CN115724909B - 抗菌肽yhx-7及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽YHX‑7及其应用,抗菌肽具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。本发明的抗菌肽对革兰氏阳性菌,如单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌及变异链球菌等具有特异性的抗菌活性,且溶血活性较低,合成序列短,分子量小,化学合成难度小,能够更加特异性地杀死生物体内的病原菌同时很好的节约规模化生产成本。

Description

抗菌肽YHX-7及其应用
技术领域
本发明涉及抗菌剂,具体地,涉及一种抗菌肽YHX-7及其应用。
背景技术
1928年Fleming发现第一种抗生素——青霉素,抗生素作为人类抗击病原体的有力武器,拯救了无数人生命的同时也带来了严重的耐药性问题。中国作为当前抗生素生产量和使用量最大的国家之一,每年抗生素的使用量占据世界抗生素总使用量的五分之一以上。抗生素不合理使用会加速耐药菌在大气、水源和土壤中的传播,每年有大约46%的抗生素会以污水、化肥和粪便等作为媒介最终进入河流。目前,耐药菌已遍布世界上的几乎任何一个角落,严重危害人类的健康与安全,因此解决病原菌的耐药性问题已经刻不容缓。
抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs),又称抗微生物肽、抗生素肽等,是一类大部分由10~50个氨基酸残基组成的短阳离子肽。抗菌肽具有包括抗细菌、抗真菌、抗病毒、杀灭寄生虫、抑制肿瘤以及调节免疫系统的多种生物活性。由于具有广谱抗菌活性和快速杀菌效率,热稳定性好,不易使致病菌产生耐药性,天然或人工合成抗菌肽在食品安全和生物替抗领域具有广阔的应用前景。
然而,尽管目前已被开发出的抗菌肽数量达到了4000余种,但只有少数的抗菌肽被应用于生产,如乳酸链球菌肽、短杆菌肽和多粘菌素等。当前,大部分抗菌肽还存在生产成本高、生物活性较低以及溶血活性高等问题,并不能满足实际应用需求。因此,开发结构简单、抗菌活性强同时细胞毒性低的抗菌肽是目前迫切需要解决的问题。
发明内容
针对上述问题,本发明提供了一种抗菌肽YHX-7及其应用,该抗菌肽对单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌以及变异链球菌等革兰氏阳性菌具有较好的抗菌活性,并且结构简单,合成难度小,安全性高。
为了实现上述目的,本发明一方面提供一种抗菌肽YHX-7,该抗菌肽具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
所述抗菌肽YHX-7包含13个氨基酸残基,分子量为1454.73Da,净电荷数为+1。
本发明第二方面提供一种上述的抗菌肽YHX-7在制备治疗单核细胞增生李斯特氏菌、变异链球菌或金黄色葡萄球菌感染性疾病药物中的应用。
具体地,所述抗菌肽YHX-7对单核细胞增生李斯特氏菌的最小抑菌浓度为16μg/mL,对变异链球菌的最小抑菌浓度为32μg/mL,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为32μg/mL。
本发明第三方面提供一种生物抗菌剂,该生物抗菌剂包含上述的抗菌肽YHX-7。
本发明第四方面提供一种动物饲料,该动物饲料包含上述的抗菌肽YHX-7。
本发明第五方面提供一种防腐剂,该防腐剂包含上述的抗菌肽YHX-7。
具体地,所述防腐剂为用于食品或者化妆品的防腐剂。
本发明第六方面提供一种洗涤剂组合物,该洗涤剂组合物包含上述的抗菌肽YHX-7。
具体地,所述洗涤剂组合物为洗手液、香皂、沐浴液、洗发剂、牙膏、洗衣液或洗衣粉。
通过上述技术方案,本发明实现了以下有益效果:
1、本发明的抗菌肽对革兰氏阳性菌,如单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌及变异链球菌等具有特异性的抗菌活性。
2、本发明所述的抗菌肽,溶血活性较低,合成序列短,分子量小,化学合成难度小,能够更加特异性地杀死生物体内的病原菌同时很好的节约规模化生产成本。
附图说明
图1为本发明提供的抗菌肽YHX-7的二级结构预测示意图;
图2为本发明提供的抗菌肽YHX-7在333μg/mL对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌效果示意图;
图3为本发明提供的抗菌肽YHX-7在333μg/mL对变异链球菌的抑菌效果示意图;
图4为本发明提供的抗菌肽YHX-7在333μg/mL对金黄色葡萄球菌的抑菌效果示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1抗菌肽的设计
在抗菌肽从头设计及对构效关系理解的基础上,对从ADP3数据库中筛选得到的对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌有抑菌作用的532条抗菌肽序列进行序列参数分析(包括序列长度、带电荷数、疏水氨基酸比例和氨基酸组成),之后按照优势参数选取原则并结合理性设计思路,确定了新抗菌肽的各项序列参数,具体如表1所示:
表1从头设计抗菌肽的序列参数
为降低合成成本,同时降低细胞毒性,序列长度值选择在抗革兰氏阳性菌数据库中参数频数第一位的13。选取带正电氨基酸Lys和极性不带电荷氨基酸Ser组成抗菌肽的极性面,选取疏水性氨基酸Leu和芳香族氨基酸Trp、Phe形成疏水面,来保证抗菌肽的两亲性结构。其中,Trp吲哚基存在的带负电π-电子云,在与阳离子氨基侧链形成阳离子-π键的同时又能与脂质双分子层表面的氨基胆碱相互作用,可以进一步提高抗菌肽对细菌细胞膜的吸附力和穿透力。带电荷数确定为+1,保证抗菌肽对细菌细胞膜的亲和力的同时尽量减小肽分子的细胞毒性。
