CN115737640B - 褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用及制备的抗癫痫和改善氨己烯酸所致视网膜毒性的药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医药技术领域，公开了褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，抗癫痫药物包括氨己烯酸制剂，给药方式为褪黑素与氨己烯酸制剂联用。本发明的有益效果在于：在采用抗癫痫药物氨己烯酸治疗癫痫时，将褪黑素与氨己烯酸联用，不仅能够减轻癫痫单位时间内的发作次数，还能改善癫痫患者的学习记忆能力；同时能够显著延长婴儿痉挛症的发作潜伏期，并减少婴儿痉挛症的发作次数；还能延缓癫痫患者体内R‑VGB和S‑VGB的代谢，显著延长血浆中R‑VGB和S‑VGB的半衰期及平均滞留时间等药动学参数，可见，褪黑素通过影响药物代谢增强氨己烯酸抗癫痫疗效；此外，褪黑素与氨己烯酸联用还可以显著改善氨己烯酸诱导的视网膜损伤，大大降低了氨己烯酸治疗癫痫所带来的副作用。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，尤其涉及褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用及制备的抗癫痫和改善氨己烯酸所致视网膜毒性的药物。
背景技术
癫痫(Epilepsy，EP)是一种慢性、复发性和进行性神经系统疾病，影响着全世界7000多万人。此外，据估计，多达3％的世界人口在其一生中的某个时期将患有癫痫，其发病率呈双峰分布，在婴儿和老年群体中风险最高。从分子、遗传和环境的角度来看，癫痫是一种多因素的脑疾病。根据国际抗癫痫联盟(ILAE)和世界卫生组织的说法，癫痫是大脑神经元突发的超同步化异常放电，导致短暂功能障碍的一种慢性脑部疾病，临床表现为反复惊厥发作及精神行为异常。不仅影响患者的日常生活，还可能对患者造成重大心理创伤，并增加患焦虑、抑郁等精神疾病的可能性。
目前用于治疗癫痫的药物旨在限制兴奋和/或加强抑制，长期服用药物来控制癫痫发作仍是最常见的选择，在过去的三十年里，17种第二代和第三代抗癫痫药物已被引入临床实践，但大约三分之一的癫痫患者在接受最充分的药物治疗后仍继续出现耐药。目前市场上的抗癫痫药物有不同的作用机制，但癫痫的治疗和预防似乎没有取得太大进展。而氨己烯酸(Vigabatrin，VGB)是一种精准作用于GABA的抗癫痫药物，用于成人难治性复杂部分癫痫的辅助治疗和婴儿痉挛(韦斯特综合征)的单一治疗。
VGB是一种GABA结构类似物，也是选择性的、不可逆的GABA转氨酶抑制剂，其抗癫痫作用是通过增加GABA在脑内的浓度。然而在20世纪90年代末，报道称VGB治疗后患者出现不可逆的外周视野缺损，并且在服用VGB的婴儿和成人中观察到视网膜纤维层萎缩。在视网膜中GABA激活比GABAA受体更敏感且不会脱敏的GABAC受体，VGB可使视网膜GABA浓度增加7倍，从而达到可以触发GABA兴奋性毒性的水平，但其毒性机制尚不清楚，可能涉及对视网膜神经节细胞的直接毒性或由毒性致感光细胞的继发性变性。因此，通过对VGB进行结构改造以及联用其他药物来增强抗癫痫疗效或降低其诱导的视网膜毒性迫在眉睫。
