猴、人类)、狗、猫、兔子、小鼠、老鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、牛、猪、鹿、麝、牛科动物、鲸鱼、海豚、河马、大象、犀牛、长颈鹿、斑马、狮子、猎豹、老虎、熊猫、小熊猫和水獭。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的活细胞构建体，其中哺乳动物来自濒危物种。
16.一种在培养中生产乳汁的方法，该方法包括培养权利要求1至15中任一项所述的活细胞构建体，从而在培养中生产乳汁。
17.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括
(a)从乳腺组织的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；
(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；
(c)在支架上培养(b)的混合群体，支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面之上生产混合群体的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中所述极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括在支架上进行培养之前，将(b)的分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞存储，可选择地，存储在冰箱或液氮中。
19.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括:
a)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；
(b)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体；
(c)对原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞群体；以及
(d)在支架上培育原代乳腺上皮细胞群体，该支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上生产原代乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
20.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，该方法包括
(a)培养永生化的乳腺上皮细胞，来生产更多的永生化的乳腺上皮细胞；
(b)在支架上培育(a)中的永生化的乳腺上皮细胞，该支架具有上表面和下表面，以在支架的上表面上生产永生化的乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在培养永生化乳腺上皮细胞之前，该方法包括:
(i)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；
(ii)培养分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体；
(iii)将由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞组成的混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞群体；和
(iv)用(1)一个或多个编码人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的核酸或猿猴病毒40(SV40)的稳定转染(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞；或用(2)小发卡RNA(shRNA)稳定转导(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞至p16(细胞周期依赖性激酶抑制剂4)(p16(INK4))和细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c-MYC)，以生产永生化的乳腺上皮细胞。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中永生化的细胞系可以被(1)一个或多个编码hTERT的核酸或SV40稳定转染，或被(2)小发卡RNA(shRNA)稳定地转导到(a)p16(细胞周期依赖性激酶抑制剂4)(p16(INK4))和(b)细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c-MYC)。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，进一步包括在支架上培育之前,存储原代乳腺上皮细胞群体或永生化乳腺上皮细胞，可选择地，其中可在冰箱或液氮中进行存储。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中单层的底面与支架的上表面相邻。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中，活细胞构建体包括与单层的顶面相邻的顶隔室。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中,活细胞构建体包括与支架的下表面相邻的底隔室。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中,培养是在温度约35℃至约39℃，可选择地约37℃下进行。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中，培养是在大气中CO2浓度约4％至约6％的情况下进行的，可选择地约5％。
29.根据权利要求17至28中任一项所述的方法，其中(b)中的培养包括在约每天至约每10天进行更换的培养基中进行培养，可选择地约每天至约每3天进行更换。
30.根据权利要求19至29中任一项所述的方法，其中分离和分类是通过荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选和/或微流控细胞分选进行。
31.一种在培养中生产乳汁的方法，包括，
培养活细胞构建体，所述活细胞构建体包括
(a)支架，该支架包括上表面、下表面和活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层，活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层具有顶面和底面，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层位于支架的上表面之上，
(b)底隔室和顶隔室，其中支架的下表面与底隔室相邻，活的原代乳腺上皮细胞的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的单层，和/或活永生化乳腺上皮细胞的单层的顶面与顶隔室相邻，