采用生物信息学预测及分析工具,对不同氨基酸排列顺序的肽序列分子量、平均疏水值、平均疏水力矩、不稳定性指数、脂肪族指数、半衰期、螺旋轮图、成为AMPs的可能性以及二级结构进行预测,选出最优的抗菌肽序列。所用生物信息学工具如下:
物化性质分析网站:Expasy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)螺旋轮图及疏水性分析网站:Heliquest(https://heliquest.ipmc.cnrs.fr/)AMPs可能性预测网站:CAMPR3(http://www.camp.bicnirrh.res.in/)二级结构预测网站:Pep-fold(https://bioserv.rpbs.univ-paris-diderot.fr/services/PEP-FOLD3/);Zhang Lab(https://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/)
通过上述工具得到的最优抗菌肽序列及物化性质如表2所示,二级结构预测结果如图1所示。
表2抗菌肽YHX-7的序列及物化性质
实施例2抑菌活性
该抗菌肽YHX-7委托强耀生物科技(上海)有限公司合成。
将金黄色葡萄球菌划线接种于LB固体培养基,将单核细胞增生李斯特氏菌和变异链球菌划线接种于BHI固体培养基,置于37℃恒温培养箱培养18h,挑取各个菌株的单菌落置于各自对应的液体培养基中,37℃恒温振荡培养12h。测量菌液的OD600值,并将其稀释至1×106CFU/mL。
①抑菌圈实验
配置LB和BHI半固体培养基(琼脂质量分数0.6%),每皿20mL加入7μL菌液振荡混匀后倒入摆放好牛津杯的培养皿中,待培养基冷却凝固后拔除牛津杯完成打孔。每孔中加入160μL抗菌肽溶液(配置使用1mg抗菌肽溶于3mL超纯水)。置于37℃恒温培养箱培养24h后测量抑菌圈直径,测试结果如图2-图4所示。
②最小抑菌浓度(MIC)的测定
向96孔板中加入培养至对数生长期的各菌株菌液(单核细胞增生李斯特氏菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌)50μL,同时在各孔中加入各浓度梯度抗菌肽溶液(512μg/mL、256μg/mL、128μg/mL、64μg/mL、32μg/mL、16μg/mL、8μg/mL、4μg/mL)50μL,并分别做阳性对照和阴性对照组。在37℃恒温培养箱培养8h后测量各孔的OD600值,取菌株生长被完全抑制的最低浓度作为抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC),测试结果如表3所示。
表3抗菌肽YHX-7的抑菌活性分析结果
从图2-图4可以看到明显的抑菌圈,结合表3可以看出,本发明的抗菌肽YHX-7对单核细胞增生李斯特氏菌、变异链球菌、金黄色葡萄球菌具有抑制作用,对单核细胞增生李斯特氏菌的最小抑菌浓度为16μg/mL,对变异链球菌的的最小抑菌浓度为32μg/mL,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为32μg/mL。
实施例3溶血活性
取健康兔血液1mL加于肝素抗凝管中,在1000xg转速下离心10min后取沉淀,用PBS缓冲液冲洗3次,将红细胞用10mL PBS重悬。用PBS缓冲液将抗菌肽YHX-7的浓度调整至4-512μg/mL,以每孔50μL的剂量加入96孔板中,并加入等体积(50μL)的红细胞悬液混匀。以PBS缓冲液作为阴性对照,以0.1%Tritonx-100作为阴性对照,在37℃恒温培养1h后取出,1000xg离心10min,取出上清液用酶标仪在570nm处测OD值,测试结果如表4所示。
溶血率计算公式为:溶血率=(AT-AO)/(AC-AO)×100%。
式中:AT为实验组的吸光值,AC为阳性对照组的吸光值,AO为阴性对照组的吸光值。
表4抗菌肽YHX-7的溶血活性(测定3次取平均值)
由表4可知,在最小抑菌浓度(MIC)条件下,抗菌肽YHX-7的溶血率均低于10%,说明抗菌肽YHX-7有较好的安全性,在制作生物抗菌剂、防腐剂和动物饲料等方面的应用前景较大,可进一步深入研究和开发利用。

Claims (9)

1.一种抗菌肽YHX-7,其特征在于,该抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的抗菌肽YHX-7在制备治疗单核细胞增生李斯特氏菌、变异链球菌或金黄色葡萄球菌感染性疾病药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述抗菌肽YHX-7对单核细胞增生李斯特氏菌的最小抑菌浓度为16μg/mL,对变异链球菌的最小抑菌浓度为32μg/mL,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为32μg/mL。
4.一种生物抗菌剂,其特征在于,包含权利要求1所述的抗菌肽YHX-7。
5.一种动物饲料,其特征在于,包含权利要求1所述的抗菌肽YHX-7。
6.一种防腐剂,其特征在于,包含权利要求1所述的抗菌肽YHX-7。
7.根据权利要6所述的防腐剂,其特征在于,所述防腐剂为用于食品或者化妆品的防腐剂。
8.一种洗涤剂组合物,其特征在于,包含权利要求1所述的抗菌肽YHX-7。
9.根据权利要求8所述的洗涤剂组合物,其特征在于,所述洗涤剂组合物为洗手液、香皂、沐浴液、洗发剂、牙膏、洗衣液或洗衣粉。
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