CN115734789A - 降解剂-抗体缀合物及其使用方法 - Google Patents

降解剂-抗体缀合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

描述了降解剂‑抗体缀合物(DAC)，该降解剂‑抗体缀合物包含抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段。所述的降解剂分子包含泛素E3连接酶结合基团(E3LB)和蛋白结合基团(PB)。可以在抗体和降解剂分子(L1)之间以及在降解剂分子(L2)的泛素E3连接酶结合基团(E3LB)和蛋白结合基团(PB)之间使用接头。还描述了使用所述DAC的方法。

Description

降解剂-抗体缀合物及其使用方法
交叉引用
本申请要求2020年3月27日提交的美国临时申请号63/000,991和2020年6月26日提交的美国临时申请号63/044,699的权益，其各自通过引用以其全文并入本文。
背景技术
本领域仍然需要癌症治疗剂，特别是具有可以消退原发性肿瘤以及侵袭性肿瘤细胞和转移的改善的治疗范围的治疗剂。
旨在破坏肿瘤血管的癌症疗法过去由于毒性而在临床试验中失败。实例包括血管破坏剂，如考布他汀(Combretastatin)(CA4P)。参见，例如，Grisham等人.Clinical trialexperience with CA4P anticancer therapy：focus on efficacy，cardiovascularadverse events，and hypertension management.Gynecol Oncol Res Pract.2018；5：1。在II期FALCON研究中，CA4P将总生存期从16.2个月降低到13.6个月，并且有7名患者在接受CA4P治疗时经历了心脏病发作。同上。由于冠心病和中风是导致死亡的主要原因，因此任何靶向血管的毒性治疗都可能导致致命毒性的风险。
TM4SF1是在血管生成中具有功能性作用的内皮标志物。参见，例如，Shih等人.TheL6 protein TM4SF1is critical for endothelial cell function and tumorangiogenesis.Cancer Res.2009；69(8)：3272-7。
发明内容
一个实施方案提供了一种异双官能团化合物，该异双官能团化合物包含：
(a)抗TM4SF1抗体；和
(b)降解剂分子。
在一些实施方案中，降解剂分子包含单配体分子，所述单配体分子与靶蛋白直接相互作用以诱导所述靶蛋白的降解。在一些实施方案中，单配体分子是SERD、SARD、IAPP拮抗剂、Boc3Arg-连接的配体或其任何组合。在一些实施方案中，降解剂分子包含单配体分子，所述单配体分子与E3泛素连接酶相互作用以调节E3泛素连接酶的底物选择性。在一些实施方案中，降解剂分子包含嵌合降解剂分子。在一些实施方案中，嵌合降解剂分子包含特异性和非遗传性凋亡蛋白抑制剂(IAP)依赖性蛋白消除物(specific and nongeneticinhibitor of apoptosis protein(IAP)-dependent protein eraser，SNIPER)。在一些实施方案中，降解剂分子包含泛素E3连接酶结合基团(E3LB)和靶蛋白结合基团(PB)。在一些实施方案中，E3LB包含表1-15中任一表中鉴定的蛋白质。
在一些实施方案中，PB包含与选自以下中的蛋白质结合的肽或小分子：细胞内蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、引起疾病或疾病相关的蛋白、TNF受体相关死亡结构域蛋白(TRADD)、受体相互作用蛋白(RIP)、TNF受体相关因子2(TRAF2)、IK-α、IK-β、IK-ε、PLCγ、IQGAP1、Rac1、MEK1/2、ERK1/2、PI4K230、Akt1/2/3、Hsp90、GSK-3β、HDAC蛋白、FoxO1、HDAC6、DP-1、E2F、ABL、AMPK、BRK、BRSK I、BRSK2、BTK、CAMKK1、CAMKKα、CAMKKβ、Rb、Suv39HI、SCF、p19INK4D、GSK-3、pi 8 INK4、myc、细胞周期蛋白E、CDK2、CDK9、CDG4/6、Cycline D、p16INK4A、cdc25A、BMI1、SCF、Akt、CHK1/2、C 1δ、CK1γ、C 2、CLK2、CSK、DDR2、DYRK1A/2/3、EF2K、EPH-A2/A4/B/B2/B3/B4、EIF2A 3、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、p53、p21 Cip1、PAX、Fyn、CAS、C3G、SOS、Ta1、Raptor、RACK-1、CRK、Rap1、Rac、KRas、NRas、HRas、GRB2、FAK、PI3K、spred、Spry、mTOR、MPK、LKB1、PAK 1/2/4/5/6、PDGFRA、PYK2、Src、SRPK1、PLC、PKC、PKA、PKBα/β、PKCα/γ/ζ、PKD、PLK1、PRAK、PRK2、WAVE-2、TSC2、DAPK1、BAD、IMP、C-TAK1、TAK1、TAO1、TBK1、TESK1、TGFBR1、TIE2、TLK1、TrkA、TSSK1、TTBK1/2、TTK、Tp12/cot1、MEK1、MEK2、PLDLErk1、Erk2、Erk5、Erk8、p90RSK、PEA-15、SRF、p27 KIP1、TIF 1a、HMGN1、ER81、MKP-3、c-Fos、FGF-R1、GCK、GSK3β、HER4、HIPK1/2/3/、IGF-1R、cdc25、UBF、LAMTOR2、Stat1、StaO、CREB、JAK、Src、PTEN、NF-κB、HECTH9、Bax、HSP70、HSP90、Apaf-1、Cyto c、BCL-2、Bcl-xL、Smac、XIAP、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、CDC37、TAB、IKK、TRADD、TRAF2、R1P1、FLIP、TAK1、JNK1/2/3、Lck、A-Raf、B-Raf、C-Raf、MOS、MLK1/3、MN1/2、MSK1、MST2/3/4、MPSK1、MEKK1、ME K4、MEL、ASK1、MINK1、MKK 1/2/3/4/6/7、NE 2a/6/7、NUAK1、OSR1、SAP、STK33、Syk、Lyn、PDK1、PHK、PIM 1/2/3、Ataxin-1、mTORC1、MDM2、p21 Waf1、细胞周期蛋白D1、Lamln A、Tp12、Myc、联蛋白、Wnt、IKK-β、IKK-γ、IKK-α、IKK-ε、ELK、p65RelA、IRAKI、IRA 2、IRAK4、IRR、FADD、TRAF6、TRAF3、MKK3、MKK6、ROCK2、RSK1/2、SGK 1、SmMLCK、SIK2/3、ULK1/2、VEGFR1、WNK 1、YES1、ZAP70、MAP4K3、MAP4K5、MAPK1b、MAPKAP-K2 K3、p38α/β/δ/γMAPK、极光激酶(Aurora)A、极光激酶B、极光激酶C、MCAK、Clip、MAPKAPK、FAK、MARK1/2/3/4、Mucl、SHC、CXCR4、Gap-1、Myc、β-联蛋白/TCF、Cbl、BRM、Mcl-1、BRD2、BRD3、BRD4、BRDt、BRD7、BRD9、AR、RAS、ErbB3、EGFR、IRE1、HPK1、RIPK2、PDE4、ERRα、FKBP12、brd9、c-Met、Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt4、Sirt5、Sirt6、Sirt7、flt3、BTK.ALK、TRIM24、GSPT1、IKZF1(Ikaros)、IKZF3(Aiolos)、CK1-α、TACC3、p85、MetAP-2、DHFR、BET、CRABP-I/II、HIF1-α、PCAF、GCN5L2(GCN5)、SMARCA2、SMARCA4、PBRM1、HER2、Akt、Hsp90、HDAC15、HDAC14、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC150、HDAC151、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeCP2、MBD1、MBD2、MBD4、KAISO(ZBTB33)、ZBTB4、ZBTB38、UHRF1、UHRF2、TET1、TET2、TET3、HATI、HTATIP(TIP60)、MYST1(MOF)、MYST2(HBO1)、MYST3(MOZ)、MYST4(MORF)、P300(EP300、KAT3B)、CBP(CREBBP、KAT3A)、NCOA1(SRC1)、NCOA2(TIF2)、NCOA3(AIB1、ACTR)、ATF-2(CREB2、CREBP1)、TFIIIC、TAF1(TAFII250)、CLOCK(KIAA0334)、CIITA(MHC2TA)、MGEA5(NCOAT)、CDY、KMT1A、KMT1B、KMT1C、KMT1E、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2E、KMT2F、EZH1、EZH2、KMT3A、WHSC1、WHSC1L1、PRDM1、PRDM2、PRDM3、PRDM4、PRDM5、PRDM9、PRDM14、PRDM16、KMT3C、KMT3E、SMYD4、DOT1L、SET8、SUV4-20H2、SetD6、SET7/9、PRMT1、PRMT2、PRMT4、PRMT5、PRMT6、PRMT7、PRMT8、PRMT9、HP1、Chd1、WDR5、BPTF、L3MBTL1、ING2、BHC80、JMJD2A、KDM1A、KDM1B、KDM2A、KDM2B、KDM3A、KDM3C、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、JARID2、KDM6A、KDM6B、KDM6C、KDM7A、KDM7C、KDM7B、JMJD5、RSBN1、JMJD6、PADI4、K-Ras、PI3K、BTK、B-Raf、ERK、MEK、P65(RELA)、NFkB的p50(NFKB1)、Ras、Raf、eNOS、Smad家族蛋白、Smad2/3/4和ERα、其变体、其突变体、其剪接变体、其得失位(indel)和其融合物。
在一些实施方案中，PB包含PLCγ抑制剂；IQGAP1抑制剂；Rac1抑制剂；MEK1/2抑制剂；ERK1/2抑制剂；PI4K230抑制剂；Akt1抑制剂；Akt2抑制剂；Akt3抑制剂；GSK-3β抑制剂；HDAC6a抑制剂；热休克蛋白90(HSP90)抑制剂；激酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；MDM2抑制剂；靶向人溴结构域和末端外基序结构域家族蛋白的化合物；HDAC抑制剂；人赖氨酸甲基转移酶抑制剂；血管生成抑制剂；免疫抑制性化合物；靶向芳烃受体(AHR)的化合物、REF受体激酶、FKBP、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体、HIV蛋白酶、HIV整合酶、HCV蛋白酶、酰基蛋白硫酯酶-1(APT)、酰基蛋白硫酯酶2(APT2)、其任何项的药学上可接受的盐、其任何项的对映异构体、其任何项的溶剂化物或其任何项的多晶型物。
在一些实施方案中，降解剂分子进一步包含位于E3LB和PB之间的接头(L2)。在一些实施方案中，接头L2通过共价键连接E3LB和PB。在一些实施方案中，接头L2包含烷基接头或PEG接头。在一些实施方案中，接头L2包含烷基接头，其中烷基接头包含式(烷基)n，其中n为烷基碳数，并且其中n＝1-12。在一些实施方案中，接头L2包含PEG接头，其中PEG接头包含式(PEG)n，其中n为PEG重复单元数，并且其中n＝1-4。在一些实施方案中，接头L2包含一个或多个共价连接的A结构单元(例如，-A1...Aq-)，其中A1是与E3LB、PB或其组合中的至少一个偶联的基团。在一些实施方案中，A1将E3LB、PB或其组合直接连接至另一个E3LB、PB或其组合。在一些实施方案中，A1通过Aq将EL3B、PB或其组合间接连接至另一个E3LB、PB或其组合。在一些实施方案中，q是大于或等于0的整数。在一些实施方案中，q是大于或等于1的整数。在一些实施方案中，q大于或等于2，Aq是与E3LB部分连接的基团，并且A1和Aq通过A结构单元连接(此类A结构单元的数目：q-2)。在一些实施方案中，q为2，Aq是与A1和E3LB部分连接的基团。在一些实施方案中，q为1，接头基团L2的结构为-A1-，并且A1是与E3LB部分和PB部分连接的基团。在一些实施方案中，q为1至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20或1至10的整数。在一些实施方案中，异双官能团化合物进一步包含位于所述降解剂分子和所述抗TM4SF1抗体之间的接头(L1)。在一些实施方案中，接头L1包含可切割性接头或不可切割性接头。
在一些实施方案中，接头L1包含可切割性接头并且其中可切割性接头包含二硫化物接头、谷胱甘肽可切割性接头或其组合。在一些实施方案中，接头L1包含MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(环己烷-1-甲酸马来酰亚胺基甲酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯)、4-(吡啶-2-基硫基)己酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-乙基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丙基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环戊基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环己基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸N-琥珀酰亚胺酯)或SIAB((4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)。
在一些实施方案中，接头L1衍生自交联试剂，其中交联试剂包含N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、3-环丙基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、3-环丁基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-(2-吡啶基二硫代基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)、4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-(2-吡啶基二硫代基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)、4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)或17-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5，8，11，14-四氧代-4，7，10，13-四氮杂十七烷-1-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CX1-1)。
在一些实施方案中，接头L1包含肽模拟接头。在一些实施方案中，肽模拟接头包含式-Str-(PM)-Sp，其中Str是与Ab共价附接的延伸单元(stretcher unit)；Sp是与降解剂部分共价附接的键或间隔子单元；并且PM是选自以下中的非肽化学部分：
Figure BDA0003967617510000071
W是-NH-杂环烷基-或杂环烷基；Y是杂芳基、芳基、-C(Q)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH--CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6亚烷基(alkylenyl)；每个R1独立地是C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；R3和R2各自独立地是H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2一起可以形成C3-C7环烷基；并且R4和R5各自独立地是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或R4和R5可以形成C3-C7环烷基环。在一些实施方案中，接头L1包含非肽模拟接头。在一些实施方案中，非肽模拟接头包含具有以下结构：
Figure BDA0003967617510000072
其中，R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基，或R1和R2形成3、4、5或6元环烷基或杂环基基团。
在一些实施方案中，抗TM4S F1抗体或其抗原结合片段包含修饰的IgG Fc区，其中相对于野生型IgG Fc区，该修饰的IgG Fc区包含一个或多个置换。在一些实施方案中，野生型IgG Fc区是野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区。在一些实施方案中，野生型Fc区是IgG1Fc区，并且其中修饰的IgG Fc区包含IgG1 Fc区，所述IgG1 Fc区在选自以下中的一个或多个位置处包含突变：野生型IgG1 Fc区的E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434；如通过Kabat中所述的EU索引编号的。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置N297的突变。在一些实施方案中，位置N297的突变包括N297C。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置E233的突变。在一些实施方案中，位置E233的突变包含E233P。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置L234的突变。在一些实施方案中，位置L234的突变包含L234A。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置L235的突变。在一些实施方案中，位置L235的突变包含L235A。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置G237的突变。在一些实施方案中，位置G237的突变包含G237A。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置M252的突变。在一些实施方案中，位置M252的突变包含M252Y。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置S254的突变。在一些实施方案中，位置S254的突变包含S254T。在一些实施方案中，IgG1Fc区包含位置T256的突变。在一些实施方案中，位置T256的突变包含T256E。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置M428的突变。在一些实施方案中，位置M428的突变包含M428L。
在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置N434的突变。在一些实施方案中，位置N434的突变包含N434S或N434A。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置T250的突变。在一些实施方案中，位置T250的突变包含T250Q。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置D265的突变。在一些实施方案中，位置D265的突变包含D265A。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含位置K322的突变。在一些实施方案中，位置K322的突变包含K322A。在一些实施方案中，IgG1Fc区包含位置P331的突变。在一些实施方案中，位置P331的突变包含P331G。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含T250Q和M428L。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含M428L和N434S。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含L234A、L235A和G237A。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含L234A、L235A、G237A和P331G。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C和P331G。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和P331G。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和N297C。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C、K322A和P331G。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含E233P和D265A。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含M252Y、S254T、T256E和N297C。在一些实施方案中，IgG1 Fc区包含选自SEQ ID No.87-88、135-145和151-153中的氨基酸序列。在一些实施方案中，IgG1 Fc区表现出一种或多种以下特性：(i)减少或消除与C1q的结合，(ii)减少或消除与Fc受体的结合，和(ii)减少或消除ADCC或CDC效应子功能。在一些实施方案中，野生型Fc区是IgG4 Fc区，并且其中修饰的IgG Fc区包含IgG4 Fc区，所述IgG4 Fc区在选自以下中的一个或多个位置处包含突变：野生型IgG4 Fc区的S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297，如通过Kabat中所述的EU索引编号的。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含位置S228的突变。在一些实施方案中，位置S228的突变是S228P。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含位置F234的突变。在一些实施方案中，位置F234的突变是F234A。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含位置L235的突变。
在一些实施方案中，位置L235的突变是L235E。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变S228P和L235E。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变S228P、L235E和N297C。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变S228P、F234A、L235E和N297C。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变M428L和N434S。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变L235E和F234A。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变S228P、L235E和N297C。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变S228P、F234A、L235A、G237A和P238S。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变F243A和V264A。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变S228P和L235A。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变M252Y和M428L；D259I和V308F；或N434S。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含突变T307Q和N434S；M428L和V308F；Q311V和N434S；H433K和N434F；E258F和V427T；或T256D、Q311V和A378V。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含一种或多种以下特性：(i)减少或消除与Clq的结合；(ii)减少或消除与Fc受体的结合；和(iii)减少或消除ADCC或CDC效应子功能。在一些实施方案中，包含IgG4 Fc区的抗TM4SF1抗体包含选自SEQ ID No.146-150和154-155中的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：a)重链，该重链包含：CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO：8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO：7、19、31、43、55、67、79、95、116或117中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ ID NO：6、18、30、42、54、66、78、94或115中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；b)轻链，该轻链包含CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO：14、26、38、50、62、74、86、110或129中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQ IDNO：13、25、37、49、61、73、85、109或128中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72或84、107、108、124、125、126或127中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重链包含与SEQ ID NO：3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132具有至少75％同一性的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO：9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133具有至少75％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，重链包含如以下中的任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO：3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132，并且轻链包含如以下中的任一项所述的氨基酸序列：SEQ IDNO：9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133。
在一些实施方案中，降解剂分子包含具有选自以下中的结构的化合物：
Figure BDA0003967617510000111
Figure BDA0003967617510000121
一个实施方案提供了一种治疗或预防对象的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括施用根据上述实施方案中任一项所述的异双官能团化合物。在一些实施方案中，EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞、EC-血小板(凝血细胞)、EC-红细胞、EC-周细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。在一些实施方案中，疾病或病症是以下项中的至少一种：(i)以病理性血管生成为特征的疾病；(ii)伤口愈合受损的疾病；(iii)心血管疾病，(iv)感染，和(v)癌症。在一些实施方案中，疾病或病症是以病理性血管生成为特征的疾病，并且其中以病理性血管生成为特征的疾病是年龄相关性黄斑变性。在一些实施方案中，疾病或病症是以伤口愈合受损为特征的疾病，并且其中以伤口愈合受损为特征的疾病是糖尿病性溃疡。在一些实施方案中，疾病或病症是心血管疾病，并且其中心血管疾病是动脉粥样硬化。在一些实施方案中，疾病或病症是感染，并且其中感染是由病毒引起的。在一些实施方案中，病毒是冠状病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症，并且其中癌症选自：乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。
一个实施方案提供了一种治疗或预防对象的炎症的方法，所述方法包括向所述对象施用根据上述实施方案中任一项的异双官能团化合物。一个实施方案提供了一种治疗或预防对象的炎症的方法，所述方法包括抑制内皮细胞和免疫细胞之间的相互作用或抑制内皮细胞和血小板之间的相互作用。一个实施方案提供了一种治疗或预防对象的炎症的方法，所述方法包括抑制内皮细胞分泌趋化因子或抑制内皮细胞对细胞因子和其他分子(例如TGF-β)的应答。一个实施方案提供了一种治疗对象的心血管疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用能够降解Brd4的化合物。一个实施方案提供了一种治疗对象的淋巴或血行转移的方法，该方法包括向对象施用根据上述实施方案中任一项的异双官能团化合物。一个实施方案提供了一种治疗对象的炎症性疾病或病症的方法，该方法包括施用包含降解剂分子和抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物。其中降解剂分子靶向一种或多种用于降解的蛋白质，其中一种或多种用于降解的蛋白质选自：Akt、Hsp90、HDAC6、K-Ras、PI3K、BTK、B-Raf、ERK、MEK、P65(RELA)、NFkB的p50(NFKB1)、Ras、Raf、eNOS、Smad家族蛋白、Smad2/3/4及其组合。在一些实施方案中，炎症性疾病或病症是病理性血管生成。在一些实施方案中，对象是人。
一个实施方案提供了一种治疗对象的癌症的方法，该方法包括与免疫调节剂联合施用根据上述实施方案中任一项的异双官能团化合物。在一些实施方案中，免疫调节剂包括与选自以下中的蛋白质结合的试剂：A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD27、CD137、2B4、TIGIT、CD155、ICOS、HVEM、CD40L、LIGHT、TIM-1、OX40、DNAM-1、PD-L1、PD1、PD-L2、CTLA-4、CD8、CD40、CEACAM1、CD48、CD70、A2AR、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAG-3、TIM-3和VISTA。
一个实施方案提供了一种异双官能团化合物，其包含：
(a)抗TM4SF1抗体；和
(b)降解剂分子，其中降解剂分子包含以下结构：
Figure BDA0003967617510000151
在一些实施方案中，异双官能团化合物包含约2.0的降解剂与抗体比(DAR)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体包含IgG1 Fc区，该IgG1 Fc区包含以下突变：M252Y、S254T、T256E和N297C，如通过Kabat中所述的EU索引编号的。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体包含：重链，该重链包含：CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO：8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO：7、19、31、43、55、67、79、95、116或117中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ IDNO：6、18、30、42、54、66、78、94或115中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及轻链，该轻链包含：CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO：14、26、38、50、62、74、86、110或129中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO：13、25、37、49、61、73、85、109或128中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ ID NO：12、24、36、48、60、72或84、107、108、124、125、126或127中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
一个实施方案提供了一种治疗对象的癌症的方法，该方法包括施用根据上述实施方案中任一项的异双官能团化合物。在一些实施方案中，该方法包括与免疫调节剂联合施用异双官能团化合物。在一些实施方案中，对象是人。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文中，其程度犹如具体地且单独地指出每个单独的出版物、专利或专利申请均通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖性特征在所附权利要求中具体地阐述。通过参考阐述其中利用本公开的原理的说明性实施方案的以下详细描述以及如下附图，将获得对本公开的特征和优点的更好理解：
图1A、图1B和图1C提供了用于与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的示例性Brd4降解剂化合物的结构。
图2提供了用于与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的示例性Brd4降解剂化合物的各种结构。
图3提供了Brd4降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图4提供了示例性降解剂抗体缀合物的结构，其包含Brd4降解剂和抗TM4SF1抗体。
图5提供了Brd4降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图6提供了示例性降解剂抗体缀合物的结构，其包含Brd4降解剂和抗TM4SF1抗体。
图7提供了Brd4降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图8提供了示例性降解剂抗体缀合物的结构，其包含Brd4降解剂和抗TM4SF1抗体。
图9提供了Brd4降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图10提供了示例性降解剂抗体缀合物的结构，其包含Brd4降解剂和抗TM4SF1抗体。
图11提供了Brd4降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图12提供了示例性降解剂抗体缀合物的结构，其包含Brd4降解剂和抗TM4SF1抗体。
图13提供了BCL-XL降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图14提供了BCL-XL降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图15提供了BCL-XL降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的合成方案。
图16提供了用于与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合的示例性AKT降解剂的结构。
图17提供了用于使用二甲基甲磺酸酯接头与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合以形成降解剂抗体缀合物(DAC)的示例性Brd4降解剂化合物的结构。
图18显示了相比于对照归一化的核Brd4比率的结果，如在内皮细胞中孵育四小时后，对以1.33pM、13.33pM、133.33pM、1.33nM和13.33nM的示例性DAC(A07-YTEC-Brd4降解剂化合物1)的浓度所评价的。
图19显示了与对照相比(图的上半部分)，示例性抗TM4SF1降解剂抗体缀合物(以133.33pM(0.13333nM)的A07-YTEC-Brd4降解剂化合物1；图的下半部分)的Brd4降解图像。
图20显示了使用内皮细胞和以下示例性DAC中的一种进行的体外测定的第5天生存力研究的结果：在DAR为5.5(DAC15)时的A07-YTEC-S-SO2Me-烷基-Brd4降解剂化合物1、在DAR为4.5(DAC14)时的A07-YTEC-S-SO2Me-烷基-Brd4降解剂化合物1和A07-YTEC-PEG4Ahx-DM1。
图21显示了使用胰腺癌细胞和以下示例性DAC中的一种进行的体外测定的第5天生存力研究的结果：在DAR为5.5(DAC15)时的A07-YTEC-S-SO2Me-烷基-Brd4降解剂化合物1和在DAR为4.5(DAC14)时的A07-YTEC-S-SO2Me-烷基-Brd 4降解剂化合物1以及A07-YTEC-PEG4Ahx-DM1。
图22显示了使用腺癌人肺泡基底上皮细胞和以下示例性DAC中的一种进行的体外测定的第5天生存力研究的结果：在DAR为5.5(DAC15)时的A07-YTEC-S-SO2Me-烷基-Brd 4降解剂化合物1和在DAR为4.5(DAC14)时的A07-YTEC-S-SO2Me-烷基-Brd 4降解剂化合物1以及A07-YTEC-PEG4Ahx-DM1。
图23提供了光谱，其显示示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物(DAC15)的药物与抗体(DAR)比，具有约5.5的DAR。
图24提供了光谱，其显示示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物(DAC14)的药物与抗体(DAR)比，DAR为约4.5。
图25提供了使用尺寸排阻柱和与降解剂(DAC15)缀合的示例性抗TM4SF1抗体产生的色谱图，DAR为约5.5。
图26提供了使用尺寸排阻柱和与降解剂(DAC14)缀合的示例性抗TM4SF1抗体产生的色谱图，DAR为4.5。
图27显示了用于本文提供的细胞杀伤和体内肿瘤消退研究中检测的降解剂抗体缀合物的示例性Brd4降解剂的结构。
图28显示了在DAR为5.5(DAC15)或4.5(DAC14)时A07-YTEC-S-SO2Me-烷基-Brd4降解剂缀合物。BRD4水平通过DAC处理后在4小时或24小时的Western印迹信号强度进行定量。
图29显示了提供示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物(DAC13)的药物与抗体(DAR)比的光谱。
图30A-30B提供了显示药物与抗体(DAR)比的光谱(图30A)和在DAR为5.5(DAC15)时示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的SEC光谱(图30B)。
图31A-31B提供了显示药物与抗体(DAR)比的光谱(图31A)和在DAR为4.5(DAC14)时示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的SEC光谱(图31B)。
图32A-32B提供了显示药物与抗体(DAR)比的光谱(图32A)和在DAR为1.0(DAC12)时示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的SEC光谱(图32B)。
图33A-33B提供了显示药物与抗体(DAR)比的光谱(图33A)和在DAR为1.6(DAC11)时示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的SEC光谱(图33B)。
图34A-34B提供了显示药物与抗体(DAR)比的光谱(图34A)和在DAR为1.9(DAC9)时示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的SEC光谱(图34B)。
图35A-35B提供了显示药物与抗体(DAR)比的光谱(图35A)和在DAR为1.8(DAC8)时示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的SEC光谱(图35B)。
图36提供了通过位点特异性缀合在DAR为2.0时示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的示意图。
图37A-37B提供了显示药物与抗体(DAR)比的光谱(图37A)和在DAR为2.0时通过位点特异性缀合的示例性抗TM4SF1抗体降解剂缀合物的SEC光谱(图37B)。
图38显示了HUVEC和A549中的BRD4蛋白降解在DAR1.9下用示例性抗TM4SF1降解剂缀合物处理24小时进行定量。
图39显示了用DAR1.9或DAR5.0的示例性抗TM4SF1DAC和游离BRD4降解剂化合物1处理的HUVEC细胞。
图40显示了在用示例性抗TM4SF1降解剂缀合物处理后肿瘤体积的影响。
具体实施方式
在几个实施方案中，本公开提供了降解剂-抗体缀合物(DAC)，其包含降解剂分子和抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。降解剂是嵌合分子，其能够通过细胞内蛋白水解而触发非期望的蛋白降解。在一些情况下，降解剂含有两个部分，一部分靶向非期望的蛋白质，并且另一部分与E3泛素连接酶接合。降解剂促进E3泛素连接酶对非期望的蛋白进行泛素化，从而导致蛋白酶体随后对非期望的蛋白进行降解。
定义
除非在本文中另有定义，否则与本公开关联使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围应当是清楚的，然而，如果存在任何潜在歧义，则本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文另有要求，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括”以及其他形式如“包含”和“含有”的使用不是限制性的。
通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学和杂交关联使用的命名及其技术是本领域公知且常用的。除非另有规定，否则本公开的方法和技术通常根据本领域公知的以及如本说明书通篇引用和论述的各种通用的和更具体的参考文献中描述的常规方法来进行。酶反应和纯化技术按照制造商的说明书进行，以本领域通常实现的方式进行，或如本文所述进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联使用的命名及其实验室程序和技术是本领域公知且常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。
为了可以更容易地理解本公开内容，所选术语如下定义。如本文所用的术语“跨膜-4L六家族成员-1”或“TM4SF1”是指跨膜4超家族/四次穿膜蛋白(tetraspanin)家族的多肽，该多肽在肿瘤脉管系统内皮细胞(EC)、肿瘤细胞(TC)、发育中的视网膜脉管系统的EC以及血管生成性血管上高度表达。TM4SF1具有被四个跨膜结构域(M1、M2、M3和M4)隔开的两个细胞外环(ECL1和ECL2)、N末端和C末端以及细胞内环(ICL)。ECL2含有两个N-糖基化位点。人TM4SF1(hTM4SF1)的氨基酸序列以SEQ ID NO：90描述(也参见NCBI参考序列号NP_055035.1)。
如本文所用的术语“抗体”意指包含与特定抗原(例如TM4SF1)特异性结合或相互作用的至少一个互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子及其多聚体(例如IgM)，该免疫球蛋白分子包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。每条重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH区和VL区可进一步细分为超变区，被称为互补决定区(CDR)，其中散布有更保守的区域，被称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。在本公开的不同实施方案中，抗TMS4F1抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或者可被天然地或人工地修饰。可以基于对两个或更多个CDR的并排分析来确定氨基酸共有序列。
术语“完整抗体”是指一种抗体，所述抗体包含四条多肽链，即通过二硫键相互连接的两条重(H)链和两条轻(L)链。在一个实施方案中，所述抗TM4SF1抗体是完整抗体。在一个实施方案中，该完整抗体是完整的人IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、IgG2或IgG4同种型。
