CN115724976A - Car修饰的免疫细胞、制备方法及其应用 - Google Patents

Car修饰的免疫细胞、制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CAR修饰的免疫细胞、制备方法及其应用，其中所述的BCMA的特异性抗体或其抗原结合片段能特异性与BCMA结合，所述BCMA的特异性抗体或其抗原结合片段包括特异性抗体重链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2、CDR3和特异性抗体轻链可变区的抗原互补决定区CDR1、CDR2、CDR3。本发明提供了一种CAR细胞，所述CAR细胞能够有效地提高杀伤肿瘤细胞的效率和临床治疗的安全性、有效性；同时，本发明还提供了特异性抗体、CAR结构或一种CAR细胞在制备药物中的应用，从而提供一种具有优良应用前景的高效、可靠、安全的肿瘤治疗的新手段。

Description

CAR修饰的免疫细胞、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于免疫治疗领域，涉及一种靶向BCMA的CAR修饰的免疫细胞、制备方法及其应用。
背景技术
近年来，免疫治疗越来越多的用于肿瘤治疗领域，相对于传统手术、化疗、放疗，靶向免疫疗法能够高效的识别肿瘤细胞，并大幅度减少对身体的损伤，具有不可替代的优势和发展潜力。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，缩写CAR)修饰的免疫细胞使用遗传工程手段修饰免疫细胞使其表达外源性抗肿瘤基因。目前随着肿瘤免疫治疗研究的积累，免疫治疗手段逐步进入临床。
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一种浆细胞的恶性肿瘤，全球每年约有160,000新发病例，是血液系统第二位常见肿瘤，目前仍无法治愈。传统的治疗方法例如蛋白酶抑制剂(PI)和免疫调节剂(IMID)虽表现出了很好的疗效，却依旧没有解决病患复发率高和药物有效清除率低等问题。B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen，BCMA)在浆细胞中高水平选择性表达，是理想的MM治疗靶点。
BCMA也叫TNFRSF17(TNF receptor superfamily member 17，TNF配体超家族成员17)，主要在浆细胞和成熟B淋巴细胞中表达，在其它的正常人体细胞中基本检测不到。BCMA是MM细胞系上最具选择性表达的受体，其表达量随着B细胞的分化而逐渐增加，在多发性骨髓瘤的疾病进程中也逐步递增。
自然杀伤(natural killer，缩写NK)细胞是非特异性免疫系统的重要组成部分，NK细胞是一种广谱免疫细胞，具有快速发现和摧毁异常细胞(如癌症或病毒感染的细胞)的特异功能，而且NK细胞不需要提前致敏或HLA配型，即可有强大的溶解异常细胞的活性。包括NK细胞在内的免疫细胞来治疗癌症已成为新的趋势，新疗法有望成为传统手术、化疗和放疗治疗无效的肿瘤患者新的治愈希望。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种BCMA的特异性抗体或其抗原结合片段，以及一种靶向BCMA的CAR修饰的免疫细胞及其制备方法和应用。
第一方面，本发明提供了一种BCMA的特异性抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述特异性抗体或其抗原结合片段与BCMA特异性地结合。
进一步，所述特异性抗体或其抗原结合片段包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。
进一步，所述重链CDR1含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列。
进一步，所述重链CDR2含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。
进一步，所述重链CDR3含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:3具有至少70％同一性的氨基酸序列。
进一步，所述轻链CDR1含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:4具有至少70％同一性的氨基酸序列。
进一步，所述轻链CDR2含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:5具有至少70％同一性的氨基酸序列。
进一步，所述轻链CDR3含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ IDNO:6具有至少70％同一性的氨基酸序列。
进一步，所述BCMA的特异性抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
进一步，所述BCMA的特异性抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
术语“抗体”在本发明中以最广义使用，而且明确覆盖单克隆抗体、多克隆抗体、自至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)，只要它们展现期望的生物学活性。
第二方面，本发明提供了一种分离的核酸分子或包含其的载体。
进一步，所述核酸分子编码前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段。
进一步，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
术语“核酸”等同于“多核苷酸”、“核苷酸”、“核酸分子”，它们之间可以在本发明中互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，经过修饰的核苷酸或碱基，和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶，或者通过合成反应掺入聚合物中的任何底物。
第三方面，本发明提供了一种BCMA的特异性抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物。
进一步，所述抗体衍生物包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联至可检测标记物形成的复合物。
进一步，所述可检测标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶标记物。
进一步，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、Texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白。
进一步，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素。
进一步，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴。
进一步，所述酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
第四方面，本发明提供了一种抗体或其抗原结合片段的偶联物。