褪黑素(Melatonin,MLT)，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺，是一种主要由松果体合成和分泌的内源性吲哚胺类物质，能够促进昼夜时间管理，调节生物节律，还具有广泛的抗炎、抗氧化及神经保护作用。褪黑素治疗可增强脑源性神经营养因子(BDNF)作用，调节中枢神经系统和外周神经系统的神经营养机制，支持神经元的存活，诱导和管理神经发生。在过去的几十年里，褪黑素被证实在多种病理情况下发挥保护作用，如抑郁症、帕金森症、睡眠障碍、老年痴呆症、衰老、呼吸窘迫综合征、败血症、癌症、多发性硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等。此外，褪黑素还可以作为一种广谱抗氧化剂和强效自由基清除剂来保护视网膜神经节细胞(RGCs)或其他细胞免受氧化/亚硝化应激、缺氧/缺血、炎症过程和细胞凋亡等。Xu等(Melatonin attenuated retinal neovascularization and neuroglialdysfunction by inhibition of HIF-1alpha-VEGF pathway in oxygen-inducedretinopathy mice.J Pineal Res 64:e12473.)研究发现，外源性给药褪黑素在未成熟小鼠视网膜中表现出多效性，如预防病理新生血管形成、改善视网膜无血管区域的血运重建以及保护神经胶质细胞。褪黑素的治疗效果已经在其他视网膜损伤动物模型中得到证实，包括2型糖尿病诱导的视网膜病变和青光眼性视网膜损伤，但褪黑素应用后是否可以增强VGB抗癫痫疗效以及改善VGB诱导的视网膜毒性尚未可知。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于如何提供一种褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，褪黑素增强抗癫痫药物的抗癫痫疗效以及改善抗癫痫药物诱导的视网膜毒性。
本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题：
本发明第一方面提出一种褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用。
优选的，所述抗癫痫药物包括氨己烯酸制剂。
优选的，所述抗癫痫药物的给药方式为褪黑素与氨己烯酸制剂联用。
优选的，所述褪黑素的剂量为5～100mg/kg，氨己烯酸制剂的剂量为150～300mg/kg。
优选的，所述褪黑素的剂量为5～20mg/kg，氨己烯酸制剂的剂量为150mg/kg。
优选的，所述抗癫痫药物的剂型为注射给药剂型或胃肠道给药剂型。
优选的，所述注射给药剂型的输注方式为静脉内输注、腹膜内输注、皮下输注或肌肉输注。
本发明第二方面提出一种抗癫痫和改善氨己烯酸所致视网膜毒性的药物，所述药物为抗癫痫药物制剂中添加褪黑素。
优选的，所述药物中包括氨己烯酸。
优选的，所述药物还包括药学上可接受的赋形剂。
本发明的优点在于：
本申请在采用抗癫痫药物氨己烯酸治疗癫痫时，将褪黑素与氨己烯酸联用，不仅能够减轻癫痫单位时间内的发作次数，还能改善癫痫患者的学习记忆能力；同时能够显著延长癫痫伴随的婴儿痉挛症的发作潜伏期，并减少婴儿痉挛症的发作次数；还能延缓癫痫患者体内R-VGB和S-VGB的代谢，显著延长血浆中R-VGB和S-VGB的半衰期及平均滞留时间等药动学参数，可见，褪黑素通过影响药物代谢增强氨己烯酸抗癫痫疗效；此外，褪黑素与氨己烯酸联用还可以显著改善氨己烯酸诱导的视网膜损伤，大大降低了氨己烯酸治疗癫痫所带来的副作用。
附图说明
图1为本申请实施例1中各组大鼠I级癫痫发作次数统计结果图
图2为本申请实施例1中各组大鼠II级癫痫发作次数统计结果图
图3为本申请实施例1中各组大鼠III级癫痫发作次数统计结果图
图4为本申请实施例1中各组大鼠IV级癫痫发作次数统计结果图
图5为本申请实施例1中各组大鼠V级癫痫发作次数统计结果图
图6为本申请实施例2中各组大鼠的行为路线图
图7为本申请实施例2中各组大鼠对新物体的偏爱指数统计结果图
图8为本申请实施例3中各组幼鼠婴儿痉挛症的扭尾潜伏期统计结果图