如本文所用的，术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”或“抗体片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可以酶法获得的、合成的或遗传工程化的多肽或糖蛋白。例如，抗体的抗原结合片段可使用任何合适的标准技术从完整抗体分子衍生，所述技术例如是蛋白水解消化，或涉及对编码抗体可变结构域和任选的恒定结构域的DNA的操作和表达的重组遗传工程技术。这样的DNA是已知的，并且/或者易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者可以合成获得。可对DNA进行测序，并且以化学方式或通过使用分子生物学技术进行操作，例如用以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域排列成合适的构型，或者用以引入密码子，创建半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸，等等。
抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的超变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR)，如CDR3肽)，或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。
如本文所用的术语抗体或其片段的“可变区”或“可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链的部分，其包括互补决定区(CDR；即CDR-1、CDR-2和CDR-3)和框架区(FR)的氨基酸序列。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。根据本公开中使用的方法，分配给CDR和FR的氨基酸位置可根据Kabat(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991))来确定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号也按照Kabat的编号。
如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区，这些CDR被指定为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用的术语“CDR集”是指存在于单一可变区中的能够结合抗原的一组三个CDR。这些CDR的精确边界已根据不同系统以不同方式限定。由Kabat(Kabat等人，Sequencesof Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1987)和(1991)))描述的系统不仅提供适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供界定三个CDR的确切残基边界。这些CDR可被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia等人，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)和Chothia等人，Nature 342：877-883(1989))发现，Kabat CDR内的某些子部分尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性，但却采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区域和重链区域。这些区域可被称为Chothia CDR，它们具有与Kabat CDR重叠的边界。界定与Kabat CDR重叠的CDR的其他边界已由Padlan(FASEB J.9：133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5)：732-45(1996))描述。其他CDR边界界定可能不严格遵循以上系统之一，但仍然与Kabat CDR重叠，尽管鉴于特定残基或残基组乃至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验发现，它们可以是缩短的或延长的。本文所用的方法可利用根据这些系统中的任何系统所确定的CDR，但优选实施方案使用Kabat或Chothia确定的CDR。
如本文所用的术语“框架区”(在下文中称为FR)是指除CDR残基以外的那些可变结构域残基。每个可变结构域一般具有四个FR，被标识为FR1、FR2、FR3和FR4。抗体或其功能片段的可变区之间的共同结构特征是本领域公知的。编码特定抗体的DNA序列通常可按照公知方法来获得，所述方法例如是通过引用并入本文中的Kabat等人1987Sequence ofProteins of Immunological Interest，U.S.Department of Health and HumanServices，Bethesda MD中描述的那些方法。另外，用于从抗体克隆功能性可变区的一般方法可见于通过引用并入本文中的Chaudhary，V.K.等人，1990 Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1066中。
本文的术语“Fc区”用来定义抗体重链的C末端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变异Fc区。尽管抗体重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区常常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至其羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据Kabat等人中的EU编号系统的残基447)可以例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程化编码抗体重链的核酸而被去除。因此，完整抗体的组合物可包含已去除所有K447残基的抗体群体，没有去除K447残基的抗体群体，以及具有含K447残基的抗体和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。此外，本公开中完整抗体的组合物可包含在C末端赖氨酸K447之后具有残基延伸的抗体群体。
如本文所用的术语“人源化抗体”是指与目的抗原(例如人TM4SF1)免疫特异性结合并且包含基本上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和基本上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。通常，人源化抗体将包含基本上全部至少一个、通常两个可变结构域，其中全部或基本上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，并且全部或基本上全部FR区是人免疫球蛋白序列的FR区。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白共有序列的至少一部分。抗体人源化方法是本领域已知的。参见，例如，Riechmann等人，1988，Nature 332：323-7；Queen等人的美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan，1991，Mol.Immunol.，28：489-498；Studnicka等人，1994，Prot.Eng.7：805-814；Roguska等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973；以及美国专利号5,565,332，所述文献全部均通过引用整体并入本文。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体中获得的抗体，即，除了可能少量存在的可能的突变，例如天然发生的突变外，构成该群体的各个抗体是相同的。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是离散抗体的混合物。在某些实施方案中，这样的单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合性多肽序列通过包括从多个多肽序列中选择单一靶标结合性多肽序列的过程来获得。例如，选择过程可以是从多个克隆，例如从杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的库中选择独特的克隆。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品的每种单克隆抗体针对抗原上的单个表位。
如本文所用的术语“嵌合抗体”是指抗体(免疫球蛋白)，其具有重链和/或轻链的部分，该部分与来源于特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与来源于另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们展现所需的生物活性即可(美国专利号4,816,567；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。
如本文所用的术语“表位”是指与抗体分子的可变区中被称为互补位的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单一抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可与抗原上的不同区域结合，并且可具有不同的生物效应。表位可被定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子集，并且具有对相互作用的亲和力作出直接贡献的那些残基。表位还可以是构象性的，即，由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括作为分子的化学活性表面基团诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的决定簇，并且在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。
术语“结合亲和力”通常是指分子(例如结合蛋白，如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。结合分子X(例如抗TM4SF1抗体)对其结合配偶体Y(例如人TM4SF1)的亲和力通常可用解离常数(KD)表示。亲和力可通过本领域已知的常用方法来测量，所述方法包括本文所述的那些方法。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快结合抗原并倾向于更久地保持结合。各种测量结合亲和力的方法是本领域已知的，其中任何方法均可用于本公开。具体的说明性实施方案包括以下。在一个实施方案中，“KD”或“KD值”可通过本领域已知的测定，例如通过结合测定来测量。KD可在例如用目的抗体的Fab变化形式及其抗原进行的RIA中测量(Chen等人，1999，J.Mol Biol 293：865-81)。KD还可以通过以下方式测量：使用FACS，或使用例如BIACORE 2000或BIACORE3000通过BIACORE进行的表面等离子体共振测定，或通过使用例如OCTET QK384系统进行的生物层干涉测量法。在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体的KD通过使用采用HUVEC细胞进行的标准流式细胞术测定来确定。“结合速率”或“缔合的速率”或“缔合速率”或“kon”和“脱离速率”或“解离速率”或“解离的速率”或“koff”还可使用例如BIACORE 2000或BIACORE 3000或OCTET QK384系统，通过以上所述的相同表面等离子体共振或生物层干涉测量技术来确定。
如本文所用的，术语“kon”旨在表示如本领域已知，抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的结合速率常数。
如本文所用的，术语“koff”旨在表示如本领域已知，抗体从抗体/抗原复合物上解离的解离速率常数。
术语“抑制”当在本文中使用时是指部分(如1％、2％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％、99％)或完全(即100％)抑制。
如本文所用的术语“癌症”是指或描述哺乳动物中的生理状况，该状况的特征一般是不受调节的细胞生长。
如本文所用的术语“与高转移风险相关的癌症”是指与已知会增加患有癌症的对象发生转移性癌症的风险的至少一种因素相关的癌症。与转移风险增加相关的因素的实例包括但不限于对象在初始癌症诊断时具有的癌性淋巴结的数目、肿瘤的大小、组织学分级，以及在初始诊断时癌症的分期。
如本文所用的术语“血行转移”是指癌细胞穿透血管壁的能力，之后它们能够通过血流循环(循环肿瘤细胞)到身体中的其他部位和组织。
如本文所用的术语“淋巴转移”是指癌细胞穿透淋巴管并且排入血管中的能力。
在本公开的背景下，如本文所用的术语“治疗”或“处理”意指逆转、减轻、预防应用这种术语的病症或病况或这种病症或病况的一种或多种症状或抑制其进展。如本文所用的术语“治疗癌症”意指抑制癌细胞的生长和/或增殖。在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法用来治疗患有转移性癌症的对象中的转移。
术语“预防癌症”或“癌症的预防”是指延迟、抑制或预防哺乳动物中癌症的发作，在该哺乳动物中，肿瘤形成或肿瘤发生的发作未经证实，但癌症倾向得到确认，无论是通过例如遗传筛查还是以其他方式确定。该术语还涵盖治疗具有恶化前状况的哺乳动物，以使恶化前状况向恶性病的进展停止，或导致恶化前状况的消退。恶化前状况的实例包括增生、发育不良和化生。在一些实施方案中，预防癌症针对处于癌症缓解期的对象来使用。
各种癌症，包括恶性或良性和/或原发性或继发性癌症，可用本公开的方法来治疗或预防。这类癌症的实例是本领域技术人员已知的，并且在标准教科书如Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(由Merck出版)中列出。
如本文所用的术语“对象”是指哺乳动物(例如人)。
如本文所用的术语“施用”是指向对象给予一定剂量的抗体或其片段或组合物(例如药物组合物)的方法。施用方法可根据各种因素(例如，所施用的结合蛋白或药物组合物，以及所治疗的病况、疾病或病症的严重程度)而不同。
如本文所用的术语“有效量”是指本文提供的抗体或药物组合物的足以导致所需结果的量。
术语“约”和“大约”意指在给定值或范围的20％以内、15％以内、10％以内、9％以内、8％以内、7％以内、6％以内、5％以内、4％以内、3％以内、2％以内、1％以内或更小百分比内。
如在本文中可互换使用的术语“同一性”或“同源性”可以是两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列之间的“同一性”、“同源性”或“同源性百分比”的计算，其可以通过为了最佳比较目的而对序列进行比对来确定(例如，可以在第一序列的序列中引入空位)。然后可以比较相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可以是序列共有的相同位置数目的函数(即，％同源性＝相同位置的数目/位置的总数目x 100)。例如，如果第一序列中的位置可以被与第二序列中的相应位置相同的核苷酸占据，则分子在该位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可以是序列共有的相同位置的数目的函数，其中考虑为了两个序列的最佳比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度。在一些实施方案中，为了比较目的而比对的序列的长度可以是参考序列长度的至少约：30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或95％。
Figure BDA0003967617510000281
搜索可以确定两个序列之间的同源性。这两个序列可以是基因、核苷酸序列、蛋白质序列、肽序列、氨基酸序列或其片段。对两个序列的实际比较可以通过公知的方法来完成，例如，使用数学算法。这样的数学算法的非限制性实例可描述于Karlin，S.和Altschul，S.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90-5873-5877(1993)中。如Altschul，S.等人，NucleicAcids Res.，25：3389-3402(1997)中所述，这样的算法可以并入NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，NBLAST)的任何相关参数。例如，用于序列比较的参数可设置为分数＝100，字长＝12，或可变化(例如，W＝5或W＝20)。其他实例包括Myers和Miller的算法，CABIOS(1989)、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在另一个实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用例如GCG软件包(Accelrys，Cambridge，UK)中的GAP程序来完成。
如本文所用的术语“可制备性”是指特定蛋白质在该蛋白质的重组表达和纯化期间的稳定性。可制备性被认为是由于在表达和纯化条件下分子的内在性质。改善的可制备性特性的实例包括蛋白质的均一糖基化，在蛋白质的重组产生期间增加的细胞效价、生长和蛋白质表达，改善的纯化性质，较低的聚集或不聚集倾向，以及改善的稳定性，包括但不限于热稳定性和在低pH下的稳定性。在一些实施方案中，提供了与其他TM4SF1抗体相比展示出可制备性以及体外和体内活性的保留的TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，通过在CDR或框架区中进行氨基酸置换对亲本TM4SF1结合蛋白进行人源化可赋予额外的可制备性益处。
在一些实施方案中，提供了展示出改善的可开发性特性的TM4SF1结合蛋白，所述特性包括但不限于例如在蛋白A纯化或尺寸排阻色谱法之后改善的纯化产率、在纯化之后改善的均质性、改善的热稳定性。在一些情况下，改善是对于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体而言的，如通过HLA分子结合所确定的。
在一些实例中，结合亲和力通过Scatchard分析来确定，该分析包括产生Scatchard图，Scatchard图是结合的配体与未结合的配体的浓度比相对于结合的配体浓度的图。
术语“血管毒性”是指抗TM4SF1抗体或其抗原结合或包含其的异双官能团化合物的任何效果，该效果直接由于抗体或降解剂化合物对携带抗原的细胞的效果或间接通过激活免疫系统和由此产生的炎症而导致血管损伤。此类血管损伤可以包括但不限于影响血管内皮细胞或下层平滑肌细胞或周细胞或任何血管的基底膜(包括心内膜(心脏的衬里))的损伤或炎症。此类血管损伤可能影响动脉，包括大动脉，例如主动脉，弹性动脉(例如主动脉)，不同大小的肌动脉，例如冠状动脉、肺动脉、颈动脉、小动脉、毛细血管、脑或视网膜动脉；venues，静脉；或它可能影响血管生成性血管，包括供应毛囊、消化道和骨髓的血管。此类血管损伤可以包括在心脏、肺、肾脏、视网膜、脑、皮肤、肝脏、消化道、骨髓、内分泌腺、睾丸或卵巢、子宫内膜和其他靶器官中的微血管功能障碍或损伤，并且可以包括肾脏的、视网膜的或脑血管的循环功能障碍。
如本文所用的术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指由细胞毒性效应细胞通过非吞噬过程杀伤抗体包被的靶细胞，该非吞噬过程的特征在于释放细胞毒性颗粒的内含物或表达诱导细胞死亡的分子。ADCC通过靶标结合的抗体(属于IgG或IgA或IgE类别)与某些Fc受体(FcR)的相互作用来触发，所述Fc受体是存在于效应细胞表面上的结合免疫球蛋白(Ig)的Fc区的糖蛋白。介导ADCC的效应细胞包括天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和树突状细胞。ADCC是一种快速效应子机制，其有效性依赖于许多参数(靶细胞表面上的抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和FcR结合亲和力)。基于PBMC的ADCC测定和基于天然杀伤细胞的ADCC测定可用于检测ADCC。这些测定中的读出数据是终点驱动的(靶细胞裂解)。
术语“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的激活由补体系统的第一组分(C1q)与(适当子类的)抗体的结合引发，所述抗体与其同源抗原结合。为了评估补体激活，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，1996，J.Immunol.Methods 202：163)。已经描述了具有改变的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)以及增加或降低的C1q结合能力的多肽变体(参见例如美国专利号6,194,551；WO1999/51642；Idusogie等人，2000，J.Immunol.164：4178-84)。可以选择不具有或具有极低CDC活性的抗体(或片段)进行使用。
如本文所用的术语“效应子功能”是指由IgG的Fc效应结构域(例如免疫球蛋白的Fc区)所贡献的功能。这样的功能可通过例如Fc效应结构域与具有吞噬或裂解活性的免疫细胞上的Fc受体结合，或通过Fc效应结构域与补体系统的组分结合来实现。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调；以及B细胞激活。
如本文所用的术语“降低”或“消除”是指能够导致优选20％或更大，更优选50％或更大，最优选75％、85％、90％、95％或更大的总体减低。降低或消除可指两个分子的结合亲和力，例如免疫球蛋白与C1q或Fc受体的结合；或者可指正在治疗的病症(例如癌症)的症状，如转移的存在或大小或原发性肿瘤的大小。
如本文所用的术语“降低的ADCC/CDC功能”是指与对照(例如具有不包括突变的Fc区的抗体)相比，特定效应子功能例如ADCC和/或CDC降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更大。
对于本公开中讨论的所有氨基酸位置，在抗体或其抗原结合片段的背景下，编号是根据EU索引。“EU索引”或“Kabat等人中的EU索引”或“EU编号方案”是指EU抗体的编号(参见，Edelman等人，1969；Rabat等人，1991)。
异双官能团化合物
本文提供了异双官能团降解剂-抗体缀合物(DAC)组合物，其导致靶蛋白的泛素化和随后蛋白质的降解。异双官能团组合物包含抗体和降解剂。降解剂包含E3泛素连接酶结合(E3LB)部分(其中E3LB部分识别E3泛素连接酶蛋白)和识别靶蛋白的蛋白质结合部分(PB)。
术语“残基”、“部分”或“基团”是指与另一组分共价结合或连接的组分。例如，“降解剂的残基”是指与一个或多个基团(例如接头(L2))共价连接的降解剂，其本身可以任选地通过接头(L1)进一步与抗体连接。
在本文提供的一方面，本文所述的降解剂-抗体缀合物(DAC)包含通过接头(L1)而与降解剂缀合的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段；其中降解剂包含泛素E3连接酶结合基团(“E3LB”)、接头(“L2”)和蛋白结合基团(“PB”)。
DAC的示例性通式是Ab-(L1-D)p，其中D是具有结构E3LB-L2-PB的降解剂；其中，E3LB是与L2共价结合的E3连接酶结合基团；L2是与E3LB和PB共价结合的接头；PB是与L2共价结合的蛋白质结合基团；Ab是与L1共价结合的抗体；L1是接头，与Ab和D共价结合；并且p值为约1至约50。变量p反映抗体可以与一个或多个L1-D基团连接。在一个实施方案中，p为约1至8。在一种情况下，p为约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7或约8。
抗TM4SF1抗体(Ab)
TM4SF1是一种具有四次穿膜蛋白拓扑结构而没有同源性的小质膜糖蛋白(NCBI参考序列号NP_055035.1)(Wright等人，Protein Sci.9：1594-1600，2000)。它在质膜上形成富含TM4SF1的结构域(TMED)，在该结构域中，如同真正的四次穿膜蛋白一样，它充当募集功能上相关的膜和胞质分子的分子促进剂(Shih等人，Cancer Res.69：3272-3277，2009；Zukauskas等人，Angiogenesis.14：345-354，2011)，并且在癌细胞生长(Hellstrom等人，Cancer Res.46∶3917-3923，1986)、运动性(Chang等人，Int J Cancer.116：243-252，2005)和转移(Richman等人，Cancer Res.5916s-5920s，1995)中起重要作用。人TM4SF1蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_055035.1)在以下显示为SEQ ID NO：134。
MCYGKCARCI GHSLVGLALL CIAANILLYF PNGETKYASE NHLSRFVWFF SGIVGGGLLMLLPAFVFIGL EQDDCCGCCG HENCGKRCAM LSSVLAALIG IAGSGYCVIV AALGLAEGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHI VEWNVSLFSILLALG GIEFILCLIQVINGVLGGIC GFCCSHQQQYDC(SEQ ID NO：91)
本公开的一个实施方案提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物，其中抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含修饰的Fc区，例如包含一个或多个突变的修饰的IgG区(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)。在一些情况下，Fc区中的所述一个或多个突变导致包含这种修饰的Fc区的异双官能团化合物的改进，在改进的方面中例如：1)减少效应子功能，2)半衰期调节，3)稳定性，和4)下游过程。在一些情况下，修饰的Fc区可以包含一个或多个突变，这些突变将减少或消除抗体与免疫系统之间的相互作用。关键相互作用可以包括抗体Fc与白细胞和血小板上的Fcγ受体的相互作用，以及与补体系统的C1q的相互作用，导致补体依赖性细胞毒性。
在一些情况下，本公开提供了包含抗TM4SF 1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物，其例如在Fc区(在这种情况下是修饰的Fc区，例如修饰的IgG Fc区)包括免疫消除性突变。在一些实施方案中，修饰的Fc区包含位置N297的修饰。在一些实施方案中，修饰的Fc区包含修饰的IgG Fc区(例如，修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，其在以下位置处包含一个或多个突变：位置E233、L234或F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、N297、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434和H435或其任何组合。在一些实施方案中，Fc区在其C末端包含残基的延伸，以使得正电荷保持在C末端(例如，在一些情况下，如果抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含两条重链，则至少一条重链包含C末端残基的延伸)。此类残基的延伸可以包括添加一个或多个氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、脯氨酸或其任何组合。在一些实例中，Fc区的延伸C末端导致抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以及包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物的CDC功能减少。在一些情况下，通过在IgG1或IgG4中的Fc的K447之后添加KP残基，单独地或与其他突变(例如，K322A、P331G-IgG1)组合，可见这种效果。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包含效应子功能降低的抗体，包括Fc区残基238、265、269、270、297、327和329中一个或多个残基的置换(参见，例如，美国专利号6,737,056)。在一些情况下，Fc区中的此类突变可包含在氨基酸位置265、269、270、297和327中的两个或更多个处的置换，例如残基265和297被置换为丙氨酸(DANA突变，即D265A和N297A)(参见，例如，美国专利号7,332,581)。在一些情况下，Fc区中的突变可包含在一个或多个氨基酸位置E233、L234、L235、G237、D265、N297、K322和P331处的置换。在一些情况下，Fc区中的突变可包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297A、K322A和P331G中的至少一个，或它们的任何组合。例如，Fc区中的突变可包含L234A/L235A/G237A(IgG1)或F234A/L235E(IgG4)，并且包含此类突变的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可表现出改变的FcgRI相互作用。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含以下突变的Fc变体：在位置M428和N434处的氨基酸置换(M428L、N434S)(参见例如US9803023)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含以下突变的Fc变体：在位置T250和M428处的氨基酸置换(T250Q、M428L)(参见例如US9803023)。
在一些实施方案中，TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包含突变D265A和N297A。在一些情况下，野生型人Fc区的位置329的脯氨酸(P329)可被置换为甘氨酸或精氨酸或足以破坏Fc/Fcy受体界面内的脯氨酸夹心结构的大氨基酸残基，该夹心结构在Fc的P329与FcgRIII的色氨酸残基W87和WHO之间形成(参见，例如Sondermann等人，Nature 406，267-273(2000年7月20日))。在进一步的实施方案中，Fc区中的突变可包含一个或多个氨基酸置换，如S228P(IgG4)、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，并且在其他实施方案中：人IgG1 Fc区的L234A和L235A，或人IgG4 Fc区的S228P和F234A、L235A或L235E。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以包括修饰的Fc区，该修饰的Fc区是野生型人IgG Fc区的Fc变体，其中人IgG Fc区的P329被甘氨酸置换并且其中该Fc变体包含在人IgG1 Fc区的L234A和L235A或人IgG4 Fc区的S228P和L235E处的至少两个另外的氨基酸置换，并且其中所述残基根据EU编号进行编号(参见，例如，US8969526)。包含P329G、L234A和L235A置换的多肽可表现出对人FcyRIIIA和FcyRIIA的亲和力降低，用于将ADCC下调至由包含野生型人IgG Fc区的多肽诱导的ADCC的至少20％，和/或用于ADCP的下调(参见，例如，US8969526)。
在一些实施方案中，抗TM4SF 1抗体或其抗原结合片段可包括包含三重突变的Fc变体：位置P329处的氨基酸置换、L234A和L235A突变(P329/LALA)(参见，例如，US8969526)。
在一些实施方案中，本公开的某些抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可包含表现出与FcR结合的改善或减弱的突变。(参见，例如，US6737056；WO 2004/056312，和Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在一些情况下，抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以包括具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换的Fc区，例如在Fc区的位置298、333和/或334处的置换。可以在Fc区进行改变，这导致改变(即改善或减弱)的C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)，例如，如US6194551、WO 99/51642和Idusogie等人(2000)J.Immunol.164：4178-4184所述。
具有半衰期增加和与新生儿Fc受体(FcRn)结合提高的抗体。FcRn以其将母体IgG转移到胎儿的功能命名，它还可以通过将它们捕获在内体中并使其返回循环来防止抗体在溶酶体中降解。(参见，例如，Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)和Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))，描述于US2005/0014934。不受任何特定理论的束缚，设想具有与FcRn结合提高的抗体从TM4SF1分离并与FcRn结合，然后将抗体再循环回到循环，从而降低血管毒性。在本文的一些实施方案中，提供了包含具有一个或多个增强FcRn再循环的置换的Fc区的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段。在本文的一些实施方案中，提供了抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其包含其中具有提高Fc区与FcRn的结合的一个或多个置换(例如，在以下一个或多个位置处的置换：根据EU编号的238、250、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、428、424、434和435，例如，Fc区残基434的置换(US 7371826))的Fc区。还参见Duncan&amp；Winter，Nature 322：738-40(1988)；US 5648260；US 5624821；US2005/0014934和WO 94/29351，涉及Fc区变体的其他实例，其全部内容通过引用并入本文。
在一些实施方案中，本文提供了具有pH依赖性FcRn结合亲和力的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。不受任何特定理论的束缚，设想了具有pH依赖性FcRn结合亲和力的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在pH>7时与FcRn分离，并且在pH 6时与FcRn结合。因此，酸性pH亚细胞器中的FcRn，例如内体，结合此类抗体并携带抗体返回到细胞膜，并且在pH＞7时将抗体释放至血浆中，再循环抗体并避免与抗体缀合的有效负载的溶酶体释放。
在某些实施方案中，本文提供了抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其包含其中具有调节FcRn再循环的一个或多个置换的Fc区。在本文的一些实施方案中，提供了包含一个或多个置换的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述置换在酸性pH例如pH 6下增强FcRn结合，并且在中性或碱性pH例如pH 7下不影响FcRn结合。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包含在根据EU编号的位置250、252、254、256、428和434中的一个或多个处的置换。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括Fc变体，所述Fc变体包含T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S置换中的一个或多个。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换T250Q和M428L的IgG1 Fc变体(“QL突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换T250Q和M428L的IgG4 Fc变体(“QL突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换M252Y、S254T和T256E的IgG1 Fc变体(“YTE突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换M428L和N434S的IgG1 Fc变体(“LS突变体”)。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可包括包含置换M428L和N434S的IgG4 Fc变体(“LS突变体”)。Fc区中调节FcRn再循环的氨基酸置换的效果描述于，例如，Hamblett等人，Mol.Pharm.13(7)：2387-96(2016)；Dall’Acqua等人，J.Biol.Chem.281(33)：23514-24(2006)，Hinton等人，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6(2003)，Hinton等人，J.Immunol.，176(1)：346-56(2006)，US20080181887、US 7361740和EP2235059，其全部内容通过引用并入本文。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S中的一个或多个置换。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、M428L和N434S中的一个或多个置换。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含置换T250Q和M428L。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc变体，所述Fc变体包含置换M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含Fc变体，所述Fc变体包含置换M252Y、S254T和T256E。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc变体，所述Fc变体包含置换M428L和N434S。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含Fc变体，所述Fc变体包含置换M428L和N434S。
在某些实施方案中，本文公开的异双官能团化合物表现出降低的血管毒性、降低的溶酶体毒性、改进的有效性和/或改进的治疗率。在一些实施方案中，本文公开的异双官能团化合物包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其包含突变的Fc区，所述突变的Fc区具有增加的FcRn结合亲和力和增加的血清半衰期。在某些实施方案中，包含突变的Fc区的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的血清半衰期为至少10天、至少15天、至少20天、至少25天、至少30天、至少35天、至少40天、至少50天、至少60天、至少70天、至少80天、至少90天、至少100天或更长。在一些实施方案中，
在某些实施方案中，本公开的异双官能团化合物表现出降低的血管毒性、改善的治疗率或两者。在某些实施方案中，本公开的异双官能团化合物包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其包含突变的Fc区，其相比于与本公开的抗体具有相同氨基酸序列但不包含对Fc区的至少一个氨基酸残基的添加、置换或缺失的抗体(在本文中也称为“未修饰的抗体”)，对负责促进效应子功能的Fc配体具有降低或消除的亲和力。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含Fc区，所述Fc区包含降低或消除抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应子功能的至少两个突变。在进一步的实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含Fc区，所述Fc区包含降低或消除抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应子功能的至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个突变。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含选自E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、P329G、P329R、A330S、P331A、P331G和P331S中的一个或多个突变。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含L234A/L235A突变，具有或不具有G237A突变。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含L234A、L235A和G237A突变。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有A327G/A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含E233P/L234V/L235A/ΔG236(缺失)突变，所述突变提供降低的与FcγRI(在本文中也称为FcgRI)、FcγRIIA(在本文中也称为FcgRIIA)、FcγRIIIA(在本文中也称为FcgRIIIAI)的结合，以及降低的ADCC和CDC效应子功能，例如，如AnZ等人.Mabs2009Nov-Ec；1(6)：572-9所述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含N297x突变，其中x＝A、D、G、Q。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有A327G/A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含K322A、P329A和P331A中的一个或多个突变，所述突变提供降低的与C1q的结合，例如，如Canfield&Morrison.JExpMed(1991)173(6)：1483-91.10.1084所述，其通过引用整体并入本文。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有V263L突变的Fc区，所述突变提供增强的与FcγRIIB(在本文中也称为FcgRIIB)的结合和增强的ADCC，例如，如Hezareh等人.J Virol.2001年12月；75(24)：12161-8所述，其通过引用而整体并入本文。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234A/L235A、G237A或L235E突变的Fc区。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234F、L235E或P331S突变的Fc区。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含选自V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S中的一个或多个突变。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有A330S/P331S突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S或H268Q/V309L/A330S/P331S突变。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含选自S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G、N297Q、P329G、P329R中的一个或多个突变。
在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P突变的Fc区，所述突变提供降低的Fab-臂交换和降低的聚集，例如，如Chappel等人Proc Natl Acad Sci U S A(1991)88(20)：9036-40所述，其通过引用而整体并入本文。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/L235E突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含S228P/E233P/F234V/L235A/ΔG236(缺失)突变。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含N297x突变，其中x＝A、D、G、Q。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/F234A/L235A突变的Fc区。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有L235E突变的Fc区，所述突变提供降低的与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA的结合，以及降低的ADCC和CDC效应子活性，例如，如Saxena等人.Front Immunol.2016年12月12日；7：580所述。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含Fc区，所述Fc区包含S228P/F234A/L235A或E233P/L235A/G236Δ突变。