进一步，所述偶联物包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段与治疗剂偶联形成的偶联物。
进一步，所述治疗剂包括细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂。
第五方面，本发明提供了一种经过改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
进一步，所述改造的宿主细胞包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或本发明第二方面所述的核酸分子或包含其的载体。
进一步，所述宿主细胞群体还包括所述改造的宿主细胞之外的宿主细胞。
进一步，所述改造的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
进一步，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌。
进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
第六方面，本发明提供了一种检测BCMA的产品。
进一步，所述产品包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或前面所述的抗体衍生物。
进一步，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。
第七方面，本发明提供了一种靶向BCMA的CAR。
进一步，所述CAR包括靶向BCMA的胞外抗原结合域。
进一步，所述胞外抗原结合域包括前面所述的特异性抗体中的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3。
进一步，所述胞外抗原结合域包括前面所述的特异性抗体中的重链可变区。
进一步，所述胞外抗原结合域包括前面所述的特异性抗体中的轻链可变区。
进一步，所述胞外抗原结合域中的重链可变区和轻链可变区之间由linker连接。
进一步，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示。
进一步，所述胞外抗原结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
进一步，所述CAR还包括铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、胞内信号传导结构域中的一种或多种。
进一步，所述铰链区是如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。
进一步，所述跨膜结构域是如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
进一步，所述共刺激结构域是如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。
进一步，所述胞内信号传导结构域是如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
进一步，所述CAR结构完整的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
第八方面，本发明提供了一种核酸分子或包含其的载体。
进一步，所述核酸分子包括编码前面所述的CAR。
进一步，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
第九方面，本发明提供了一种经过改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
进一步，所述改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体包括前面所述的CAR、本发明第八方面所述的核酸分子或包含其的载体。
进一步，所述宿主细胞群体还包含所述改造的宿主细胞之外的宿主细胞。
进一步，所述改造的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞。
进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
进一步，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌。
进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
进一步，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞。
进一步，所述淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞。
术语“淋巴细胞”是指白细胞的一种，是体积最小的白细胞。其由淋巴器官产生，主要存在于淋巴管中循环的淋巴液中，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，是淋巴系统几乎全部免疫功能的主要执行者。淋巴细胞是一类具有免疫识别功能的细胞系，按其发生迁移、表面分子和功能的不同，可分为T淋巴细胞(又名T细胞)、B淋巴细胞(又名B细胞)和自然杀伤(NK)细胞。T细胞和B细胞都是抗原特异性淋巴细胞，它们的最初来源是相同的，都来自造血组织。
术语“T细胞”是指胸腺依赖淋巴细胞，是骨髓来源的淋巴干细胞在胸腺内分化而成的。胸腺发育成熟的T细胞转移到外周淋巴器官或淋巴组织，在没有接触特异性抗原分子刺激前，保持相对静息状态，称初始T细胞。一旦接受相应抗原的刺激，它们便转化为代谢活跃、直径为15～20μm的大淋巴细胞，并增殖分化。大部分分化为效应性T细胞，获得了迁移、产生细胞因子和其他效应的功能，小部分形成记忆性T细胞。效应性T细胞寿命较短，具有杀伤靶细胞的功能。记忆性T细胞寿命可长达数年，甚至终身，当机体再次遇到相同抗原刺激时，能迅速转化增殖，形成大量效应性T细胞，启动更大强度的免疫应答，并使机体较长时期保持对该抗原的免疫力。按T细胞在免疫应答中的功能不同，可将T细胞分为以下三个亚群：细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、调节性T细胞。
术语“B细胞”是指骨髓依赖淋巴细胞，来源于骨髓，占血液淋巴细胞总数的50～10％。在骨髓发育成熟的初始B细胞离开骨髓，迁入周围淋巴器官和淋巴组织，受抗原刺激后，增殖分化为效应性B细胞，即浆细胞，合成和分泌抗体，发挥免疫功能；少量转化为记忆性B细胞储备起来，其作用和记忆性T细胞相同。B细胞在体内存活的时间较短，仅数天至数周，但其记忆细胞在体内可长期存活。
术语“NK细胞”是指自然杀伤细胞，由骨髓中的淋巴干细胞分化而来，占血液淋巴细胞总数的10～15％，缺乏B细胞、T细胞的分子标记特征，可直接杀伤病毒感染细胞、肿瘤细胞和异体细胞。NK细胞形似大淋巴细胞，在细胞质内有许多大小不等的嗜天青颗粒，故又称大颗粒淋巴细胞。
进一步，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
进一步，所述载体为质粒载体。
进一步，所述质粒载体是pLenti-puro。
第十方面，本发明提供了5种方法，所述方法包括：
(1)一种生产前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括如下步骤：培养本发明第五方面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，从培养物中分离出前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段。
