CN115725549A - 几丁质酶突变体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种几丁质酶突变体。与野生型相比，该突变体包含R89K、D149S和N169I三个突变位点，其在里氏木霉中的表达酶活提高了110%，取得了意料不到的技术效果，有利于降低该酶的生产成本，促进其在医药、农业、食品加工等领域中的广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体涉及一种几丁质酶。
背景技术
几丁质又称甲壳素或甲壳质，是大多数真菌的细胞壁成分，也是真菌病害有效防治的限制因子之一。由于几丁质酶对真菌细胞壁物质有降解作用，故对于真菌病害的防治具有潜在的应用前景。几丁质酶的种类有微生物几丁质酶、植物几丁质酶和动物几丁质酶，产生几丁质酶的微生物包括细菌、放线菌和霉菌，而且不同的微生物产生的几丁质酶的类别和性质也不尽相同。几丁质酶是一种能够将几丁质分解成几丁质单糖——N-乙酰基葡萄糖的酶。
不同生物来源的几丁质酶分子质量差异很大，一般在20～90ku内。其中微生物几丁质酶多为20～60ku，植物几丁质酶在20～45ku内，昆虫几丁质酶为40～85ku。几丁质酶的最适pH值在1.0～8.0内，等电点为3.1～10.0。几丁质酶的热稳定性良好，一般在4～60℃较为稳定，大多数几丁质酶的最适反应温度为40～60℃。许多金属离子尤其是重金属离子如Ar+、Cu2+、Zn2+、Hg2+、Sn2+、Co2+和Fe3+等对几丁质酶活力具有不同程度的影响。
几丁质酶在生物体中发挥的作用各不相同。微生物几丁质酶的主要作用是水解几丁质产生供其生长繁殖所需的碳源与能源，在自然界物质循环和能量循环中发挥着重要作用；植物几丁质酶在抗病原微生物方面具有防御和保护作用；昆虫几丁质酶主要与其胚胎后期发育和蜕皮相关；病毒编码的几丁质酶与其感染宿主的机制有关；几丁质酶在真菌、原生动物和非脊椎动物的生长和形态建立上也具有非常重要的作用。
目前，人们对于几丁质酶的应用主要集中于几丁质水解产物的开发与利用。
1、几丁质酶在医药领域中的应用
几丁质酶将几丁质分解为几丁寡糖和其一些衍生物。例如壳寡糖和 N-乙酰氨基葡萄糖。这些几丁寡糖具有多种生理功能，可激活人体巨噬细胞和淋巴细胞，增强机体免疫力，它们既有无毒、无过敏性、可生物相容、 可生物降解的优点，已广泛应用于抗癌的临床治疗以及保健食品的开发领域；
2、几丁质酶在处理海洋渔业产生的废弃物中广泛应用
海洋废弃物：虾、蟹、龙虾、磷虾等甲壳动物在食品加工过程中会产生大量副产品，主要由几丁质、碳酸钙和蛋白质组成，对其处理会产生大量的几丁质和壳多糖。目前，已经完成了关于海洋废弃物几丁质利用率以及一些具有生物活性的几丁单糖或寡糖生产的调查，由产几丁质酶的微生物或经纯化处理的几丁质酶水解几丁质生成N-乙酰葡萄糖胺试验已经成功。
3、几丁质酶在生物防治中的应用
在农业上几丁质酶可作为生物杀菌或杀虫剂，提高植物的抗病能力。传统方式是直接利用几丁质酶产生菌防治植物真菌病害。
由于微生物几丁质酶比动植物几丁质酶催化作用的pH值和温度范围更宽，且制备相对更容易，所以国内外获得几丁质酶的方法主要是微生物发酵法。但目前几丁质酶的产量仍普遍偏低，严重限制了其推广与应用。
发明内容
本发明为解决现有技术问题，提供了一种新型几丁质酶突变体。与野生型相比，该突变体的酶活水平得到显著提高，有利于降低该酶的生产成本。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明涉及一种几丁质酶突变体，其包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：89，149，169。
在本发明的一些实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
在一些更具体的实施例中，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：R89K，D149S，N169I。
在本发明的一些实施例中，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：R89K，D149S，N169I，R89K/D149S，R89K/N169I，D149S/N169I，R89K/D149S/N169I。
本发明还涉及编码上述几丁质酶突变体的DNA分子。
本发明还涉及包含上述DNA分子的重组表达载体。
本发明还涉及一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。
将上述的重组表达载体转入宿主细胞中，重组表达的几丁质酶突变体的酶活得到显著提升。
在本发明的一些实施例中，宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