其中，活的原代乳腺上皮细胞的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的单层的活的原代乳腺细胞，或永生化乳腺上皮细胞的单层通过其顶面分泌乳汁到顶隔室，从而在培养中生产乳汁。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，底隔室包括基本培养基，该基本培养基与原代乳腺上皮细胞的连续极化单层的底面接触，与混合群体的连续极化单层的底面接触，或与活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层的底面接触。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中培养在温度约35℃至约39℃，可选择地约37℃下进行。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中培养在大气中CO2浓度约为4％至约6％，可选择地，约为5％的情况下进行。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中培养包括监测溶解的O2和CO2的浓度。
36.根据权利要求31至35所述的方法，进一步包括向基本培养基中添加催乳素，从而提供一种催乳培养基。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中，培养包括监测基本培养基和/或催乳培养基中的葡萄糖浓度和/或葡萄糖消耗速率。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在葡萄糖消耗速率处于稳定状态时添加催乳素。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中，所述催乳素由表达重组催乳素的微生物细胞或人类细胞(例如，s179d-催乳素)生产。
40.根据权利要求31至39中任何一项所述的方法，进一步包括从顶隔室收集乳汁以生产收集的乳汁。
41.根据权利要求40所述的方法，其中通过端口进行收集。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中收集是通过重力或真空进行的，可选择地，真空连接到端口上。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，进一步包括冷冻所收集的乳汁以生产冷冻乳汁和/或冻干收集的乳汁以生产冻干乳汁。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，进一步包括将所收集的乳汁、冷冻乳汁和/或冻干乳汁封装到容器中。
45.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，进一步包括从所收集的乳汁中提取一种或多种成分。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，将来自所收集的乳汁中的成分冻干和/或浓缩，以生产冻干或浓缩的乳汁成分产品。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，来自所收集的乳汁中的成分通过膜过滤或反渗透进行浓缩。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中，冻干或浓缩的乳汁成分产品被封装在容器中。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中，来自所收集的乳汁中的成分为乳蛋白、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质含量。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中，所述容器是无菌的。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中，所述容器是真空密封的。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中，所述容器是食品级容器。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的方法，其中，所述容器可以是筒、罐、瓶、袋、盒或包。
53.一种生产经过修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的方法，其中，该方法包括向细胞中引入:
(a)编码包含经过修饰的胞内信号域的催乳素受体的多核苷酸，可选择地，所述催乳素受体包括将第10外显子的第154位拼接至第11外显子的3’序列上的截断片段
(b)编码与配体结合的嵌合催乳素受体的多核苷酸，其能够在缺乏催乳素的情况下激活乳汁合成；
(c)编码组成性激活或条件性激活的催乳素受体蛋白的多核苷酸，可选择地，该多核苷酸编码组成性激活的人催乳素受体蛋白，该组成性激活的人催乳素受体蛋白缺失第9到187氨基酸；
(d)编码经过修饰(重组)的催乳素蛋白效应物的多核苷酸，其包括(i)融合至STAT5酪氨酸激酶域的JAK2酪氨酸激酶域；和/或(ii)融合至JAK2酪氨酸激酶域的催乳素受体胞内域；
(e)引入昼夜节律相关的基因PER2(周期昼夜节律蛋白同源物2)的功能缺失突变；和/或
(f)编码一种或多种葡萄糖转运基因GLUT1和/或GLUT12的多核苷酸，从而在单层的底面增加营养吸收的速率。
55.根据权利要求53所述的方法，其中，JAK2酪氨酸激酶域融合至STAT5酪氨酸激酶域的C端(例如，编码JAK2酪氨酸激酶域的多核苷酸连接到编码STAT5酪氨酸激酶域的多核苷酸的3'端)。
56.根据权利要求53所述的方法，其中功能缺失突变包括PER2中从第348到434位置的87个氨基酸缺失。
在描述了本发明之后，将在下面的实施例中更详细地对其进行解释，本文所包括的这些实施例仅仅为了说明，并不用于限制本发明。
实施例
实施例1
为收集乳汁而设计的细胞培养系统应该支持产品的分区分泌，这样乳汁就不会暴露在为细胞提供营养的培养基中。在人体内，分泌乳汁的上皮细胞在乳腺的内表面排列成连续的单层。单层是定向的，使得底面就附着在下面的基底膜上，而乳汁则从顶面分泌出来，并存储在腺体或腺泡的腔室中，直到在挤奶或提供营养时取出。沿着细胞侧面的紧密连接确保了底层组织和位于腺泡腔室的乳汁之间的屏障。因此，在体内，乳腺组织的排列使乳汁分泌被分隔开，乳腺上皮细胞自身建立界面，维持着营养物质的定向吸收和乳汁的分泌。
本发明描述了一种细胞培养装置，它再现了乳腺的分隔能力，可用于从体外生长的乳腺上皮细胞收集乳汁。该装置可以包括支架，以支持在两个隔室之间的界面处的乳腺细胞的增殖，从而使上皮单层提供营养介质和分泌的乳汁之间的物理边界。支架除了提供生长的表面外，还提供了引导细胞极化的空间线索，并确保吸收和分泌的定向性。本发明描述了用于生产和收集用于营养用途的乳汁的分隔细胞培养装置中乳腺上皮细胞的制备、培养和刺激(例如，见图1)。
乳腺上皮细胞的制备。乳腺上皮细胞取自切除的乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的手术外植体。一般来说，在手术切除乳腺组织后，任何脂肪或基质组织都要在无菌条件下人工去除，剩下的乳腺组织用胶原酶和/或透明质酸酶酶解，这些酶是在化学定义的营养介质中制备的，化学定义的营养介质应当由“公认安全”的成分(GRAS)构成。样品在温和搅拌下保持在37℃。消化后，通过离心或将样品倒入无菌尼龙细胞过滤器收集单细胞或类器官的悬浮液。然后将细胞悬浮液转移到涂有适当细胞外基质成分(如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维连接蛋白)的组织培养板上。