在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有至少S228P突变的Fc区。参见，例如，Angal等人(Mol Immunol.1993年1月；30(1)：105-8)描述了对人IgG4重链的铰链序列的分析，以将在残基241(根据EU编号系统，并且现在对应于Kabat编号中的残基228)处丝氨酸的存在确定为在一定比例的分泌型人IgG4中的铰链区中重链间二硫桥异质性的原因。Silva等人(J Biol Chem.2015年2月27日；290(9)：5462-9)描述了人IgG4中的阻止体内和体外IgG4 Fab-臂交换的S228P突变。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有L235E或S228P突变的Fc区。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有N297A、N297D或N297G突变的Fc区。
在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有P329G、P329R突变的Fc区。
在一个示例性实施方案中，任何IgG同种型的突变Fc区在位置234、235、236、237、297、318、320、322处包含一个或多个突变(如WO1988007089所述，其通过引用而整体并入本文)。Fc区中的其他可能的突变，包括置换、缺失和添加，还在例如US20140170140、WO2009100309、US20090136494和US8969526中描述，它们通过引用而整体并入本文。
可进行体外和/或体内细胞毒性测定，以证实CDC和/或ADCC活性的降低或消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定，以确保抗体缺乏FcγR结合(因此可能缺乏ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。用来评估目的分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5，500，362(参见例如Hellstrom，I.等人，Proc.Nat’1 Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063)和Hellstrom，I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；美国专利号5，821，337(参见Bruggemann，M.等人，J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如用于流式细胞术的ACTI.TM.非放射性细胞毒性测定(CellTechnology，Inc.Mountain View，Calif.)；以及CytoTox96.RTM.非放射性细胞毒性测定(Promega，Madison，Wis.)。可用于这类测定的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可替代地或附加地，可在体内，例如在诸如Clynes等人，Proc.Nat’1Acad.Sci.USA95(1998)652-656中公开的动物模型中评估目的分子的ADCC活性。还可进行C1q结合测定，以证实抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202(1996)163；Cragg，M.S.等人，Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg，M.S.和Glennie，M.J.，Blood 103(2004)2738-2743)。还可使用本领域已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova，S.B.等人，Int’1.Immunol.18(12)(2006)1759-1769)。
在一些实施方案中，任何IgG同种型的突变Fc区包含在位置L328处的突变，如L328M、L328D、L328E、L328N、L328Q、L328F、L328I、L328V、L328T、L328H、L328A(参见，例如，US20050054832)。
在一个实施方案中，与未修饰的抗体相比，本公开的抗体或其抗原结合片段展现出降低的或消除的ADCC效应子功能。在另一实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段展现出降低的ADCC效应子功能，其是未修饰的抗体的ADCC效应子功能的至少1/2或至少1/3或至少1/5或至少1/10或至少1/50或至少1/100。在又一实施方案中，与未修饰的抗体相比，本公开的抗体展现出降低至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少100％的ADCC效应子功能。在本公开的另一方面，由本公开的抗体或其抗原结合片段诱导的ADCC效应子功能的降低或下调是降低至由未修饰的抗体诱导的ADCC观测值的0％、2.5％、5％、10％、20％、50％或75％。在某些实施方案中，ADCC活性的降低和/或消除可归因于本公开的抗体或其抗原结合片段对Fc配体和/或受体的亲和力降低。
调节抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的pH依赖性TM-4SF1结合的CDR置换
本公开的一个实施方案提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物，其中该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段表现出对TM4SF1的pH依赖性结合亲和力。在一些情况下，与其他pH范围相比，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在某些pH范围以更高的亲和力结合至TM4SF1。例如，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以在酸性pH下相比于在中性pH或碱性pH下以不同的亲和力结合至TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下相比于在中性或碱性pH下以更高的亲和力结合至TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下相比于在中性或碱性pH下以更低的亲和力结合至TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在酸性pH下结合至TM4SF1并在中性或碱性pH下从TM4SF1解离。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在pH7或更高下结合至TM4SF1并在pH6或更低下从TM4SF1分离。在亚细胞区室(例如血浆、细胞溶质和细胞核)中，pH为中性或碱性。在溶酶体或内体中，pH为酸性。不受任何理论的束缚，在一些情况下，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与抗原结合并随后内化到内体的膜中。pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以在内体中从TM4SF1分离并在内体内结合至FcRn受体，并且可以通过FcRn受体而被再循环返回至循环中，而不是在内体进展成的溶酶体中降解。因此，pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以与TM4SF1抗原结合多次。因此，pH依赖性抗TM4SF1抗体和包含该抗体的化合物(连同有效负载，例如本文所述的降解剂化合物)可以被FcRn受体再循环，而不在溶酶体中释放有效负载。
当抗原将结合的抗体和/或任何相关的有效负载(如本文所述的降解剂化合物)携带至溶酶体时，发生靶标介导的药物处置或TMDD，其中有效负载被释放。与TMDD相关的溶酶体毒性如Grimm等人，J.Pharmacokinet.Pharmacodyn.36(5)：407-20(2009)中所述，其通过引用以其全文并入本文。在一些实施方案中，本文提供了包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物，其表现出降低的血管毒性、增加的血清半衰期和/或改善的治疗率。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在CDR残基中包含一个或多个组氨酸氨基酸残基置换。不受任何特定理论的束缚，在抗TM4SF1抗体的合适位置引入组氨酸残基可以实现对TM4SF1的pH可调节的结合亲和力。例如，pH依赖性抗TM4SF1抗体可以在酸性溶酶体或内体环境中从TM4SF1解离，并且随后通过FcRn结合而被再循环进入循环。与其他方面相当的野生型抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段相比，pH依赖性抗TM4SF1抗体可以表现出增加的血清半衰期和降低的降解速率或溶酶体中有效负载释放速率。在一些情况下，pH依赖性抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以显示出增加的半衰期、降低的血管毒性、改善的治疗窗和/或改善的或至少约等同的体内效力。
本文公开了制备包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物的方法，该异双官能团化合物通过以pH依赖性方式调节抗体-TM4SF1结合亲和力而具有增加的半衰期和/或药效学效果，该方法包括选择抗体CDR组氨酸残基或优化影响抗体pKa的微环境的其他残基，以使得抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在pH6.0/pH7.4下的Kd比和/或Koff比为至少2、3、4、8、10、16或更高，或在2、3、4、8、10、16或更高之间的范围。在一些实施方案中，该方法包括将氨基酸置换引入抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段中以实现TM4SF1亲和力，其在pH 7.4下的KD为至少约100nM，如在25℃下测量。在某些实施方案中，所述方法包括产生在CDR残基中或优化影响pKa的微环境的其他残基中富含组氨酸的抗体文库。在一些实施方案中，抗体文库包含抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中将组氨酸残基引入CDR位置中。在一些实施方案中，抗体文库包含一系列抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中抗体文库中的每个抗TM4SF1抗体包含在不同CDR位置的单个组氨酸置换。在一些实施方案中，抗体文库包含一系列抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其各自包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个组氨酸残基突变。在一些实施方案中，在抗体文库的TM4SF1抗体或抗原片段中的至少一个中，每个CDR位置均突变成组氨酸。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在CDR区包含1、2、3、4、5或更多个组氨酸置换。可以将组氨酸残基工程化至抗TM4SF1抗体轻链(LC)或重链(HC)的不同位置以获得pH依赖性结合亲和力。因此，在一些实施方案中，本文提供了具有组氨酸工程化的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR1、CDR2和/或CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR1中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR2中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链可变区(VL)的CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR1、CDR2和/或CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR1中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR2中包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链可变区(VH)的CDR3中包含一个或多个组氨酸残基。因此，在一些实施方案中，本公开的异双官能团化合物包含经组氨酸工程化的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3中，例如在SEQ ID No.101或SEQ ID No.131的位置30(S30H)、92(S92H)和93(N93H)中的一个或多个中，包含一个或多个组氨酸残基。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段在重链的CDR1、CDR2和/或CDR3中，例如在SEQ ID No.92或SEQ ID No.130的位置28(T28H)、31(N31H)、32(Y32H)、52(N52H)、54(Y54H)、57(N57H)、100(Q100H)和101(Y101H)中的一个或多个中，包含一个或多个组氨酸残基。
位置N297(Asn 297)的置换和一个或多个降解剂与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的缀合
人IgG分子在CH2结构域中的每个N297残基处均具有保守的糖基化位点，使这些侧链N-聚糖成为位点特异性缀合的方便靶标。该糖基化位点距离可变区足够远，因此药物部分与附接的聚糖的缀合不应影响抗原结合。在本公开的一些实施方案中，降解剂化合物通过使用示例性方法而连接至聚糖，这些示例性方法包括用高碘酸盐将这些聚糖中所含的邻位二醇部分氧化切割以产生醛，所述醛可以被还原胺化并缀合至酰肼和氨氧基化合物。(参见，例如，O′Shannessy，等人(1984)Immunol.Lett.8：273-77)。
另一种方法可以包括增加这些聚糖中N-乙酰葡糖胺残基的岩藻糖基化。这些岩藻糖残基的氧化可产生羧酸和醛部分，这些部分可用于将药物和荧光团连接到抗体上的这些特异性位点(参见，例如，Zuberbuhler等人(2012)Chem.Commun.48：7100-02)。另一种方法可以包括修饰这些聚糖中的唾液酸(以及增加这些聚糖中的唾液酸含量)，随后氧化唾液酸并与氨氧基药物缀合以形成肟连接的缀合物(参见，例如，Zhou等人(2014)BioconjugateChem.25：510-20)。
可替代地，可以使用唾液酸转移酶将含有生物正交官能团的修饰的唾液酸残基掺入这些聚糖中。然后可以修饰生物正交官能团以将降解剂化合物附接至聚糖的位点(参见，例如，Li，等人(2014)Angew.Chem.Int.53：7179-82)。修饰这些聚糖位点的另一种方法是使用糖基转移酶将半乳糖或含有酮或叠氮化物的半乳糖类似物连接至这些聚糖中的N-乙酰葡糖胺，并将药物或放射性核苷酸连接至半乳糖分子(参见，例如，Khidekel，等人，(2003)J.Am.Chem.Soc.125：16162-63；Clark，等人，(2008)J.Am.Chem.Soc.130：11576-77；Boeggeman，等人(2007)Bioconjugate Chem.18：806-14)。另一种方法依赖于在通过代谢寡糖工程化而表达抗体时将修饰的糖引入这些聚糖中(参见，例如Campbell，等人(2007)Mol.BioSyst.3：187-94；Agard，等人，(2009)Acc.Chem.Res.42：788-97)。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段通过位点特异性缀合而与降解剂化合物缀合。可以选择几种天然的或工程化的氨基酸，包括半胱氨酸和谷氨酰胺作为缀合位点。
在一些情况下，可以将半胱氨酸残基工程化至抗体重链(HC)或轻链(LC)的不同位置以进行偶联，例如在位置N297，即N297C。因此，在一些实施方案中，本公开的DAC包含半胱氨酸工程化的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。
在抗TM4SF1抗体的合适位置引入半胱氨酸残基可以实现对缀合位点的控制，并且获得的位点特异性缀合物可能比通过野生型缀合(即通过还原的链间半胱氨酸缀合)获得的缀合物更均质。在一些情况下，与野生型缀合物相比，包含通过半胱氨酸的至少一个缀合的DAC可以表现出至少等同的体内效力、改善的药代动力学(PK)和扩大的治疗窗。在一些实施方案中，DAC包含可切割性二肽接头(即缬氨酸-丙氨酸)和降解剂化合物，其与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的Fc部分中重链位置N297C的半胱氨酸连接。在一些情况下，DAC的平均降解剂与抗体比(DAR)大于或等于1，例如DAR为约2、6、10等。
不受任何特定理论的束缚，设想通过非配对的半胱氨酸的位点特异性缀合可以是相对简单和可扩展的。例如，降解剂化合物的偶联可以在不需要特殊试剂的情况下完成。在一些情况下，与常规缀合物相比，通过位点特异性半胱氨酸制备的DAC可以显示出更强的体内抗肿瘤活性，并且可具有更好的耐受性。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的位置N297可以突变成半胱氨酸，即N297C，并且半胱氨酸残基可以与降解剂化合物缀合。在一些情况下，N297C突变与附近残基中的附加的突变联合，以添加稳定化残基(例如，精氨酸、赖氨酸)和/或去除谷氨酸。在一些情况下，除了N297C之外，残基292-303的一个或多个位置也经修饰。位置292-303的序列可以是REEQYCSTYRVV(在IgG1中)，和REEQFCSTYRVV(在IgG4中)。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段通过谷氨酰胺残基的位点特异性缀合而与降解剂化合物缀合。在一些情况下，微生物转谷氨酰胺酶(mTG)可用于将含胺的药物接头或反应性间隔子转移到抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段(例如去糖基化的抗-TM4SF1抗体或其抗原结合片段)的重链中的Q295残基中。可以使用两步化学酶促方法来优化缀合，其中含有生物正交叠氮基或硫醇功能接头的反应性间隔子通过mTG附接至抗体，随后与二苯并环辛炔(DBCO)或含有MMAE的马来酰亚胺反应。通过使用应变促进的叠氮化物-炔烃环加成(SPAAC)或硫醇-马来酰亚胺化学，可以用例如约2的DAR来生成DAC。
在一些情况下，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段通过谷氨酰胺残基(例如Q295)以及位置297的半胱氨酸N297C的位点特异性缀合而缀合至降解剂化合物。这种突变组合可以打开抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段中的两个缀合柄，并且可以获得更高DAR的DAC。半胱氨酸缀合可以是例如马来酰亚胺、卤代乙酰胺或其他配偶体。可以优化生物缀合形式和方法以改善DAC稳定性和有效性。在一些实施方案中，一种或多种降解剂化合物通过马来酰亚胺而与抗TM4SF1抗体或抗原结合片段缀合，例如半胱氨酸-马来酰亚胺缀合。除马来酰亚胺外，在一些情况下与抗TM4SF1抗体反应的其他官能团，例如经半胱氨酸工程化的抗TM4SF1抗体的硫醇基团，包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在一些实施方案中，降解剂化合物通过乙酰胺而与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合。例如，降解剂可以通过溴乙酰胺缀合而与抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段缀合。
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段对TM4SF1的ECL2结构域是特异性的。人TM4SF1 ECL2结构域的氨基酸序列是EGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVSLFS(SEQ ID NO：92)。
如以下表16中所述，本公开中包括对TM4SF1为特异性的新型抗体。表16中所述的抗体是单克隆鼠抗体AGX-A03、AGX-A04、AGX-A05、AGX-A07、AGX-A08、AGX-A09和AGX-A11，其中每一种在实施例中描述的筛选中鉴定，并且与TM4SF1的ECL2区结合。以下表16中进一步提供了人源化抗体h AGX-A07和h AGX-A01。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含IgG重链恒定区，该IgG重链恒定区包含SEQ ID NO：87或88所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：73或74至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，该轻链恒定区包含SEQ ID NO：89所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：89至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，该重链可变结构域包含SEQ ID NO：3、15、27、39、51、63或75所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：3、15、27、39、51、63或75至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链，该重链包含SEQ ID NO：90或92所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：90或92至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链，该重链包含SEQ ID NO：112或114所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：112或114至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO：9、21、33、45、57、69或81所示的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：9、21、33、45、57、69或81至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO：97、99、101、103或105所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：97、99、101、103或105至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO：97、99或101所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：97、99或101至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在另一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，该轻链可变结构域包含SEQ ID NO：122所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：122至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％相同或100％相同的序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1，该重链CDR1包含与SEQ ID NO：6、18、30、42、54、66或78至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2，该重链CDR2包含与SEQ ID NO：7、19、31、43、55、67或79至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3，该重链CDR3包含与SEQ ID NO：8、20、32、44、56、68或80至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1，该轻链CDR1包含与SEQ ID NO∶12、24、36、48、60、72或84至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2，该轻链CDR2包含与SEQ ID NO：13、25、37、49、61、73或85至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO：14、26、38、50、62、74或86至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR1，该重链CDR1包含与SEQ ID NO：94或SEQ ID NO：115至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR2，该重链CDR2包含与SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：116或SEQID NO：117至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR3，该重链CDR3包含与SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120或SEQ ID NO：121至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR1，该轻链CDR1包含与SEQ ID NO：107、SEQ ID NO：108、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126或SEQ ID NO：127至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，包含轻链CDR2，该轻链CDR2包含与SEQ ID NO：109或SEQ ID NO：128至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO：110、SEQ ID NO：111或SEQID NO：129至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，该轻链CDR3包含与SEQ ID NO：110或SEQ ID NO：129至少约80％到至少约85％、至少约85％到至少约90％、至少约90％到至少约91％、至少约91％到至少约92％、至少约92％到至少约93％、至少约93％到至少约94％、至少约94％到至少约95％、至少约95％到至少约96％、至少约96％到至少约97％、至少约97％到至少约98％、至少约98％到至少约99％或至少约99％到100％相同的氨基酸序列。
鼠单克隆抗体AGX-A03的氨基酸序列在表16中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO：6、7和8(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：12、13和14(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：6、7和8的氨基酸序列所示的CDR，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：12、13和14的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A03的CDR。此外，AGX-A03的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO：3和9描述。
鼠单克隆抗体AGX-A04的氨基酸序列在表16中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO：18、19和20(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：24、25和26(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：18、19和20的氨基酸序列所示的CDR，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：24、25和26的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A04的CDR。此外，AGX-A04的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ IDNO：15和21描述。
鼠单克隆抗体AGX-A05的氨基酸序列在表16中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO：30、31和32(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：36、37和38(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：30、31和32的氨基酸序列所示的CDR，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：36、37和38的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A05的CDR。此外，AGX-A05的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ IDNO：27和33描述。鼠单克隆抗体AGX-A07的氨基酸序列在表16中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQ ID NO：42、43和44(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：48、49和50(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQID NO：42、43和44的氨基酸序列所示的CDR，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：48、49和50的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A07的CDR。此外，AGX-A07的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO：39和45描述。
在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07(h AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：90的氨基酸序列所示的重链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07(hm AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：90的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列。如表16中所示，SEQ ID NO：90所示的重链序列在本文中也称为AGX-A07 H2。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：90的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列，其中所述一个或多个置换处于SEQ ID NO：90的氨基酸位置1、44和80处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含E1Q(在重链的位置1处谷氨酸被置换为谷氨酰胺，SEQ ID NO：90)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含D44G(在重链的位置44处天冬氨酸被置换为甘氨酸，SEQ ID NO：90)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含F80Y(在重链的位置80处苯丙氨酸被置换为酪氨酸，SEQ ID NO：90)。在一些实施方案中，提供了一种人源化的突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：92的氨基酸序列所示的重链序列。如表16中所示，SEQ IDNO：92所示的重链序列在本文中也称为AGX-A07H2v1。在一些实施方案中，提供了人源化的AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：97的氨基酸序列所示的轻链序列。如表16中所示，SEQ ID NO：97所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：97的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：97的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中所述一个或多个置换处于SEQ ID NO：97的氨基酸位置3、26、62和90处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含I3V(在轻链的位置3处异亮氨酸被置换为缬氨酸，SEQ ID NO：97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26Q(在轻链的位置26处天冬酰胺被置换为谷氨酰胺，SEQ ID NO：97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26S(在轻链的位置26处天冬酰胺被置换为丝氨酸，SEQ ID NO：97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含G62S(在轻链的位置62处甘氨酸被置换为丝氨酸，SEQ ID NO：97)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含W90Y(在轻链的位置90处色氨酸被置换为酪氨酸，SEQ ID NO：97)。在一些实施方案中，提供了人源化的突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，其包含如选自SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103和SEQ ID NO：105中的氨基酸序列所示的轻链序列。
如表16中所示，SEQ ID NO：99所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v1，SEQID NO：101所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07L5v2，SEQ ID NO：103所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v3，而SEQ ID NO：105所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A07L5v4。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列以SEQ ID NO：91提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列以SEQ ID NO：93提供。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO：98(AGX-A07 L5)提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO：100(AGX-A07 L5v1)、SEQ ID NO：102(AGX-A07 L5v2)、SEQ ID NO：104(AGX-A07 L5v3)和SEQ ID NO：106(AGX-A07 L5v4)提供。
在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：132的氨基酸序列所示的重链可变结构域序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：130或SEQ ID NO：132的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链可变结构域序列。在一个实施方案中，提供了一种人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：133的氨基酸序列所示的轻链可变结构域序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：131或SEQ ID NO：133的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链可变结构域序列。
在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包含如SEQ ID NO：131的氨基酸序列所示的序列，该重链可变结构域序列包含如SEQ ID NO：130的氨基酸序列所示的序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列在如SEQ ID NO：131的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换，该重链可变结构域序列在如SEQ ID NO：130的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列包含如SEQ ID NO：133的氨基酸序列所示的序列，该重链可变结构域序列包含如SEQ ID NO：132的氨基酸序列所示的序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变结构域序列和重链可变结构域序列，该轻链可变结构域序列在如SEQ ID NO：133的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换，该重链可变结构域序列在如SEQ ID NO：132的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换。在一些实施方案中，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，其包含重链序列，该重链序列包含如SEQ ID NO：156的氨基酸序列所示的序列，或在SEQ ID NO：156的氨基酸序列中包含一个或多个置换的序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO：94、95和96(CDRl、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO：94、95和96(CDRl、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：94所示的重链CDR1序列，或在如SEQ ID NO：94所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：95所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO：95所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：96所示的重链CDR3序列，或在如SEQ ID NO：96所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR3序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO：107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO：107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQID NO：108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO：108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO：108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：107或108所示的轻链CDR1序列，或在如SEQ ID NO：107或108所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：109所示的轻链CDR2序列，或在如SEQ ID NO：109所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：110或111所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO：110或111所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：110所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO：110所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。
在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含在SEQ ID NO：132(在本文中也称为AGX-A07 H2)中包含以下氨基酸置换的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO：133(在本文中也称为AGX-A07 L5)中包含以下氨基酸置换的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含在SEQ ID NO：132中包含以下氨基酸置换的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO：133中包含以下氨基酸置换的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S，其中该重链包含CDR1(SEQ ID NO：94)、CDR2(SEQ ID NO：95)和CDR3(SEQID NO：96)，并且该轻链包含CDR1(SEQ ID NO：108)、CDR2(SEQ ID NO：109)和CDR3(SEQ IDNO：110)。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07是AGX-A07 H2v1 L5v2，并且包含重链和轻链，该重链包含如SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列(在本文中也称为AGX-A07 H2v1)，该轻链包含如SEQ ID NO：131所示的氨基酸序列(在本文中也称为AGX-A07 L5v2)。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A07包含重链和轻链，该重链包含如SEQ ID NO：92所示的氨基酸序列，该轻链包含如SEQ ID NO：101所示的氨基酸序列。
鼠单克隆抗体AGX-A08的氨基酸序列在表16中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO：54、55和56(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：60、61和62(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：54、55和56的氨基酸序列所示的CDR，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：60、61和62的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A08的CDR。此外，AGX-A08的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ IDNO：51和57描述。