本发明提供的几丁质酶突变体包含R89K、D149S和N169I三个突变位点。与野生型相比，所述突变体在里氏木霉中的表达酶活提高了110%，摇瓶发酵酶活达到131U/mL，取得了意料不到的技术效果，从而有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域中的广泛应用。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook, 2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (Ausubel, 2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，本领域的技术人员可以在本发明所记载的技术方案的基础上，采用本领域其它常规的方法、实验方案和试剂，而不限于本发明具体实施例的限定。
菌株与载体：大肠杆菌DH5α本公司保藏，里氏木霉宿主菌Q4本公司保藏、载体pKL本公司保藏，Amp等购自上海生工生物工程有限公司。
酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自NEB公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。
主要培养基：
LB培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；
LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/ml氨苄青霉素；
YEG培养基：0.5%酵母粉、1%葡萄糖
上层半固体培养基：0.1%MgSO4, 1%KH2PO4, 0.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖, 18.3%山梨醇, 0.35%琼脂糖；
下层基础培养基：2%葡萄糖，0.5%(NH4)2SO4, 1.5%KH2PO4, 0.06%MgSO4, 0.06%CaCl2，1.5%琼脂粉；
MM发酵培养基：1.5%葡萄糖，1.7%乳糖，2.5%玉米浆，0.44%(NH4)2SO4，0.09%MgSO4，2%KH2PO4，0.04%CaCl2，0.018%吐温-80，0.018%微量元素，0.018%聚丙二醇-2000
下面结合具体实施方式，对本发明做进一步阐述。
实施例1 几丁质酶基因克隆
申请人将来源于里氏木霉（Trichoderma reesei）的野生型几丁质酶基因命名CHIT，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。根据里氏木霉的密码子偏好性，对其进行密码子优化，送华大基因进行基因合成。所述野生型几丁质酶CHIT基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
运用PCR技术克隆几丁质酶CHIT基因片段，引物和反应条件如下：
上游引物1(F)：GTACGGTACCGCCCGCTGCATCATGTACCTCA（下划线为KpnI酶切位点）；
下游引物1(R)：CTGATCTAGATTACAGCTCGTCCTTGGACTCGCCCT（下划线为XbaI酶切位点）。
PCR条件为：98℃变性1min；98℃变性10s，56℃复性15s，72℃延伸1min，30个循环，72℃保温5min。CHIT基因全长1107bp。
实施例2 几丁质酶突变体的筛选与里氏木霉工程菌的构建
申请人为了进一步提高野生型几丁质酶CHIT的表达酶活，通过定向进化技术对该酶的基因进行了大量突变的筛选。
以优化后的几丁质酶基因为模板，利用引物上游引物1(F)和下游引物1(R)，用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒（Stratagene）进行PCR扩增；胶回收PCR产物。所述PCR产物即为几丁质酶突变体的基因片段。
2.1表达质粒的构建
将野生型几丁质酶CHIT的基因片段和上述获得的PCR产物用限制性内切酶Kpn I和Xba I进行双酶切，同样对木霉表达载体pKL用限制性内切酶Kpn I和Xba I进行双酶切。然后用T4连接酶把双酶切产物即克隆基因和表达载体22℃连接过夜。最后，把连接产物导入大肠杆菌DH5a，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养。待转化子出现后，用牙签逐个挑至多个96孔板，然后提取质粒用于里氏木霉转化。
2.2里氏木霉原生质体制备
接种里氏木霉菌丝于PDA平板上生长7天；切取直径约3cm的菌落置于约60ml YEG液体培养基中，30℃，200 rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有20ml裂解酶液（0.2g/10ml，0.7 M NaCl溶解，Sigma L1412）酶解2 h；取出酶解液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000 rpm，离心10 min；弃上清，加5 ml 溶液2悬浮，然后3000 rpm，离心10 min；加适量溶液2悬浮分装（200 µl/管，108个/ml）。
2.3转化