或者，外植体试样可以加工成小块，例如用无菌手术刀切碎。将组织碎片放在合适的表面上，如明胶海绵或涂有适当细胞外基质的塑料组织培养板上。
放置的细胞保持在37℃，且在潮湿的培养箱与5％的二氧化碳的大气下。在培养过程中，培养基约每1天至约每3天进行更换，细胞进行继代培养，直到获得足够数量的活细胞以供后续处理，可以包括准备在液氮中存储；通过稳定转染SV40、TERT或其他与衰老相关的基因来发展永生化细胞系；通过例如荧光激活细胞分类等方法分离乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和干细胞/祖细胞类型；和/或引入到分隔的组织培养装置中，用于生产和收集供人类食用的乳汁。
用于生产乳汁的乳腺上皮细胞的培育。用于营养用途的乳汁由乳腺上皮细胞生产，该乳腺上皮细胞如上所述进行分离并以支持分区分泌的方式进行培养，以便保持营养培养基和产品之间的分隔。该系统依赖于乳腺上皮细胞的能力，当将其接种到位于分泌乳汁的顶隔室和提供营养介质的底隔室之间界面处的适当支架上时，建立具有适当顶面-底面极性的连续单层(例如，见图2)。例如，放置在组织培养板中的Transwell过滤器，以及基于中空纤维或微结构支架的生物反应器，可以用来支持这些特性。
乳腺上皮细胞分离和扩增后，将细胞悬浮在由食品级成分组成的化学定义的营养培养基中，并接种到预先涂有细胞外基质蛋白混合物，例如胶原蛋白、层粘连蛋白和/或纤维连接蛋白的培养装置中。细胞培养装置可以是任何允许从极化的、汇合的上皮单层中分离吸收营养物质和分泌产物的设计。实例包括中空纤维和微结构支架生物反应器(例如，分别见图3和4)。替代方法包括其他三维组织培养方法，如制备脱细胞乳腺作为支架，再填充干细胞以在体外产生功能器官，或从在水凝胶基质或悬浮液中生长的乳腺上皮细胞类器官或“乳腺球”的管腔中收集乳汁。
该装置包括密封外壳，在约5％二氧化碳的湿化大气中保持约37℃的温度。随着细胞在生物反应器内增殖，监测葡萄糖摄取以评估培养物的生长。葡萄糖消耗的稳定表明细胞已经达到汇合、接触抑制状态。使用跨膜电阻确保单层的完整性。传感器在多个位置监测培养基中溶解的O2和CO2的浓度。由计算机控制的泵通过生物反应器以使平衡营养物质的输送与代谢废物，例如氨和乳酸的清除相平衡的速率循环培养基。使用乳酸补充和适应技术(Freund et al.2018年，Int J Mol Sci，19(2))或通过穿过填充沸石的腔室去除废物后，可以通过系统回收培养基。
刺激生产乳汁。在体内和培养的乳腺上皮细胞中，催乳素刺激乳汁的生产和分泌。在培养中，可以外源性地在营养培养基中提供催乳素，浓度接近于哺乳期间在体内观察到的浓度，例如，约20ng/ml至约200ng/ml。可从商业上获得纯化的催乳素；但是，可以采用提供催乳素或刺激泌乳的替代方法，包括从微生物或哺乳动物细胞培养物中表达和纯化重组蛋白。或者，通过培养表达和分泌催乳素的细胞制备的条件培养基可应用于乳腺上皮细胞培养以刺激泌乳。可以串联地设置生物反应器，这样，在暴露于生长在所述的分隔培养装置中的乳腺细胞之前，调整穿过表达催乳素的细胞的培养物或其他关键培养基补充物的培养基。
其他上调乳汁产量和/或避免使用外源性催乳素的方法包括信号通路的分子操作，其通过将催乳素与乳腺上皮细胞表面的受体结合来进行调节，例如以下方法:(a)靶向催乳素翻译后修饰的构建体的表达；(b)催乳素受体替代亚型的表达；(c)嵌合催乳素受体的表达，其胞外域与结合位点交换为不同的配体；(d)引入编码组成性激活或条件性激活的催乳素受体的基因，或其下游效应物的经过修饰的例子，例如STAT5或Akt；(e)敲除或修饰PER2昼夜节律基因；和/或(f)旨在提高乳腺上皮单层的底面处养分吸收速率的分子方法。
乳汁的收集。通过，例如，安装在培养装置的顶隔室的端口来连续或间隔收集分泌的乳汁。可在端口上施加真空以促进收集，真空也可有助于刺激进一步生产。所收集的乳汁可封装在无菌容器中并密封以供分发，冷冻或冻干以供存储，或加工以提取特定成分。
本发明提供用于生产营养用途的乳汁的乳腺上皮细胞培养物。除人类母乳外，该方法还可用于生产其他哺乳动物的乳汁，例如供人类食用或兽类使用。因为在此之前体外生产乳汁是不可能的，这项技术除了为现有产品提供一种替代的生产方式之外，还可能带来新的商业机会。这项技术的商业开发产生了广泛而深远的社会和经济影响。通过培养细胞生产人类乳汁可能为解决食物匮乏地区婴儿营养不良问题提供一种手段，为无法用母乳喂养的早产儿提供必要的营养，并为母亲提供一种新的喂养婴儿的选择，通过方便的婴儿配方食品提供最佳营养。牛奶或羊奶的生产提供了一个减少动物农业对环境、社会和动物福利的影响的机会。这里描述的工艺解决了细胞农业新兴领域的一个重要缺口，在不损害我们对最基本的营养来源的生物和文化依恋的情况下，引入了一个大幅更新人类的食物供应的机会。
实施例2
该实施例描述了在中空纤维生物反应器中生物合成人乳制品的成功生产，该生物反应器接种有原代人乳腺上皮细胞(HMECs)。正如下面详细讨论的，对生物合成乳制品的分析表明，它含有许多与人类乳汁中所发现的化合物相同的化合物，包括许多以前未在非基因工程的、完整人体系统中生产的化合物。
该实施例描述的方法提供了使用易于商业化生产的可扩展工艺生产非转基因人类生物合成乳制品的概念证明。中空纤维生物反应器是特别有利的系统，由于表面积最大，同时允许细胞组织成用于乳汁生产和分泌的理想三维结构。这种细胞培养系统使细胞达到生产完整的乳汁分子所需的密度和复杂性，包括多肽、蛋白质、脂类和碳水化合物，特别是低聚糖。在下面的实例中，相对较小的生物反应器筒(表面积为400cm2)每天生产约30毫克(mg)的乳蛋白。如下面更详细地描述的，该系统可以很容易地适应每天1克的规模(例如，每天1-3克)，例如通过使用更大的商业生物反应器筒。
该实施例所描述的工艺也利用食品级材料，包括基膜和培养基成分，在无致病菌的环境中培养泌乳的原代HUMECs。因此，所得的生物合成的人乳制品不需要巴氏杀菌，不像牛乳或人乳的提取物制成的乳产品。众所周知，巴氏杀菌降低或破坏许多乳汁成分的免疫和营养生物活性，包括重要分子，如胆盐活化激活脂肪酶(BSAL)和溶菌酶。因此，与巴氏杀菌乳制品相比，这里所述的生物合成人乳制品有望具有优越的营养特性以及提供生物活性分子(如抗菌和抗炎分子)所赋予的其他独特特性。
下面的段落描述了在一个小的(表面积为400cm2)中空纤维生物反应器中培养原代HUMECs的泌乳单层，并提供了由这些细胞所分泌的生物合成人乳汁的初步表征。
原代人乳腺上皮细胞(HMECs)扩增:
HMECs取自ATCC(PCS-600-010)。HMECs(1安瓿；5x105个细胞)在乳腺上皮细胞培养基(ATCC PCS-600-30)中扩增成IV型胶原蛋白包覆的T300瓶(或2个T175瓶)。一旦获得合适的细胞数，但在达到汇合之前，将HMECs分离，在生长培养基中重悬，并接种到中空纤维生物反应器中，其制备方法如下。
中空纤维生物反应器的制备:
所使用的细胞培养装置是中空纤维生物反应器，允许从极化且汇合的上皮单层中分隔吸收营养物质和分泌乳制品(例如，见图3和图4A-C)。这种生物反应器是由毛细管制成，这些毛细管由PVDF、聚砜或其他生物学上的合适材料制成，并组装成圆柱形的筒。细胞被接种到毛细管外(EC)空间，培养基通过毛细管被泵入毛细管内(IC)空间。图4B显示了一个说明性的示意图。