(2)一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中BCMA或其片段的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段接触，或将待测样品与前面所述的抗体衍生物接触，检测BCMA或其片段与前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段或前面所述的抗体衍生物的复合物的形成。
(3)一种制备本发明第五方面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或本发明第二方面所述的核酸分子或包含其的载体导入到宿主细胞中。
进一步，所述导入的方式包括磷酸钙转染、DEAE、右旋糖介导的转染、电穿孔、噬菌体感染。
(4)一种特异性地抑制BCMA的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或本发明第二方面所述的核酸分子或包含其的载体导入到生物体细胞中，通过表达前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段抑制BCMA的活性。
进一步，所述生物体细胞是体外培养的细胞。
(5)一种制备本发明第九方面中所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，所述方法包括将前面所述的CAR，或本发明第八方面所述的核酸分子或包含其的载体转导进入宿主细胞。
进一步，所述转导方法包括慢病毒载体转导、逆转录病毒载体转导、转座子转导或mRNA电穿孔技术。
进一步，所述转导是指慢病毒载体转导。
进一步，所述慢病毒载体转导转入使用的是穿梭pLVX-puro。
进一步，所述慢病毒载体转导所使用的的包装三质粒为pRSV-Rev，pMDLg/pRRE，pMD2.G。
进一步，所述慢病毒载体转导中的质粒的混合比例为pLenti-puro：pRSV-Rev：pMDLg/pRRE：pMD2.G＝2:1:1:1。
进一步，所述方法包括制备改造NK细胞的方法。
进一步，所述方法还包括制备NK细胞的步骤。
进一步，所述方法还包括检测CAR-NK细胞上CAR表达效率的步骤。
进一步，所述方法还包括扩增CAR-NK细胞地步骤。
进一步，所述扩增是在体外进行的。
第十一方面，本发明提供了一种组合物。
进一步，所述组合物包括本发明第九方面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体。
进一步，所述组合物包括药学上可接受的辅料。
进一步，所述组合物包括药学上可接受的注射剂用辅料。
进一步，所述组合物的剂型为水剂。
第十二方面，本发明提供了5种应用，所述应用包括：
(1)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子或包含其的载体、前面所述的抗体衍生物，或本发明第五方面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测BCMA或其片段的产品中的应用。
(2)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子或包含其的载体、本发明第五方面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体、前面所述的CAR，或本发明第八方面所述的核酸分子或包含其的载体在制备治疗BCMA导致的疾病的药物组合物中的应用。
进一步，所述疾病是与BCMA的表达相关的癌症。
进一步，所述BCMA的表达相关的癌症包括血液瘤、实体瘤。
进一步，所述实体瘤包括肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌。
进一步，所述血液瘤包括白血病、骨髓瘤、淋巴瘤。
进一步，所述白血病包括淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病。
进一步，所述骨髓瘤包括孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、轻链型骨髓瘤、不分泌型骨髓瘤。
进一步，所述淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。
(3)前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段、本发明第二方面所述的核酸分子或包含其的载体，或本发明第五方面所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备调节BCMA活性或水平的药物中的应用。
(4)一种本发明第九方面中所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备杀伤体外癌细胞的药剂中的应用。
进一步，所述体外癌细胞包括肺癌细胞系、胰腺癌细胞系、肝癌细胞系、神经胶质瘤细胞系、乳腺癌细胞系、结肠癌细胞系或前列腺癌细胞系。
进一步，所述肺癌细胞系包括NCI-H1385、Tul-1、A549、16HBE、SKMES1或NCIH460。
进一步，所述胰腺癌细胞系包括SW1990、KP4、Panc-1、Paca-2、Patu8988、Bxpc-3、Capan-1/2、Aspc-1、jr305或PC-3。
进一步，所述肝癌细胞系包括SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Hep3B、Huh-7或PLC/PRF/5。
进一步，所述神经胶质瘤细胞系包括U87MG、U251MG、A172、KALS-1、SW1783、SH-SY5Y。
进一步，所述乳腺癌细胞系包括MCF-7、HCC1143、HCC1187、HCC1599、HCC1806、HCC38、HCC1937或MDA-MB-453。
进一步，所述结肠癌细胞系包括SW480、SW620、SW1116、LOVO、HCT116、HCT-15、HT-29、LS180、LS174T、NCI-H716、Caco-2、COLO205、COLO320、COLO320DM、CT26.WT、DLD-1、RKO、RKO-E6、RKO-AS45-1或T84。
进一步，所述前列腺癌细胞系包括LNCaP、PC-3或DU145。
(5)本发明第九方面中所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或前面所述的组合物在制备治疗疾病的药物中的应用。
进一步，所述疾病是与BCMA的表达相关的癌症。
进一步，所述BCMA的表达相关的癌症包括血液瘤、实体瘤。
进一步，所述实体瘤包括肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌。
进一步，所述血液瘤包括白血病、骨髓瘤、淋巴瘤。
进一步，所述白血病包括淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病。
进一步，所述骨髓瘤包括孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、轻链型骨髓瘤、不分泌型骨髓瘤。
进一步，所述淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。
附图说明
图1是不同阳性克隆抗体与抗原的结合能力图；
