CN115724908A - 一种预防非病毒性肝炎的组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种预防非病毒性肝炎的组合物及其制备方法和应用，属于食品加工技术领域。所述组合物包括粗肽，所述粗肽氨基酸序列为IIe‑Val‑Tyr‑Pro‑Trp‑Thr‑Gln‑Arg；还包括脂质和辅料，所述粗肽和所述脂质形成油包水的乳化体系，所述乳化体系和所述辅料混合形成所述组合物。通过实验证明，本发明制备的组合物有改善非病毒性肝炎的功效，为非病毒性肝炎的预防和治疗提供了一种新的途径。

Description

一种预防非病毒性肝炎的组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，特别是涉及一种预防非病毒性肝炎的组合物及其制备方法和应用。

背景技术

炎症伴随疾病的发生易加剧疾病的发展，甚至导致恶性肿瘤。肝炎是重要的病理特征之一，可导致脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化。根据全球疾病负担研究，不适当的饮食习惯(包括饮酒、高脂肪、高胆固醇等)导致的非病毒性肝炎是导致发病、死亡的重要疾病之一。目前抗生素用于缓解非病毒性肝炎，但抗生素过量使用会引起较强的副作用，因此非病毒性肝炎的治疗仍然是世界范围内的主要的健康问题。先前已有研究证实不适当的饮食会损害肠道屏障功能并加速LPS的易位，从而激活下游通路和相关炎症因子的释放进而导致肝炎的产生。巨噬细胞在LPS的刺激下可能通过产生炎症介质(ROS和NO)、一系列细胞因子(白细胞介素1β、白细胞介素6、TNF-α)，并且ROS可能诱导氧化应激从而介导细胞凋亡和炎症并加剧疾病的发展。因此抑制氧化应激和炎症反应是改善LPS介导的非病毒性肝炎的有效策略。

近年来，生物活性肽已被普遍应用于改善炎症反应和预防肝脏疾病恶化。尽管已有多种活性多肽(如胶原蛋白肽、金华火腿寡肽等)被证明可以改善肝损伤，但对于预防不适当饮食引起的非病毒性肝炎依然是一个挑战。生物活性肽来源广泛，包括植物、动物、微生物等，因为其含有丰富的蛋白质。畜禽血液作为动物副产品之一，具有丰富的蛋白质，是优质来源之一。然而，目前对于家禽血液的开发利用还远远不够，主要集中在食用、一些药用原料的提取及动物饲料，有很大一部分直接被废弃，资源严重浪费。因此，以畜禽血液为提取原料，可以为家禽血液的高值化加工寻找新的方向，为食品级血液制品的发展提供新的方向，也为非病毒性肝炎预防提供一种新的途径。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防非病毒性肝炎的组合物及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，利用家禽血液分离提取一种粗肽，将该粗肽与脂质及辅料制成具有抗非病毒性肝炎的组合物，实现了提高畜禽血液的利用价值，并为预防非病毒性肝炎提供了一种新的途径。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种预防非病毒性肝炎的组合物，所述组合物包括粗肽，所述粗肽氨基酸序列为IIe-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg(SEQ ID NO：1)。