鼠单克隆抗体AGX-A09的氨基酸序列在表16中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO：66、67和68(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：72、73和74(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：66、67和68的氨基酸序列所示的CDR，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：72、73和74的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A09的CDR。此外，AGX-A09的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ IDNO：63和69描述。
鼠单克隆抗体AGX-A11的氨基酸序列在表16中描述。具体来说，重链CDR序列如SEQID NO：78、79和80(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：84、85和86(CDR1、CDR2和CDR3)所示。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含重链可变区和/或轻链可变区，所述重链可变区包含如SEQ ID NO：78、79和80的氨基酸序列所示的CDR，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：84、85和862的氨基酸序列所示的CDR。本公开中包括人源化抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包含AGX-A11的CDR。此外，AGX-A11的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ IDNO：75和81描述。
人源化抗体AGX-A01(h AGX-A01)的氨基酸序列在表16中描述。如表16中所示，SEQID NO：112所示的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1。具体来说，重链CDR序列如SEQ IDNO：115、116和118(CDR1、CDR2和CDR3)所示，而轻链CDR氨基酸序列如SEQ ID NO：124、128和129(CDR1、CDR2和CDR3)所示。此外，人源化的AGX-A01的示例性重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别以SEQ ID NO：112和122描述。人源化的AGX-A01的重链和轻链的示例性编码序列分别以SEQ ID NO：113和123描述。
在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01(hm AGX-A01)抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：112的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列。在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：112的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的重链序列，其中所述一个或多个置换处于SEQ ID NO：112的氨基酸位置63和106处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含G63S(在重链的位置63处甘氨酸被置换为丝氨酸，SEQ ID NO：112)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106E(在重链的位置106处天冬氨酸被置换为谷氨酸，SEQ ID NO：112)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106S(在重链的位置106处天冬氨酸被置换为丝氨酸，SEQ ID NO：112)。在一些实施方案中，提供了一种人源化的突变AGX-A01抗体或抗原结合片段，其包含如SEQ ID NO：114的氨基酸序列所示的重链序列。如表16中所示，SEQ ID NO：114所示的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1v1。
在一些实施方案中，提供了人源化的AGX-A01抗体或抗原结合片段，其包含如SEQID NO：122的氨基酸序列所示的轻链序列。如表16中所示，SEQ ID NO：122所示的轻链序列在本文中也称为AGX-A01 L10。在一些实施方案中，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中所述一个或多个置换处于选自SEQ ID NO：122的氨基酸位置1、33、42、51、86和90中的一个或多个氨基酸位置处。在一些实施方案中，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其包含在如SEQ ID NO：122的氨基酸序列所示的序列中包含一个或多个置换的轻链序列，其中所述一个或多个置换处于选自SEQ ID NO：122的氨基酸位置1、33、42、51和86中的一个或多个氨基酸位置处。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含A1E(在轻链的位置1处丙氨酸被置换为谷氨酸，SEQID NO：122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含N33S(在轻链的位置33处天冬酰胺被置换为丝氨酸，SEQ ID NO：122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含M42Q(在轻链的位置42处甲硫氨酸被置换为谷氨酰胺，SEQ ID NO：122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含V51L(在轻链的位置51处缬氨酸被置换为亮氨酸，SEQ ID NO：122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D86E(在轻链的位置86处天冬氨酸被置换为谷氨酸，SEQ ID NO：122)。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含I90V(在轻链的位置90处异亮氨酸被置换为缬氨酸，SEQ ID NO：122)。
在一些情况下，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO：115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)所示的重链CDR序列，或在如SEQ ID NO：115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：115所示的重链CDR1序列，或在如SEQ ID NO：115所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：116所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO：116所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：117所示的重链CDR2序列，或在如SEQ ID NO∶117所示的序列中包含一个或多个置换的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如选自SEQ IDNO：118、119、120和121中的序列所示的重链CDR3序列，或在选自SEQ ID NO：118、119、120和121中的序列中包含一个或多个置换的重链CDR3序列。
在一些情况下，人源化的AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO：124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的轻链CDR序列，或在如SEQ ID NO：124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)所示的序列中包含一个或多个置换的CDR序列。
在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：125、126、127或128所示的轻链CDR1序列，或在如SEQ ID NO：125、126、127或128所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：129所示的轻链CDR2序列，或在如SEQ ID NO：129所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化的突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO：130所示的轻链CDR3序列，或在如SEQ ID NO：130所示的序列中包含一个或多个置换的轻链CDR1序列。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：3所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：9所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SFl抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：15所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：21所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF 1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：27所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：33所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：39所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：45所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：51所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：57所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：63所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：69所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：75所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：81所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：97所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF 1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：99所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：101所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：103所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：90所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：105所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：97所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ IDNO：99所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：101所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：103所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO：92所示的核酸序列编码的重链可变结构域，以及由SEQ ID NO：105所示的核酸序列编码的轻链可变结构域。
I在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其具有与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：51、SEQ IDNO：63、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：112或SEQ ID NO：114中的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的重链可变结构域序列；并且具有与选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：21、SEQ IDNO：33、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：81、SEQ ID NO：97、SEQ IDNO：99、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：105或SEQ ID NO：122中的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其具有与选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：39、SEQ IDNO：51、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：112或SEQID NO：114中的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的重链可变结构域序列；并且具有与选自SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：81、SEQ IDNO：97、SEQ ID NO：99、SEQ ID NO：101或SEQ ID NO：122中的氨基酸序列至少95％相同、至少96％相同、至少97％相同、至少98％相同、至少99％相同或100％相同的轻链可变结构域序列。
在一个实施方案中，本公开包括一种抗TM4SF1抗体，该抗TM4SF1抗体是IgG，并且包含四条多肽链，包括两条各自包含重链可变结构域和重链恒定区CH1、CH2和CH3的重链，以及两条各自包含轻链可变结构域和轻链恒定区(CL)的轻链。在某些实施方案中，该抗体是人IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方案中，该抗体是人IgG1。在其他实施方案中，该抗体是IgG2。重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列可含有如表16所示的CDR。
互补决定区(CDR)被称为轻链可变结构域与重链可变结构域两者中的超变区。可变结构域的更高度保守的部分被称为框架(FR)。给定抗体的CDR和框架区(FR)可使用由Kabat等人(同上)、Lefranc等人(同上)和/或Honegger和Pluckthun(同上)描述的系统来鉴定。本领域技术人员还熟悉Kabat等人(1991，NIH Publication 91-3242，NationalTechnical Information Service，Springfield，Va.)描述的编号系统。就此而言，Kabat等人定义了一种针对可变结构域序列，包括用于鉴定CDR的编号系统，该编号系统适用于任何抗体。
一个或多个CDR可共价地或非共价地并入分子中，以使其成为抗原结合蛋白。
抗原结合蛋白可并有CDR作为较大多肽链的部分，可使CDR共价连接至另一多肽链，或者可非共价地并有CDR。CDR允许抗原结合蛋白与特定目的抗原特异性结合。特别是，已知CDR3在抗体或抗体片段的抗原结合中起重要作用。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：20、SEQID NO：32、SEQ ID NO：44、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：68或SEQ ID NO：80中任一个所示的CDR3结构域，并且包含可变结构域，所述可变结构域包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：75中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：26、SEQID NO：38、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：74或SEQ ID NO：86中任一个所示的CDR3结构域，并且具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，CDR3结构域保持恒定，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力，或与亲本相比具有改善的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：19、SEQID NO：31、SEQ ID NO：43、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：79中任一个所示的CDR2结构域，并且包含可变结构域，所述可变结构域包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：63或SEQ ID NO：75中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：25、SEQID NO：37、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：73或SEQ ID NO：85中任一个所示的CDR2结构域，并且具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，CDR2结构域保持恒定，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力，或与亲本相比具有改善的功能特性，例如结合亲和力。
在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4S F1抗体或其抗原结合片段包含重链，该重链包含如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：18、SEQID NO：30、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：66或SEQ ID NO：78中任一个所示的CDR1结构域，并且包含可变结构域，所述可变结构域包含与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％相同的氨基酸序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链，该轻链包含如SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：24、SEQID NO：36、SEQ ID NO：48、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：72或SEQ ID NO：84中任一个所示的CDR1结构域，并且具有轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含与SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：21、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：45、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：69或SEQ ID NO：81中任一个所示的序列至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％相同的氨基酸序列。因此，在某些实施方案中，CDR1结构域保持恒定，而可向重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中引入可变性，同时该抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特性，例如结合亲和力。
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含含有Fc区的重链，其中所述Fc区包含选自SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQID NO：145、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：153中的序列：或者其中所述Fc区包含在选自SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQID NO：145、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：153中的序列中包含一个或多个置换的序列。例如，在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含Fc区，其中所述Fc区包含与选自SEQ ID NO：135、SEQ ID NO：136、SEQ ID NO：137、SEQ ID NO：138、SEQ ID NO：139、SEQ ID NO：140、SEQ ID NO：141、SEQ ID NO：142、SEQ ID NO：143、SEQ ID NO：144、SEQID NO：145、SEQ ID NO：151、SEQ ID NO：152和SEQ ID NO：153中的序列至少约70％至约100％，如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、在至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含重链，该重链包含选自SEQ IDNO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155和SEQ ID NO：156中的序列：或者其中所述重链包含在选自SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：154、SEQ IDNO：155和SEQ ID NO：156中的序列中包含一个或多个置换的序列。例如，在一些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体包含重链，该重链包含与选自SEQ ID NO：146、SEQ ID NO：147、SEQ ID NO：148、SEQ ID NO：149、SEQ ID NO：150、SEQ ID NO：154、SEQ ID NO：155和SEQ IDNO：156中的序列至少约70％至约100％，如至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、在至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的序列。
还可以对表16中所述的抗TM4SF1抗体和片段进行人源化。对非人抗体进行人源化的各种方法是本领域已知的。例如，人源化抗体可具有从非人类来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基常常被称为“输入”残基，这些残基通常取自“输入”可变结构域。例如，可按照Jones等人，1986，Nature 321：522-25；Riechmann等人，1988，Nature 332：323-27；以及Verhoeyen等人，1988，Science 239：1534-36的方法，通过用超变区序列置换人抗体的相应序列来进行人源化。
在一些情况下，通过CDR移植来构建人源化抗体，其中将亲本非人抗体(例如啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列移植到人抗体框架上。例如，Padlan等人确定CDR中仅有约三分之一的残基实际上接触抗原，并且将这些残基称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等人，1995，FASEB J.9∶133-39)。在SDR移植技术中，仅将SDR残基移植到人抗体框架上(参见，例如，Kashmiri等人，2005，Methods 36：25-34)。
选择在制备人源化抗体中使用的人轻链可变结构域和重链可变结构域对于降低抗原性而言都可能是重要的。例如，根据所谓的“最佳匹配”方法，相对于已知人类可变结构域序列的整个文库来筛查非人(例如啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可将与啮齿动物序列最接近的人类序列选择为人源化抗体的人框架(Sims等人，1993，J.Immunol.151：2296-308；以及Chothia等人，1987，J.Mol.Biol.196：901-17)。另一种方法使用衍生自具有特定轻链或重链子组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可用于若干不同人源化抗体(Carter等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285-89；以及Presta等人，1993，J.Immunol.151：2623-32)。在一些情况下，框架衍生自最丰富的人子类——VL6子组I(VL6I)和VH子组III(VHIII)的共有序列。在另一种方法中，使用人种系基因作为框架区的来源。
通常更理想的是，使抗体在保留它们对抗原的亲和力和其他有利生物性质的情况下人源化。为了实现这个目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且为本领域技术人员所熟悉。可获得用来说明并展示所选候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构的计算机程序。这些程序包括例如WAM(Whitelegg和Rees，2000，Protein Eng.13：819-24)、Modeller(Sali和Blundell，1993，J.Mol.Biol.234：779-815)和Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch，1997，Electrophoresis 18：2714-23)。对这些展示的检查允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中可能的作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以这种方式，可从接受序列和输入序列中选择并组合FR残基，以便实现所需抗体特性，如增加的对靶抗原的亲和力。通常，超变区残基直接并最实质性地参与影响抗原结合。
可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等人，J.Immunol.151(1993)2296)；衍生自具有轻链可变区或重链可变区的特定子组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(1992)4285；以及Presta等人，J.Immunol.，151(1993)2623)；人成熟(体细胞突变的)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson，Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及通过筛查FR文库获得的框架区(参见例如Baca等人，J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684以及Rosok等人，J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。
人源化抗体及其制备方法例如综述于Almagro和Fransson，Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并且还描述于例如Riechmann等人，Nature 332(1988)323-329；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人，Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan，Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等人，Methods36(2005)43-60(描述“FR改组”)；以及Osbourn等人，Methods 36(2005)61-68和Klimka等人，Br.J.Cancer，83(2000)252-260(描述FR改组的“指导选择”方法)中。
在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。
在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的。
在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-8M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-3M至约1x10-4M、约1x10-4M至约1x10-5M、约1x10-5M至约1x10-6M、约1x10-6至约1x10-7M、约1x10-7至约1x10-8M、约1x10-8M至约1x10-9M、约1x10-9M至约1x10-10M、约1x10-10M至约1x10-11M、约1x10-11M至约1x10-12M、约2x10-3M至约2x10-4M、约2x10-4M至约2x10-5M、约2x10-5M至约2x10-6M、约2x10-6至约2x10-7M、约2x10-7至约2x10-8M、约2x10-8M至约2x10-9M、约2x10-9M至约2x10-10M、约2x10-10M至约2x10-11M、约2x10-11M至约2x10-12M、约3x10-3M至约3x10-4M、约3x10-4M至约3x10- 5M、约3x10-5M至约3x10-6M、约3x10-6至约3x10-7M、约3x10-7至约3x10-8M、约3x10-8M至约3x10- 9M、约3x10-9M至约3x10-10M、约3x10-10M至约3x10-11M、约3x10-11M至约3x10-12M、约4x10-3M至约4x10-4M、约4x10-4M至约4x10-5M、约4x10-5M至约4x10-6M、约4x10-6至约4x10-7M、约4x10-7至约4x10-8M、约4x10-8M至约4x10-9M、约4x10-9M至约4x10-10M、约4x10-10M至约4x10-11M、约4x10-11M至约4x10-12M、约5x10-3M至约5x10-4M、约5x10-4M至约5x10-5M、约5x10-5M至约5x10-6M、约5x10-6至约5x10-7M、约5x10-7至约5x10-8M、约5x10-8M至约5x10-9M、约5x10-9M至约5x10-10M、约5x10-10M至约5x10-11M、约5x10-11M至约5x10-12M、约5x10-7M至约5x10-11M、约5x10-7M、约1x10- 7M、约5x10-8M、约1x10-8M、约5x10-9M、约1x10-9M、约5x10-10M、约1x10-10M、约5x10-11M或约1x10-11M的KD与人TM4SF1结合。在一些实施方案中，该KD在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中确定。
在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-10M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在某些实施方案中，在使用过度表达HEK293的细胞的标准流式细胞术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。在一个实施方案中，HEK293细胞被转染以表达食蟹猴TM4SF1。在进一步的实施方案中，HEK293细胞以约600个mRNA拷贝/106个18SrRNA拷贝表达食蟹猴TM4SF1。
测定抗体或抗体片段的KD的方法是本领域已知的。例如，表面等离子体共振可用于测定抗体对抗原的KD(例如，在25℃下使用BIACORE 2000或BIACORE 3000(BIAcore，Inc.，Piscataway，N.J.)，其中抗原或Fc受体以约10个应答单位(RU)固定在CM5芯片上)。在某些实施方案中，使用FACS或流式细胞术测定KD，由此使用表达TM4SF1的细胞如HEK293细胞或HUVEC细胞来结合抗体或片段，并根据标准方法测量KD。使用流式细胞术测定抗体的亲和力例如描述于Geuijen等人(2005)J Immunol Methods.302(1-2)：68-77中。在某些实施方案中，使用FACS来测定抗体的亲和力。
在一个实施方案中，本公开表征了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有含有保守性氨基酸置换的本文所述的CDR氨基酸序列，以使得该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含与表16所示的CDR氨基酸序列至少95％相同(或至少96％相同，或至少97％相同，或至少98％相同，或至少99％相同)的CDR的氨基酸序列。“保守性氨基酸置换”是其中某一氨基酸残基被具有化学性质(例如电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一氨基酸残基代替的置换。通常，保守性氨基酸置换基本上不改变蛋白质的功能性质。在两个或更多个氨基酸序列因保守性置换而彼此不同的情况下，序列同一性百分比或相似性程度可以向上调整，以校正该置换的保守性质。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。参见，例如，Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24：307-331，通过引用并入本文。具有化学性质类似的侧链的氨基酸的群组的实例包括(1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。
在一方面，本公开进一步表征了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合，其中该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有人IgG框架区的轻链可变区，并且包含含有人IgG框架区的重链可变区。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与食蟹猴TM4SF1交叉反应。
在本公开的另一方面，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，如在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中所确定的，其以约5x10-8M或更低的KD与人TM4SF1的ECL2环上的表位结合。在一个实施方案中，在使用过度表达HEK293的细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10-6M或更低的KD与食蟹猴TM4SF1结合。在一个实施方案中，在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约lx10-8M或更低的KD与人TM4SF1结合。在一个实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以1x10-3M至约1x10-4M、约1x10-4M至约1x10-5M、约1x10-5M至约1x10-6M、约1x10-6至约1x10-7M、约1x10-7至约1x10-8M、约1x10-8M至约1x10-9M、约1x10-9M至约1x10-10M、约1x10-10M至约1x10-11M、约1x10-11M至约1x10-12M、约2x10- 3M至约2x10-4M、约2x10-4M至约2x10-5M、约2x10-5M至约2x10-6M、约2x10-6至约2x10-7M、约2x10-7至约2x10-8M、约2x10-8M至约2x10-9M、约2x10-9M至约2x10-10M、约2x10-10M至约2x10- 11M、约2x10-11M至约2x10-12M、约3x10-3M至约3x10-4M、约3x10-4M至约3x10-5M、约3x10-5M至约3x10-6M、约3x10-6至约3x10-7M、约3x10-7至约3x10-8M、约3x10-8M至约3x10-9M、约3x10-9M至约3x10-10M、约3x10-10M至约3x10-11M、约3x10-11M至约3x10-12M、约4x10-3M至约4x10-4M、约4x10- 4M至约4x10-5M、约4x10-5M至约4x10-6M、约4x10-6至约4x10-7M、约4x10-7至约4x10-8M、约4x10- 8M至约4x10-9M、约4x10-9M至约4x10-10M、约4x10-10M至约4x10-11M、约4x10-11M至约4x10-12M、约5x10-3M至约5x10-4M、约5x10-4M至约5x10-5M、约5x10-5M至约5x10-6M、约5x10-6至约5x10-7M、约5x10-7至约5x10-8M、约5x10-8M至约5x10-9M、约5x10-9M至约5x10-10M、约5x10-10M至约5x10-11M、约5x10-11M至约5x10-12M、约5x10-7M至约5x10-11M、约5x10-7M、约1x10-7M、约5x10-8M、约1x10-8M、约5x10-9M、约1x10-9M、约5x10-10M、约1x10-10M、约5x10-11M或约1x10-11M的KD与人TM4SF1结合。在一些实施方案中，该KD在使用HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中确定。在一个实施方案中，在使用表达TM4SF1的HUVEC细胞的标准流式细胞术测定中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10-10M或更低的KD与人TM4SF1结合。
在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段与人TM4SF1的结合不依赖于对人TM4SF1的ECL2环的糖基化，即抗体的结合不依赖于在ECL2环(SEQ ID NO：77)内TM4SF1的糖基化。
本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可以是任何同种型(例如但不限于IgG、IgM和IgE)中的任一种。在某些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。在特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段是IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，该抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、人IgG2或人IgG4同种型。
在ADCC和/或CDC活性方面，IgG2是天然最低的(An等人，MAbs.2009年11月-12月；1(6)：572-579)。因此，在某些实施方案中，有利地使用IgG2。然而，IgG2具有两个额外半胱氨酸(导致4个铰链间二硫键)，这使其倾向于通过形成抗体间二硫键而聚集。在相关实施方案中，对IgG2半胱氨酸进行突变以减少聚集。
本公开提供了与TM4SF1结合的抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非完整抗体存在优势。片段的较小尺寸允许快速清除，并且可导致改进的细胞、组织或器官可及性。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人，2003，Nature Med.9：129-34。
已开发了用于产生抗体片段的各种技术。在传统上，这些片段通过蛋白水解消化完整抗体而获得(参见例如Morimoto等人，1992，J.Biochem.Biophys.Methods24：107-17；以及Brennan等人，1985，Science 229：81-83)。然而，这些片段现在可以直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和scFv抗体片段全部可在大肠杆菌或酵母细胞中表达并从大肠杆菌或酵母细胞分泌，由此允许轻松产生大量这些片段。可从以上讨论的抗体噬菌体文库中分离抗体片段。或者，Fab’-SH片段可以直接从大肠杆菌中回收，并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等人，1992，Bio/Technology10：163-67)。根据另一方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。例如，美国专利号5,869,046中描述了包含补救受体结合表位残基的具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段。产生抗体片段的其他技术对熟练技术人员来说是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见，例如，WO 93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458)。Fv和scFv具有完整的组合位点，其没有恒定区；因此，它们可能适合在体内使用过程中减少的非特异性结合。可以构建scFv融合蛋白，以在scFv的氨基或羧基末端产生效应蛋白的融合(参见，例如，Borrebaeck编，同上)。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如，如以上引用的参考文献所述。这类线性抗体可以是单特异性的或多特异性的，如双特异性的。
在某些实施方案中，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv。
例如，对人TM4SF1具有高亲和力的抗TM4SF1抗体(和片段)可使用本领域已知的筛选技术来鉴定。例如，单克隆抗体可使用首先由Kohler等人，1975，Nature 256：495-97描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利号4,816,567)。
在杂交瘤方法中，例如使用人TM4SF1的ECL2环或表达TM4SF1的细胞(由此在细胞表面上表达ECL2环)来使小鼠或其他适当的宿主动物，如仓鼠免疫，以引发淋巴细胞，其产生或能够产生将与用于免疫的蛋白质特异性结合的抗体。或者，可在体外使淋巴细胞免疫。在免疫后，分离淋巴细胞，然后使用合适的融合剂如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice59-103(1986))。
接种由此制备的杂交瘤细胞，并使其在合适的培养基中生长，在某些实施方案中，该培养基含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质(也被称为融合配偶体)。例如，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的选择性培养基一般将包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，它们阻止HGPRT缺陷型细胞的生长。
示例性融合配偶体骨髓瘤细胞是高效融合，支持由所选抗体生产细胞稳定高水平产生抗体，并且对针对未融合的亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的细胞。示例性骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，如SP-2和衍生物，例如可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Manassas，Va.)获得的X63-Ag8-653细胞，以及来源于可从SalkInstitute Cell Distribution Center(San Diego，Calif.)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系。还已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor，1984，Immunol.133：3001-05；以及Brodeur等人，Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications 51-63(1987))。
测定杂交瘤细胞生长所在的培养基针对抗原的单克隆抗体的产生。通过免疫沉淀或通过体外结合测定如RIA或ELISA来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可以例如通过Munson等人，1980，Anal.Biochem.107：220-39中所述的Scatchard分析来测定。