图2是pTT5质粒载体图；
图3是编号840IgG抗体与细胞中的BCMA结合能力图；
图4是编号840抗体与K562和NCI-H929细胞中的BCMA结合能力图；
图5是编号840的CAR-NK细胞CAR表达效率检测图；
图6是细胞杀伤性实验图。
具体实施方式
下面将参考附图并结合具体实施例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅是为了举例，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
实施例1抗体库构建及抗体库质量检测
1、动物免疫
1)选择3只雌性、健康BALB/c小鼠，8～10周龄；
2)免疫前留少量血清，在检测效价时作为阴性对照；
3)将50μg抗原用PBS稀释至50μl，与等体积佐剂混合均匀，混合溶液共100μl；
4)采取小腿肌肉注射方法免疫1只小鼠，共免疫两次，分别在第0天和第21天进行；
5)初次免疫后第35天在小鼠尾巴取血，检测血清效价。
2、效价检测
1)包被：将检测原用pH9.6碳酸包被液稀释至5μg/ml，96孔酶标板每孔包被100μl，4℃，过夜；
2)封闭：用4％脱脂奶粉-PBS封闭，300μl/孔，37℃，2h；
3)一抗结合：弃孔内液体，用PBST洗三遍，加入小鼠抗血清，1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、……1:1638400稀释，100μl/孔，37℃结合1h。分别设阴性血清和PBS对照孔，阴性血清1:1000稀释；
4)二抗结合：弃孔内液体，用PBST洗三遍，加入HRP-goat anti-mouse IgG(Fc)，1:5000稀释，100μl/孔，37℃结合1h；
5)显色：弃孔内液体，用PBST洗五遍，加入TMB显色液，100μl/孔，避光显色；
6)终止：每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应；
7)酶标仪读A450值。
3、构建抗体库
3.1分离RNA
1)破碎免疫小鼠脾脏，加入适量Trizol使细胞裂解充分；
2)裂解液13000rpm离心，弃去沉淀；
3)每1mL裂解液上清加入200μl氯仿，剧烈震荡30s，冰浴5min；
4)13000rpm离心10min，管内分为3层，小心吸出350-500μl上清。
5)加入等体积异丙醇混匀，-20℃静置30min，13000rpm离心10min。
6)弃去上清，沉淀用75％冰乙醇1ml清洗两次沉淀，将沉淀晾干，根据沉淀量用已经加入RRI的DEPC水复溶。
3.2PCR扩增基因
1)使用Oligo(dT)逆转录RNA得到cDNA；
2)使用小鼠抗体特征序列引物扩增轻重链基因；
3)重叠PCR得到ScFv片段。
3.3连接及转化
1)ScFv片段酶切
ScFv片段酶切反应体系如表1所示，37℃酶切过夜。
表1 ScFv片段酶切反应体系
试剂 体积
ScFv PCR产物 3μg
酶1 3μl
酶2 3μl
10×buffer 20μl
ddH<sub>2</sub>O Up to 200μl
2)载体酶切
载体使用双酶切法，酶切体系如表2所示。
表2载体酶切体系
试剂 体积
PNC 10μg
酶1 4μl
酶2 4μl
10×buffer 20μl
ddH<sub>2</sub>O Up to 200μl
配置好酶切体系后，将体系放于37℃水浴酶切2h，之后70℃水浴20min终止反应；
3)酶切后的片段、载体使用自产T4 DNA聚合酶连接，脱盐后用于电击转化；
4)从冰箱中取出分装好的感受态，每支加入10μl左右脱盐产物，轻轻吸打混合均匀；
5)取出1支混合液加入电击杯中，放入电击槽中，电击；
6)电击结束后立即取出电击杯，用2YT培养基洗出杯中菌液，转移至三角瓶中培养；
7)培养1h后，取样涂布平板测库容；
8)补加抗生素和葡萄糖，培养至OD600＝1.0，取一部分菌液包装噬菌体，剩余培养至OD600>3.5，离心收菌；
3.4包装噬菌体
1)在上述OD600＝1.0的菌液中，加入M13KO7浸染，混匀后放入37℃培养箱中静置30min；
2)静置后，37℃，180rpm缓慢摇晃30min；
3)侵染的菌液4℃，5000rpm离心10min，弃尽上清，用300mL2YT培养基(含有终浓度100μg/mL氨苄青霉素、50μg/mL卡那霉素)重悬沉淀，30℃，220rpm过夜；
4)300ml过夜菌9000rpm离心20min，量取200mL上清，加入1/4体积的PEG6000/NaCl，冰水浴沉淀4h；
5)冰浴后，4℃，9000rpm，离心20min，倒掉上清，根据沉淀的量加入3ml左右PBS溶解沉淀；
6)过滤除菌后，按体积加入一定量的50％的甘油，至甘油终浓度为17％；
7)混匀后，分装到EP管中，取部分进行噬菌体滴度测定和污染检测，其余-80℃冻存。
3.5测定噬菌体滴度
1)早上接种TG1单克隆于2YT无抗培养基中，37℃，220rpm培养至OD600≈1.0；
2)取噬菌体库梯度稀释到10-10，取100μl稀释液加入到200μL培养好的TG1中，37℃培养箱静置30min，全部涂布至氨苄抗性平板上，37℃过夜培养，第二天统计板上克隆数，计算滴度，TG1单克隆用于实施例2中的抗体筛选。
4、抗体库质量检测
4.1初级细菌文库污染检测
1)取冻存菌库，涂布200μl原液，并涂布10-2-10-6的梯度稀释液，30℃培养过夜；
2)平板菌落计数。烈性噬菌体的存在会在平板上产生溶解斑，或减少菌落，尤其是在用未稀释或低稀释原代细菌细胞库涂布的平板上。
4.2次级细菌文库污染检测
1)取冻存菌库，1：1000接种，37℃，220rpm培养至OD600>1，涂布200μl培养菌，30℃培养过夜；
2)烈性噬菌体的存在会在平板上产生溶解斑，或减少菌落。
4.3噬菌体文库污染检测
1)取噬菌体库，10μl侵染300μl OD600>0.8的TG1菌液，37℃静置30min。涂布200μl混合液，并涂布10-2-10-5梯度稀释液，30℃培养过夜；
2)常规感染噬菌体库，将噬菌体加入上述TG1培养基中，轻轻混合，37℃孵育30min；
3)涂在2YT-AG平板上，30℃培养过夜；
4)平皿菌落计数，烈性噬菌体的存在会在平板上产生溶解斑，或减少菌落，尤其是在用未稀释或低稀释原代细菌细胞库涂布的平板上。
实施例2抗体库筛选
1、实验材料
1)2YT培养基：Tryptone16 g，Yeast extract 10g，NaCl 5g，加去离子水定容到1L。2YT固体培养基含1.5％琼脂。
2YT+A(Amp)+G(glu)液体培养基：A:100μg/ml G:0.1％。
2YT+A(Amp)+G(glu)固体培养基：A:100μg/ml G:1.0％。
2)40％葡萄糖：40g葡萄糖加水定容至100ml(w/v)，过滤除菌后分装，4℃保存。
3)氨苄青霉素：配制浓度(100mg/ml)，0.5g AMP+5ml水，充分溶解，过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。工作浓度(100μg/ml)，1:1000稀释使用。
4)1×PBS缓冲液：NaCl 8.0g，KH2PO4 0.24g，Na2HPO4·12H2O 3.63g，KCl0.2g，加去离子水定容到1L，盐酸调PH 7.4。
5)封闭液：2％M-PBS，1×PBS+2％Milk(w/v)充分溶解后，9000rpm离心2min取上清，现配现用。
6)包被液：0.1M NaHCO3，NaOH调PH9.6，过滤除菌，4℃保存。