图9为本申请实施例3中各组幼鼠婴儿痉挛症的屈曲潜伏期统计结果图
图10为本申请实施例3中各组幼鼠婴儿痉挛症发作次数统计结果图
图11为本申请实施例4中各组大鼠血浆中R-VGB的药时曲线图
图12为本申请实施例4中各组大鼠血浆中S-VGB的药时曲线图
图13为本申请实施例5中各组大鼠血浆中R-VGB和S-VGB药动学参数汇总表
图14为本申请实施例5中各组大鼠血浆中R-VGB和S-VGB药动学参数变化图
图15为本申请实施例6中各组大鼠外周视网膜HE染色图(n＝3)。
图1至图7中：
*P<0.05与对照组比较；**P<0.01与对照组比较；
#P<0.05与模型组比较；##P<0.01与模型组比较；
$P<0.05与VGB组(150mg/kg)比较；$$P<0.01与VGB组(150mg/kg)比较；
％P<0.05与MLT组(5mg/kg)比较；％％P<0.01与MLT组(5mg/kg)比较；
^P<0.05与MLT组(10mg/kg)比较；^^P<0.01与MLT组(10mg/kg)比较；
@P<0.05与MLT组(20mg/kg)比较；@@P<0.01与MLT组(20mg/kg)比较。
图8至图10中：
*P<0.05与对照组比较；**P<0.01与对照组比较；
#P<0.05与模型组比较；##P<0.01与模型组比较；
$P<0.05与VGB组(150mg/kg)比较；$$P<0.01与VGB组(150mg/kg)比较；
&P<0.05与VGB组(300mg/kg)比较；&&P<0.01与VGB组(300mg/kg)比较；
％P<0.05与MLT组(100mg/kg)比较；％％P<0.01与MLT组(100mg/kg)比较。
图13至图14中：
*P<0.05，**P<0.01，与VGB组(200mg/kg)相应R-VGB比较；
#P<0.05，##P<0.01，与VGB组(200mg/kg)相应S-VGB比较。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的试验材料和试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例中未注明具体技术或条件者，均可以按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实施例1
本实施例提供褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，研究褪黑素联用氨己烯酸(VGB)对KA诱导的癫痫大鼠单位时间内发作次数的影响。
将SD大鼠随机分为对照组、模型组以及造模成功后各给药组：褪黑素治疗组(5、10、20mg/kg)、阳性对照药物VGB组(50、150mg/kg)以及褪黑素联合VGB组(褪黑素：5、10、20mg/kg，VGB：150mg/kg)。对照组腹腔注射生理盐水，模型组腹腔注射KA诱导癫痫发作，KA初始剂量为10mg/kg，观察大鼠行为及状态，按Racine分级标准评估癫痫发作强度，1小时内若未观察到4级癫痫发作，将KA降低至5mg/kg，每30min注射一次并继续观察，直到出现4～5级癫痫发作，以纳入实验。造模结束后，给药组大鼠分别按照上述给药剂量持续灌胃给药4周进行治疗，对照组和模型组大鼠给予等体积溶媒。治疗结束后，除对照组外均再次腹腔注射KA，剂量为10mg/kg，按Racine分级标准，观察单位时间内各发作等级的癫痫发作的次数，结果如图1～5所示。
图1～5分别依次对应I级、II级、III级、IV级、V级的癫痫发作强度，对比可知：与阳性对照药物VGB组相比，褪黑素联用VGB组大鼠在单位时间内各等级癫痫发作次数整体均有所降低，尤其是高等级的癫痫发作次数显著减少。表明褪黑素联用VGB能够减轻单位时间内癫痫发作次数，且对于高等级癫痫发作次数的降低效果显著。
