CN115728282A - 一种显微成像方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种显微成像方法，步骤包括对样本进行采集、提纯等预处理后，利用涂抹或沉降法使样本平铺在半透明或不透明的固定载体表面，并在固定载体的成分中添加具有受紫外激发、发射可见光特性的荧光物质，最后使用紫外激发光源照射样本及固定载体以使之发光并用显微成像系统观察。这一方法使得细胞明场照明的光源光路可以被置于与显微光路同一侧因而允许使用半透明或不透明的样本固定载体，并且光源具有最大数值孔径，提供理想的照明效果。

Description

一种显微成像方法

技术领域

本发明涉及显微光学领域，具体涉及一种显微成像方法。

背景技术

观察显微镜下的细胞样本是医学诊断的金标准。传统上，这一观察的样本是以玻璃载玻片为载体的细胞涂片。

由于玻璃透明，因此可以以光源从一面照射、从另一面观察被细胞部分吸收或反射后投射的光线。

但是，将细胞均匀、恰好保留一层地涂在玻璃载玻片上的操作十分困难，实践中往往出现细胞堆叠而相互阻挡、分布不一致等问题，严重干扰后续观察。

一些实验中，细胞样本在微型反应容器中处理后再转移至玻璃载玻片的过程不仅困难，而且可能导致样本损失，影响实验结果。

发明内容

对此,本发明提供一种显微成像方法。其将细胞固定在半透明或不透明的固定载体表面，并在固定载体的成分中添加受紫外照射时发出白色荧光的物质，使得激发光照射固定载体时其发出的白色荧光成为照亮细胞的明场背景光。这一方法使得细胞明场照明的光源光路可以被置于与显微光路同一侧因而允许使用半透明或不透明的样本固定载体，并且光源具有最大数值孔径，提供理想的照明效果。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他实施例的附图。

图1是以玻璃载玻片为样本载体的明场显微光路。

图2是以荧光固定载体为样本载体的显微光路。

图3是在微孔板的管中使用固定载体的显微光路。

具体实施方式

现在详细参考附图并描述实施例。为了全面理解本发明，在以下详细描述中提到了众多具体细节。但是本领域技术人员应该理解，本发明可以无需这些具体细节而实现。在其他实例中，不详细描述公知的方法、过程、组件和电路，以免不必要地使实施例模糊。

为了步步递进的解释本方法原理，首先展示常见的明场显微光路如图1所示。

其中，明场光源1101发出白光，传播途径如箭头线1102所指，照亮涂抹在玻璃载玻片1201上表面的样本1202。部分光被样本吸收或反射，剩余继续传播经由显微物镜1301、显微管镜1302投影在图像传感器1303上成像。样本吸收或反射了光的部分，在其图像中是较暗的像素点。

类似图1的结构，本方法一个实施例如图2所示。

荧光激发光源2103发出的紫外激发光，传播途径如箭头线2104所指。激发光经由长通分光镜2304反射，经过显微物镜2301投射在样本2202和有荧光特性的固定载体2203上，使得固定载体发射出白色荧光。白色荧光发射光自下而上照亮样本，并且部分被样本吸收或反射，其余部分传播途径如箭头线2105所示，经由显微物镜2301、透过长通分光镜2304后再经由显微管镜2302投影在图像传感器2303上成像。本图2中传播途径2105与图1中传播途径1102相同，区别在于图1中传播的是原生自光源的白色光，本图2中传播的是发射自受激固定载体的白色光。

其中，长通分光镜2304是常用的光学器件，其具有允许阈值以上波长的光线透射、将阈值以下波长的光线反射的特性。根据荧光原理，发射光波长长于激发光，因此合适的长通分光镜不难找到。

应当着重说明的是，虽然本方法使用了荧光激发光源，但光源的用途并非激发结合在样本上的荧光物质，而是样本所附着的固定载体中的荧光物质，因而照亮样本的并非荧光激发光，而是固定载体的荧光发射光。