7)洗涤液：0.1％PBST，0.3％PBST，0.5％PBST(T：Tween20，要配制成10％的母液使用)。
8)洗脱液：胰酶细胞消化液。
9)噬菌体沉淀液：PEG6000/NaCl(20％PEG/2.5M NaCl)，称取40g PEG6000和29.22g NaCl，加入140ml水，在电磁炉上，开水浴至颗粒完全溶解，冷水降温到溶液澄清，定容至200ml，低磅灭菌。
2、实验方法
1)预试验：测定靶分子和对照分子的理化性质(PH值、浓度、溶液体系、分子量，SDS电泳)。
2)包被靶分子：用包被液(0.1M NaHCO3 PH9.6)将靶分子稀释至需要的合理浓度，每孔100μl，在湿盒中4℃静置过夜(如有对照分子，一起包被)。
3)封闭空白孔(扣除背景)：用2％M-PBS封闭，300μl/孔，视情况封闭多少个孔。在湿盒中4℃静置过夜(2％M-PBS需9000rpm离心2min，取上清)。
4)划TG1平板：挑取TG1单克隆或取冻存菌于10ml 2YT液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养至对数期，然后划无抗平板。
5)接TG1菌：挑取TG1单克隆于10ml 2YT液体培养基中，37℃，250rpm震荡培养至对数期(OD≈0.5)用于测滴度。
6)封闭靶分子：倒掉包被靶分子孔中的包被液，PBS洗板3次，每孔加入300μl封阻液(2％M-PBS)，37℃静置1h。
7)扣除前背景：PBS洗板3次，将库(投入库的量约1.0×1013pfu)与1％M-PBS混合，然后100μl/孔，加入到封闭好的空白孔中，室温静置1h。
8)结合：PBS洗3次封闭好的步骤6)的包被孔，将扣除前背景的步骤7)的抗体库100μl/孔加入步骤6)的包被孔中结合，室温结合1h。
9)洗涤：0.1％、0.2％、0.3％或0.5％PBST洗板(每次液体要充满孔，枪头不能碰内壁)，每次缓摇1min。若是需要较多克隆，进行8次洗板，若是一般淘选则进行9次洗板。PBST洗板多次过后再次用PBS洗板一次。
10)甘氨酸洗脱：100μl/孔，室温缓摇8min，吸出后用15μl/孔的Tris-HCl(pH 9.1)终止，得到洗脱产物，4℃保存。
11)测定滴度：测定洗脱产物噬菌体滴度。
12)接TG1单克隆菌：将TG1单克隆接种于20ml 2YT培养基37℃，250rpm震荡培养至对数期(OD＝0.5)。
13)洗脱产物侵染：加入洗脱产物混匀，37℃静置30min。
14)补加抗性：补加Amp 4μl(终浓度20μg/ml)，37℃，180rpm缓摇60min。
15)M13KO7侵染：向瓶中加入相应量的M13KO7(辅助噬菌体的数:菌体数≥10:1)37℃静置20min。
16)补加培养基：补加30ml 2YT培养基及6μl Amp(终浓度20μg/ml)，180rpm缓摇60min。
17)收菌重悬：5000rpm离心10min收菌，菌体重悬在50ml 2YT+Amp(终浓度50μg/ml)+Kan(终浓度10μg/ml)中，30℃，220rpm过夜培养。
18)将过夜培养的培养物转入离心管中，4℃，12000rpm离心10min。上清转入另一离心管同样条件再离心。将上清的转入新离心管，加入1/4体积的PEG6000/NaCl，4℃沉淀4h。
19)4℃，12000rpm离心20min，倒掉上清液，瞬离一次，吸去残留上清。
20)重悬沉淀于0.5ml PBS中，4℃，12000rpm离心10min使残余细胞沉淀，上清转入另一新鲜离心管中，此为扩增产物。
21)测扩增产物滴度。
22)洗脱产物阳性率鉴定，鉴定反应体系及PCR程序如表3所示。
表3洗脱产物阳性鉴定反应体系及PCR程序
Figure BDA0003918661030000151
23)第一轮淘选结束。根据第一轮淘选结果，通过适当降低靶分子包被的浓度，或者提高洗涤液中Tween20的浓度和洗涤次数及时间，降低靶分子与噬菌体库的结合时间和温度，提高淘选压力，进行第二，三轮淘选。以降低背景，进一步富集高亲和力的噬菌体。
注：直接包被法中扣除背景相对简单，一般只需要经噬菌体库及洗脱产物各一步扣除背景，有对照分子的应在包被有对照分子的ELISA平板内扣除对照背景。
实施例3单克隆噬菌体制备
1)在96孔培养板NEST(板1)A1-H11中加入2YT+A+G(终浓度Amp 100μg/ml，Glu0.1％)，100μl/孔(将配好的2YT+A+G倒入无菌的一次性培养皿中，用排枪加入)。
2)用镊子夹住黄枪头从涂有2-E(3-E)洗脱产物的培养皿中挑取单克隆(蘸一下即可)，然后在培养基中蘸一下使噬菌体接入。
3)将接好菌的培养板盖好盖子，用医用透明胶带先将盖子和板子封好，在放入拉口袋中，外用皮筋缠好，37℃，220rpm过夜培养。
4)准备新的96孔培养板NEST(板2)，在A1-H11中加入2YT+A(终浓度Amp 100μg/ml)，100μl/孔，(将配好的2YT+A倒入无菌的一次性培养皿中，用排枪加入)。
5)用排枪吸取20μl板1中的噬菌体，对应接入板2中。
6)将转接的培养板盖好盖子，用医用透明胶带先将盖子和板子封好，在放入拉口袋中，外用皮筋缠好，37℃，220rpm至OD＝0.5左右。
7)加M13KO7：用2YT将M13KO7稀释至需要浓度，20μl/孔加入孔中，37℃静置30min后180rpm缓摇30min。
8)加2YT+A+K(终浓度Amp 50μg/ml，Kan 25μg/ml)100μl/孔(将配好的2YT+A+K倒入无菌的一次性培养皿中，用排枪加入)。
9)将培养板盖好盖子，用医用透明胶带先将盖子和板子封好，在放入拉口袋中，外用皮筋缠好，30℃，220rpm过夜培养。
10)取过夜培养板，加入4％M-PBS 80μl/孔，盖好盖子，用医用胶带封好，4000rpm,10min水平离心，(配平时要注意板子缺刻的位置)。此时phage体积是240μl/孔，用80μl/孔4％M-PBS稀释用于phage ELISA结合时使用。
实施例4单克隆与目的蛋白的Phage ELISA结合能力测定
一、步骤
1、包被：取ELISA平板用PH9.6包被液稀释靶蛋白，50μl/孔，在湿盒中37℃静置1h或4℃静置过夜。
2、封闭：甩出多余包被液，并倒置平板在干净纸巾上拍甩去除残液，PBS洗板3次。加入封阻液，300μl/孔，37℃在湿盒中静置1h。
3、一抗：甩出多余噬菌体溶液，并倒置平板在干净纸巾上拍甩去除残液，PBS洗板3次。用1％Milk-PBS 1:1000稀释HRP兔抗M13，加入50μl/孔，37℃在湿盒中静置1h。
4、显色：甩出多余溶液，并倒置平板在干净纸巾上拍甩去除残液，PBS洗板4次。TMB显色液，50μl/孔，2M H2SO4终止，450nm检测。
二、检测结果
检测结果如图1所示，结果表明抗体阳性克隆具有结合抗原的能力。
实施例5 IgG重构及其抗体检测结果
1、获得抗体序列
将实施例4鉴定出的其中一个阳性单克隆进行抗体测序，获得本发明保护的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO:8所示。
2、构建抗体的表达质粒
构建IgG重组质粒所使用的原始载体为pTT5，载体如图3所示，利用PCR扩增技术扩增抗体序列，利用双酶切法插入pTT5载体，酶切位点为EcoRI和BamHI。
3、细胞转染法转染293细胞
1)细胞准备：293细胞，使用DMEM+10％FBS调整密度为1×106/ml，125ml摇瓶内溶液体积30ml。
2)转染复合物配置
a、将30μg抗体表达质粒稀释至1.5ml KPM培养基(KPM终体积为摇瓶液体总量的10％)，混匀；
b、将150μl T1噬菌体稀释至1.5ml KPM培养基，其中质粒：T1＝1:5，混匀，室温孵育5min；