一旦鉴定出产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，即可通过有限稀释程序对克隆进行亚克隆，并且通过标准方法使其生长(Goding，同上)。用于该目的的合适的培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。另外，例如通过将细胞腹膜内注射到小鼠中，可使杂交瘤细胞在动物中体内生长为腹水肿瘤。
通过常规抗体纯化程序，例如亲和色谱法(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换色谱法、羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析等，从培养基、腹水或血清中适当地分离由亚克隆分泌的单克隆抗体。
使用常规程序(例如通过使用能够与编码鼠抗体的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)，易于对编码单克隆抗体的DNA进行分离和测序。杂交瘤细胞可充当这类DNA的来源。一旦分离，即可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或者否则不产生抗体蛋白质的骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等人，1993，Curr.Opinion in Immunol.5：256-62以及Pluckthun，1992，Immunol.Revs.130：151-88。
在进一步的实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可从使用例如在Antibody PhageDisplay：Methods and Protocols(O’Brien和Aitken编，2002)中描述的技术产生的抗体噬菌体文库中分离。在原则上，通过筛查含有展示与噬菌体外壳蛋白融合的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆。针对所需抗原筛查这类噬菌体文库。使表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆吸附于抗原，因此与文库中的非结合克隆分离。然后将结合克隆从抗原中洗脱下来，并且可通过额外的抗原吸附/洗脱循环来进一步富集。
可使可变结构域功能性地在噬菌体上展示为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短柔性肽而共价连接，或展示为Fab片段，其中VH和VL各自与恒定结构域融合并且非共价地相互作用，如例如Winter等人，1994，Ann.Rev.Immunol.12：433-55中所述。
VH和VL基因的储库(Repertoires)可通过PCR单独地克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可搜索噬菌体文库中的抗原结合克隆，如Winter等人(同上)所述。来自经免疫的来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体，而无需构建杂交瘤。或者，可以克隆天然储库以提供单一来源的针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的人抗体，而不进行任何免疫，如Griffiths等人，1993，EMBO J12：725-34所述。最后，还可以通过以下方式合成制备天然文库：从干细胞克隆未重排的V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高度可变CDR3区域并实现体外重排，如例如Hoogenboom和Winter，1992，J.Mol.Biol.227：227-88所述。
对文库的筛查可通过本领域中已知的各种技术来实现。例如，可使用TM4SF1(例如ECL2环的可溶性形式或表达所述环的细胞)包被吸附板的各孔，在固定于吸附板的或在细胞分选中使用的宿主细胞上表达，缀合至生物素以供用链霉亲和素包被的珠子捕集，或者在用于淘选展示文库的其他任何方法中使用。通过使用如Bass等人，1990，Proteins 8：309-14以及WO 92/09690所述的长时间洗涤和单价噬菌体展示，以及通过使用如Marks等人，1992，Biotechnol.10：779-83所述的低抗原包被密度，可以促进对具有缓慢解离动力学(例如良好结合亲和力)的抗体的选择。
抗TM4SF1抗体可通过以下方式获得：设计适于选择目的噬菌体克隆的抗原筛选程序，随后使用来自目的噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如Fv序列)或来自VH和VL序列的各种CDR序列以及Kabat等人(同上)所述的适当恒定区(例如Fc)序列来构建全长抗TM4SF1抗体克隆。
可使用本领域中已知以及本文所述的结合测定对抗TM4SF1抗体进行筛选，以确定抗体是否对TM4SF1的ECL2环具有治疗性亲和力。抗体抑制或降低转移性细胞活性的能力可使用本领域中的标准测定以及本文所述的测定来测量。临床前测定需要使用通常属于以下三种类型之一的动物转移模型：(i)通常通过用以产生肺转移的尾静脉注射，通过用以产生肝转移的门静脉或脾内注射，或通过用以产生骨转移和其他转移的左心室心脏注射，将转移性小鼠肿瘤细胞如B16F10黑素瘤TC注射至小鼠中；(ii)将转移性肿瘤细胞或完整肿瘤片段正位移植至小鼠中，所述方法常常需要稍后手术切除原发性肿瘤以预防与原发性肿瘤生长相关的发病；和(iii)自发性转移的遗传工程化小鼠模型，其中最常见的是MMTV-Pyt(小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤病毒中间T抗原)小鼠乳腺癌模型，该模型提供人类癌症转移的一种高度真实的小鼠模型；超过85％的半合子MMTV-PyMT雌性自发地发生可触知的乳腺肿瘤，所述肿瘤在8-16周龄时转移至肺。通过随TM4SF1免疫阻断程度而变化的，处死动物的肺中转移性结节的活体动物成像或直接计数来量化肺中的转移性负荷，以及实现例如肺转移降低至少50％的治疗水平，将指示例如治疗性抗体可以在本公开的方法中使用。此外，跨物种反应性测定在本领域中是已知的。可使用的测定的实例例如描述于Khanna和Hunter(Carcinogenesis.2005年3月；26(3)：513-23)以及Saxena和Christofori(Mol Oncol.2013年4月；7(2)：283-96)中，这些文献通过引用而整体并入本文。
在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段经半胱氨酸工程化，用于通过还原和再氧化进行缀合。在一些实施方案中，经半胱氨酸工程化的抗体通过用还原剂例如DTT(Cleland试剂，二硫苏糖醇)或TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐；Getz等人(1999)Anal.Biochem.Vol 273：73-80；Soltec Ventures，Beverly，MA)处理，然后用温和的氧化剂(例如脱氢抗坏血酸)重新形成链间二硫键(再氧化)而与本文所述的接头-降解剂中间体的缀合反应。
在一些情况下，经半胱氨酸工程化的抗TM4SF1抗体被还原，例如，在含2mM EDTA的50mM Tris，pH 8.0中在室温下用约50倍过量的DTT过夜进行，这去除Cys和谷胱甘肽加合物以及减少抗体中的链间二硫键。在一些情况下，加合物的去除通过使用PLRP-S柱的反相LCMS进行监测。然后可以通过添加至少约四倍体积的10mM琥珀酸钠，pH 5缓冲液来稀释和酸化还原型经半胱氨酸工程化的抗体。可替代地，通过添加到至少四倍体积的10mM琥珀酸盐，pH 5并用10％乙酸滴定直至pH约为5来稀释和酸化抗体。随后将较低pH值和稀释的经半胱氨酸工程化的抗体负载至HiTrap S阳离子交换柱上，用数个柱体积的10mM乙酸钠，pH 5洗涤，并用50mM Tris，pH 8.0，150mM氯化钠洗脱。通过进行再氧化，在亲代Mab中存在的半胱氨酸残基之间重新建立二硫键。用15X脱氢抗坏血酸(DHAA)处理上述洗脱的还原型经半胱氨酸工程化的抗体约3小时，或者，可替代地，在室温下用200nM至2mM硫酸铜(CuSO4)水溶液处理过夜。可以使用本领域已知的其他氧化剂，即氧化剂和氧化条件。环境空气氧化也可能是有效的。这种温和的部分再氧化步骤以高保真度有效地形成链内二硫化物。可以使用PLRP-S柱通过反相LCMS监测再氧化。可以如上所述用琥珀酸盐缓冲液稀释再氧化的经半胱氨酸工程化的抗体以达到约5的pH，并且可以如上所述在S柱上进行纯化，不同之处在于用在10mM琥珀酸盐，pH 5(缓冲液A)中的10mM琥珀酸盐，pH 5，300mM氯化钠(缓冲液B)的梯度进行洗脱。向洗脱的抗体中添加EDTA至终浓度为2mM，并在必要时浓缩以达到超过5mg/mL的终浓度。所得的经半胱氨酸工程化的抗体可用于缀合，可在-20℃或-80℃下等分量保存。在6200系列TOF或QTOF Agilent LC/MS上进行液相色谱/质谱分析。在一些情况下，样品在加热至80℃的
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，1000A，微孔柱(50mm×2.1mm，Polymer Laboratories，Shropshire，UK)上进行色谱分析。使用从30-40％B的线性梯度(溶剂A：0.05％TFA的水溶液，溶剂B：0.04％TFA的乙腈溶液)并使用电喷雾源直接离子化洗脱液。数据由MassHunter软件(Agilent)收集和解卷积。在LC/MS分析之前，用PNGase F(2单位/ml；PROzyme，SanLeandro，CA)在37℃下处理抗体或缀合物(50微克)2小时以去除N-连接的碳水化合物。
可替代地，在37℃下用LysC(0.25μg/50μg(微克)抗体或缀合物)部分地消化抗体或缀合物15分钟而得到Fab和Fc片段，用于LCMS分析。对解卷积LCMS光谱中的峰进行分配和定量。降解剂与抗体比(DAR)通过计算与降解剂缀合的抗体相对应的一个或多个峰的强度与观测的所有峰的强度之比来计算。
降解剂化合物
降解剂是异双官能团小分子，可以与靶蛋白和泛素连接酶二者结合，导致靶标的泛素化和降解。降解剂试剂包含靶蛋白的配体(蛋白结合(PB)结构域)和E3连接酶识别结构域(E3LB)的配体。一旦降解剂已诱导对靶标的足够程度的泛素化，它就被蛋白酶体识别和降解。在一些情况下，蛋白结合结构域通过接头而连接到E3LB。降解剂可以诱导快速且持续的降解，诱导对下游信号的强烈抑制，并显示增强的靶标选择性。降解剂允许选择性细胞内去除非期望的蛋白质。此外，单个降解剂分子可以与靶蛋白分子进行多轮结合，从而使降解剂能够充当对蛋白质的选择性破坏的催化剂。
本文提供的降解剂具有结构E3LB-L2-PB；其中E3LB是E3连接酶结合基团，L2是接头，并且PG是蛋白结合基团。在一些情况下，E3LB与L2共价结合。在一些情况下，L2与蛋白结合基团(PB)共价结合。
降解剂抗体缀合物(DAC)可以包含单一抗体，其中单一抗体可以具有多于一种降解剂，每种降解剂通过接头L1而与抗体共价连接。“降解剂负载”是每个抗体的降解剂部分的平均数目。每个抗体(Ab)的降解剂负载范围可以为1至8种降解剂(D)。即，在PAC式Ab-(L1-D)p中，p的值为约1至约50、约1至约8、约1至约5、约1至约4、或约1至约3。通过接头L1而与抗体共价连接的每种降解剂可以是相同的或不同的降解剂，并且可以具有与共价连接至抗体的任何其他L1相同类型或不同类型的接头。在一个实施方案中，Ab是经半胱氨酸工程化的抗体并且p为约2。
对于一些DAC，p可能受抗体上的附接位点数目的限制。例如，抗体可以具有仅一个或几个半胱氨酸硫醇基团，或者可以具有仅一个或几个足够反应性的硫醇基团，接头可以通过该硫醇基团而被附接。Ab上连接L1-D的另一个反应位点是赖氨酸残基的胺官能团。p的值包括约1至约50、约1至约8、约1至约5、约1至约4、约1至约3的值，并且其中p等于2。在一些实施方案中，本文所述的主题涉及任何DAC，其中p为约1、2、3、4、5、6、7或8。
通常，在缀合反应期间，少于理论最大值的降解剂部分与抗体缀合。抗体可以包含例如不与接头L-降解剂基团(L1-D)或接头试剂反应的许多赖氨酸残基。仅反应性最高的赖氨酸基团可以与胺反应性接头试剂反应。此外，仅反应性最高的半胱氨酸硫醇基团可以与硫醇反应性接头试剂或接头L1-降解剂基团反应。通常，抗体不包含许多(若有)游离的和反应性的半胱氨酸硫醇基团，这些基团可以连接至降解剂部分。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在，并且必须在部分或全部还原条件下用还原剂(例如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP)还原。但是，PAR的降解剂负载(降解剂/抗体比，“PAR”)可以通过几种不同的方式进行控制，包括：(i)限制接头L-降解剂基团或接头试剂相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，和(iii)半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制还原条件。
DAC中使用的降解剂可以包括但不限于PROTAC-DB中公开的降解剂(参见GaoqiWeng，等人.PROTAC-DB：an online database of PROTACs.Nucleic Acids Research，2020；2021年3月26日见刊)。
E3连接酶识别结构域(E3LB)
E3泛素连接酶赋予泛素化的底物特异性。存在与这些连接酶结合的已知配体。如本文所述，E3泛素连接酶结合基团是可以结合E3泛素连接酶的肽或小分子。
E3泛素连接酶的代表性实例包括但不限于von Hippel-Lindau(VHL)；cereblon、XIAP、E3A；MDM2；后期促进复合物(APC)；UBR5(EDD1)；SOCS/BC框/eloBC/CUL5/RING；LNXp80；CBX4；CBLL1；HACE1；HECTD1；HECTD2；HECTD3；HECW1；HECW2；HERC1；HERC2；HERC3；HERC4；HUWE1；ITCH；NEDD4；NEDD4L；PPIL2；PRPF19；PIAS1；PIAS2；PIAS3；PIAS4；RANBP2；RNF4；RBX1；SMURF1；SMURF2；STUB1；TOPOR5；TRIP12；UBE3A；UBE3B；UBE3C；UBE4A；UBE4B；UBOX5；UBR5；WWP1；WWP2；Parkin；A20/TNFAIP3；AMFR/gp78；ARA54；β-TrCP1/BTRC；BRCA1；CBL；CHIP/STUB1；E6；E6AP/UBE3A；F框蛋白15/FBXO15；FBXW7/Cdc4；GRAII/RNF128；HOIP/RNF31；cIAP-1/HIAP-2；cIAP-2/HIAP-1；cIAP(pan)；ITCH/AIP4；KAP1；MARCH8；Mind Bomb1/MIB1；Mind Bomb 2/MIB2；MuRF1/TRIM63；NDFIP1；NEDD4；NleL；Parkin；RNF2；RNF4；RNF8；RNF168；RNF43；SART1；Skp2；SMURF2；TRAF-1；TRAF-2；TRAF-3；TRAF-4；TRAF-5；TRAF-6；TRIM5；TRIM21；TRIM32；UBR5；和ZNRF3。
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另一种示例性的E3泛素连接酶是von Hippel-Lindau(VHL)肿瘤抑制因子，它是E3连接酶复合物VCB的底物识别亚单元，其也由细长蛋白B和C、Cul2和Rbx1组成。VHL的主要底物是缺氧诱导性因子1α。(HIF-1α)是一种转录因子，其应答于低氧水平而上调基因，例如促血管生成生长因子VEGF和红细胞诱导细胞因子促红细胞生成素。结合VHL的化合物可以是羟脯氨酸化合物，例如在WO 2013/106643中公开的那些，以及在US2016/0045607、WO 2014/187777、US20140356322A1和美国专利号9,249,153中描述的其他化合物。另一种示例性的E3泛素连接酶是MDM2。用于MDM2的小分子结合化合物的实例包括“nutlin”化合物，例如nutlin 3a和nutlin 3，具有以下结构：
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用于本文的MDM2结合化合物包括，例如，以下项中描述的那些：WO2012/121361；WO2014/038606；WO2010/082612；WO2014/044401；WO2009/151069；WO2008/072655；WO2014/100065；WO2014/100071；WO2014/123882；WO2014/120748；WO2013/096150；WO2015/161032；WO2012/155066；WO2012/065022；WO2011/060049；WO2008/036168；WO2006/091646；WO2012/155066；WO2012/065022；WO2011/153509；WO2013/049250；WO2014/151863；WO2014/130470；WO2014/134207；WO2014/200937；WO2015/070224；WO2015/158648；WO2014/082889；WO2013/178570；WO2013/135648；WO2012/116989；WO2012/076513；WO2012/038307；WO2012/034954；WO2012/022707；WO2012/007409；WO2011/134925；WO2011/098398；WO2011/101297；WO2011/067185；WO2011/061139；WO2011/045257；WO2010/121995；WO2010/091979；WO2010/094622；WO2010/084097；WO2009/115425；WO2009/080488；WO2009/077357；WO2009/047161A1；WO2008/141975A1；WO2008/141917A1；WO2008/125487A1；WO2008/034736A2；WO2008/055812A1；WO2007/104714A1；WO2007/104664A1；WO2007/082805A1；WO2007/063013A1；WO2006/136606A2；WO2006/097261A1；WO2005/123691A1；WO2005/110996A1；WO2005/003097A1；WO2005/002575A1；WO2004/080460A1；WO2003/051360A1；WO2003/051359A1；WO1998/001467；WO2011/023677；WO2011/076786；WO2012/066095；WO2012/175487；WO2012/175520；WO2012/176123；WO2013/080141；WO2013/111105；WO2013/175417；WO2014/115080；WO2014/115077；WO2014/191896；WO2014/198266；WO2016/028391A9；WO2016/028391A2；WO2016/026937；WO2016/001376；WO2015/189799；WO2015/155332A1；WO2015/004610A8；WO2013/105037A1；WO2012/155066A3；WO2012/155066A2；WO2012/033525A3；WO2012/047587A2；WO2012/033525A2；WO2011/106650A3；WO2011/106650A2；WO2011/005219A1；WO2010/058819A1；WO2010/028862A1；WO2009/037343A1；WO2009/037308A1；WO2008/130614A3；WO2009/019274A1；WO2008/130614A2；WO2008/106507A3；WO2008/106507A2；WO2007/107545A1；WO2007/107543A1；WO2006032631A1；WO2000/015657A1；WO1998/001467A2；WO1997/009343A3；WO1997/009343A2；WO1996/002642A1；US2007/0129416；Med.Chem.Lett，2013，4，466-469；J.Med.Chem.，2015，58，1038-1052；Bioorg.Med.Chem.Lett.25(2015)3621-3625；Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)3310-3314。设想与DAC一起使用的MDM2的小分子结合化合物的其他具体实例包括但不限于RG7112、RG7388、MI773/SAR405838、AMG 232、DS-3032b、RO6839921、RO5045337、RO5503781、依达奴林(Idasanutlin)、CGM-097和MK-8242。
另一种示例性的E3泛素连接酶是X连接的凋亡抑制剂(XIAP)。XIAP是阻止凋亡细胞死亡的蛋白质。用于XIAP的小分子结合化合物的实例包括美国专利号9,096,544；WO2015187998；WO 2015071393；美国专利号9,278,978；9,249,151；US 20160024055；US20150307499；US 20140135270；US 20150284427；US 20150259359；US 20150266879；US20150246882；US 20150252072；US 20150225449；美国专利号8,883,771，J.Med.Chem.，2015，58(16)6574-6588和Small-molecule Pan-IAP Antagonists：A Patent Review(2010)Expert Opin Ther Pat；20：251-67(Flygare&Fairbrother)中公开的化合物。示例性化合物包括下式的所有四氢-苯并二嗪酮(benzodiazinone)化合物：
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用于XIAP的其他小分子结合化合物包括但不限于AEG35156、信筒子醌(Embelin)、TWX006和TWX024。当XIAP结合部分用作降解剂的部分时，XIAP结合部分可以与XIAP的BIR2或BIR3结构域或两者结合。
另一种示例性E3泛素连接酶是cereblon。
蛋白结合(PB)基团
降解剂的PB组分是指与旨在被降解的靶蛋白(例如，寡肽或多肽)结合的分子。由本文所述的化合物介导的泛素化靶标包括真核系统或微生物系统中的任何蛋白，包括病毒、细菌或真菌，如本文另外所述。
PB基团包括小分子靶蛋白部分，例如热休克蛋白90(HSP90)抑制剂；激酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；MDM2抑制剂；靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物；HDAC抑制剂；人赖氨酸甲基转移酶抑制剂；血管生成抑制剂；免疫抑制性化合物；靶向芳烃受体(AHR)、REF受体激酶、FKBP、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体、HIV蛋白酶、HIV整合酶、HCV蛋白酶、酰基蛋白硫酯酶-1和-2(APT和APT2)的化合物，其药学上可接受的盐、其对映异构体、其溶剂化物或其多晶型物，以及可以靶向目的蛋白的其他小分子。
目的靶蛋白包括，例如，结构蛋白、受体、酶、细胞表面蛋白、与细胞综合功能相关的蛋白质，包括参与催化活性、芳香酶活性、运动活性、解旋酶活性、代谢过程(合成代谢和分解代谢)、抗氧化活性、蛋白水解、生物合成中的蛋白质，具有激酶活性、氧化还原酶活性、转移酶活性、水解酶活性、裂合酶活性、异构酶活性、连接酶活性、酶调节剂活性、信号转导活性、结构分子活性、结合活性(蛋白、脂质碳水化合物)、受体活性、细胞运动性、膜融合、细胞通讯、生物过程的调节、发育、细胞分化、对刺激应答的蛋白质，行为蛋白，细胞粘附蛋白，参与细胞死亡的蛋白质，参与转运(包括蛋白转运蛋白活性、核转运蛋白、离子转运蛋白活性、通道转运蛋白活性、载体活性、渗透酶活性、分泌活性、电子转运蛋白活性、发病机制、分子伴侣调节活性、核酸结合活性、转录调节活性、细胞外组织和生物发生活性、翻译调节活性)的蛋白质。
降解剂分子的PB组分可以是结合蛋白靶标的肽或小分子，例如，细胞内蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、引起疾病或疾病相关的蛋白、TNF受体相关死亡结构域蛋白(TRADD)、受体相互作用蛋白(RIP)、TNF受体相关因子2(TRAF2)、IK-α、IK-β、IK-ε、PLCγ、IQGAP1、Rac1、MEK1/2、ERK1/2、PI4K230、Akt1/2/3、Hsp90、GSK-3β、HDAC蛋白、FoxO1、HDAC6、DP-1、E2F、ABL、AMPK、BRK、BRSK I、BRSK2、BTK、CAMKK1、CAMKKα、CAMKKβ、Rb、Suv39HI、SCF、p19INK4D、GSK-3、pi 8 INK4、myc、细胞周期蛋白E、CDK2、CDK9、CDG4/6、Cycline D、p16INK4A、cdc25A、BMI1、SCF、Akt、CHK1/2、C 1δ、CK1γ、C 2、CLK2、CSK、DDR2、DYRK1A/2/3、EF2K、EPH-A2/A4/B/B2/B3/B4、EIF2A 3、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、p53、p21Cip1、PAX、Fyn、CAS、C3G、SOS、Ta1、Raptor、RACK-1、CRK、Rap1、Rac、KRas、NRas、HRas、GRB2、FAK、PI3K、spred、Spry、mTOR、MPK、LKB1、PAK 1/2/4/5/6、PDGFRA、PYK2、Src、SRPK1、PLC、PKC、PKA、PKBα/β、PKCα/γ/ζ、PKD、PLK1、PRAK、PRK2、WAVE-2、TSC2、DAPK1、BAD、IMP、C-TAK1、TAK1、TAO1、TBK1、TESK1、TGFBR1、TIE2、TLK1、TrkA、TSSK1、TTBK1/2、TTK、Tp12/cotl、MEK1、MEK2、PLDLErk1、Erk2、Erk5、Erk8、p90RSK、PEA-15、SRF、p27 KIP1、TIF 1a、HMGN1、ER81、MKP-3、c-Fos、FGF-R1、GCK、GSK3β、HER4、HIPK1/2/3/、IGF-1R、cdc25、UBF、LAMTOR2、Stat1、StaO、CREB、JAK、Src、PTEN、NF-KB、HECTH9、Bax、HSP70、HSP90、Apaf-1、Cyto c、BCL-2、Bcl-xL、Smac、XIAP、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、CDC37、TAB、IKK、TRADD、TRAF2、R1P1、FLIP、TAK1、JNK1/2/3、Lck、A-Raf、B-Raf、C-Raf、MOS、MLK1/3、MN1/2、MSK1、MST2/3/4、MPSK1、MEKK1、ME K4、MEL、ASK1、MINK1、MKK 1/2/3/4/6/7、NE 2a/6/7、NUAK1、OSR1、SAP、STK33、Syk、Lyn、PDK1、PHK、PIM 1/2/3、Ataxin-1、mTORC1、MDM2、p21Waf1、细胞周期蛋白D1、Lamln A、Tp12、Myc、联蛋白、Wnt、IKK-β、IKK-γ、IKK-α、IKK-ε、ELK、p65RelA、IRAKI、IRA 2、IRAK4、IRR、FADD、TRAF6、TRAF3、MKK3、MKK6、ROCK2、RSK1/2、SGK 1、SmMLCK、SIK2/3、ULK1/2、VEGFR1、WNK 1、YES1、ZAP70、MAP4K3、MAP4K5、MAPK1b、MAPKAP-K2 K3、p38α/β/δ/γMAPK、极光激酶A、极光激酶B、极光激酶C、MCAK、Clip、MAPKAPK、FAK、MARK 1/2/3/4、Mucl、SHC、CXCR4、Gap-1、Myc、β-联蛋白/TCF、Cbl、BRM、Mcl-1、BRD2、BRD3、BRD4、BRDt、BRD7、BRD9、AR、RAS、ErbB3、EGFR、IRE1、HPK1、RIPK2、PDE4、ERRα、FKBP12、brd9、c-Met、Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt4、Sirt5、Sirt6、Sirt7、flt3、BTK.ALK、TRIM24、GSPT1、IKZF1(Ikaros)、IKZF3(Aiolos)、CK1-α、TACC3、p85、MetAP-2、DHFR、BET、CRABP-I/II、HIF1-α、PCAF、GCN5L2(GCN5)、SMARCA2、SMARCA4、PBRM1、HER2、Akt、Hsp90、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10、HDAC11、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeCP2、MBD1、MBD2、MBD4、KAISO(ZBTB33)、ZBTB4、ZBTB38、UHRF1、UHRF2、TET1、TET2、TET3、HATI、HTATIP(TIP60)、MYST1(MOF)、MYST2(HBO1)、MYST3(MOZ)、MYST4(MORF)、P300(EP300、KAT3B)、CBP(CREBBP、KAT3A)、NCOA1(SRC1)、NCOA2(TIF2)、NCOA3(AIB1、ACTR)、ATF-2(CREB2、CREBP1)、TFIIIC、TAF1(TAFII250)、CLOCK(KIAA0334)、CIITA(MHC2TA)、MGEA5(NCOAT)、CDY、KMT1A、KMT1B、KMT1C、KMT1E、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2E、KMT2F、EZH1、EZH2、KMT3A、WHSC1、WHSC1L1、PRDM1、PRDM2、PRDM3、PRDM4、PRDM5、PRDM9、PRDM14、PRDM16、KMT3C、KMT3E、SMYD4、DOT1L、SET8、SUV4-20H2、SetD6、SET7/9、PRMT1、PRMT2、PRMT4、PRMT5、PRMT6、PRMT7、PRMT8、PRMT9、HP1、Chd1、WDR5、BPTF、L3MBTL1、ING2、BHC80、JMJD2A、KDM1A、KDM1B、KDM2A、KDM2B、KDM3A、KDM3C、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、JARID2、KDM6A、KDM6B、KDM6C、KDM7A、KDM7C、KDM7B、JMJD5、RSBN1、JMJD6、PADI4、K-Ras、PI3K、BTK、B-Raf、ERK、MEK、P65(RELA)、NFkB的p50(NFKB1)、Ras、Raf、eNOS、Smad家族蛋白、Smad2/3/4和ERα、其变体、其突变体、其剪接变体、其得失位和其融合物。在一些实施方案中，PB基团结合选自以下中的蛋白：Akt、Hsp90、HDAC6、K-Ras、PI3K、BTK、B-Raf、ERK、MEK、P65(RELA)、NFkB的p50(NFKB1)、Ras、Raf、eNOS、Smad家族蛋白、Smad2/3/4及其组合。
在一些实施方案中，PB是结合Brd4的小分子，例如选自以下中的结构(或其药学上合适的盐或互变异构体)：
Figure BDA0003967617510001431
Figure BDA0003967617510001432
7-(3，5-二氟吡啶-2-基)-N-(5-((5-(1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯氧基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)异噁唑-3-基)氧基)戊基)-2-甲基-10-((甲基磺酰基)甲基)-3-氧代-3，4，6，7-四氢-2H-2，4，7-三氮杂二苯并[cd，f]薁-9-甲酰胺(两种单一立体异构体)；
Figure BDA0003967617510001433
(2S，4R)-1-((S)-2-(H-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂
Figure BDA0003967617510001443
-6-基)乙酰氨基)十一酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯氧基)吡咯烷-2-甲酰胺；
Figure BDA0003967617510001441
(2S，4R)-1-((S)-2-(H-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2，3，9-三甲基-6H-噻吩并[3，2-f][1，2，4]三唑并[4，3-a][1，4]二氮杂
Figure BDA0003967617510001444
-6-基)乙酰氨基)十一酰胺基)-3，3-二甲基丁酰基)-4-羟基-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苯氧基)吡咯烷-2-甲酰胺；
Figure BDA0003967617510001442
4-(3，5-二氟吡啶-2-基)-N-(11-(((S)-1-((2S，4R)-4-羟基-2-((4-(4-甲基噻唑-5-基)苯氧基)氨基甲酰基)吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-11-氧代十一烷基)-10-甲基-7-((甲基磺酰基)甲基)-11-氧代-3，4，10，11-四氢-1H-1，4，10-三氮杂二苯并[cd，f]薁-6-甲酰胺；
Figure BDA0003967617510001451
4-(3，5-二氟吡啶-2-基)-N-(11-(((S)-1-((2S，4R)-2-(((2′-氟-[1，1′-联苯基]-4-基)氧基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-3，3-二甲基-1-氧代丁烷-2-基)氨基)-11-氧代十一烷基)-10-甲基-7-((甲基磺酰基)甲基)-11-氧代-3，4，10，11-四氢-1H-1，4，10-三氮杂二苯并[cd，f]薁-6-甲酰胺；和
Figure BDA0003967617510001452
4-(3，5-二氟吡啶-2-基)-N-(5-((5-(1-((2S，4R)-2-(((2′-氟-〔1，1′-联苯基]-4-基)氧基)氨基甲酰基)-4-羟基吡咯烷-1-基)-3-甲基-1-氧代丁烷-2-基)异噁唑-3-基)氧基)戊基)-10-甲基-7-((甲基磺酰基)甲基)-11-氧代-3，4，10，11-四氢-1H-1，4，10-三氮杂二苯并[cd，f]薁-6-甲酰胺(两种单一立体异构体)。
在一些实施方案中，PB是具有以下结构的小分子，其中R是叠氮化物、DBCO、四嗪、BCN、马来酰亚胺、BrAc或任何缀合点击柄，并且其中杂原子可以位于间隔子/接头/链上的任何位置：
Figure BDA0003967617510001461
在一些实施方案中，PB是具有以下结构的小分子，其中X是S-R、苄基、硫醚、与抗体的缀合柄、二硫化物增溶基团或二硫化物辅助基团，并且Y是杂原子，例如氮，硫或氧：
Figure BDA0003967617510001462
在一些实施方案中，PB是具有以下结构之一的小分子，其中R是Peg间隔子、聚肌氨酸或终止于抗体的任何缀合柄；X是S-R、苄基、硫醚、与抗体的缀合柄、二硫化物增溶基团或二硫化物辅助基团；并且Y是氧或氮：
Figure BDA0003967617510001471
Figure BDA0003967617510001472
在一些实施方案中，PB是结合Brd4的小分子，例如降解剂化合物1，如图17所示，并且降解剂抗体缀合物包含另在图17中所示的结构。
在一些实施方案中，PB是靶向人BET含溴结构域的蛋白的小分子。靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物包括但不限于与如下所述的靶标相关的化合物，其中“R”表示接头基团L或-L-(VHL配体部分)基团附接的位点。例如：
1.
Figure BDA0003967617510001481
JQ1，Filippakopoulos等人.″Selective inhibition of BET bromodomains，″Nature(2010)，468，1067-1073；Romero，等人，J.Med.Chem.59，1271-1298(2016)；
2.
Figure BDA0003967617510001482
I-BET，Nicodeme等人，″Supression of Inflammation by a Synthetic HistoneMimic，″Nature(2010)，468，1119-1123；Chung等人，″Discovery and Characterizationof Small Molecule Inhibitors of the BET Family Bromodomains，″J.Med Chem.(2011)，54，3827-3838；Romero，等人，J.Med.Chem.59，1271-1298(2016)；
3.
Figure BDA0003967617510001483
Hewings等人，″3，5-Dimethylisoxazoles Act as Acetyl-lysine BromodomainLigands，″J.Med.Chem.，(2011)，54，6761-6770；
4.
Figure BDA0003967617510001491
I-BET151，Dawson等人，″Inhibition of BET Recruitment to Chromatin as anEffective Treatment for MLL-fusion Leukemia，″Nature(2011)478，529-523；
5.Romero，等人，J.Med.Chem.59，1271-1298(2016)中鉴定的BET溴结构域抑制剂，包括但不限于：
a.I-BET151
Figure BDA0003967617510001492
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
b.PFI-1
Figure BDA0003967617510001493
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
c.OTX015
Figure BDA0003967617510001494
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
d.
Figure BDA0003967617510001501
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
e.
Figure BDA0003967617510001502
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
f.
Figure BDA0003967617510001503
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
g.
Figure BDA0003967617510001504
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
h.
Figure BDA0003967617510001511
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
1.
Figure BDA0003967617510001512
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
j.
Figure BDA0003967617510001513
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
k.
Figure BDA0003967617510001514
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
1.
Figure BDA0003967617510001521
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
m.
Figure BDA0003967617510001522
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
n.
Figure BDA0003967617510001523
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
o.
Figure BDA0003967617510001524
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
p.
Figure BDA0003967617510001531
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
q.
Figure BDA0003967617510001532
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
r.
Figure BDA0003967617510001533
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
S.
Figure BDA0003967617510001534
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
t.
Figure BDA0003967617510001541
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
u.
Figure BDA0003967617510001542
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
V.
Figure BDA0003967617510001543
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
w.
Figure BDA0003967617510001544
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
X.
Figure BDA0003967617510001551
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
y.
Figure BDA0003967617510001552
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
Z.
Figure BDA0003967617510001553
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
aa.
Figure BDA0003967617510001554
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
bb.
Figure BDA0003967617510001561
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
cc.
Figure BDA0003967617510001562
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
dd.
Figure BDA0003967617510001563
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
ee.
Figure BDA0003967617510001564
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
ff.
Figure BDA0003967617510001571
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
gg.
Figure BDA0003967617510001572
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
hh.
Figure BDA0003967617510001573
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
ii.
Figure BDA0003967617510001574
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
jj.
Figure BDA0003967617510001581
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
kk.
Figure BDA0003967617510001582
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
ll.
Figure BDA0003967617510001583
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
mm.
Figure BDA0003967617510001584
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
nn.
Figure BDA0003967617510001591
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
oo.