在细胞接种之前，通过下列步骤准备筒：用PBS至少孵育24小时，然后在室温下用PBS中以1:1混合的IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白(25μg层粘连蛋白-111,25μg IV型胶原蛋白)的混合物包裹毛细管过夜。然后，将胶原蛋白/层粘连蛋白混合物替换成细胞生长培养基，并在室温下孵育过夜。
生物反应器中的细胞生长:
接种后，根据葡萄糖利用确定的达到汇合所需的时间，让HMECs在生物反应器中增殖。葡萄糖利用是细胞代谢的一个指标。在指数增长期间，葡萄糖利用急剧增加，然后放缓，当细胞达到汇合时下降到一个较低的稳定状态。正如所料，如图4所示，在生物反应器接种后的数天内，葡萄糖利用迅速增加，然后趋于平稳，在第10天左右下降到一个较低的稳定水平，表明细胞已经达到汇合。当汇合时，单层形成了屏障，分隔了毛细管内(IC)空间和毛细管外(ECS)空间。
HMECs在生物反应器中使用基本乳腺上皮细胞生长培养基(
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PCS-600-030TM)进行培养，并添加杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM,Sigma Aldrich)，DMEM含有化学定义的用于高密度细胞培养的培养基(FiberCellSystems CDM-HD)。DMEM/CDM-HD的用量根据葡萄糖利用的速率进行调整。一旦葡萄糖利用稳定在10mg/天以下(见图4)，将DMEM/CDM-HD按体积的10％的量添加到基本生长培养基中。这是在催乳素刺激之前提高葡萄糖含量，以便使葡萄糖更容易作为哺乳的碳源而获得。此外，一旦葡萄糖利用稳定下来，表明细胞已汇合，每天从ECS中提取一个样本(“ECS捕获”)并冷冻起来，用于后续的蛋白质、脂类和碳水化合物含量分析，详细描述如下。用注射器从ECS室端口孔收集样品，离心，收集上清液，分成0.5mL等分试样，并冷冻在-80℃下，用于分析。离心步骤产生的颗粒状碎片在与原始样品相当体积的PBS中重悬，并在-80℃冷冻。通过在培养基中添加催乳素来刺激乳汁生产。
刺激乳汁生产:
在第11天，在葡萄糖利用初步稳定之后，向培养基中添加100ng/mL催乳素，为细胞泌乳做准备(图4中的第一个箭头)。尽管100ng/mL通常被认为是哺乳期间人类母亲的催乳素的血清浓度，但研究表明，在足月龄时催乳素水平相当高，约为200ng/mL。因此，我们测试了在一段时间后增加催乳素的量是否能有效地刺激生物反应器培养的细胞生产乳汁。添加100ng/ml催乳素15天后，在生物反应器中培养第26天，催乳素的量增加到200ng/ml(图4中第二个箭头)。如图5所示，在将催乳素增加到200ng/ml约5天内，总蛋白质产量迅速增加，增加了4-5倍。此外，后期催乳素浓度的下降(图4中的第三个箭头)与总蛋白质产量的下降相关，表明总蛋白质产量可以通过改变催乳素的量来控制。在不受任何理论约束的情况下，我们认为，在开始暴露于100ng/ml的催乳素后，将催乳素增加到200ng/ml是激活生物反应器培养的细胞的最大泌乳量的关键。
生物合成乳制品的特性
乳糖合成是乳汁生产的限速步骤(Mahmoud等人，Am J Physiol EndocrinolMetab，2012；3(3):E365-376.)。此外，乳糖也是几乎所有哺乳动物乳汁中的主要碳水化合物。它的存在是哺乳动物乳汁生物合成成功的标志。因此，我们分析了催乳素刺激后的ECS捕获的乳糖。乳糖检测采用酶测定法(乳糖分析试剂盒，Sigma Aldrich)。图6A显示了将细胞接种到生物反应器后随时间变化的乳糖浓度(微摩尔，uM)。该图显示，在第26天，催乳素增加到200ng/ml之后，乳糖产量显著增加。
人乳还含有功能性非营养成分，包括脂类、氨基酸、生物胺和碳水化合物形式的代谢物，特别是以低聚糖的形式。人乳代谢物组通常被定义为人乳中发现的一组低分子量分子(小于1500Da)。因此，我们进一步使用Chenomx NMR Suite软件对生物合成乳制品的代谢物成分进行了核磁共振(NMR)分析，如Smilowitz et等人，J.Nutr，143:1709-1718,2013所描述的。该技术已在人乳中得到验证，并提供了碳水化合物、氨基酸和有机酸含量的定量测量方法。
代谢物分析发现成功生物合成了关键人乳代谢物，包括2'墨角藻糖基乳糖，以及乳糖和肌醇。乳汁也是肌醇的重要来源，它的存在进一步表明哺乳动物乳汁的综合生物合成成功。肌醇常被添加到婴儿配方食品中，以确保在新生儿早期发育期间避免潜在的肌醇缺乏。2'墨角藻糖基乳糖是一种低聚糖，它是天然存在于人类母乳中最常见的人乳低聚糖(HMO)，约占人乳中发现的所有HMO的30％。上清液中存在2'墨角藻糖基乳糖表明生物反应器细胞成功制备了人类的低聚糖。图6B显示了将细胞接种到生物反应器后随时间变化的2'墨角藻糖基乳糖浓度(微摩尔，uM)。该图显示，在第26天催乳素增加到200ng/ml之后，2'墨角藻糖基乳糖产量显著增加。
为了确认乳糖和2'墨角藻糖基乳糖是由细胞分泌的，而不是简单地存在于培养基中，我们还分析了培养基、ECS捕获和储存这些碳水化合物分子的存储库的样本。如图6C所示，在细胞培养基中没有这些分子的证据，但在ECS捕获和存储库样品中，乳糖和2'墨角藻糖基乳糖的代表性峰都非常明显。人乳光谱用于定性比较，不能与其他光谱按比例进行比较。
除了这些重要的碳水化合物，我们还分析了生物合成乳制品中的人酪蛋白-2，这是人乳中的主要蛋白质之一。图7显示了使用生物反应器接种后第22、25、26、27和29天从ECM捕获中分离的蛋白质，酪蛋白产量随时间的变化。酪蛋白在第25天开始检测到，并在接下来的几天里继续显著增加。
利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对代表性ECS捕获的蛋白质含量进行分析，以显现分子量在5-250kDa之间的蛋白质。图8显示了考马斯氏染色凝胶的图像，该考马斯氏染色凝胶载有4个存储库样品(左起第1-4通道)和4个ECS捕获样品(第5-8通道)，对应于催乳素刺激之后的第20、21、22和25天。在分子量标记旁边的第9通道显示了来自人乳的蛋白质，以供比较。存储库样品取自生物反应器的毛细管内(IC)空间(即毛细管内部的空间，如图3B所示)，其中含有生长培养基。这些结果表明，该生物反应器生产了生物合成乳制品，其中含有许多的蛋白质与人乳中所发现的蛋白质相同。
通过液相色谱和质谱分析(LC-MS)进一步分析了来自第5通道的ECS捕获，以确定存在的蛋白质。下面提供了LC-MS分析方法的细节。该分析总共鉴定了来自67个蛋白质组的81个蛋白质。这些蛋白质包括α-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白和α-乳清蛋白，以及血清白蛋白、乳运铁蛋白、黄嘌呤脱氢酶、黄嘌呤氧化酶、嗜乳脂蛋白、胰岛素、脂滴包被蛋白-2、骨桥蛋白。
表1：生物合成的乳制品的蛋白质成分