c、将T1噬菌体稀释液加入DNA稀释液，混匀，室温孵育30min，即得到转染复合物。
3)转染
a、将转染复合物加入细胞悬液，混匀；
b、37℃，CO2浓度5％的摇床内120rpm培养24h。
4)加入添加剂：培养24h后加入终浓度为0.5％的TN1溶液(Tryptone N1来自Organotechni#19553)(原溶液浓度10％)。
5)转染第6天，4400rpm离心10min收集上清。
4、蛋白A亲和层析纯化IgG抗体
1)上清液用0.45μm滤器过滤，留过滤液备用；
2)将1ml ProteinA色谱柱用五蒸水冲洗20个柱体积，再用PB冲洗20个柱体积，流速：1.0ml/min。
3)样品上样，流速：1.0ml/min，上样结束后用PB冲洗20个柱体积至基线。
4)0.1M柠檬酸-柠檬酸钠(PH＝3.4)洗脱，收集洗脱液。(收集管中需事先加入约150μl的1M PH9.0 Tris-HCI缓冲液，防止抗体在过酸环境下失活)。
5)洗脱产物用2M PH＝8.0Tris-HCI小心调PH值至5.0，静置10min，观察无沉淀后再调至6.0。
6)鉴定。
5、IgG重构抗体检测
1)敏感性检测
利用表达BCMA的细胞NCI-H929检测编号840IgG抗体与细胞中的BCMA结合的能力，检测结果如图3所示。其中抗体所使用的剂量为0μg、0.4μg、2μg、10μg。
利用BCMA-的K562细胞和BCMA+的NCI-H929细胞检测编号840抗体(2μg)与细胞中的BCMA结合的能力，结果如图4所示，K562(左)没有表达BCMA，因此荧光强度低，NCI-H92表达内生性BCMA，被编号840抗体染色，峰右移。
实施例6CAR-NK细胞的构建方法及体外功能评价
1、NK细胞制备
1)从献血者获得PBMC：取全血20-40ml，缓慢的把全血加到15ml淋巴细胞分离液体，离心1200xg 10min，轻柔获得上层血清，获取白膜层，尽量不接触ficoll层，加入40mlDPBS重悬细胞，离心400xg 10min，去上清，再次加入40ml DPBS洗涤细胞，离心400xg10min，去上清，重悬于NK激活培养基(包括细胞因子II和细胞因子III)(依科赛NE000-N022)。
2)获得上层血清置于56℃30min，然后4℃10min，1200xg 10min，获得上清，为自体血清。
3)从1)中获得PBMC后，使用10％灭活血清和NK激活培养基调整细胞浓度到2×106cells/ml。
4)72小时后，加入等量体积的含有10％自体血清的NK基础培养基(包含细胞因子III)。
5)48小时后，取细胞计数，使用NK基础培养基调整细胞密度至1.5×106cells/ml。
6)每隔48小时，重复5)，培养至14-16天收获NK细胞。
2、CAR表达载体的构建
1)CAR结构各部分及其连接顺序：胞外抗原结合域(ScFv)-铰链区-跨膜结构域-共刺激结构域-胞内信号传导结构域。
完整的CAR结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示。
2)构建载体
由北京华大六合生物技术有限公司进行载体构建，包括合成基因片段，连接入表达载体pLenti-puro质粒，使用BamHI和AgeI酶切位点切开基因片段和表达质粒产生粘性末端并连入。
3、病毒包装
病毒包装使用三代慢病毒包装系统-共四质粒系统，包装三质粒pRSV-Rev，pMDLg/pRRE，pMD2.G，穿梭pLVX-puro，HEK293T细胞作为病毒生产细胞，混合比例pLenti-puro：pRSV-Rev：pMDLg/pRRE：pMD2.G＝3:1:1:1，转染试剂使用脂质体mirus TransIT-293(mir2700)，脂质体和DNA比例为3:1，转染后，三天收集上清，高速离心40000xg 6小时。
4、病毒转导
将病毒按照感染浓度为10MOI直接加入NK细胞的培养基中，同时加入0.8μg/ml的polybrene，孵育6小时后，去除含有病毒NK培养基，加入新鲜的NK培养基，继续培养48小时后，检测CAR表达。
5、CAR-NK细胞的扩增
6、CAR-NK细胞CAR表达效率检测
取感染过后的NK细胞0.5E6，PBS清洗两次后，检测BCMA CAR抗体(美天旎)1:100稀释，孵育60分钟后，PBS清洗两次，使用流式细胞仪检测阳性细胞数。确认CAR阳性率，如图5所示，阳性率为24.03％。
7、细胞杀伤性实验
本实施例采用的DELFIA EuTDA 试剂盒进行检测细胞毒性效果。
具体步骤为：H929细胞与BATDA reagent(2μl/ml)预先混合孵育30min(37℃)，经过5次洗涤彻底洗脱细胞外残留reagent，分别按照比例H929：NK为1:1、1:2、1:4、1:8混合孵育2小时后，reagent从H929中释放到细胞培养基中，由于不同杀伤效果，reagent释放的量不同，收集包含reagent的细胞上清液，混合ES溶液室温孵育15min，每3min轻轻震动混匀。使用酶标仪TRF通道读取荧光数据(315nm激发640nm接收)。计算公式为：％＝(上清读数-自发光读数)/(细胞裂解最大读数-自发光读数)，获得杀伤率。
结果如图6所示，由图6可知，在H929：NK效靶比分别为1:1、1:2、1:4、1:8时，840CAR-NK细胞对靶细胞的杀伤活性为10.7％、18.4％、29.4％、37.2％，而作为对照组的NK细胞对靶细胞的杀伤活性为5％-10％。对比发现，840CAR-NK细胞产品对抗原细胞有更好的杀伤力。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种BCMA的特异性抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述特异性抗体或其抗原结合片段与BCMA特异性地结合；
优选地，所述特异性抗体或其抗原结合片段包括重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；
优选地，所述重链CDR1含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:1具有至少70％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述重链CDR2含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述重链CDR3含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:3具有至少70％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述轻链CDR1含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:4具有至少70％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述轻链CDR2含有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:5具有至少70％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述轻链CDR3含有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6具有至少70％同一性的氨基酸序列；
优选地，所述BCMA的特异性抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