实施例2
本实施例提供褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，研究褪黑素联用氨己烯酸(VGB)对KA诱导的癫痫大鼠学习与记忆能力的影响。
对实施例1中各组大鼠进行新物体识别试验，新物体识别试验是检测实验动物学习与记忆能力的经典范式。新物体识别实验装置为一个尺寸为100cm×100cm×30cm的黑色长方体箱，实验分为适应期和检测期两个部分。实验前三天为适应期：每天将大鼠头朝箱体壁放入场地自由探索10min以熟悉环境；第四天为检测期，分为两个阶段：第一阶段：在箱子底部对角线的三分之一处各放置两个完全一样的物体，将实施例1中各组大鼠头朝箱体壁放入场地自由探索10min；24h后进入第二阶段：将其中一个旧物体更换成另一个颜色形状均不相同的新物体，并保持其位置不变，记录大鼠在5min内对新旧物体的探索行为。
各组大鼠的行为路线如图6所示，图中圆圈表示新物体，矩形表示旧物体。可以看出：模型组大鼠探索新物体的频率明显减少，说明癫痫会导致大鼠的学习与记忆能力下降；阳性对照药物VGB组大鼠对新物体接触的频率有所增加，说明VGB给药具有减轻大鼠的学习与记忆能力下降的效果；本实施例还另外增加了对照+褪黑素治疗组(10mg/kg)，可以看出对照组、模型组大鼠单用褪黑素对新物体的接触频率虽有所提高，但行为路线分布杂乱，大鼠的学习与记忆能力仍未得到较好的改善；而褪黑素联合VGB组大鼠与新物体均有较高的接触频率，且行为路线分布更为均匀，表明褪黑素联用VGB对KA给药所致大鼠学习与记忆能力下降具有明显的改善效果。
观察大鼠接触新旧物体的频率并计算大鼠对新物体的偏爱指数，新物体的偏爱指数：大鼠探索新物体的时间与探索新旧物体的时间的比值。各组大鼠对新物体的偏爱指数统计结果如图7所示。可以看出：模型组大鼠对新物体偏爱指数明显降低，而阳性对照药物VGB组和褪黑素联合VGB组大鼠对新物体的偏爱指数均有所提高，尤其是褪黑素联合VGB组(褪黑素10mg/kg，VGB：150mg/kg)大鼠对新物体的偏爱指数提升的最为明显，进一步说明了褪黑素联用VGB对KA给药所致大鼠学习与记忆能力下降具有明显的改善效果。
实施例3
本实施例提供褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，研究褪黑素联用氨己烯酸(VGB)对婴儿痉挛症大鼠扭尾潜伏期、屈曲潜伏期及发作次数的影响。
对SD孕鼠在孕晚期按照0.5mg/kg注射一次倍他米松和生理盐水；将幼鼠随机分为对照组、对照+褪黑素治疗组(100mg/kg)、模型组、褪黑素治疗组(25、50、100mg/kg)、阳性对照药物VGB组(150、300mg/kg)以及褪黑素联合VGB组(褪黑素：100mg/kg，VGB：150、300mg/kg)。对日龄在P13、P14和P15的幼鼠，给药组按照上述所示剂量进行灌胃给药，对照组和模型组给予等体积溶媒；在P15给药半小时后模型组和其他各给药组幼鼠腹腔注射NMDA(15mg/kg)进行造模，对照组和对照+褪黑素治疗组(100mg/kg)幼鼠腹腔注射生理盐水。幼鼠在注射NMDA后观察3小时内出现高度屈曲的情况：1.注射NMDA的5～10分钟后，幼鼠开始表现出行为变化—首先是尾巴扭动(它们的尾巴以快速、扫掠的“S”形动作摆动)，然后是一阵奔跑，中间是片刻的冰冻；2.注射NMDA后约15分钟出现第一次屈曲痉挛(即尾巴盘绕在身体下方，头部和颈部过度弯曲)。在两次痉挛之间，幼鼠绕着笼子跑，有时表现出冷冻行为，痉挛次数随着时间逐渐减少。观察NMDA造模后婴儿痉挛症幼鼠扭尾潜伏期、屈曲潜伏期以及发作次数，结果分别如图8、9、10所示。