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上述几种分子只天然存在于人乳中，对高温巴氏杀菌或辐照巴氏杀菌的降解很敏感。特别是，胆盐激活脂肪酶(BSAL)在脂类代谢，包括胆固醇和甘油三酯的吸收中起到重要的作用。牛乳中没有发现BSAL，婴儿出生时也会不生产BSAL。重组的BSAL第III期临床试验失败，可能是由于缺乏脆弱的翻译后修饰和/或蛋白质折叠不合适，其中任何一种都可能导致生物活性的显著丧失。由于其在脂类吸收方面的重要作用，BSAL被用于浓缩的人类供体乳汁中，以促进出生体重极低的早产儿的热量吸收。
溶酶菌是另一重要的免疫分子，其对降解敏感，从而丧失生物活性。试图以重组的方式生产这些分子，但未能重现在母乳中发现的这种天然蛋白质的生物活性。
图10显示了生物合成的乳制品的样品中的一些重要乳蛋白的相对含量。样品制备和LC-MS分析的一般方法
基本根据Gundry,R.L.等人Curr.Prot.Mol.Biol.2009 10.25.1–10.25.23.Theapproximate protein content of each sample was determined with a QubitFluorometer(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)的“基本规程2”步骤2-6，通过质谱分析法对蛋白质进行消化和制备。
多肽通过微孔板C18固相萃取(Glygen Corp.，Columbia,MD)进行纯化。固相以99.9％乙腈(ACN)/0.1％TFA为条件，以1％ACN/0.1％TFA为平衡。加载样品，用1.2mL(约6柱体积)1％ACN/0.1％TFA洗涤固相。然后，用80％ACN/0.1％TFA洗脱多肽，真空离心干燥。将多肽重新溶于3％ACN中进行液相色谱-质谱(LC-MS)分析。
多肽在Agilent 6530B Q-TOF LC/MS精确质量四极杆飞行时间(Q-TOF)LC-MS系统上进行分析。纳米LC(nano-LC)芯片由360nL的加载柱和150mm分析柱组成，均填充C18。分析柱在0.3L/min的纳米泵流速下进行操作。梯度洗脱溶剂为(A)3％ACN/0.1％FA和(B)90％ACN/0.1％FA。如果先驱离子的强度达到至少1000个离子数或光谱相对强度的0.01％，则选择先驱离子进行串联片段化。碰撞能量由公式“能量(V)＝((m/z)/100)*斜率+截距”确定，斜率和截距的数值分别为3和2。在数据采集过程中，根据注入的m/z 322.048121和922.009798的校准离子进行质量校准。
每个数据文件的所有光谱保存为Agilent.d文件，并使用蛋白质组学软件PEAKSStudio进行分析，以从串联MS数据中识别多肽。半胱氨酸的半胱氨酸碘乙酰胺化被设定为固定修饰。甲硫氨酸氧化、磷酸化(丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸)、脱酰胺化(天冬酰胺和谷氨酰胺)和氨基甲酰化(赖氨酸和N-端)被允许作为可变的翻译后修饰。母离子容错设置为20ppm，碎片离子使用±0.035Da。每个肽的最大切割缺失被设置为2。无标记定量的峰积分在保留时间窗口为1分钟和分子量的偏差为30ppm的情况下进行。所有的肽匹配以1％的错误发现率被识别，蛋白质需要满足至少20的-10log(p值)阈值。
脂类含量分析
除了碳水化合物和蛋白质，脂类也是哺乳动物乳汁的重要成分。通过LC-MS提取并识别氧化脂类，如下所示。氧化脂类还被称为脂肪酸的生物活性脂类介质。下面的表2显示了报告为两个独立ECS样品的平均值的游离氧化脂类的浓度(nM)，以及如果已知的分子分类。Gan等人(Lipids 2020年11月；55(6):661-670)在人脱脂奶中确定的比较量也显示了关键分子，其中生物活性脂类以较高含量存在于ECS样品中。与脱脂奶比较是恰当的，因为它捕获了可溶性脂类，这是乳汁中生物学上更相关的脂类。脱脂奶和生物反应器培养细胞上清液中溶解脂类的比较合理地反映了生物合成乳制品与牛奶相比脂类含量的质量。从下表列出的脂类中可以明显看出，在ECS样本中发现了许多人乳中存在的抗炎脂类。此外，ECS样品中存在的许多脂类浓度比Gan等人报道的那些相对更高。
表2：生物合成乳制品的脂类成分
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Figure BDA0003837973560000481
Figure BDA0003837973560000491
缩写：EpOME,环氧十八碳烯酸；EpETrE,环氧二十碳三烯酸；EpETE，环氧二十碳四烯酸；EpDPE，环氧二十二碳五烯酸；DiHOME，二羟基十八碳稀酸；DiHETrE，二羟基二十碳三烯酸；DiHETE，二羟基二十碳四烯酸；HODE，羟基十八碳二烯酸；HETrE，羟基二十碳三烯酸；HETE，羟基二十碳四烯酸；HOTrE，羟基十八碳三烯酸；HEPE，羟基二十碳五烯酸；HdoHE，羟基二十二碳六烯酸；LT，白三烯。
生物活性脂类纯化和分析的一般方法
从重量为33mg和74mg的两个ESC样品中分别提取未酯化的脂类。样品在冰上解冻，加入10ul、2uM的含9种氘代替代标准液的替代示踪溶液，并在600uL含0.002％的BHT、250uM的EDTA和0.01％的乙酸的甲醇:水(1:4v:v)中提取。将样品涡旋5秒，在13,000rpm、0℃下离心10分钟。去除沉淀蛋白质，剩余的提取物用Waters Corp公司的100mg tC18 Sep-Pak柱进行固相萃取(SPE)。用2mL甲醇重力洗脱柱上的氧化脂类，氮气下干燥，100uL的LC-MS/MS级甲醇重整。过滤后的氧化脂类提取物在-80℃下保存至LC-MS/MS分析。使用与Agilent6460三-四极串联质谱仪(Agilent，Santa Clara,CA,USA)耦合的Agilent1290 Infinity UHPLC系统，在负模式下电喷雾电离，对所有样品进行一周内氧化脂类提取物的分析。分析物在Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱(2.1×150mm,1.8μm,Agilent,Santa Clara,CA,USA,Cat#959759-902)上分离后，使用优化的动态多反应监测(dMRM)条件捕获。自动进样器和柱分别保持在4℃和45℃。流动相A为0.1％醋酸的Milli-Q超纯水溶液。流动相B为含0.1％醋酸的乙酸乙腈/甲醇(80:15,v/v)。
商业可行的规模化乳汁生产
本文描述的方法提供了使用易于商业化生产的扩展工艺生产非转基因人类生物合成乳制品的一种概念验证。如图9所示，将催乳素增加至200ng/ml的5天后，产奶量(以总分泌的蛋白质的量分析)超过30mg/天。该日产量一直持续至试验哺乳期结束。这个量是使用相对小的生物反应器筒(400cm2的细胞生长表面积)获得的。使用市面上最大的生物反应器筒，其具有约3平方米(m2)的表面积，这个量将转化为约1-3g/天。这个工艺可进一步扩展，例如通过填充更多的纤维和/或更长的纤维到一个或多个相互平行排列的筒中。