另外，选用紫外光作为激发光，并通过长通分光镜将之从发射光中滤除，是为了避免了其在样本和固定载体表面的反射造成的干扰。

因此本方法并非使用荧光显微成像原理，而更接近于用将样本附着在一片明场光源表面进行明场成像，而这片明场光源的发光原理是受激发射，类似于荧光灯。

图2所示实施例的一个实施方案中关键部件如下。荧光激发光源2103使用350nm波长紫外光源，长通分光镜2304采用边缘波长375nm，固定载体2203为加入Maxbrite OB-1(C.I.393)荧光剂的低熔点PVC。根据其特性，荧光激发光源2103发出的350nm激发光短于长通分光镜2304阈值，将被全部反射；固定载体2203被紫外照射后发出白光，照亮样本。

在图2所示的实施例之上进一步改进，本方法的另一个实施例如图3所示。

与图2所示的实施例对比，图3的所示的实施例将整个光路上下倒置，以满足更复杂的固定载体3203使用，以下加以说明。

生物实验中，常常需要对微量样本在溶液中进行处理，而此溶液一般装盛在多孔板中。例如，在培养的细菌样本，会选用96孔板为容器：一块长127.76mm、宽85.48mm的方形板上紧密排列12x8个直径5mm、深10mm的长管，如图3中样本管3204所示。每个长管中装有少量样本及培养液。

培养试验后、观察结果前，离心可以迫使细菌样本沉淀平铺在长管底部形成薄薄一层。此时，抽出培养液，加入暂时液化的固定载体并将之固化，形成如图中固定载体3203的状态，可以将细菌样本完全封闭在管底。

图3所示实施例中其余部分的原理与图2所示实施例完全相同：荧光激发光源3103发出的紫外激发光，传播途径如箭头线3104所指。激发光经由长通分光镜3304反射，经过显微物镜3301投射在样本3202和固定载体3203上，使得固定载体发射出白色荧光。一部分白色荧光发射光自上而下照亮样本，其传播途径如3105所示，经由显微物镜3301、透过长通分光镜3304后再经由显微管镜3302投影在图像传感器3303上成像。

图3所示实施例可以直观的体现本方法相较传统明场成像的两个优势。

第一，加入固化的固定载体3203可以固定被观察样本3202，使之不受后续操作移动，特别是固定载体可以选用疏松多孔的成分，允许部分试剂通过而阻止样本移动。本方法中，由于发光的是固定载体的表面部分(通常只有几百微米)，因此对其透明度要求不高，可选择范围广；如果用传统明场成像，由于需要如图1所示的1101光源透射过样本的上部，则要求样本管3204中不能添加固定载体，或者必须选择在数千微米厚度下依然高透明度的成分，都会限制样本的处理手段。

第二，由于样本管3204一般是开口小、深度大，则明场照明的光源宽度-距离比(也就是数值孔径)无法做大，限制了显微系统的综合数值孔径，也就限制了其光学解析力，难以用于观察细菌-细胞尺度的样本。

本发明的不局限于上述实施方式，本发明的上述各个实施方式的技术方案彼此可以交叉组合形成新的技术方案，另外凡采用等同替换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围内。

Claims (6)

1.一种显微成像方法，特征在于：

将样本附着在固体的固定载体表面，在所述固定载体中加入荧光物质，从样本所在表面的方向以所述荧光物质对应的激发波长照射样本及其所附着的固定载体，使固定载体发出荧光，以所述荧光的发射光照亮所述样本后使用显微光学系统成像。

2.根据权利要求1所述的显微成像方法，其特征在于：

所述样本是半透明的，薄片状、或经沉淀或涂抹成薄层的生物组织、矿石或人工合成物质。

3.根据权利要求1所述的显微成像方法，其特征在于：

所述固定载体是凝胶状固体，具有亲水性或亲脂性或兼有。

4.根据权利要求1所述的显微成像方法，其特征在于：

所述荧光物质的主要激发频段在350至410纳米波长范围内，主要发射频段在400纳米至700纳米波长范围内。

5.根据权利要求3所述的显微成像方法，其特征在于：

所述固定载体具有疏松多孔结构。

6.根据权利要求2、3、4和5所述的显微成像方法，其特征在于：

样本制备过程中，包含如下步骤：对样本进行采集、提纯等预处理后，首先将混合了所述样本的溶液加入观察容器，然后利用离心法或自然沉降法使所述样本平铺在所述观察容器底部，接着抽去所述观察容器中部分所述溶液，最后加入凝胶剂形成所述凝胶状固体。

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