从图8～10可以看出，与对照组、模型组和褪黑素用药组相比，阳性对照药物VGB组和褪黑素联合VGB组的婴儿痉挛症幼鼠扭尾潜伏期和屈曲潜伏期有所延长，痉挛发作次数有所减少；而与阳性对照药物VGB组相比，褪黑素联合VGB组的婴儿痉挛症幼鼠扭尾潜伏期和屈曲潜伏期显著延长，发作次数也显著减少，表明褪黑素对VGB在延长婴儿痉挛症幼鼠扭尾潜伏期和屈曲潜伏期与减少痉挛发作次数方面具有显著的增强效果。
实施例4
本实施例提供褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，研究褪黑素联用氨己烯酸(VGB)对大鼠血浆中R-VGB和S-VGB代谢的影响。
将SD大鼠随机分为阳性对照药物VGB组(200mg/kg)和褪黑素联合VGB组(褪黑素：20mg/kg，VGB：200mg/kg)，分别按照上述给药剂量对大鼠进行灌胃给药，并检测0～24h大鼠血浆中R-VGB和S-VGB的浓度变化情况，得到R-VGB和S-VGB的药时曲线分别如图11、12所示。
从图11、12可以看出，褪黑素联合VGB组大鼠血浆中R-VGB和S-VGB在两小时后的浓度均高于阳性对照药物VGB组，表明在采用VGB治疗癫痫时，联用褪黑素能够延缓血浆中R-VGB和S-VGB的代谢，有利于延长药效。
实施例5
本实施例提供褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，研究褪黑素联用氨己烯酸(VGB)对大鼠血浆中R-VGB和S-VGB药动学参数的影响。
将SD大鼠随机分为阳性对照药物VGB组(200mg/kg)和褪黑素联合VGB组(褪黑素：20mg/kg，VGB：200mg/kg)，分别按照上述给药剂量对大鼠进行灌胃给药，并检测大鼠血浆中R-VGB和S-VGB的药动学参数，结果如图13、14所示。
从图13、14可以看出，褪黑素联合VGB组大鼠血浆中R-VGB半衰期、表观分布容积、平均滞留时间均延长，S-VGB半衰期、平均滞留时间也有所延长，进一步说明在采用VGB治疗癫痫时联用褪黑素，褪黑素通过影响药物代谢增强氨己烯酸抗癫痫疗效。
实施例6
本实施例提供褪黑素在制备抗癫痫药物中的应用，研究褪黑素联用氨己烯酸(VGB)对癫痫大鼠视网膜形态学的影响。
对实施例1中各组大鼠经给药治疗(对照组和模型组为给予等体积溶媒)后，对大鼠的外周视网膜进行HE染色，结果如图15所示。可以看出：阳性对照药物VGB组大鼠的外周视网膜结构严重紊乱，锥状光感受器内外节严重扭曲、数量显著减少，证明了采用VGB治疗癫痫会严重诱导视网膜损伤；而将褪黑素与VGB联用后，显著改善了VGB诱导的视网膜损伤。
本申请的实施原理为：本申请在采用抗癫痫药物氨己烯酸治疗癫痫时，将褪黑素与氨己烯酸联用，不仅能够减轻癫痫单位时间内的发作次数，还能改善癫痫患者的学习记忆能力；同时能够显著延长婴儿痉挛症的发作潜伏期，并减少婴儿痉挛症的发作次数；还能延缓癫痫患者体内R-VGB和S-VGB的代谢，显著延长血浆中R-VGB和S-VGB的半衰期及平均滞留时间等药动学参数，可见，褪黑素通过影响药物代谢增强氨己烯酸抗癫痫疗效；此外，褪黑素与氨己烯酸联用还可以显著改善氨己烯酸诱导的视网膜损伤，大大降低了VGB治疗癫痫所带来的副作用。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (2)
1.褪黑素在制备改善氨己烯酸所致视网膜损伤药物中的应用，其特征在于：所述药物由褪黑素与氨己烯酸组成。
2.根据权利要求1所述的褪黑素在制备改善氨己烯酸所致视网膜损伤药物中的应用，其特征在于：所述褪黑素的剂量为5～20mg/kg，氨己烯酸制剂的剂量为150mg/kg。
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