总之，本文中示出的数据表明，中空纤维生物反应器培养的HUMECs产生了类似于人乳的物质。由这些细胞生产的生物合成乳制品的成分分析表明，成功生产了完整的人乳蛋白质、生物活性脂类、以及包括关键的低聚糖的碳水化合物。本文中所述的生物合成乳制品含有许多重要的分子，这些分子以前没有通过其他基于生物反应器的方法在单一产品中生产，其中一些分子已被证明难以通过重组方法生产。这些分子包括乳糖、胆盐激活脂肪酶，2’墨角藻糖基乳糖、溶菌酶和骨桥蛋白。此外，本文生产的生物合成的乳制品没有致病菌，不需要巴氏杀菌，并且该乳制品包含几种抗菌的人乳蛋白质，例如乳铁蛋白和溶菌酶。此外，我们已在此证明以足够规模生产用于食品的生物合成的乳制品是可行的。据我们所知，这表示，第一种不需要巴氏杀菌就能在商业上可行的规模下生产人乳或其他哺乳动物乳汁，例如绵羊奶、山羊奶或牛奶。由于巴氏杀菌被认为会减少或消除许多蛋白质的活性，包括那些赋予人乳显著益处的蛋白质的活性，本文中所描述的工艺生产的乳制品有望具有远优于其他形式的商业生产的乳汁的营养特性和其他特性(例如抗菌性)。
上述实施例是对本发明的说明，不应被解释为对本发明的限制。虽然本发明已参照优选的实施例进行了详细的描述，但是在下列权利要求中所描述和限定的本发明范围和精神范围内，存在变化和修改。

Claims (78)

1.一种活细胞构建体，包括
具上表面和下表面的支架，以及
在所述支架的所述上表面之上的(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层；
(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的所述连续单层具有顶面和底面(例如这些细胞形成极化且汇合的细胞单层)，
其中所述活细胞构建体包括顶隔室和底隔室，所述顶隔室位于(a)活的原代乳腺上皮细胞，(b)由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或(c)永生化的乳腺上皮细胞的连续单层的顶面之上并与其相邻，所述底隔室位于所述支架的下表面之下并与其相邻。
2.根据权利要求1所述的活细胞构建体，其中，由原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞产生的乳汁通过细胞的顶面分泌到顶隔室。
3.权利要求1或权利要求2所述的活细胞构建体，其中，底隔室包括基本培养基，所述基本培养基与活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体和/或永生化乳腺上皮细胞的底面接触。
4.根据权利要求3所述的活细胞构建体，其中基本培养基包括碳源、化学缓冲系统、一种或多种必需氨基酸、一种或多种维生素和/或辅助因子以及一种或多种无机盐。
5.根据权利要求3或权利要求4所述的活细胞构建体，其中基本培养基是催乳培养基，还包括催乳素。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的活细胞构建体，其中支架被制成二维表面(例如，Transwell过滤器)、三维微图案化表面(例如，微结构生物反应器、脱细胞组织)，或能够组装成束的圆柱形结构(例如，中空纤维生物反应器)。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的活细胞构建体，其中所述支架的上表面包覆一种或多种细胞外基质蛋白。
8.根据权利要求6所述的活细胞构建体，其中所述一种或多种细胞外基质蛋白为胶原蛋白、层粘连蛋白、巢蛋白、腱生蛋白和/或纤维连接蛋白。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的活细胞构建体，其中所述支架包括天然聚合物、生物相容性合成聚合物、合成肽和/或从其任何组合衍生的复合材料。
10.根据权利要求9所述的活细胞构建体，其中所述天然聚合物为胶原蛋白、壳聚糖、纤维素、琼脂糖、海藻酸盐、明胶、弹性蛋白、硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素、硫酸角蛋白和/或透明质酸。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的活细胞构建体，其中所述生物相容性合成聚合物可以是聚砜、聚偏氟乙烯、聚乙烯共醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸钠、丙烯酸酯聚合物和/或聚乙二醇。
12.根据权利要求1到9中任一项所述的活细胞构建体，其中所述的支架是多孔的。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的活细胞构建体，其中所述活的原代乳腺上皮细胞，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体，和/或永生化化乳腺上皮细胞来自哺乳动物。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的活细胞构建体，其中所述哺乳动物是灵长类动物(如黑猩猩、红毛猩猩、大猩猩、猴(例如,旧大陆、新大陆)、狐猴、人类)、狗、猫、兔子、小鼠、老鼠、马、奶牛、山羊、绵羊、牛、猪、鹿、麝、牛科动物、鲸鱼、海豚、河马、大象、犀牛、长颈鹿、斑马、狮子、猎豹、老虎、熊猫、小熊猫和水獭。
15.根据权利要求1至13中任一项所述的活细胞构建体，其中所述哺乳动物来自濒危物种。
16.一种在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括培养权利要求1至15中任一项所述的活细胞构建体，从而在培养中生产乳汁。
17.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括
(a)从乳腺组织的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；
(b)培养所述分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的混合群体；
(c)在支架上培养(b)的混合群体，所述支架具有上表面和下表面，以在所述支架的上表面之上生产所述混合群体的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中所述极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
18.根据权利要求17所述的方法，进一步包括在支架上进行培育之前，将(b)的分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞存储，可选择地，存储在冰箱或液氮中。
19.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括:
a)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；
(b)培养所述分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞的混合群体；
(c)对原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞的所述混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞群体；以及
(d)在支架上培育原代乳腺上皮细胞群体，所述支架具有上表面和下表面，以在支架的所述上表面之上生产原代乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中所述极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
20.一种制备活细胞构建体用于在培养中生产乳汁的方法，所述方法包括