Figure BDA0003967617510001592
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
pp.RVX-208
Figure BDA0003967617510001593
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
qq.BI2536
Figure BDA0003967617510001594
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
rr.LY294002
Figure BDA0003967617510001601
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；和
ss.LY303511
Figure BDA0003967617510001602
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；和
6.Ghoshal，等人，″BET inhibitors in cancer therapeutics：a patentreview，″Expert Opinion on Therapeutic Patents，26：4，505-522，(2016)(以下简称Ghoshal，等人(2016))中鉴定的BET抑制剂，包括但不限于：
a.TEN010
Figure BDA0003967617510001603
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
b.CPI-0610
Figure BDA0003967617510001604
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
c.二氮杂
Figure BDA0003967617510001605
类
Figure BDA0003967617510001611
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
d.吡咯类和吡唑类
Figure BDA0003967617510001612
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
e.异噁唑类
Figure BDA0003967617510001613
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
f.喹啉和喹唑啉
Figure BDA0003967617510001614
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
g.噁嗪
Figure BDA0003967617510001621
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
h.苯并哌嗪
Figure BDA0003967617510001622
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
i.MS436
Figure BDA0003967617510001623
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
j.CPI-203
Figure BDA0003967617510001624
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；
k.Y803
Figure BDA0003967617510001625
(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))；和
1.Ghoshal，等人(2016)的图1或图4-27中任一项中报道的基于苯二氮杂
Figure BDA0003967617510001631
的BET抑制剂(经衍生，使得附接接头基团L或-L-(VHL配体部分))。
接头
本文所述的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段可以间接缀合至降解剂分子(例如，通过具有直接共价或非共价相互作用的接头(L1))。在降解剂分子内，泛素E3连接酶结合基团(E3LB)可以是间接缀合的蛋白质结合基团(PB)分子(例如，通过具有直接共价或非共价相互作用的接头(L2))。
接头L1
在一些实施方案中，将一个或多个降解剂分子与抗TM4SF1抗体缀合以形成DAC的接头(“L1”)是双官能团或多官能团部分。在一些实施方案中，可以使用L1制备DAC，该L1具有用于与降解剂和抗体共价附接的反应性官能团。例如，在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体(Ab)的半胱氨酸硫醇可以与接头的反应性官能团或接头L1-降解剂基团形成键以制备DAC。
接头通常可以分为两类：可切割的(例如肽、腙或二硫化物)或不可切割的(例如硫醚)。可以被溶酶体酶(例如组织蛋白酶B)水解的肽接头，例如缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)，已被用于将药物和抗体(US 6,214,345)连接。在一些情况下，此类接头对于它们在体循环中的相对稳定性和在肿瘤中有效释放药物的能力特别有用。在DAC的情况下，由天然肽代表的化学空间是有限的；因此，需要有各种非肽接头，其作用类似于肽并且可以被溶酶体蛋白酶有效切割。因此，本文在一些实施方案中提供了不同类型的非肽接头，用作可被溶酶体酶切割的接头L1。
A)肽模拟接头-本文提供了可被溶酶体酶切割的不同类型的用于PAC的非肽接头、肽模拟接头。例如，二肽(例如Val-Cit)中间的酰胺键被酰胺模拟物替代；和/或整个氨基酸(例如，Val-Cit二肽中的缬氨酸氨基酸)被非氨基酸部分(例如，环烷基二羰基结构(例如，环大小＝4或5))替代。
当L1是肽模拟接头时，它由下式表示
-Str-(PM)-Sp-，
其中：
Str是与Ab共价附接的延伸单元；
Sp是与降解剂部分共价附接的键或间隔子单元；和
PM是选自以下中的非肽化学部分：
Figure BDA0003967617510001641
W是-NH-杂环烷基-或杂环烷基；
Y是杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH-CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6亚烷基；每个R1独立地是C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；
R3和R2各自独立地是H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或者R3和R2一起可以形成C3-C7环烷基；和
R4和R5各自独立地是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或者R4和R5可以形成C3-C7环烷基环。
在一些实施方案中，L1通过E3LB、L2或PB基团中的任一个而与降解剂分子连接。在一些实施方案中，Y是杂芳基；R4和R5一起形成环丁基环。在一些实施方案中，Y是选自以下中的部分：
Figure BDA0003967617510001642
Figure BDA0003967617510001651
在一些实施方案中，Str是由下式表示的化学部分：
Figure BDA0003967617510001652
其中R6选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、C3-C8环烷基、(C1-C8亚烷基)O-和C1-C10亚烷基-C(O)N(Ra)-C2-C6亚烷基，其中每个亚烷基可以被选自以下中的一个至五个取代基取代：卤素、三氟甲基、二氟甲基、氨基、烷基氨基、氰基、磺酰基、磺酰胺、亚砜、羟基、烷氧基、酯、羧酸、烷硫基、C3-C8环烷基、C4-C7杂环烷基、芳基、芳基烷基、杂芳基烷基和杂芳基，每个Ra独立地是H或C1-C6烷基；Sp是-Ar-Rb-，其中Ar是芳基或杂芳基，Rb是(C1-C10亚烷基)O-。
在实施方案中，Str具有下式：
Figure BDA0003967617510001653
其中R7选自C1-C10亚烷基、C1-C10烯基、(C1-C10亚烷基)O-、N(Rc)-(C2-C6亚烷基)-N(Rc)和N(Rc)-(C2-C6亚烷基)；其中每个Rc独立地是H或C1-C6烷基；Sp是-Ar-Rb-，其中Ar是芳基或杂芳基，Rb是(C1-C10亚烷基)O-或Sp-C1-C6亚烷基-C(O)NH-。
在一些实施方案中，L1是由下式表示的非肽化学部分
Figure BDA0003967617510001654
R1是C1-C6烷基、C1-C6烯基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；R3和R2各自独立地是H或C1-C10烷基。
在一些实施方案中，L1是由下式表示的非肽化学部分
Figure BDA0003967617510001655
R1是C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2；
R4和R5一起形成C3-C7环烷基环。
在一些实施方案中，L1是由下式表示的非肽化学部分
Figure BDA0003967617510001661
R1是C1-C6烷基、(C1-C6烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C6烷基)NHC(O)NH2并且W如上所定义。
在一些实施方案中，接头可以是肽模拟接头，例如在WO2015/095227、WO2015/095124或WO2015/095223中描述的那些。
B)非肽模拟接头。在一些实施方案中，接头L1与抗体形成二硫键。在一方面，接头具有以下结构：
Figure BDA0003967617510001662
其中，R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基，或R1和R2形成3、4、5或6元环烷基或杂环基。接头共价结合至抗体和降解剂，如下所示：
Figure BDA0003967617510001663
在一方面，接头的羰基连接至降解剂分子中的胺基。还应注意，与Ab连接的硫原子是抗体中半胱氨酸的硫基团。在另一方面，接头L1具有能够与抗体上存在的游离半胱氨酸反应以形成共价键的官能度。此类反应性官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、α-卤代乙酰基、激活的酯(例如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯)。参见，例如，Klussman等人(2004)，Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773的第766页的缀合方法和本文的实施例。
在一些实施方案中，接头具有能够与抗体上存在的亲电基团反应的官能团。这种亲电基团的实例包括但不限于醛和酮羰基。在一些实施方案中，接头的反应性官能团的杂原子可以与抗体上的亲电基团反应并与抗体单元形成共价键。此类反应性官能团的非限制性实例包括但不限于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。
接头L1可以包含一种或多种接头组分。示例性接头组分包括6-马来酰亚胺基己酰基(“MC”)、马来酰亚胺基丙酰基(“MP”)、缬氨酸-瓜氨酸(“val-cit”或“vc”)、丙氨酸-苯丙氨酸(“ala-phe”)、对氨基苄氧羰基(“PAB”)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺基酯(“SPP”)和环己烷-1甲酸4-(N-马来酰亚胺基甲基)酯(“MCC”)。各种接头组分是本领域已知的，其中一些如下所述。在一些实施方案中，接头L1或其片段包含MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(环己烷-1-甲酸马来酰亚胺基甲酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺基酯)、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸N-琥珀酰亚胺酯)、SIAB((4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺基酯)。接头或其片段的其他实例包括：BS3([双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯]；BS3是同双官能团N-羟基琥珀酰亚胺酯，其靶向可接近的伯胺)、NHS/EDC(N-羟基琥珀酰亚胺和N-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS/EDC实现伯胺基团与羧基基团的缀合)、磺基-EMCS([N-e-马来酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS是异双官能团反应性基团(马来酰亚胺和NHS-酯)，其对巯基和氨基具有反应性)、酰肼(大多数蛋白含有暴露的碳水化合物，并且酰肼是将羧基基团和伯胺连接的有用试剂)和SATA(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸酯；SATA对胺具有反应性并添加受保护的巯基)。为了形成共价键，化学反应基团有多种活性羧基(例如酯)，其中羟基部分在修饰肽所需的水平上是生理上可接受的。具体的试剂包括N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基琥珀酰亚胺(磺基-NHS)、马来酰亚胺-苯甲酰基-琥珀酰亚胺(MBS)、γ-马来酰亚胺基-丁酰氧基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、马来酰亚胺基丙酸(MPA)、马来酰亚胺基己酸(MHA)和马来酰亚胺基十一烷酸(MUA)。伯胺是NHS酯的主要靶标。存在于蛋白的N末端的可接近的α-氨基和赖氨酸的ε-胺与NHS酯反应。当NHS酯缀合反应与伯胺反应释放N-羟基琥珀酰亚胺时，形成酰胺键。这些含有琥珀酰亚胺的反应性基团在本文中称为琥珀酰亚胺基。在本公开的某些实施方案中，蛋白上的官能团将是硫醇基团并且化学反应性基团将是含有马来酰亚胺基的基团，例如γ-马来酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。这种含有马来酰亚胺的基团在本文中被称为马来酰亚胺基团。当反应混合物的pH值为6.5-7.4时，马来酰亚胺基团对肽上的巯基最具选择性。在pH 7.0时，马来酰亚胺基团与巯基(蛋白(例如血清白蛋白或IgG)上的硫醇基团)的反应速率比与胺的反应速度快1000倍。因此，可以在马来酰亚胺基团和巯基之间形成稳定的硫醚键。
在一些实施方案中，接头L1包含赖氨酸接头。在一些实施方案中，所述接头包含MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(环己烷-1-甲酸马来酰亚胺基甲酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯)、4-(吡啶-2-基硫基)己酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-乙基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丙基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环戊基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环己基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸N-琥珀酰亚胺酯)或SIAB((4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)。在一些实施方案中，所述接头衍生自交联试剂，其中交联试剂包含N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、3-环丙基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、3-环丁基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-(2-吡啶基二硫代基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)、4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-(2-吡啶基二硫代基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)、4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)或17-(2，5-二氧代-2，5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5，8，11，14-四氧代-4，7，10，13-四氮杂十七烷-1-酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CX1-1)。
接头可以是“可切割性接头”，促进降解剂的释放。非限制性示例性可切割性接头包括酸不稳定性接头(例如，包含腙)、蛋白酶敏感性(例如，肽酶敏感性)接头、光不稳定性接头或含二硫化物的接头(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；US5208020)。
在某些实施方案中，接头具有下式：
-Aa-Ww-Yy-
其中A是“延伸单元”，并且a为0至1的整数；W是“氨基酸单元”，并且w为0至12的整数；Y是“间隔子单元”，并且y为0、1或2。此类接头的示例性实施方案描述于美国专利号7,498,298。
在一些实施方案中，接头组分包含将抗体与另一接头组分或降解剂分子连接的“延伸单元”。非限制性示例性延伸单元如下所示(其中波浪线表示与抗体、降解剂或其他接头组分共价附接的位点)：
Figure BDA0003967617510001701
接头L2
本文所述的降解剂的E3LB和PB基团可以通过任何合适的方式与接头(L2)连接，包括但不限于共价连接。在一些情况下，接头基团L2是包含一个或多个共价连接的A结构单元的基团(例如-A1...Aq-)，其中A1是与E3LB、PB或其组合中的至少一个偶联的基团。在某些实施方案中，A1将E3LB、PB或其组合直接连接至另一个E3LB、PB或其组合。在其他情况下，A1通过Aq将EL3B、PB或其组合间接连接至另一个E3LB、PB或其组合。
在某些情况下，A1至Aq各自独立地是键、CRLaRLb、O、S、SO、SO2、NRLc、SO2NRLc、SONRLc、CONRLc、NRLcCONRLd、NRLcSO2NRLd、CO、CRLa-CRLb、C≡C、SiRLaRLb、P(O)RLa、P(O)ORLa、NRLcC＝NCN)NRLd、NRLcC＝NCN)、NRLcC(＝CNO2)NRLd、任选被0-6个RLa和/或RLb基团取代的C3-11环烷基、任选被0-6个RLa和/或RLb基团取代的C3-11杂环基、任选被0-6个RLa和/或RLb基团取代的芳基、任选被0-6个RLa和/或RLb基团取代的杂芳基，其中RLa或RLb各自独立地可以与其他A基团连接以形成可以进一步被0-4个RLe基团取代的环烷基和/或杂环基部分；其中RLa、RLb、RLc、RLd和RLe各自独立地是H、卤素、C1-8烷基、OC1-8烷基、SC1-8烷基、NHC1-8烷基、N(C1-8烷基)2、C3-11环烷基、芳基、杂芳基、C3-11杂环基、OC1-8环烷基、SC1-8环烷基、NHC1-8环烷基、N(C1-8环烷基)2、N(C1-8环烷基)(C1-8烷基)、OH、NH2、SH、SO2C1-8烷基、P(O)(OC1-8烷基)(C1-8烷基)、P(O)(OC1-8烷基)2、CC-C1-8烷基、CCH、CH＝CH(C1-8烷基)、C(C1-8烷基)＝CH(C1-8烷基)、C(C1-8烷基)＝C(C1-8烷基)2、Si(OH)3、Si(C1-8烷基)3、Si(OH)(C1-8烷基)2、COC1-8烷基、CO2H、卤素、CN、CF3、CHF2、CH2F、NO2、SF5、SO2NHC1-8烷基、SO2N(C1-8烷基)2、SONHC1-8烷基、SON(C1-8烷基)2、CONHC1-8烷基、CON(C1-8烷基)2、N(C1-8烷基)CONH(C1-8烷基)、N(C1-8烷基)CON(C1-8烷基)2、NHCONH(C1-8烷基)、NHCON(C1-8烷基)2、NHCONH2、N(C1-8烷基)SO2NH(C1-8烷基)、N(C1-8烷基)SO2N(C1-8烷基)2、NHSO2NH(C1-8烷基)、NH SO2N(C1-8烷基)2、NH SO2NH2。
在某些情况下，q为大于或等于0的整数。在某些情况下，q为大于或等于1的整数。在某些情况下，例如，当q大于2时，Aq是连接至E3LB部分的基团，并且A1和Aq通过A结构单元而连接(此类A结构单元数：q-2)。在某些情况下，例如，当q为2时，Aq是连接至A1和E3LB部分的基团。在某些情况下，例如当q为1时，接头基团L2的结构是-A1-，并且A1是连接至E3LB部分和PB部分的基团。在另外的情况中，q为1至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20或1至10的整数。
在某些情况下，接头(L2)选自：
Figure BDA0003967617510001721
Figure BDA0003967617510001731
Figure BDA0003967617510001741
Figure BDA0003967617510001751
Figure BDA0003967617510001761
在一些情况下，接头基团可以任选地是具有1至约100个乙二醇单元、约1至约50个乙二醇单元、1至约25个乙二醇单元、1至约25个乙二醇单元、约1至10个乙二醇单元、1至约8个乙二醇单元和1至6个乙二醇单元、2至4个乙二醇单元的取代的(聚)乙二醇，或散布有任选取代的O、N、S、P或Si原子的任选取代的烷基。在某些情况下，接头被芳基、苯基、苄基、烷基、亚烷基或杂环基团取代。接头可以是不对称的或对称的。在一些情况下，接头可以是取代或未取代的聚乙二醇基团，其大小范围为约1至约12个乙二醇单元、1至约10个乙二醇单元、约2至约6个乙二醇单元、约2至5个乙二醇单元、约2至4个乙二醇单元。
E3LB基团和PB基团可以通过对接头的化学性质合适且稳定的任何基团而与接头基团共价连接。接头可以通过酰胺、酯、硫酯、酮基、氨基甲酸酯(carbamate)(氨基甲酸乙酯(urethane))、碳或醚独立地共价键合至E3LB基团和PB基团，其中每个基团可以插入在E3LB基团和PB基团上的任何位置，以提供泛素连接酶上的E3LB基团和待降解的靶蛋白上的PB基团的最大结合。在PB基团是E3LB基团的某些方面，用于降解的靶蛋白可以是泛素连接酶本身。在某些方面，接头可以与E3LB和/或PB基团上的任选取代的烷基、亚烷基、烯烃或炔基、芳基或杂环基连接。在一些情况下，E3LB基团或PB基团可以被衍生以产生与接头上的化学官能团反应的化学官能团。可替代地，可能需要对接头进行衍生以包括可以与E3LB和/或PB上的官能团反应的化学官能团。
L2还可以由下式表示：
Figure BDA0003967617510001771
其中Z是将E3LB与X连接的基团；并且X是将Z与基团PB连接的基团。
在实施方案中，Z是不存在(键)、-(CH2)i-O、-(CH2)i-S、-(CH2)i-NR、(CH2)i-X1Y1基团，其中X1Y1形成酰胺基团或氨基甲酸酯基团、酯或硫酯基团，或
Figure BDA0003967617510001772
其中，每个R是H、或C1-C3烷基、烷醇基团或杂环(包括水溶性杂环，优选吗啉基(morpholino)、哌啶或哌嗪基团以促进接头基团的水溶性)；每个Y独立地是键、O、S或N-R；并且每个i独立地为0至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；在实施方案中，X是
Figure BDA0003967617510001781
其中每个V独立地是键(不存在)，
Figure BDA0003967617510001782
j为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；
k为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；优选地k为1、2、3、4或5；
m′为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；
n为1至100、1至75、1至60、1至55、1至50、1至45、1至40、2至35、3至30、1至15、1至10、1至8、1至6、1、2、3、4或5；
X1是O、S或N-R，优选是O；
Y同上；
并且CON是连接基团(其可以是键)，当存在于接头基团中时，将Z连接至X。
在实施方案中，CON是键(不存在)、杂环，包括水溶性杂环，例如哌嗪基或其他基团或基团，
Figure BDA0003967617510001791
其中X2是O、S、NR4、S(O)、S(O)2、-S(O)2O、-OS(O)2或OS(O)2O；X3是O、S、CHR4、NR4；和
R是H或任选地被一个或两个羟基取代的C1-C3烷基基团，或其药学上可接受的盐、对映异构体或立体异构体。
在一些方面，接头基团是具有1至约100个乙二醇单元、约1至约50个乙二醇单元、1至约25个乙二醇单元、约1至10个乙二醇单元、1至约8个乙二醇单元和1至6个乙二醇单元、2至4个乙二醇单元的(聚)乙二醇。
在实施方案中，CON是
Figure BDA0003967617510001792
或酰胺基团。
尽管E3LB基团和PB基团可以通过对接头的化学性质合适且稳定的任何基团而与接头基团共价连接，但在一些方面，接头通过酰胺、酯、硫酯、酮基团、氨基甲酸酯(氨基甲酸酯)或醚而与E3LB基团和PB基团独立地共价键合，所述基团各自可以插入在E3LB基团和PB基团上的任何位置，以使E3LB基团能够与泛素连接酶结合，并且PB基团与待降解的靶蛋白结合。例如，如本文所示，可以设计接头并将其连接至E3LB和PB，以最小化、消除或中和其存在可能对E3LB和PB与其各自的结合配偶体的结合产生的任何影响。在某些方面，用于降解的靶向蛋白可以是泛素连接酶。
使用方法
本公开进一步提供了一种抑制内皮细胞(EC)所特有的细胞-细胞相互作用的方法，所述相互作用例如是但不限于EC-EC、EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用。在某些实施方案中，本公开的含有抗TM4SF1抗体和片段的DAC可用来治疗具有特征在于异常EC-细胞相互作用的病理学的任何人疾病或病症。在某些实施方案中，该EC-细胞相互作用是EC-白细胞相互作用，其中使用对EC-白细胞相互作用的抑制来预防炎症。
在其他实施方案中，本公开提出了一种治疗或预防对象的疾病或病症的方法，其中该疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括施用如本文所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，该EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。在示例性实施方案中，该疾病是炎症性疾病或病症，并且本公开的抗体和片段用于抑制EC-白细胞相互作用。在另一示例性实施方案中，该疾病或病症选自炎症性疾病或癌症。白细胞向血管内皮的粘附是炎症性过程的标志。因此，在一个实施方案中，本公开的含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的DAC用来治疗炎症性疾病，其中抑制白细胞向内皮细胞的附着或抑制白细胞跨内皮的迁移有助于治疗(参见例如Rychly等人，Curr Pharm Des.2006；12(29)：3799-806，该文献通过引用而整体并入本文)。实例包括但不限于脓毒症、炎症性肠病、银屑病或多发性硬化。
每年，仅在美国就有约50万患者死于癌症。肿瘤转移导致这些死亡中的约90％。没有阻断转移的疗法是已知的。本公开提供了抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段可基于对由新颖靶标TM4SF1介导的肿瘤细胞(TC)-内皮细胞(EC)相互作用的免疫阻断来治疗癌症并抑制转移性细胞。
如上所述，TM4SF1是一种四次穿膜蛋白样细胞表面小糖蛋白，最初作为在TC侵袭和转移中具有作用的TC抗原被发现。TM4SF1由TC和EC选择性表达。在小鼠与人中，TM4SF1均以低水平在对正常组织进行供给的血管EC上表达。已经表明，TM4SF1以约10-20倍高的水平在内衬于对许多人类癌症进行供给的血管的血管EC上表达，并且以等同的高水平在培养的EC上表达。富含TM4SF1的微域(TMED)募集细胞表面蛋白，如整联蛋白，以帮助形成nanopodia，即从细胞表面延伸并且介导细胞-细胞相互作用的薄膜通道。因此，在某些情况下，本文所述的含有抗TM4SF1抗体和片段的DAC干扰nanopodia介导的相互作用，并且抑制TC外渗所必需的TC与EC的相互作用。
本公开的DAC可被配制用于治疗患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症，如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、肝癌、胃癌和肺癌；肥胖症；黄斑变性；糖尿病视网膜病变；银屑病；类风湿性关节炎；细胞免疫性；和红斑痤疮)的对象(例如人)。
TM4SF1在大多数上皮TC的表面上高度表达，并且还在内衬于肿瘤血管的EC上以及在培养的EC上高度表达。它在正常血管EC的表面上以约1/10-1/20低的水平表达。在小鼠模型中，肿瘤向肺的转移与EC和TC两者上的TM4SF1表达相关。转移需要TC初始附着至血管EC上，它们随后跨越EC迁移进入肺或其他转移部位。以下实施例显示，在一些情况下，本公开的抗TM4SF1抗体在培养中干扰TC-EC相互作用，并且还可在体内抑制肿瘤转移。
因此，本公开的DAC可用来阻断转移中的一个或两个最早步骤，即，TC向血管EC的附着和/或TC跨越EC的变移，由此预防高危癌症患者中的转移或大大减少转移的数目。
本公开还提供了一种用于预防转移的方法。人类肿瘤通常在生长的早期阶段使TC脱落到血液和淋巴中；因此，对原发性肿瘤的早期治疗不能提供转移尚未发生的保证。因此，TM4SF1的免疫阻断可用于治疗或预防血行转移或者治疗或预防淋巴性转移。
在一些实施方案中，本公开的方法涉及抑制对象中的转移性细胞。在一个实施方案中，对象患有癌症，例如与转移相关的癌症或已转移的癌症。在其他实施方案中，对象已针对癌症进行了治疗，并且处于缓解期或部分缓解期，其中施用本文所述的含有抗TM4SF1抗体或片段的DAC的益处是它们起到预防转移以及维持缓解或部分缓解的作用。
在某些实施方案中，本公开提供了一种治疗具有发生转移的较大风险的个体的方法，其中施用本文所述的含有抗TM4SF1抗体和片段的DAC可用来抑制转移或延迟转移的发作。
本公开中包括一种通过向有需要的对象施用抗TM4SF1抗体来阻断肿瘤转移，特别是向肺的转移的方法。在一些实例中，抗TM4SF1抗体是人抗TM4SF1抗体，在本文中也称为抗hTM4SF1。在某些实施方案中，所述方法可包括向有需要的对象施用有效量的含有抗hTM4SF1抗体的DAC，其中所述有效量的所述抗体阻止肿瘤细胞(TC)附着于血管内皮细胞(EC)以及跨血管内皮细胞(EC)迁移。
在某些实施方案中，向患有癌症或处于转移风险中的对象施用含有抗TM4SF1抗体的DAC，以使剂量和频率维持长期TM4SF1免疫阻断。给药方案将通过以足以使在对象的正常血管EC上表达的TM4SF1饱和的量向对象施用含有抗TM4SF1抗体的DAC，来最大程度地抑制TM4SF1介导的转移。
在某些实施方案中，含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的DAC的有效施用量是足以在一周时实现循环抗体浓度>1μg/ml的量。
在某些实施方案中，含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的DAC的有效施用量是足以持续约1个月连续维持抗体的血清浓度等于或高于1μg/ml的量。
在一个实施方案中，本公开提供了一种治疗或预防人类对象中的转移的方法，该方法包括向该对象施用有效量的含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的DAC，其中该抗体或其抗原结合片段的所述有效量包括1至80mg/kg的量的所述抗体或其抗原结合片段。
用于治疗性使用本公开的DAC的给药模式可以是将抗体递送至宿主的任何适当途径，如肠胃外给药，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、经肺、经粘膜(口服、鼻内、阴道内、经直肠)，使用呈片剂、胶囊、溶液、粉剂、凝胶、颗粒形式的制剂；以及容纳于注射器、植入装置、渗透泵、药筒、微型泵中；或为熟练技术人员所了解以及本领域中已知的其他手段。部位特异性给药可通过例如关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病变内、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内或经皮递送来实现。
在一些实施方案中，本公开的DAC可通过任何适合途径向对象施用，例如通过静脉内(i.v.)输注或团注以胃肠外方式、以肌肉内方式或以皮下方式或以腹膜内方式。静脉内输注可以经例如15、30、60、90、120、180或240分钟，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时来给予。在一些实施方案中，给予对象的剂量是约0.005mg至约100mg/kg，例如约0.05mg至约30mg/kg或约5mg至约25mg/kg，或约4mg/kg、约8mg/kg、约16mg/kg或约24mg/kg，或例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。在某些实施方案中，给予对象的剂量是例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。在一些情况下，给予对象的本公开的抗体的剂量可以是通过静脉内给药的约0.1mg/kg至10mg/kg。在一些情况下，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约0.1mg/kg至10mg/kg。在一些情况下，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约0.1mg/kg。在一些情况下，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约0.1mg/kg。在一些实施方案中，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约0.3mg/kg。在一些实例中，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约0.3mg/kg。在一些实例中，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约1.0mg/kg。在一些实例中，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约1.0mg/kg。在一些实例中，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过静脉内给药的约3.0mg/kg。在一些实例中，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约3.0mg/kg。在一些实例中，给予对象的本公开的抗体的剂量可以是通过静脉内给药的约10.0mg/kg。在一些实例中，给予对象的本公开的抗体的剂量是通过皮下给药的约10.0mg/kg。
在某些实施方案中，给予本公开的抗体的固定单位剂量，例如50、100、200、500或1000mg，或者剂量可基于患者的表面积，例如500、400、300、250、200或100mg/m2。在一些情况下，施用1至8次剂量(例如1、2、3、4、5、6、7或8次)以治疗患者，但可以给予9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或更多次剂量。
在一些实施方案中，在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更久之后，重复施用本文所述的本公开的DAC。如同长期给药一样，重复治疗过程也是可能的。重复给药以相同剂量或以不同剂量进行。在一些实例中，本文所述的本公开的DAC通过静脉内输注在每周间隔下以8mg/kg或以16mg/kg施用8周，随后每两周以8mg/kg或以16mg/kg进行施用，再持续16周，随后每四周以8mg/kg或以16mg/kg进行施用。或者，在一些实施方案中，本文所述的本公开的DAC在每周间隔下以0.1mg/kg至约10mg/kg施用17周。例如，在一些情况下，在启动治疗之后，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或替代地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或以其任意组合，使用每24、12、8、6、4或2小时一次的单剂量或分剂量，或以其任意组合，以每天约0.1-100mg/kg，如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg的量，以每日剂量提供本公开的抗体。在一些实施方案中，预防性施用本文所述的本公开的抗体，以降低发生炎症性疾病如RA、银屑病关节炎或银屑病的风险，延迟炎症性疾病如RA、银屑病关节炎或银屑病的进展中的事件的发生。在一些实例中，将本公开的DAC冻干以供储存，并且在使用前在合适的载体中重建。在一些情况下，本公开的抗体以无菌冷冻液体形式提供于具有塞子和带有翻开式盖子的铝封的玻璃小瓶中。在一些实例中，每个小瓶可容纳含有3.3mL 50mg/mL的抗体(包括10％过量灌装)在10mM组氨酸、8.5％(w/v)蔗糖和0.04％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂(pH5.8)中的溶液的DAC。在一些实例中，小瓶不含防腐剂，并且用于单次使用。小瓶可冷冻并避光保存。为了准备用于静脉内给药，在一些实例中，将DAC制剂在用无菌稀释剂稀释之前用0.22微米过滤器过滤。在一些实例中，使用管线内0.22微米过滤器，经至少30分钟的一段时间，通过静脉内输注来施用多达约100mL体积的稀释的DAC。或者，在一些实施方案中，以1或2次皮下注射施用DAC，其在约3.3mL中含有约50mg/mL抗体。皮下注射部位可以例如在腹部区域内。
药物组合物
在一些实施方案中，本公开的DAC可以包含在组合物(例如药物组合物)中。本公开的药物组合物可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
如本文所用的术语“药物组合物”是指含有与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的TM4SF1结合蛋白，并且在政府监管机构批准下作为用于治疗哺乳动物疾病的治疗方案的一部分制造或销售的组合物。例如，可以将药物组合物配制成以单位剂型(例如，片剂、胶囊、囊片、软胶囊(gel cap)或糖浆)口服给药；局部给药(例如，作为乳膏、凝胶、洗剂或软膏)；静脉内给药(例如，作为无颗粒栓子的无菌溶液并在适合静脉内使用的溶剂系统中)；或本文所述的其他任何制剂。
如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指对于所治疗的哺乳动物(例如人)在生理学上可接受，同时维持与其一起施用的蛋白质的治疗性质的载体。一种示例性的药学上可接受的载体为生理盐水。其他生理学上可接受的载体及其制剂是本领域技术人员已知的，并且例如在通过引用并入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版，A.Gennaro，1990，Mack Publishing Company，Easton，PA)中描述。
在一些实施方案中，包含含有TM4SF1抗体或其抗原结合片段的DAC的药物组合物被制备成溶液，在甘油、液体聚乙二醇中的分散体，及其在油中的任何组合，固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体制剂、包含纳米颗粒的剂型、包含微粒的剂型、聚合物剂型，或它们的任意组合。
在一些实例中，药学上可接受的赋形剂是Handbook of PharmaceuticalExcipients，American Pharmaceutical Association(1986)中描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。
在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。在一些实施方案中，作为缓冲剂，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐或其组合在本公开的药物组合物中使用。