每个质粒 DNA取10 ul 加入到200µl原生质体中，接着加入50µl 25%PEG溶液轻轻混匀，冰浴20min；然后加入2 ml 25%PEG，轻轻混匀，室温静置5min，把原生质体加到50 ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基，轻轻混匀后倒入含100µg/ml潮霉素下层基础培养基，30℃黑暗培养数天至转化子长出。
上述获得的阳性转化子即为重组表达野生型几丁质酶CHIT及其突变体的里氏木霉工程菌株。
2.4摇瓶发酵验证
将上述构建得到的重组表达野生型几丁质酶CHIT及其突变体的里氏木霉工程菌株分别接种于MM发酵培养基，30℃培养48h，然后25℃乳糖诱导培养72h。离心取发酵上清液，参照GB/T 34799-2017所述方法进行几丁质酶酶活测定分析。
结果显示，与重组表达野生型几丁质酶CHIT的工程菌相比，本发明构建的重组表达几丁质酶突变体的工程菌中，仅有1株菌的酶活显著提高。申请人将该工程菌命名为里氏木霉CHIT-17（Trichoderma reesei CHIT-17）。
该菌株摇瓶发酵上清液中几丁质酶酶活高达131 U/ml，与重组表达野生型几丁质酶CHIT的工程菌提高了110%，取得了意料不到的技术效果。
实施例4 几丁质酶突变体序列的确定
4.1 总DNA的提取
将上述构建得到的酶活水平最高的里氏木霉CHIT-17过夜培养，取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心5 min，弃上清；加入400μl抽提缓冲液（100 mM Tris-HCl，100 mMEDTA，250 mM NaCl，1%SDS)；然后加100mg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65℃水浴20min后，加入200μl 10M NH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min，取上清；加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000 rpm离心10min，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解，于-20℃保存。
4.2 测序分析
利用实施例1中所述上下游引物进行PCR，扩增目的基因。PCR扩增条件为94℃3min；94℃30S；56℃30S，72℃60S 30个循环；72℃5min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。PCR回收产物做TA克隆，挑取阳性转化子送上海生工生物工程有限公司测序分析。
测序结果显示，从里氏木霉CHIT-17中扩增得到的几丁质酶突变体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4。
将野生型几丁质酶CHIT与上述几丁质酶突变体的氨基酸序列进行比对发现，所述几丁质酶突变体中包含三个突变位点，分别为R89K，D149S和N169I。
本发明提供的几丁质酶突变体能显著提高其在里氏木霉中的表达量，有利于降低该酶的生产成本，促进其在工业领域的广泛应用。
Claims (9)
1.一种几丁质酶突变体，其特征在于，所述突变体包含与SEQ ID NO:1具有至少95%同一性的氨基酸序列，且与SEQ ID NO:1相比在选自下组中的至少一个位置上包含氨基酸的取代：89，149，169。
2.如权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少96%，97%，98%，或至少99%的同一性。
3.如权利要求2所述的突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比具有至少99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，或至少99.9%的同一性。
4.如权利要求3所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含下组中至少一个氨基酸的取代：R89K，D149S，N169I。
5.如权利要求4所述的突变体，其特征在于，所述突变体包含的取代或取代的组合选自下述取代和取代的组合：R89K，D149S，N169I，R89K/D149S，R89K/N169I，D149S/N169I，R89K/D149S/N169I。
6.编码权利要求5所述的几丁质酶突变体的DNA分子。
7.包含权利要求6所述的DNA分子的重组表达载体。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求7所述的重组表达载体。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为里氏木霉（Trichoderma reesei）。
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