(a)培养永生化的乳腺上皮细胞，来生产更多的永生化的乳腺上皮细胞；
(b)在支架上培育(a)中的永生化的乳腺上皮细胞，所述支架具有上表面和下表面，以在所述支架的上表面之上生产永生化的乳腺上皮细胞的极化且连续(即汇合)的单层，其中所述极化且连续的单层包括顶面和底面，从而生产用于在培养中生产乳汁的活细胞构建体。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在培养永生化乳腺上皮细胞之前，所述方法包括:
(i)从乳腺组织(例如，胸部组织、乳房组织、乳头组织)的乳腺外植体中分离原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，以生产分离的乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞；
(ii)培养所述分离的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞，来生产由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体；
(iii)将由原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和/或乳腺祖细胞组成的所述混合群体进行分类，来生产原代乳腺上皮细胞群体；和
(iv)用一个或多个编码人类端粒酶逆转录酶(hTERT)的核酸或猿猴病毒40(SV40)稳定转染(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞；或用小发卡RNA(shRNA)稳定转导(iii)中的原代乳腺上皮细胞群体中的一个或多个细胞至p16细胞周期依赖性激酶抑制剂4(p16(INK4))和细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c-MYC)，以生产永生化的乳腺上皮细胞。
22.根据权利要求20所述的方法，其中永生化的细胞系可以被一个或多个编码hTERT的核酸或SV40稳定转染；或永生化的细胞系可以被小发卡RNA(shRNA)稳定地转导到p16细胞周期依赖性激酶抑制剂4)(p16(INK4))和细胞周期进入和增殖代谢主要调节因子(c-MYC)。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的方法，进一步包括在支架上培育之前,存储原代乳腺上皮细胞群体或永生化乳腺上皮细胞，可选择地，其中在冰箱或液氮中进行存储。
24.根据权利要求17至23中任一项所述的方法，其中单层的底面与支架的上表面相邻。
25.根据权利要求17至24中任一项所述的方法，其中，活细胞构建体包括与单层的顶面相邻的顶隔室。
26.根据权利要求17至25中任一项所述的方法，其中,活细胞构建体包括与支架的下表面相邻的底隔室。
27.根据权利要求17至26中任一项所述的方法，其中,培养是在温度约35℃至约39℃，可选择地约37℃下进行。
28.根据权利要求17至27中任一项所述的方法，其中，培养是在大气中CO2浓度约4％至约6％的情况下进行的，可选择地约5％。
29.根据权利要求17至28中任一项所述的方法，其中(b)中的培养包括在约每天至约每10天进行更换的培养基中进行培养，可选择地约每天至约每3天进行更换。
30.根据权利要求19至29中任一项所述的方法，其中分离和分类是通过荧光激活细胞分选、磁激活细胞分选和/或微流控细胞分选进行。
31.一种在培养中生产乳汁的方法，包括，
培养活细胞构建体，所述活细胞构建体包括
(a)支架，所述支架包括上表面、下表面和活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层；活的原代乳腺上皮细胞的连续(即汇合)极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的所述连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层具有顶面和基面，其中活的原代乳腺上皮细胞的连续极化单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的连续极化单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层位于所述支架的上表面之上，
(b)底隔室和顶隔室，其中所述支架的所述下表面与底隔室相邻，活的原代乳腺上皮细胞的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的单层，和/或活的永生化乳腺上皮细胞的单层的顶面与所述顶隔室相邻，
其中，活的原代乳腺上皮细胞的单层，由活的原代乳腺上皮细胞、乳腺肌上皮细胞和乳腺祖细胞组成的混合群体的单层的活的原代乳腺细胞，或永生化乳腺上皮细胞的单层通过其顶面分泌乳汁到所述顶隔室，从而在培养中生产乳汁。
32.根据权利要求31所述的方法，其中，所述底隔室包括基本培养基，所述基本培养基与原代乳腺上皮细胞的连续极化单层的底面接触，与混合群体的连续极化单层的底面接触，或与活的永生化乳腺上皮细胞的连续极化单层的底面接触。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中培养在温度约35℃至约39℃，可选择地约37℃下进行。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中培养在大气中CO2浓度约为4％至约6％，可选择地，约为5％的情况下进行。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的方法，其中培养包括监测溶解的O2和CO2的浓度。
36.根据权利要求31至35所述的方法，进一步包括向基本培养基中添加催乳素，从而提供一种催乳培养基。
37.根据权利要求31至36中任一项所述的方法，其中，培养包括监测所述基本培养基和/或催乳培养基中的葡萄糖浓度和/或葡萄糖消耗速率。
38.根据权利要求37所述的方法，其中在葡萄糖消耗速率处于稳定状态时添加催乳素。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中，所述催乳素由表达重组催乳素的微生物细胞或人类细胞(例如，s179d-催乳素)生产。
40.根据权利要求31至39中任一项所述的方法，进一步包括从顶隔室收集乳汁以生产收集的乳汁。
41.根据权利要求40所述的方法，其中通过端口进行收集。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的方法，其中收集是通过重力或真空进行的，可选择地，真空连接到端口上。
43.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，进一步包括冷冻所收集的乳汁以生产冷冻乳汁和/或冻干收集的乳汁以生产冻干乳汁。
44.根据权利要求40至43中任一项所述的方法，进一步包括将所收集的乳汁、冷冻乳汁和/或冻干乳汁封装到容器中。
45.根据权利要求40至42中任一项所述的方法，进一步包括从所收集的乳汁中提取一种或多种成分。
46.根据权利要求45所述的方法，其中，将来自所收集的乳汁中的成分冻干和/或浓缩，以生产冻干或浓缩的乳汁成分产品。