在一些实施方案中，赋形剂包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗微生物剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实例中，抗氧化剂进一步包括但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁羟甲苯(BHT)、丁羟茴醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂包括有效霉素A、TL-3、原钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、氟磷酸二异丙酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含粘合剂作为赋形剂。合适的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶化淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯基噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖类、寡糖及其组合。在一些实例中，在药物制剂中使用的粘合剂选自淀粉，如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然树胶和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡类；碳酸钙；磷酸钙；醇类，如山梨醇、木糖醇、甘露醇，以及水，或其任意组合。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含润滑剂作为赋形剂。合适的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁和轻质矿物油。在一些实施方案中，在药物制剂中使用的润滑剂选自金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂酰富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山萮酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属十二烷基硫酸盐(如十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石，或它们的组合。
在一些实施方案中，药物制剂包含分散增强剂作为赋形剂。在一些实例中，合适的分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、羟基乙酸淀粉钠、同晶硅酸盐(isoamorphous silicate)和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。
在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施方案中，崩解剂是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉、甜味剂、粘土如膨润土、微晶纤维素、藻酸盐、羟基乙酸淀粉钠、树胶如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合，以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。
在一些实施方案中，赋形剂包括调味剂。在一些实例中，掺入外层的调味剂选自合成调味油和调味芳香剂；天然油；植物、叶、花和果实的提取物；及其组合。在一些实施方案中，调味剂可选自肉桂油；冬青油；薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉；香草；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；以及水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏的香精。
在一些实施方案中，赋形剂包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查尔酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(Stevia Rebaudiana)(甜菊甙)；蔗糖的氯衍生物如三氯蔗糖；以及糖醇如山梨醇、甘露醇、木糖醇等。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例可包括食品、药物和化妆品着色剂(FD&C)，药物和化妆品着色剂(D&C)，以及外用药物和化妆品着色剂(Ext.D&C)。着色剂可用作染料或其相应的色淀。
在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含螯合剂。在一些情况下，螯合剂是杀真菌螯合剂。实例包括但不限于：乙二胺-N，N，N′，N′-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠、三钠、四钠、二钾、三钾、二锂和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物；反式-1，2-环己烷-N，N，N′，N′-四乙酸一水合物；N，N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1，3-二氨基-2-羟基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；1，3-二氨基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；乙二胺-N，N′-二乙酸；乙二胺-N，N′-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N，N′-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N，N′，N′-三乙酸；乙二胺-N，N，N′，N′-四(亚甲基膦酸)；O，O′-双(2-氨基乙基)乙二醇-N，N，N′，N′-四乙酸；N，N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N，N-二乙酸；1，6-六亚甲基二胺-N，N，N′，N′-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1，2-二氨基丙烷-N，N，N′，N′-四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7，19，30-三氧杂-1，4，10，13，16，22，27，33-八氮杂双环[11，11，11]三十五烷六氢溴化物；或三乙烯四胺-N，N，N′，N″，N″′，N″′-六乙酸。
还涉及组合产品，其包含本文公开的抗TM4SF1抗体和一种或多种其他抗微生物剂或抗真菌剂，例如，多烯如两性霉素B、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、脂质体两性霉素B(L-AMB)和脂质体制霉菌素、唑类和三唑类如伏立康唑、氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、泊沙康唑等；葡聚糖合酶抑制剂如卡泊芬净、米卡芬净(FK463)和V-棘白菌素(LY303366)；灰黄霉素；烯丙胺类如特比萘芬；氟胞嘧啶或其他抗真菌剂，包括本文所述的那些。另外，预期肽可以与局部抗真菌剂如环吡酮胺、卤普罗近、托萘酯、十一烯酸酯、局部制霉菌素、阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬、特比萘芬和其他局部药剂组合。在一些情况下，药物组合物包含额外的药剂。在一些情况下，额外的药剂以治疗有效量存在于药物组合物中。
在普通的储存和使用条件下，如本文所述的药物组合物包含防腐剂以防止微生物的生长。在某些实例中，如本文所述的药物组合物不包含防腐剂。适合注射使用的药物形式包括无菌的水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。药物组合物包含载体，该载体是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和/或植物油，或其任意组合。例如，通过使用包衣，如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需要的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，来保持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来阻止微生物的作用。在许多情况下，包含等渗剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以引起可注射组合物的延长吸收。
例如，对于在水溶液中的肠胃外施用，如有必要，将液体剂型适当地缓冲，并且用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。液体剂型特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、瘤内和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，可采用的无菌水性介质是本领域技术人员已知的。例如，在某些情况下，将一个剂量溶解于1mL至20mL的等渗NaCl溶液中，并且添加至100mL至1000mL的流体(例如，碳酸氢钠缓冲盐水)中，或在建议的输注部位处注射。
在某些实施方案中，通过将所需量的免疫治疗剂与以上列举的各种其他成分(如果需要)一起并入合适的溶剂中，然后过滤除菌，来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌媒介物中来制备分散体，该无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些成分中的所需其他成分。在一些情况下，本文公开的组合物被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括，例如，酸加成盐(通过蛋白质的游离氨基形成)，并且该盐是用无机酸例如盐酸或磷酸，或有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等形成的。在一些情况下，通过游离羧基形成的盐衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等。在一些实施方案中，在配制后，药物组合物以与剂量制剂相容的方式和治疗有效的量施用。
在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含有效量的如本文公开的抗TM4SF1抗体与药学上可接受的载体的组合。如本文所用的，“药学上可接受的”包括不干扰活性成分的生物活性的有效性并且/或者对其所施用至的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液、各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上相容的载体的其他非限制性实例可包括凝胶、生物可吸收的基质材料、含有免疫治疗剂的植入元件，或其他任何合适的媒介物、递送或分配工具或材料。这样的载体例如通过常规方法配制，并且以有效量施用于对象。
联合疗法
在某些实施方案中，本公开的方法包括施用如本文公开的DAC，随后进行、在此之前进行或联合使用一种或多种进一步疗法。进一步疗法的实例可包括但不限于化学疗法、放射疗法、抗癌剂或其任何组合。进一步疗法可以与免疫疗法的施用同时或序贯施用。在某些实施方案中，本公开的方法包括施用如本文公开的免疫疗法，随后进行、在此之前进行或联合使用一种或多种抗癌剂或癌症疗法。抗癌剂包括但不限于化疗剂、放疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施方案中，癌症疗法包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施方案中，本公开的方法包括施用如本文所公开的免疫疗法，随后进行、在此之前进行或联合使用一种或多种其他免疫调节剂组合。在一些实例中，免疫调节剂包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物、分子或物质。其他免疫调节剂的非限制性实例包括与选自以下的蛋白质结合的试剂：A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD27、CD137、2B4、TIGIT、CD155、ICOS、HVEM、CD40L、LIGHT、TIM-1、OX40、DNAM-1、PD-L1、PD1、PD-L2、CTLA-4、CD8、CD40、CEACAM1、CD48、CD70、A2AR、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4，BTLA、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAG-3、TIM-3和VISTA；抗CD33抗体或其可变区；抗CD11b抗体或其可变区；COX2抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)，细胞因子，例如IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN3和1FNy，以及趋化因子，例如MIP-1、MCP-1和IL-8。
在某些实例中，在所述另外的疗法是放射疗法的情况下，示例性的剂量是5,000Rad(50Gy)至100,000Rad(1000Gy)，或50,000Rad(500Gy)，或所述范围内的其他合适的剂量。或者，放射剂量是约30至60Gy、约40至约50Gy、约40至48Gy或约44Gy，或所述范围内的其他合适的剂量，其中该剂量例如通过如上所述的剂量学研究来确定。如本文所用的“Gy”可指等于100Rad的辐射的特定吸收剂量的单位。Gy是“戈瑞(Gray)”的缩写。
在某些实例中，在所述另外的疗法是化学疗法的情况下，示例性的化疗剂包括但不限于烷化剂(例如，氮芥衍生物、乙烯亚胺、烷基磺酸酯、肼和三嗪、亚硝基脲和金属盐)、植物生物碱(例如，长春花生物碱、紫杉烷、鬼臼毒素和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如，蒽环类、色霉素类等)、抗代谢物(例如，叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂和各种其他抗肿瘤药(例如，核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂和类视黄醇)。示例性的化疗剂可以包括但不限于阿那曲唑
Figure BDA0003967617510001931
比卡鲁胺
Figure BDA0003967617510001932
硫酸博来霉素
Figure BDA0003967617510001933
白消安
Figure BDA0003967617510001934
白消安注射液
Figure BDA0003967617510001935
卡培他滨
Figure BDA0003967617510001936
N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂
Figure BDA0003967617510001937
卡莫司汀
Figure BDA0003967617510001938
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003967617510001939
顺铂
Figure BDA00039676175100019310
克拉屈滨
Figure BDA00039676175100019311
环磷酰胺
Figure BDA00039676175100019312
阿糖胞苷、胞嘧啶阿糖核苷
Figure BDA00039676175100019313
阿糖胞苷脂质体注射液
Figure BDA00039676175100019314
达卡巴嗪
Figure BDA00039676175100019315
更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素
Figure BDA00039676175100019316
柠檬酸柔红霉素脂质体注射液
Figure BDA00039676175100019317
地塞米松、多西他赛
Figure BDA00039676175100019318
盐酸多柔比星
Figure BDA00039676175100019319
Figure BDA00039676175100019320
依托泊苷
Figure BDA00039676175100019321
磷酸氟达拉滨
Figure BDA00039676175100019322
5-氟尿嘧啶
Figure BDA00039676175100019323
氟他胺
Figure BDA00039676175100019324
替扎他滨、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲
Figure BDA00039676175100019325
伊达比星
Figure BDA00039676175100019326
异环磷酰胺
Figure BDA00039676175100019327
伊立替康
Figure BDA00039676175100019328
L-天冬酰胺酶
Figure BDA00039676175100019329
甲酰四氢叶酸钙、美法仑
Figure BDA00039676175100019330
6-巯基嘌呤
Figure BDA00039676175100019331
甲氨蝶呤
Figure BDA00039676175100019332
米托蒽醌
Figure BDA00039676175100019333
麦罗塔、紫杉醇
Figure BDA00039676175100019334
phoenix(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他汀、聚苯丙生20和卡莫司汀植入物
Figure BDA00039676175100019335
枸橼酸他莫昔芬
Figure BDA00039676175100019336
替尼泊甙
Figure BDA00039676175100019337
6-硫鸟嘌呤、噻替派、替拉扎明
Figure BDA00039676175100019338
注射用盐酸拓扑替康
Figure BDA00039676175100019339
长春碱
Figure BDA00039676175100019340
长春新碱
Figure BDA00039676175100019341
和长春瑞滨
Figure BDA00039676175100019342
依鲁替尼、艾代拉利司(idelalisib)和维本妥昔单抗(brentuximabvedotin)。
示例性的烷化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯(triazenes)：尿嘧啶氮芥
Figure BDA00039676175100019343
Figure BDA00039676175100019344
Figure BDA00039676175100019345
盐酸氮芥
Figure BDA00039676175100019346
环磷酰胺
Figure BDA00039676175100019347
Figure BDA0003967617510001941
异环磷酰胺
Figure BDA0003967617510001942
美法仑
Figure BDA0003967617510001943
苯丁酸氮芥
Figure BDA0003967617510001944
哌泊溴烷
Figure BDA0003967617510001945
三亚乙基三聚氰胺
Figure BDA0003967617510001946
三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺
Figure BDA0003967617510001947
噻替派
Figure BDA0003967617510001948
白消安
Figure BDA0003967617510001949
Figure BDA00039676175100019410
卡莫司汀
Figure BDA00039676175100019411
洛莫司汀
Figure BDA00039676175100019412
链脲菌素
Figure BDA00039676175100019413
和达卡巴嗪
Figure BDA00039676175100019414
另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂
Figure BDA00039676175100019415
替莫唑胺
Figure BDA00039676175100019416
Figure BDA00039676175100019417
更生霉素(也称为放线菌素-D，
Figure BDA00039676175100019418
)；美法仑(也称为L-PAM、L-溶肉瘤素(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥，
Figure BDA00039676175100019419
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00039676175100019420
)；卡莫司汀
Figure BDA00039676175100019421
苯达莫司汀
Figure BDA00039676175100019422
白消安
Figure BDA00039676175100019423
Figure BDA00039676175100019424
卡铂
Figure BDA00039676175100019425
洛莫司汀(也称为CCNU，
Figure BDA00039676175100019426
)；顺铂(也称为CDDP，
Figure BDA00039676175100019427
)；苯丁酸氮芥
Figure BDA00039676175100019428
环磷酰胺
Figure BDA00039676175100019429
达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺，
Figure BDA00039676175100019430
)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)，
Figure BDA00039676175100019431
)；异环磷酰胺
Figure BDA00039676175100019432
泼尼氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼
Figure BDA00039676175100019433
二氯甲基二乙胺(也称氮芥、盐酸氮芥(mustine)和二氯甲基二乙胺盐酸盐，
Figure BDA00039676175100019434
)；链脲菌素
Figure BDA00039676175100019435
噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA，
Figure BDA00039676175100019436
)；环磷酰胺
Figure BDA00039676175100019437
Figure BDA00039676175100019438
以及盐酸苯达莫司汀
Figure BDA00039676175100019439
示例性的蒽环类可包括但不限于，例如，多柔比星
Figure BDA00039676175100019440
Figure BDA00039676175100019441
博来霉素
Figure BDA00039676175100019442
柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素，
Figure BDA00039676175100019443
)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体，
Figure BDA00039676175100019444
)；米托蒽醌
Figure BDA00039676175100019445
表柔比星(EllenceTM)；伊达比星
Figure BDA00039676175100019446
丝裂霉素C
Figure BDA00039676175100019447
格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素(ravidomycin)；以及去乙酰基拉维霉素(desacetylravidomycin)。
示例性的长春花生物碱包括但不限于酒石酸长春瑞滨
Figure BDA0003967617510001951
长春新碱
Figure BDA0003967617510001952
和长春地辛
Figure BDA0003967617510001953
长春碱(也称为硫酸长春碱、长春花碱和VLB，
Figure BDA0003967617510001954
Figure BDA0003967617510001955
)；以及长春瑞滨
Figure BDA0003967617510001956
示例性的蛋白酶体抑制剂可以是但不限于硼替佐米
Figure BDA0003967617510001957
卡非佐米(PX-171-007，(S)-4-甲基-N-((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰氨基)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；marizomib(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(MLN-9708)；delanzomib(CEP-18770)；以及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。
如本文所用的“与……组合”意指抗TM4SF1抗体和另外的疗法作为治疗方案或计划的一部分施用于对象。在某些实施方案中，联合使用并不要求在施用前将抗TM4SF1抗体与另外的疗法物理组合，也不要求其在同一时间范围内施用。例如，非限制性地，所述抗TM4SF1抗体和一种或多种药剂同时施用于所治疗的对象，或者在同一时间施用或以任何顺序或在不同的时间点顺序施用。
试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了包括本公开的组合物(例如药物组合物)(例如，包括含有抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的DAC的组合物)的试剂盒。试剂盒包括关于允许临床医师(例如医师或护士)向对象施用其中含有的组合物以治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的说明书。
在某些实施方案中，试剂盒包括含有有效量的本公开的抗体的单剂量药物组合物的包装。任选地，试剂盒中可包括施用药物组合物所必需的仪器或装置。例如，本公开的试剂盒可提供一个或多个含有有效量的本公开的疫苗、载体、稳定化三聚体或优化的病毒多肽的预填充注射器。此外，试剂盒还可包括额外的组成部分，诸如关于患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的对象使用一种或多种含有本公开的TM4SF1结合蛋白或多核苷酸的药物组合物的施用时间表的说明书。
表16.序列描述
Figure BDA0003967617510001961
Figure BDA0003967617510001971
Figure BDA0003967617510001981
Figure BDA0003967617510001991
Figure BDA0003967617510002001
Figure BDA0003967617510002011
Figure BDA0003967617510002021
Figure BDA0003967617510002031
Figure BDA0003967617510002041
Figure BDA0003967617510002051
Figure BDA0003967617510002061
Figure BDA0003967617510002071
Figure BDA0003967617510002081
Figure BDA0003967617510002091
Figure BDA0003967617510002101
Figure BDA0003967617510002111
Figure BDA0003967617510002121
Figure BDA0003967617510002131
Figure BDA0003967617510002141
Figure BDA0003967617510002151
Figure BDA0003967617510002161
Figure BDA0003967617510002171
Figure BDA0003967617510002181
Figure BDA0003967617510002191
Figure BDA0003967617510002201
Figure BDA0003967617510002211
Figure BDA0003967617510002221
Figure BDA0003967617510002231
Figure BDA0003967617510002241
Figure BDA0003967617510002251
实施例
通过参考作为本申请的示例性实施方案提供的以下非限制性实施例，可以更好地理解本申请。提供以下实施例是为了更全面地说明实施方案，但绝不应将其解释为限制本申请的广泛范围。
实施例1：降解剂与抗TM4SF1抗体的缀合
将各种示例性降解剂(Brd4、BCL-XL、Akt)与抗TM4SF1抗体缀合。Brd4降解剂的示例结构在图1A、1B、1C和图2中提供。使用如图3所示的化学合成路线，通过马来酰亚胺-缬氨酸-瓜氨酸可切割性接头将示例性Brd4降解剂中的一种与AGX-A07抗TM4SF1抗体缀合。所得抗体-降解剂缀合物如图4所示。
使用图5所示的步骤合成另一个示例性降解剂缀合物。在第一步中，合成谷胱甘肽可切割的二硫化物接头。如图5的步骤2所示，Brd4降解剂(图1B)用谷胱甘肽可切割的二硫化物接头进行酯化。得到的降解剂-抗体缀合物如图6所示。
如图7所示，通过谷胱甘肽可切割性接头将图1C(上图)的Brd4降解剂与AGX-A07抗体缀合，合成另一种示例性降解剂缀合物。所得结构如图8所示。
用于将Brd4降解剂与AGX-A07抗体缀合的另一种方法如图9所示，其中图1B中所示的Brd4降解剂使用可切割的二硫化物接头进行缀合。所得结构在图10中提供。类似地，图1C(上图)的Brd4降解剂通过可切割的二硫化物接头而与AGX-A07缀合，合成方案如图11所示，随后是图12中的所得缀合物结构。
在进一步的研究中，使用图13和图14中所示的合成方案合成BCL-XL降解剂。为了增强BCL-XL降解剂的效力，合成第二代BCL-XL降解剂，如图15所示。BCL-XL是线粒体蛋白。用小分子抑制BCL-XL蛋白已被广泛研究为癌症的治疗策略。在临床中，BCL-XL的小分子抑制剂包括WEHI-539(图14)(参见Lessene，G.等人.Structure-guided design of aselectiVe Bcl-XL inhibitor.Nat.Chem.Biol.9，390-397(2013))、A115463(图15)(参见ZF Tao，等人，Discovery of a Potent and SelectiVe BCL-XL Inhibitor with in ViVoActiVity，ACS Med Chem Lett.2014Aug 26；5(10)：1088-93)和ABT 263(参见Khan，S.；Zhang，X.；Lv，D.；Zhang，Q.；He，Y.；Zhang，P.；Liu，X.；Thummuri，D.；Yuan，Y.；Wiegand，J.S.；等人.A selective BCL-XL PROTAC degrader achieves safe and potent anti-tumor activity.Nat.Med.2019，25，1938-1947)，其诱导靶向和剂量限制性血小板减少症。
在最近的研究中，Khan等人发现BCL-XL降解剂比BCL-XL抑制剂更有效，对血小板的毒性更小。然而，在这项工作中设计的BCL-XL降解剂缺乏选择性并且不具有显著效力(DC50为333nM)。本实施例研究的目的是设计BCL-XL的降解剂抗体缀合物(DAC)，它选择性地将有效的BCL-XL的降解剂分子递送至靶细胞。为了实现这一目标，BCL-XL降解剂将基于高效的第二代BCL-XL抑制剂(A115463，如图15所示)进行设计。如本文所述，新型BCL-XL降解剂将通过可切割性和/或不可切割性接头而与示例性抗TM4SF1抗体缀合。
丝氨酸/苏氨酸激酶AKT是磷酸肌醇3-激酶(PI3K)信号传导级联的主要组分。PI3K/AKT是癌症中失调最高的信号传导通路之一，大部分肿瘤表现出异常的AKT激活。尽管强效小分子AKT已进入临床试验，但尚未观察到稳健和持久的治疗应答。You等人设计了如图16所示的pan-AKT降解剂，其利用GDC0068作为AKT配体。上述分子显示所有三种AKT从10至1000nM的降解。有意思的是，AKT降解比单独使用抑制剂具有更强的抗增殖效果，并且即使在洗脱之后，下游信号传导的丢失/抑制仍然存在。
AKT是由TMED转运的蛋白质。因此，预期包含AKT降解剂和抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的DAC由于这种物理接近性而在靶向AKT方面将具有有效性优势。邻近效应可能将当前一代降解剂的效力改善多达10,000倍，并可能提供更长的作用持续时间。图16所示的AKT降解剂分子的修饰形式将被设计并预期具有化学柄以安装可切割性和不可切割性接头以用于缀合抗体。
还合成了Akt降解剂，设计为相对于Akt抑制剂GDC-0068具有增强的效力。图16示出了一些修饰的Akt降解剂的结构。
实施例2：示例性降解剂抗TM4SF1缀合物的有效性
这些研究的目的是表征和评价根据本公开的示例性降解剂抗体缀合物的有效性，该缀合物包含与Brd4降解剂化合物1缀合的在Fc区具有修饰的抗TM4SF1抗体(A07-YTEC)(结构如图27所示)。Brd4是核蛋白，通过组蛋白乙酰化来调节基因表达，从而实现染色质去压实和拓扑-I激活。示例性降解剂抗体缀合物(表示为A07-YTEC-降解剂化合物1)被表征以评估降解剂与抗体比(DAR)，并进一步通过尺寸排阻色谱、Q-ToF完整液相色谱质谱进行表征。为了测量每个示例性降解剂抗体缀合物的DAR值，生成DAC15和DAC14的解卷积光谱(分别见图23和图24)。解卷积光谱可用于根据总离子色谱(TIC)峰计算或确认DAR值。此外，使用尺寸排阻柱(21.2mm×300mm)和pH7.4的磷酸盐缓冲盐水作为流动相生成DAC15(图25)和DAC14(图26)的色谱图。使用适当的缓冲液以最大限度地提高稳定性并最大限度地减少靶蛋白缀合物的聚集。对于色谱图，样品在不同pH值的各种缓冲液中合成，然后放入PD-10脱盐柱中，放入选定的最终制剂缓冲液中。为了比较的目的，使用包含含有与作为其细胞毒剂的类美登素(maytansinoid)有效负载缀合的修饰的Fc区的抗人TM4SF1抗体(A07-YTEC)的缀合物(称为ABZ或A07-YTEC-PEG4Ahx-DM1)进行另外的体外测定。
通过QTOF和SEC评估与BRD4降解剂化合物缀合的其他抗TM4SF1抗体，以确定DAR和任何聚集体的形成。示例性光谱显示在图30A-B(DAC15)、图31A-B(DAC14)、图32A-B(DAC12)、图33A-B(DAC11)、图34A-B(DAC9)、图35A-B(DAC8)和图37A-B(DAR为约2.0(位点特异性))。
使用包含A07一YTEC一降解剂化合物1的示例性缀合物进行体外测定。该测定的目的是使用HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)检查降解剂抗体缀合物在降解Brd4中的有效性。在20ng/mL的浓度下，观察到对测试细胞的强烈杀伤。
将HUVEC细胞与各种浓度的示例性降解剂抗体缀合物(表示为A07-YTEC-降解剂化合物1)一起孵育。评价的浓度包括对照1.33pM、13.33pM、133.33pM(0.13333nM)、1.33nM和13.33nM，如图18所示。在孵育四小时后，在示例性抗体-降解剂缀合物(A07-YTEC-降解剂化合物1)的不同摩尔浓度下，评价归一化为对照样品的核Brd4的比率。在孵育24小时后，通过共聚焦显微镜再次评价Brd4的核浓度，并与对照样品进行比较(图19)。在孵育五天后，测定EC50值以评价A07-YTEC-降解剂化合物1(在DAR为约5.0和约5.5时)杀死HUVEC细胞的效力，并使用MiaPaca2(胰腺癌细胞)和A549进一步测试细胞(肺泡癌细胞)。此外，评价与增溶基团缀合的A07-YTEC抗人抗体的五天杀伤活性以进行比较。五天细胞杀伤活性如图20(HUVEC细胞)、图21(MiaPaca2细胞)和图22(A549细胞)所示。
体外测定的结果表明，在以约20ng/ml(133.33pM)的浓度引入示例性抗体-降解剂缀合物的情况下，测试的细胞被强烈杀死。在孵育四小时后，在不同摩尔浓度的示例性抗体-降解剂缀合物(A07-YTEC-降解剂化合物1)下，评价归一化为对照样品的核Brd4的比率。1.33pM、13.33pM、133.33pM、1.33nM和13.33nM的结果表明部分降解(20％-40％)，在133.33pM下核Brd4蛋白减少24％。13.33nM浓度(40％)的降低幅度最大，但其他测试浓度均未显示超过24％的降低。
在24小时后，再次评价133.33pM样品中的Brd4和DAPI水平并与对照进行比较。结果表明在细胞核中显著(>50％)降解(图19)。在五天后，评价A07-YTEC-降解剂化合物1在DAR为5.5(DAC15)时、A07-YTEC-降解剂化合物1在DAR为4.5(DAC14)时和A07-YTEC-PEG4Ahx-DM1(ABZ)在DAR为约2时的EC50值(对于HUVEC细胞的杀伤)。结果表明，DAC15的EC50值为0.157nM，DAC14为0.099nM，ABZ为0.1nM，如图20所示。ABZ包括类美登素接头有效负载，用作阳性对照和比较手段，以显示产生与细胞毒性分子相似水平的活性的非细胞毒素的有效性。
还使用示例性肿瘤细胞再次评价有效性。确定示例性DAC15和示例性DAC16在胰腺癌细胞(MiaPaca2)和肺癌细胞(A549)中孵育5天后的EC50值，以及A07-YTEC-PEG4Ahx-DM1的EC50值。结果在表17中并且也显示在图21和22。对于测试的两种肿瘤细胞系，结果表明，与DAR为5.5的缀合物(DAC15)相比，DAR为4.5的A07-YTEC-降解剂化合物1(DAC14)具有提高的EC50值。这与使用HUVEC细胞进行的体外测定的结果相似。
表17：内皮细胞和示例性肿瘤细胞的杀伤活性(EC50)
Figure BDA0003967617510002301
其他示例性DAC的细胞生存力研究结果如表18所示。在体外细胞杀伤测定中测试的示例性DAC中，一些缀合物包括针对TM4SF1(DAC16、DAC17)的鼠替代抗体，其余包括本文所述的人源化抗TM4SF1抗体(例如，在Fc区具有突变的AGX-A07，例如，YTEC突变)。
表18：示例性DACS的细胞杀伤活性总结
Figure BDA0003967617510002302
Figure BDA0003967617510002311
实施例3.Brd4降解测定
细胞杀伤测定。将细胞(HUVEC、MiaPaca2和A549)以10,000个细胞/mL的密度接种在96孔平底黑色微孔板(Corning，部件号3904)中的测定培养基(EGM2完全培养基用于HUVEC；RPMI/10％FBS用于MiaPaca2和A549)中。细胞在37℃下培养过夜。在第2天，含有Brd4降解剂化合物1的示例性抗TM4SF1降解剂缀合物在培养基中连续稀释5倍，并将100μl稀释的化合物转移到细胞板中。细胞板中测试示例性抗TM4SF1降解剂缀合物的最终最高浓度为333.335nM，最低浓度为0.0043nM。细胞板在37℃下孵育5天。将10μl PrestoBlue HS细胞生存力试剂(ThermoFisher cat#P50201)添加到每个孔中，并在CO2培养箱中孵育1小时，然后通过酶标仪(VarioskanTMLUX多模式酶标仪)读取570nm/600nm激发和发射处的吸光度)。
通过共聚焦荧光成像进行BRD4降解测定。Brd4的免疫荧光染色使用Cellvis玻璃底板(P24-1.5P)如下进行。从孔中吸出孔上清液，并分配300μL/孔的兔mAb Anti-Brd4[BL-149-2H5](Bethyl Laboratories，A700-004)在PBS/0.1％Triton中以1：500稀释。样品在室温下孵育2小时。用100μL/孔的PBS洗涤样品4次。将300μL/孔的二抗溶液[驴抗兔IgG(H+L)高度交叉吸收的二抗、Alexa Fluor 647(ThermoFisher Catalog#A-31573)和PBS/0.1％Triton中的DAPI]分配到每孔。使用Olympus共聚焦显微镜(FV3000)捕获Brd4的荧光图像。核Brd4荧光信号强度通过ImageJ计算，数据表示为归一化为对照的核Brd4比率。