优选地，所述BCMA的特异性抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
2.如下任意一项所述的物质：
1)一种分离的核酸分子或包含其的载体，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段；
优选地，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸；
2)一种BCMA的特异性抗体或其抗原结合片段的抗体衍生物，其特征在于，所述抗体衍生物包括权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联至可检测标记物形成的复合物；
优选地，所述可检测标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶标记物；
优选地，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、Texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白；
优选地，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素；
优选地，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴；
优选地，所述酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶；
3)一种抗体或其抗原结合片段的偶联物，其特征在于，所述偶联物包括权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段与治疗剂偶联形成的偶联物；
优选地，所述治疗剂包括细胞毒性剂、激素制剂、靶向小分子制剂、蛋白酶体抑制剂、化疗剂、溶瘤药物、细胞因子、共刺激分子的激活剂、抑制性分子的抑制剂；
4)一种经过改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，其特征在于，所述改造的宿主细胞包括权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或权利要求2所述的核酸分子或包含其的载体；
优选地，所述宿主细胞群体还包括所述改造的宿主细胞之外的宿主细胞；
优选地，所述改造的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；
优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；
优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌；
优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞。
3.一种检测BCMA的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段或权利要求2中2)所述的抗体衍生物；
优选地，所述产品包括试剂盒、芯片或试纸。
4.一种靶向BCMA的CAR，其特征在于，所述CAR包括靶向BCMA的胞外抗原结合域，所述胞外抗原结合域包括权利要求1中所述的特异性抗体或其抗原结合片段的重链CDR1、重链CDR2、重链CDR3、轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；
优选地，所述胞外抗原结合域包括权利要求1中所述的特异性抗体或其抗原结合片段的重链可变区；
优选地，所述胞外抗原结合域包括权利要求1中所述的特异性抗体或其抗原结合片段的轻链可变区；
优选地，所述胞外抗原结合域中的重链可变区和轻链可变区之间由linker连接；
优选地，所述linker的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；
优选地，所述胞外抗原结合域的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；
优选地，所述CAR还包括铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域、胞内信号传导结构域中的一种或多种；
优选地，所述铰链区是如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列；
优选地，所述跨膜结构域是如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列；
优选地，所述共刺激结构域是如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列；
优选地，所述胞内信号传导结构域是如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列；
优选地，所述CAR结构完整的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示。
5.一种核酸分子或包含其的载体，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求4所述的CAR；
优选地，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸。
6.一种经过改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，其特征在于，所述改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体包括权利要求4所述的CAR、权利要求5所述的核酸分子或包含其的载体；
优选地，所述宿主细胞群体还包含所述改造的宿主细胞之外的宿主细胞；
优选地，所述改造的宿主细胞包括原核细胞、真核细胞；
优选地，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体；
优选地，所述细菌包括大肠杆菌、枯草杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、假单胞菌属、链霉菌、葡萄球菌；
优选地，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母细胞；
优选地，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞；
优选地，所述淋巴细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞；
优选地，所述载体包括质粒、慢病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、线性多核苷酸；
优选地，所述载体为质粒载体；
优选地，所述质粒载体是pLenti-puro。
7.如下任一种方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)一种生产权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：培养权利要求2中4)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，从培养物中分离出权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段；