47.根据权利要求46所述的方法，其中，来自所收集的乳汁中的成分通过膜过滤或反渗透进行浓缩。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的方法，其中，冻干或浓缩的乳汁成分产品被封装在容器中。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的方法，其中，来自所收集的乳汁的成分为乳蛋白、脂类、碳水化合物、维生素和矿物质含量。
50.根据权利要求48或49所述的方法，其中，所述容器是无菌的。
51.根据权利要求48至50中任一项所述的方法，其中，所述容器是真空密封的。
52.根据权利要求48至51中任一项所述的方法，其中，所述容器是食品级容器。
53.根据权利要求48至52中任一项所述的方法，其中，所述容器可以是筒、罐、瓶、袋、盒或包。
54.一种生产经过修饰的原代乳腺上皮细胞或永生化乳腺上皮细胞的方法，其中，所述方法包括向细胞中引入:
(a)编码包含经过修饰的胞内信号域的催乳素受体的多核苷酸，可选择地，所述催乳素受体包括将第10外显子的第154位拼接至第11外显子的3’序列上的截断片段
(b)编码与配体结合的嵌合催乳素受体的多核苷酸，其能够在缺乏催乳素的情况下激活乳汁合成；
(c)编码组成性激活的或条件性激活的催乳素受体蛋白的多核苷酸，可选择地，该多核苷酸编码组成性激活的人催乳素受体蛋白，该组成性激活的人催乳素受体蛋白缺失氨基酸第9到187；
(d)编码经过修饰(重组)的催乳素蛋白效应物的多核苷酸，其包括(i)融合至STAT5酪氨酸激酶域的JAK2酪氨酸激酶域；和/或(ii)融合至JAK2酪氨酸激酶域的催乳素受体胞内域；
(e)引入昼夜节律相关的基因PER2(周期昼夜节律蛋白同源物2)的功能缺失突变；和/或
(f)编码一种或多种葡萄糖转运基因GLUT1和/或GLUT12的多核苷酸，从而在单层的底面增加营养吸收的速率。
55.根据权利要求54所述的方法，其中，JAK2酪氨酸激酶域融合至STAT5酪氨酸激酶域的C端(例如，编码JAK2酪氨酸激酶域的多核苷酸连接到编码STAT5酪氨酸激酶域的多核苷酸的3'端)。
56.根据权利要求54所述的方法，其中功能缺失突变包括PER2中从第348到434位置的87个氨基酸缺失。
57.一种组合物，包括根据权利要求1-15中任一项所述的活细胞构建体生产的生物合成乳制品。
58.一种组合物，包括根据权利要求16-18或31-54中任一项所述的方法生产的生物合成乳制品。
59.一种活细胞构建体，包括泌乳原代的人乳腺上皮细胞(HMECs)，在定义有毛细管内(IC)空间和毛细管外(EC)空间的管状筒内，以平行阵列布置的多个中空毛细管上形成连续的单层，
每个中空毛细管由半渗透膜制造，所述半透膜限定了与IC空间相邻的内表面和与EC空间相邻的外表面，
其中每个中空毛细管的外表面涂覆有IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的混合物，HUMEC单层与涂覆的表面接触；以及其中添加有催乳素的细胞生长培养基填充IC空间。
60.根据权利要求59所述的活细胞构建体，其中，所述半渗透膜由聚偏二氟乙烯(PVDF)或聚砜制备而成。
61.根据权利要求59或60所述的活细胞构建体，其中，所述半渗透膜的截留分子量(MWCO)在5-80千道尔顿(kDa)之间。
62.一种组合物，包括由根据权利要求59-61中任一项所述的活细胞构建体生产的生物合成乳制品。
63.一种生物合成人乳组合物，包括脂类成分、蛋白质成分和碳水化合物成分，其中脂类成分、蛋白质成分和碳水化合物成分分别由人脂类、人蛋白质或多肽、或人碳水化合物组成，并且该组合物不包含致病菌、细胞毒素和转基因分子或基因工程分子。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中，所述组合物没有巴氏杀菌。
65.根据权利要求63或64所述的组合物，其中，脂类成分包括1％-5％的组合物。
66.根据权利要求63至65中任一项所述的组合物，其中，蛋白成分包括0.5％-1％的组合物。
67.根据权利要求63至66中任一项所述的组合物，其中，碳水化合物成分包括6％-8％的组合物。
68.根据权利要求63至67中任一项所述的组合物，其中，脂类成分包括棕榈酸、油酸和一种或多种生物活性的脂肪酸脂质介质。
69.根据权利要求68所述的组合物，其中，所述一种或多种生物活性脂肪酸脂质介质是抗炎的化合物。
70.根据权利要求68所述的组合物，其中，所述一种或多种生物活性的脂肪酸脂质介质选自由环氧十八碳烯酸(EpOME)；环氧二十碳三烯酸(EpETrE)；环氧二十碳四烯酸(EpETE)；环氧二十二碳五烯酸(EpDPE)；二羟基十八碳烯酸(DiHOME)；二羟基二十碳三烯酸(DiHETrE)；二羟基二十碳四烯酸(DiHETE)；羟基十八碳二烯酸(HODE)；羟基二十碳三烯酸(HETrE)；羟基二十碳四烯酸(HETE)；羟基十八碳三烯酸(HOTrE)；羟基二十碳五烯酸(HEPE)；羟基二十二碳六烯酸(HdoHE)；以及白三烯所构成的组。
71.根据权利要求63至70中任一项所述的组合物，其中，蛋白质成分包括一种或多种选自由α-乳清蛋白、胆盐激活脂肪酶(BSAL)、嗜乳脂蛋白、酪蛋白、脂肪酸合成酶、胰岛素、乳凝集素、乳铁蛋白、乳转铁蛋白、溶菌酶、粘蛋白-1、骨桥蛋白、围脂滴蛋白-2、血清白蛋白、黄嘌呤脱氢酶/黄嘌呤氧化酶所构成的组的蛋白质或多肽。
72.根据权利要求71所述的组合物，其中，所述蛋白质成分包括BSAL、溶菌酶和乳铁蛋白。
73.根据权利要求63至72中任一项所述的组合物，其中，所述碳水化合物成分包括乳糖、2’-墨角藻糖基乳糖、肌醇、乳糖N新四糖(LNnT)、6’-唾液乳糖、唾液酸乳糖-N-四糖、I型乳糖-N-岩藻五糖(LNFP)、II型乳糖-N-岩藻五糖(LNFP)、和二唾液-乳糖-N-四糖的一种或多种。
74.根据权利要求63至73中任一项所述的组合物，其中，所述组合物由根据权利要求59至61中任一项所述的活细胞构建体生产。
75.一种制备生物合成乳制品的方法，所述方法包括
在包含IV型胶原蛋白的底物上的生长培养基中扩增人乳腺上皮细胞(HUMECs)的群体；将扩增的HUMECs群体从底物中移出，并将移出的HUMECs接种在中空纤维生物反应器中，所述中空纤维生物反应器包含预涂有IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的混合物的毛细管；培养HUMECs一段时间，直到HUMECs汇合；以及通过将所述HUMECs与催乳素接触来刺激生物合成乳制品的生产，将所述HUMECs与催乳素接触所使用的方法包括用100ng/ml催乳素接触细胞一段时间，接着200ng/ml催乳素接触细胞第二段时间。
76.根据权利要求75所述的方法，其中，所述HUMECs选自原代细胞、原代永生化细胞或重组细胞。
77.根据权利要求75或76所述的方法，还包括：在接种HUMECs之前，制备生物反应器，其中制备生物反应器包括：在生物反应器内创造负压，并将磷酸盐缓冲溶液(PBS)中的IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的1:1混合物涂覆于中空纤维。
78.根据权利要求77所述的方法，其中，涂覆IV型胶原蛋白和I型层粘连蛋白的混合物是使用插入生物反应器端口的注射器完成的。
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