如图28所示，还通过Western印迹通过用示例性抗TM4S1 DAC处理HUVEC或MiaPaca2细胞来评价BRD4降解。在降解剂抗体缀合物孵育4小时或24小时后评估BRD4降解。观察到示例性降解剂抗体缀合物(其包括如图27中所示的Brd4降解剂结构)在体外HUVEC内皮细胞和MiaPaca2肿瘤细胞中对BRD4降解非常有效。早在用示例性缀合物处理后4小时就观察到可测量的BRD4蛋白降解，在24小时降解高达90％(在HUVEC中)和70-80％(在MiaPaca2中)。
实施例4：降解剂化合物的位点特异性标记
在一些情况下，降解剂化合物与抗TM4SF1抗体的位点特异性缀合可以作为前述实施例中描述的半随机缀合的替代方式进行。此处描述了抗TM4SF1抗体与BRD4降解剂化合物的位点特异性缀合。图36显示了在本文公开的方法中通过位点特异性缀合产生的示例性DAC(DAC4)的示意图。
位点特异性缀合和合成
对于该过程，将BRD4降解剂化合物1的10mM储备溶液溶解在DMSO中。制备在PBS7.4中的5mM DTT溶液。制备示例性抗TM4SF1抗体(14.66mg/mL)。向在5mL eppendorf中的14.66mg/mL、672.38μL的10mg抗体中添加1.267mL的5mM EDTA、50mM Tris8.5，使终浓度为5mg/ml；ii)通过添加4.5eq.的DTT(来自5mM DTT储备液，60.03μL)将抗TM4SF1抗体在恒温混合器上于37℃下还原2小时；iii)将抗TM4SF1抗体还原2小时后，使用4ml、50k MWCOamicon过滤柱去除多余的DTT，并洗涤柱3次；iv)使用适当体积的5mM EDTA、50mM Tris 8.5稀释所得抗TM4SF1抗体；v)缓慢添加10eq.的DMSO中的BRD4降解剂化合物1(66.7μL，来自10mM储备液)降解剂，然后添加25-30％乙二醇以达到5mg/mL的终浓度；vi)将eppendorf在Thermomixer上于室温下孵育过夜；vii)接下来的几天，使用PD-10柱从反应混合物中除去乙二醇(条件：2.5ml样品上样和使用5mM EDTA、50mM Tris 8.5的3.5ml洗脱)；viii)然后使用4ml、50k MWCO amicon过滤柱将抗TM4SF1抗体-BRD4降解剂化合物1缓冲交换至10mM精氨酸、PBS 7.4缓冲液中；ix)抗TM4SF 1抗体-BRD4降解剂化合物1，通过Q-TOF完整质谱分析显示DAR 2种类的药物与抗体比(DAR)；x)10mg抗TM4SF1抗体产生7.5mg抗TM4SF1抗体-BRD4降解剂化合物1(75％产率)。表征示例性缀合物以评估降解剂与抗体比(DAR)，并进一步通过尺寸排阻色谱、Q-ToF完整液相色谱质谱进行表征。为了测量各个示例性降解剂抗体缀合物的DAR值，生成去卷积光谱(图37A)。解卷积光谱可用于根据总离子色谱(TIC)峰计算或确认DAR值。此外，使用尺寸排阻柱(21.2mm×300mm)和pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水作为流动相生成色谱图(图37B)。如图37A中所见，通过位点特异性缀合产生的示例性缀合物的DAR值为约2。
BRD4降解
BRD4降解使用通过使用上述方案的位点特异性缀合策略产生的示例性缀合物DAC4进行评估。使用这些DAC评估HUVEC和A549细胞以确定DC50(DC50：24小时内50％BRD4蛋白降解)。示例性缀合物显示在HUVEC细胞中具有31.86pM的DC50，在A549细胞中具有362.5pM的DC50(图38)。
体外细胞增殖试验
评估示例性缀合物DAC4的有效性的体外测定使用先前描述的细胞生存力测定进行。如图39所示，发现示例性缀合物DAC4在内皮细胞HUVEC中具有0.423nM的EC50。相同的抗体在A549中显示出3-5nM的EC50，在SKOV3肿瘤细胞中显示出1.191nM的EC50(表18)。此外，与具有约5的DAR但其他方面相同的缀合物相比，具有约2的DAR的示例性缀合物DAC4具有改进的与可显影性有关的性质，包括更好的溶解度。
体内肿瘤消退
在本研究中，评估了示例性缀合物DAC4在小鼠模型中影响A549异种移植肿瘤生长的能力。在图40中，评估了由1次注射或每天1次注射持续四天(q1dx4)组成的两种治疗方案。以12mg/kg向动物对象施用处理。
如图40所示，在用示例性缀合物给药后的不同时期测量肿瘤体积。与未注射药物的对照相比，示例性缀合物DAC4显示出有前景的肿瘤消退，特别是在q1dx4注射方案中。
虽然在本文中已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见，这些实施方案仅作为实例提供。在不背离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。应当理解，在实施本发明时可以采用对本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims (125)

1.一种异双官能团化合物，所述异双官能团化合物包含：
(a)抗TM4SF1抗体；和
(b)降解剂分子。
2.如权利要求1所述的异双官能团化合物，其中所述降解剂分子包含单配体分子，所述单配体分子与靶蛋白直接相互作用以诱导所述靶蛋白的降解。
3.如权利要求2所述的异双官能团化合物，其中所述单配体分子是SERD、SARD、IAPP拮抗剂、Boc3Arg-连接的配体或其任何组合。
4.如权利要求1所述的异双官能团化合物，其中所述降解剂分子包含单配体分子，所述单配体分子与E3泛素连接酶相互作用以调节所述E3泛素连接酶的底物选择性。
5.如权利要求1所述的异双官能团化合物，其中所述降解剂分子包含嵌合降解剂分子。
6.如权利要求5所述的异双官能团化合物，其中所述嵌合降解剂分子包含特异性和非遗传性凋亡蛋白抑制剂(IAP)依赖性蛋白消除物(SNIPER)。
7.如权利要求1所述的异双官能团化合物，其中所述降解剂分子包含泛素E3连接酶结合基团(E3LB)和靶蛋白结合基团(PB)。
8.如权利要求7所述的异双官能团化合物，其中所述E3LB包含表1-15中任一表中鉴定的蛋白质。
9.如权利要求7或8所述的异双官能团化合物，其中所述PB包含与选自以下中的蛋白质结合的肽或小分子：细胞内蛋白、细胞外蛋白、细胞表面蛋白、引起疾病或疾病相关的蛋白、TNF受体相关死亡结构域蛋白(TRADD)、受体相互作用蛋白(RIP)、TNF受体相关因子2(TRAF2)、IK-α、IK-β、IK-ε、PLCγ、IQGAP1、Rac1、MEK1/2、ERK1/2、PI4K230、Akt1/2/3、Hsp90、GSK-3β、HDAC蛋白、FoxO1、HDAC6、DP-1、E2F、ABL、AMPK、BRK、BRSKI、BRSK2、BTK、CAMKK1、CAMKKα、CAMKKβ、Rb、Suv39HI、SCF、p19INK4D、GSK-3、pi 8INK4、myc、细胞周期蛋白E、CDK2、CDK9、CDG4/6、Cycline D、p16 INK4A、cdc25A、BMI1、SCF、Akt、CHK1/2、C 1δ、CK1γ、C 2、CLK2、CSK、DDR2、DYRK1A/2/3、EF2K、EPH-A2/A4/B/B2/B3/B4、EIF2A 3、Smad2、Smad3、Smad4、Smad7、p53、p21 Cip1、PAX、Fyn、CAS、C3G、SOS、Ta1、Raptor、RACK-1、CRK、Rap1、Rac、KRas、NRas、HRas、GRB2、FAK、PI3K、spred、Spry、mTOR、MPK、LKB1、PAK 1/2/4/5/6、PDGFRA、PYK2、Src、SRPK1、PLC、PKC、PKA、PKBα/β、PKCα/γ/ζ、PKD、PLK1、PRAK、PRK2、WAVE-2、TSC2、DAPK1、BAD、IMP、C-TAK1、TAK1、TAO1、TBK1、TESK1、TGFBR1、TIE2、TLK1、TrkA、TSSK1、TTBK1/2、TTK、Tpl2/cot1、MEK1、MEK2、PLDL Erk1、Erk2、Erk5、Erk8、p90RSK、PEA-15、SRF、p27KIP1、TIF 1a、HMGN1、ER81、MKP-3、c-Fos、FGF-R1、GCK、GSK3β、HER4、HIPK1/2/3/、IGF-1R、cdc25、UBF、LAMTOR2、Stat1、StaO、CREB、JAK、Src、PTEN、NF-κB、HECTH9、Bax、HSP70、HSP90、Apaf-1、Cyto c、BCL-2、Bcl-xL、Smac、XIAP、胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、CDC37、TAB、IKK、TRADD、TRAF2、R1P1、FLIP、TAK1、JNK1/2/3、Lck、A-Raf、B-Raf、C-Raf、MOS、MLK1/3、MN 1/2、MSK1、MST2/3/4、MPSK1、MEKK1、ME K4、MEL、ASK1、MINK1、MKK 1/2/3/4/6/7、NE 2a/6/7、NUAK1、OSR1、SAP、STK33、Syk、Lyn、PDK1、PHK、PIM 1/2/3、Ataxin-1、mTORC1、MDM2、p21 Waf1、细胞周期蛋白D1、Lamln A、Tpl2、Myc、联蛋白、Wnt、IKK-β、IKK-γ、IKK-α、IKK-ε、ELK、p65RelA、IRAKI、IRA 2、IRAK4、IRR、FADD、TRAF6、TRAF3、MKK3、MKK6、ROCK2、RSK1/2、SGK1、SmMLCK、SIK2/3、ULK1/2、VEGFR1、WNK 1、YES1、ZAP70、MAP4K3、MAP4K5、MAPK1b、MAPKAP-K2 K3、p38α/β/δ/γMAPK、极光激酶A、极光激酶B、极光激酶C、MCAK、Clip、MAPKAPK、FAK、MARK 1/2/3/4、Mucl、SHC、CXCR4、Gap-1、Myc、β-联蛋白/TCF、Cbl、BRM、Mcl-1、BRD2、BRD3、BRD4、BRDt、BRD7、BRD9、AR、RAS、ErbB3、EGFR、IRE1、HPK1、RIPK2、PDE4、ERRα、FKBP12、brd9、c-Met、Sirt1、Sirt2、Sirt3、Sirt4、Sirt5、Sirt6、Sirt7、flt3、BTK.ALK、TRIM24、GSPT1、IKZF1(Ikaros)、IKZF3(Aiolos)、CK1-α、TACC3、p85、MetAP-2、DHFR、BET、CRABP-I/II、HIF1-α、PCAF、GCN5L2(GCN5)、SMARCA2、SMARCA4、PBRM1、HER2、Akt、Hsp90、HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、HDAC10、HDAC11、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b、MeCP2、MBD1、MBD2、MBD4、KAISO(ZBTB33)、ZBTB4、ZBTB38、UHRF1、UHRF2、TET1、TET2、TET3、HATI、HTATIP(TIP60)、MYST1(MOF)、MYST2(HBO1)、MYST3(MOZ)、MYST4(MORF)、P300(EP300、KAT3B)、CBP(CREBBP、KAT3A)、NCOA1(SRC1)、NCOA2(TIF2)、NCOA3(AIB1、ACTR)、ATF-2(CREB2、CREBP1)、TFIIIC、TAF1(TAFII250)、CLOCK(KIAA0334)、CIITA(MHC2TA)、MGEA5(NCOAT)、CDY、KMT1A、KMT1B、KMT1C、KMT1E、KMT2A、KMT2B、KMT2C、KMT2D、KMT2E、KMT2F、EZH1、EZH2、KMT3A、WHSC1、WHSC1L1、PRDM1、PRDM2、PRDM3、PRDM4、PRDM5、PRDM9、PRDM14、PRDM16、KMT3C、KMT3E、SMYD4、DOT1L、SET8、SUV4-20H2、SetD6、SET7/9、PRMT1、PRMT2、PRMT4、PRMT5、PRMT6、PRMT7、PRMT8、PRMT9、HP1、Chd1、WDR5、BPTF、L3MBTL1、ING2、BHC80、JMJD2A、KDM1A、KDM1B、KDM2A、KDM2B、KDM3A、KDM3C、KDM4A、KDM4B、KDM4C、KDM4D、KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D、JARID2、KDM6A、KDM6B、KDM6C、KDM7A、KDM7C、KDM7B、JMJD5、RSBN1、JMJD6、PADI4、K-Ras、PI3K、BTK、B-Raf、ERK、MEK、P65(RELA)、NFkB的p50(NFKB1)、Ras、Raf、eNOS、Smad家族蛋白、Smad2/3/4和ERα、其变体、其突变体、其剪接变体、其得失位和其融合物。
10.如权利要求7或8所述的异双官能团化合物，其中所述PB包含PLCγ抑制剂；IQGAP1抑制剂；Rac1抑制剂；MEK1/2抑制剂；ERK1/2抑制剂；PI4K230抑制剂；Akt1抑制剂；Akt2抑制剂；Akt3抑制剂；GSK-3β抑制剂；HDAC6a抑制剂；热休克蛋白90(HSP90)抑制剂；激酶抑制剂；磷酸酶抑制剂；MDM2抑制剂；靶向人BET含溴结构域蛋白的化合物；HDAC抑制剂；人赖氨酸甲基转移酶抑制剂；血管生成抑制剂；免疫抑制性化合物；靶向芳烃受体(AHR)的化合物、REF受体激酶、FKBP、雄激素受体(AR)、雌激素受体(ER)、甲状腺激素受体、HIV蛋白酶、HIV整合酶、HCV蛋白酶、酰基蛋白硫酯酶-1(APT)、酰基蛋白硫酯酶2(APT2)、其任何项的药学上可接受的盐、其任何项的对映异构体、其任何项的溶剂化物或其任何项的多晶型物。
11.如权利要求7-10中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述降解剂分子进一步包含位于所述E3LB和所述PB之间的接头(L2)。
12.如权利要求11所述的异双官能团化合物，其中所述接头L2通过共价键连接所述E3LB和所述PB。
13.如权利要求11或12所述的异双官能团化合物，其中所述接头L2包含烷基接头或PEG接头。
14.如权利要求13所述的异双官能团化合物，其中所述接头L2包含所述烷基接头，其中所述烷基接头包含式(烷基)n，其中n为烷基碳数，并且其中n＝1-12。
15.如权利要求13所述的异双官能团化合物，其中所述接头L2包含所述PEG接头，其中所述PEG接头包含式(PEG)n，其中n为PEG重复单元数，并且其中n＝1-4。
16.如权利要求13所述的异双官能团化合物，其中所述接头L2包含一个或多个共价连接的A结构单元(例如，-A1...Aq-)，其中A1是与E3LB、PB或其组合中的至少一个偶联的基团。
17.如权利要求16所述的异双官能团化合物，其中A1将E3LB、PB或其组合直接连接至另一个E3LB、PB或其组合。
18.如权利要求16所述的异双官能团化合物，其中A1通过Aq将EL3B、PB或其组合间接连接至另一个E3LB、PB或其组合。
19.如权利要求16-18中任一项所述的异双官能团化合物，其中q为大于或等于0的整数。
20.如权利要求16-19中任一项所述的异双官能团化合物，其中q为大于或等于1的整数。
21.如权利要求16-20中任一项所述的异双官能团化合物，其中q大于或等于2，Aq是与E3LB部分连接的基团，并且A1和Aq通过A结构单元连接(此类A结构单元的数目：q-2)。
22.如权利要求16-21中任一项所述的异双官能团化合物，其中q为2，Aq是与A1和E3LB部分连接的基团。
23.如权利要求16-22中任一项所述的异双官能团化合物，其中q为1，所述接头基团L2的结构为-A1-，并且A1是与E3LB部分和PB部分连接的基团。
24.如权利要求16-22中任一项所述的异双官能团化合物，其中q为1至100、1至90、1至80、1至70、1至60、1至50、1至40、1至30、1至20或1至10的整数。
25.如权利要求1-24中任一项所述的异双官能团化合物，其进一步包含位于所述降解剂分子和所述抗TM4SF1抗体之间的接头(L1)。
26.如权利要求25所述的异双官能团化合物，其中所述接头L1包含可切割性接头或不可切割性接头。
27.如权利要求26所述的异双官能团化合物，其中所述接头L1包含所述可切割性接头并且其中所述可切割性接头包含二硫化物接头、谷胱甘肽可切割性接头或其组合。
28.如权利要求25所述的异双官能团化合物，其中所述接头L1包含MC(6-马来酰亚胺基己酰基)、MCC(环己烷-1-甲酸马来酰亚胺基甲酯)、MP(马来酰亚胺基丙酰基)、val-cit(缬氨酸-瓜氨酸)、val-ala(缬氨酸-丙氨酸)、ala-phe(丙氨酸-苯丙氨酸)、PAB(对氨基苄氧羰基)、SPP(4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯)、4-(吡啶-2-基硫基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)己酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-甲基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、5-乙基-4-(吡啶-2-基硫基)庚酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丙基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环戊基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环己基-4-(吡啶-2-基硫基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1甲酸N-琥珀酰亚胺酯)或SIAB((4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚胺酯)。
29.如权利要求25所述的抗体-药物缀合物，其中所述接头L1衍生自交联试剂，其中所述交联试剂包含N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、3-环丙基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、3-环丁基-3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-(2-吡啶基二硫代基)戊酸N-琥珀酰亚胺酯(SPP)、4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-(2-吡啶基二硫代基)丁酸N-琥珀酰亚胺酯(SPDB)、4-环丙基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、4-环丁基-4-(吡啶-2-基二硫烷基)丁酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯、N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)、碘乙酸N-琥珀酰亚胺酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基(4-碘乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、马来酰亚胺PEG NHS、4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-琥珀酰亚胺酯(SMCC)、4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷甲酸N-磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)或17-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5,8,11,14-四氧代-4,7,10,13-四氮杂十七烷-1-酸2,5-二氧代吡咯烷-1-基酯(CX1-1)。
30.如权利要求25所述的异双官能团化合物，其中所述接头L1包含肽模拟接头。
31.如权利要求30所述的异双官能团化合物，其中所述肽模拟接头包含式-Str-(PM)-Sp，其中Str是与Ab共价附接的延伸单元；Sp是与降解剂部分共价附接的键或间隔子单元；并且PM是选自以下中的非肽化学部分：
Figure FDA0003967617500000071
W是-NH-杂环烷基-或杂环烷基；Y是杂芳基、芳基、-C(O)C1-C6亚烷基、C1-C6亚烷基-NH2、C1-C6亚烷基-NH--CH3、C1-C6亚烷基-N-(CH3)2、C1-C6烯基或C1-C6亚烷基；每个R1独立地是C1-C10烷基、C1-C10烯基、(C1-C10烷基)NHC(NH)NH2或(C1-C10烷基)NHC(O)NH2；R3和R2各自独立地是H、C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基或杂芳基烷基，或R3和R2一起可以形成C3-C7环烷基；并且R4和R5各自独立地是C1-C10烷基、C1-C10烯基、芳基烷基、杂芳基烷基、(C1-C10烷基)OCH2-，或R4和R5可以形成C3-C7环烷基环。
32.如权利要求25所述的异双官能团化合物，其中所述接头L1包含非肽模拟接头。
33.如权利要求32所述的异双官能团化合物，其中所述非肽模拟接头包含具有以下结构：
Figure FDA0003967617500000072
其中，R1和R2独立地选自H和C1-C6烷基，或R1和R2形成3、4、5或6元环烷基或杂环基基团。
34.如权利要求1-33中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含修饰的IgG Fc区，其中相对于野生型IgG Fc区，所述修饰的IgG Fc区包含一个或多个置换。
35.如权利要求34所述的异双官能团化合物，其中所述野生型IgG Fc区是野生型IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区
36.如权利要求34或35所述的异双官能团化合物，其中所述野生型Fc区是IgG1 Fc区，并且其中所述修饰的IgG Fc区包含IgG1 Fc区，所述IgG1 Fc区在选自以下中的一个或多个位置处包含突变：野生型IgG1 Fc区的E233、L234、L235、G237、M252、S254、T250、T256、D265、N297、K322、P331、M428和N434；如通过Kabat中所述的EU索引编号的。
37.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置N297的所述突变。
38.如权利要求37所述的异双官能团化合物，其中位置N297的所述突变包含N297C。
39.如权利要求36-38中任一项所述的异双官能团化合物，其中IgG1 Fc区包含位置E233的所述突变。
40.如权利要求39所述的异双官能团化合物，其中位置E233的所述突变包含E233P。
41.如权利要求36-40中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置L234的所述突变。
42.如权利要求41所述的异双官能团化合物，其中位置L234的所述突变包含L234A。
43.如权利要求36-42中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置L235的所述突变。
44.如权利要求43所述的异双官能团化合物，其中位置L235的所述突变包含L235A。
45.如权利要求36-44中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置G237的所述突变。
46.如权利要求45所述的异双官能团化合物，其中位置G237的所述突变包含G237A。
47.如权利要求36-46中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置M252的所述突变。
48.如权利要求47所述的异双官能团化合物，其中位置M252的所述突变包含M252Y。
49.如权利要求36-48中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置S254的所述突变。
50.如权利要求49所述的异双官能团化合物，其中位置S254的所述突变包含S254T。
51.如权利要求36-50中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置T256的所述突变。
52.如权利要求51所述的异双官能团化合物，其中位置T256的所述突变包含T256E。
53.如权利要求36-52中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置M428的所述突变。
54.如权利要求50所述的异双官能团化合物，其中位置M428的所述突变包含M428L。
55.如权利要求36-54中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置N434的所述突变。
56.如权利要求55所述的异双官能团化合物，其中位置N434的所述突变包含N434S或N434A。
57.如权利要求36-56中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置T250的所述突变。
58.如权利要求57所述的异双官能团化合物，其中位置T250的所述突变包含T250Q。
59.如权利要求36-58中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置D265的所述突变。
60.如权利要求59所述的异双官能团化合物，其中位置D265的所述突变包含D265A。
61.如权利要求36-60中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置K322的所述突变。
62.如权利要求61所述的异双官能团化合物，其中位置K322的所述突变包含K322A。
63.如权利要求36-62中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含位置P331的所述突变。
64.如权利要求63所述的异双官能团化合物，其中位置P331的所述突变包含P331G。
65.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含T250Q和M428L。
66.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含M428L和N434S。
67.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含L234A、L235A和G237A。
68.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含L234A、L235A、G237A和P331G。
69.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C和P331G。
70.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和P331G。
71.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A和N297C。
72.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含L234A、L235A、G237A、N297C、K322A和P331G。
73.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含E233P、L234A、L235A、G237A、D265A、N297C、K322A和P331G。
74.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含E233P和D265A。
75.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含M252Y、S254T和T256E。
76.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含M252Y、S254T、T256E和N297C。
77.如权利要求36所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区包含选自SEQ IDNo.87-88、135-145和151-153中的氨基酸序列。
78.如权利要求36-77中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG1 Fc区表现出一种或多种以下特性：(i)减少或消除与Clq的结合，(ii)减少或消除与Fc受体的结合，和(ii)减少或消除ADCC或CDC效应子功能。
79.如权利要求1-35中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述野生型Fc区是IgG4Fc区，并且其中所述修饰的IgG Fc区包含IgG4 Fc区，所述IgG4 Fc区在选自以下中的一个或多个位置处包含突变：野生型IgG4 Fc区的S228、F234、L235、G237、P238、F243、T250、M252、S254、T256、E258、D259、V264、D265、K288、T299、T307、V308、Q311、K322、L328、P329、A330、P331、T356、K370、A378、R409、V427、M428、H433、N434、H435和N297，如通过Kabat中所述的EU索引编号的。
80.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含位置S228的所述突变。
81.如权利要求80所述的异双官能团化合物，其中位置S228的所述突变是S228P。
82.如权利要求79-81中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含位置F234的所述突变。
83.如权利要求82所述的异双官能团化合物，其中位置F234的所述突变是F234A。
84.如权利要求79-83中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含位置L235的所述突变。
85.如权利要求84所述的异双官能团化合物，其中位置L235的所述突变是L235E。
86.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P和L235E。
87.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P、L235E和N297C。
88.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P、F234A、L235E和N297C。
89.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变M428L和N434S。
90.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变L235E和F234A。
91.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P、L235E和N297C。
92.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P、F234A、L235A、G237A和P238S。
93.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变F243A和V264A。
94.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变S228P和L235A。
95.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变M252Y和M428L；D259I和V308F；或N434S。
96.如权利要求79所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含突变T307Q和N434S；M428L和V308F；Q311V和N434S；H433K和N434F；E258F和V427T；或T256D、Q311V和A378V。
97.如权利要求79-96中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述IgG4 Fc区包含一种或多种以下特性：(i)减少或消除与Clq的结合；(ii)减少或消除与Fc受体的结合；和(iii)减少或消除ADCC或CDC效应子功能。
98.如权利要求79-97中任一项所述的异双官能团化合物，其中包含所述IgG4 Fc区的所述抗TM4SF1抗体包含选自SEQ ID No.146-150和154-155中的氨基酸序列。
99.如权利要求1-97中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：
a.重链，所述重链包含：CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ IDNO:6、18、30、42、54、66、78、94或115中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及
b.轻链，所述轻链包含：CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110、111或129中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQID NO:13、25、37、49、61、73、85、109或128中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、84、107、108、124、125、126或127中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
100.如权利要求99所述的异双官能团化合物，其中所述重链包含与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132具有至少75％同一性的氨基酸序列，并且轻链包含与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133具有至少75％同一性的氨基酸序列。
101.如权利要求100所述的异双官能团化合物，其中所述重链包含如以下中的任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112、114、130或132，并且轻链包含如以下中的任一项所述的氨基酸序列：SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101、122、131或133。
102.如权利要求1-101中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述降解剂分子包含具有选自以下中的结构的化合物：
Figure FDA0003967617500000141
Figure FDA0003967617500000151
103.一种治疗或预防对象的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括施用根据权利要求1-102中任一项所述的异双官能团化合物。
104.如权利要求103所述的方法，其中所述EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-成纤维细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞、EC-血小板(凝血细胞)、EC-红细胞、EC-周细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一种或多种。
105.如权利要求103或104所述的方法，其中所述疾病或病症是以下项中的至少一种：(i)以病理性血管生成为特征的疾病；(ii)伤口愈合受损的疾病；(iii)心血管疾病，(iv)感染，和(v)癌症。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述疾病或病症是所述以病理性血管生成为特征的疾病，并且其中所述以病理性血管生成为特征的疾病是年龄相关性黄斑变性。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述疾病或病症是以伤口愈合受损为特征的疾病，并且其中所述以伤口愈合受损为特征的疾病是糖尿病性溃疡。
108.如权利要求105所述的方法，其中所述疾病或病症是所述心血管疾病，并且其中所述心血管疾病是动脉粥样硬化。
109.如权利要求105所述的方法，其中所述疾病或病症是所述感染，并且其中所述感染是由病毒引起的。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述病毒是冠状病毒。
111.如权利要求105所述的方法，其中所述疾病或病症是所述癌症，并且其中所述癌症选自：乳腺癌、肺癌、结肠癌、前列腺癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、胶质母细胞瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤。
112.一种治疗或预防对象的炎症的方法，所述方法包括向所述对象施用根据权利要求1-102中任一项所述的异双官能团化合物。
113.一种治疗对象的淋巴或血行转移的方法，包括向所述对象施用根据权利要求1-102中任一项所述的异双官能团化合物。
114.一种治疗对象的炎症性疾病或病症的方法，所述方法包括施用包含降解剂分子和抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的异双官能团化合物，其中所述降解剂分子靶向一种或多种用于降解的蛋白质，其中所述一种或多种用于降解的蛋白质选自：Akt、Hsp90、HDAC6、K-Ras、PI3K、BTK、B-Raf、ERK、MEK、P65(RELA)、NFkB的p50(NFKB1)、Ras、Raf、eNOS、Smad家族蛋白、Smad2/3/4及其组合
115.如权利要求114所述的方法，其中所述炎症性疾病或病症是病理性血管生成。
116.如权利要求103-115中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
117.一种治疗对象的癌症的方法，所述方法包括与免疫调节剂联合施用根据权利要求1-102中任一项所述的异双官能团化合物。
118.如权利要求117所述的方法，其中所述免疫调节剂包括与选自以下中的蛋白质结合的试剂：A2AR、B7-H3、B7-H4、BTLA、CD27、CD137、2B4、TIGIT、CD155、ICOS、HVEM、CD40L、LIGHT、TIM-1、OX40、DNAM-1、PD-L1、PD1、PD-L2、CTLA-4、CD8、CD40、CEACAM1、CD48、CD70、A2AR、CD39、CD73、B7-H3、B7-H4、BTLA、IDO1、IDO2、TDO、KIR、LAG-3、TIM-3和VISTA。
119.一种异双官能团化合物，所述异双官能团化合物包含：
(a)抗TM4SF1抗体；和
(b)降解剂分子，其中所述降解剂分子包含以下结构：
Figure FDA0003967617500000171
120.如权利要求119所述的异双官能团化合物，包含约2.0的降解剂与抗体比(DAR)。
121.如权利要求119或120所述的异双官能团化合物，其中所述抗TM4SF1抗体包含IgG1Fc区，所述IgG1 Fc区包含以下突变：M252Y、S254T、T256E和N297C，如通过Kabat中所述的EU索引编号的。
122.如权利要求119-121中任一项所述的异双官能团化合物，其中所述抗TM4SF1抗体包含：
-重链，所述重链包含：CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ IDNO:6、18、30、42、54、66、78、94或115中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；以及
-轻链，所述轻链包含：CDR3结构域，所述CDR3结构域包含与选自SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110、111或129中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；CDR2结构域，所述CDR2结构域包含与选自SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85、109或128中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列；和CDR1结构域，所述CDR1结构域包含与选自SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、84、107、108、124、125、126或127中的序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。
123.一种治疗对象的癌症的方法，所述方法包括施用根据权利要求119-122中任一项所述的异双官能团化合物。
124.如权利要求123所述的方法，包括与免疫调节剂联合施用所述异双官能团化合物。
125.如权利要求122-124中任一项所述的方法，其中所述对象是人。
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