(2)一种非诊断和非治疗目的检测待测样品中BCMA或其片段的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段接触或将待测样品与权利要求2中2)所述的抗体衍生物接触，检测BCMA或其片段与权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段或权利要求2中2)所述的抗体衍生物的复合物的形成；
(3)一种制备权利要求2中4)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或权利要求2中1)所述的核酸分子或包含其的载体导入到宿主细胞中；
优选地，所述导入的方式包括磷酸钙转染、DEAE、右旋糖介导的转染、电穿孔、噬菌体感染；
(4)一种特异性地抑制BCMA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段，或权利要求2中1)所述的核酸分子或包含其的载体导入到生物体细胞中，通过表达权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段抑制BCMA的活性；
优选地，所述生物体细胞是体外培养的细胞；
(5)一种制备权利要求6中所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体的方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求4所述的CAR，或权利要求5所述的核酸分子或包含其的载体转导进入宿主细胞；
优选地，所述转导方法包括慢病毒载体转导、逆转录病毒载体转导、转座子转导或mRNA电穿孔技术；
优选地，所述转导是指慢病毒载体转导；
优选地，所述慢病毒载体转导转入使用的是穿梭pLVX-puro；
优选地，所述慢病毒载体转导所使用的的包装三质粒为pRSV-Rev，pMDLg/pRRE，pMD2.G；
优选地，所述慢病毒载体转导中的质粒的混合比例为pLenti-puro：pRSV-Rev：pMDLg/pRRE：pMD2.G＝2:1:1:1；
优选地，所述方法包括制备改造NK细胞的方法；
优选地，所述方法还包括制备NK细胞的步骤；
优选地，所述方法还包括检测CAR-NK细胞上CAR表达效率的步骤；
优选地，所述方法还包括扩增CAR-NK细胞地步骤；
优选地，所述扩增是在体外进行的。
8.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求6所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体；
优选地，所述组合物包括药学上可接受的辅料；
优选地，所述组合物包括药学上可接受的注射剂用辅料；
优选地，所述组合物的剂型为水剂。
9.如下任一种应用，其特征在于，所述应用包括：
(1)权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求2中1)所述的核酸分子或包含其的载体、权利要求2中2)所述的抗体衍生物，或权利要求2中4)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测BCMA或其片段的产品中的应用；
(2)权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求2中1)所述的核酸分子或包含其的载体、权利要求2中4)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体、权利要求4所述的CAR，或权利要求5所述的核酸分子或包含其的载体在制备治疗BCMA的表达相关的癌症的药物组合物中的应用；
优选地，所述BCMA的表达相关的癌症包括血液瘤、实体瘤；
优选地，所述实体瘤包括肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌；
优选地，所述血液瘤包括白血病、骨髓瘤、淋巴瘤；
优选地，所述白血病包括淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病；
优选地，所述骨髓瘤包括孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、轻链型骨髓瘤、不分泌型骨髓瘤；
优选地，所述淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤；
(3)权利要求1所述的特异性抗体或其抗原结合片段、权利要求2中1)所述的核酸分子或包含其的载体，或权利要求2中4)所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备调节BCMA活性或水平的药物中的应用；
(4)一种权利要求6中所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备杀伤体外癌细胞的药剂中的应用；
优选地，所述体外癌细胞包括肺癌细胞系、胰腺癌细胞系、肝癌细胞系、神经胶质瘤细胞系、乳腺癌细胞系、结肠癌细胞系或前列腺癌细胞系；
优选地，所述肺癌细胞系包括NCI-H1385、Tul-1、A549、16HBE、SKMES1或NCIH460；
优选地，所述胰腺癌细胞系包括SW1990、KP4、Panc-1、Paca-2、Patu8988、Bxpc-3、Capan-1/2、Aspc-1、jr305或PC-3；
优选地，所述肝癌细胞系包括SMMC-7721、Bel-7402、MHCC97、HepG2、Hep3B、Huh-7或PLC/PRF/5；
优选地，所述神经胶质瘤细胞系包括U87MG、U251MG、A172、KALS-1、SW1783、SH-SY5Y；
优选地，所述乳腺癌细胞系包括MCF-7、HCC1143、HCC1187、HCC1599、HCC1806、HCC38、HCC1937或MDA-MB-453；
优选地，所述结肠癌细胞系包括SW480、SW620、SW1116、LOVO、HCT116、HCT-15、HT-29、LS180、LS174T、NCI-H716、Caco-2、COLO205、COLO320、COLO320DM、CT26.WT、DLD-1、RKO、RKO-E6、RKO-AS45-1或T84；
优选地，所述前列腺癌细胞系包括LNCaP、PC-3或DU145；
(5)权利要求6中所述的改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，或权利要求8所述的组合物在制备治疗疾病的药物中的应用，其特征在于，所述疾病是与BCMA的表达相关的癌症。
10.根据权利要求9中所述的癌症，其特征在于，所述BCMA的表达相关的癌症包括血液瘤、实体瘤；
优选地，所述实体瘤包括肺癌、脑癌、结肠癌、直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、胃癌、子宫颈癌、头颈癌、卵巢癌、睾丸癌、垂体癌、食道癌、皮肤癌、胰腺癌、骨癌；
优选地，所述血液瘤包括白血病、骨髓瘤、淋巴瘤；
优选地，所述白血病包括淋巴细胞白血病、髓细胞白血病、混合细胞白血病；
优选地，所述骨髓瘤包括孤立性浆细胞瘤、多发性骨髓瘤、轻链型骨髓瘤、不分泌型骨髓瘤；
优选地，所述淋巴瘤包括非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤。
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