优选的是，所述组合物还包括脂质和辅料，所述粗肽和所述脂质形成油包水的乳化体系，所述乳化体系和所述辅料混合形成所述组合物。

优选的是，所述粗肽源自于家禽血液。

本发明还提供一种所述的组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)粗肽的提取

将源于家禽血液的血粉酶解后，离心、超滤，得到粗肽提取物；

所得粗肽提取物依次经过尺寸排阻色谱法、离子交换色谱以及反相高效液相色谱分离，获取粗肽；

(2)脂质的制备

收集家禽油脂，在高温条件下精炼提取，过滤弃油渣后，与棕榈酸酯和硬脂酸酯混合，制成脂质；

(3)乳化均质

将步骤(1)制备的粗肽、步骤(2)制备的脂质，以及聚甘油蓖麻醇酸酯混合，高速剪切，形成油包水的乳液体系；

(4)将步骤(3)制备的乳液体系和辅料，混合搅拌均匀，得到预防非病毒性肝炎的组合物。

优选的是，步骤(1)中，酶解条件为：所述血粉和胃蛋白酶按照质量比400:1混合，在37℃条件下酶解4小时。

优选的是，步骤(2)中，精炼提取条件为：120-150℃条件下精炼提取20-40分钟；

所述家禽油脂、棕榈酸酯和硬脂酸酯的质量比为(80-82):(11-13):7。

优选的是，步骤(3)中，所述粗肽、脂质和聚甘油蓖麻醇酸酯的质量比为(40-60):(40-60):(6-8)；

高速剪切条件为：以25000-30000rpm/min转速高速剪切，使乳液分散成纳米颗粒。

优选的是，步骤(4)中，所述乳化体系和所述辅料的质量比为(60-80):(20-40)。

本发明还提供所述的组合物在制备预防非病毒性肝炎药物中的应用。

本发明还提供一种食品或者药物，包括所述的组合物。

本发明公开了以下技术效果：

本发明利用家禽血液获取粗肽，通过实验验证该粗肽具有较强的稳定性，能够抵抗胃肠道的消化作用，进而发挥抗非病毒肝炎的作用，因此，本发明解决了现有技术中家禽血液利用不充分的问题，并且为非病毒性肝炎预防和治疗提供了新的思路。

本发明制备的粗肽较为系统，并且结合家禽油脂，制备成一种可以抗非病毒性肝炎的组合物，根据需要可以将组合物制备成药物或者食品，并且可以制备成包括颗粒、粉状冲剂、片剂、软糖等多种形式，非常方便，为健康多元饮食提供了新的途径。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为LPS和GBP浓度对RAW264.7巨噬细胞的毒性及细胞活力的影响；A：LPS对RAW264.7巨噬细胞活力的影响；B：GBP对RAW264.7巨噬细胞活力的影响；C：LPS+GBP对RAW264.7巨噬细胞活力的影响；D：LPS+GBP对炎症因子IL-1β的影响；E：LPS+GBP对炎症因子IL-6的影响；F：LPS+GBP对炎症因子TNF-α的影响；

图2为尺寸排阻色谱法获得的肽对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤模型的影响；A：尺寸排阻色谱法分离粗肽提取物的谱图；B：评估组分A-F对炎症因子1L-1β的水平的影响；C：评估组分A-F对炎症因子IL-6的水平的影响；D：评估组分A-F对炎症因子TNF-α的水平的影响；

图3为离子交换层析分离得到的肽对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤模型的影响；A：离子交换层析分离GBP-E组分的谱图；B：评估馏分E1和E2对炎症因子1L-1β的水平的影响；C：评估馏分E1和E2对炎症因子IL-6的水平的影响；D：评估馏分E1和E2对炎症因子TNF-α的水平的影响；

图4为反相液相色谱法获得的多肽对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞损伤模型的影响；A：反相高效液相色谱对E1分离的谱图；B：评估不同馏分对炎症因子1L-1β的水平的影响；C：评估不同馏分对炎症因子IL-6的水平的影响；D：评估不同馏分对炎症因子TNF-α的水平的影响；

图5为活性肽IIe-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg(IVYPWTQR)分析鉴定图；A：RP-HPLC图；B：一级质谱图；C：二级质谱图；

图6为胃蛋白酶-胰蛋白酶模拟GI(胃肠道)消化对IVYPWTQR稳定性的影响；A：评估不同处理组对炎症因子1L-1β的水平的影响；B：评估不同处理组对炎症因子IL-6的水平的影响；C：评估不同处理组对炎症因子TNF-α的水平的影响；

图7为IVYPWTQR处理组经胰蛋白酶模拟肠道消化后的RP-LC图；

图8为MS/MS鉴定6.2337min组分的分子量和氨基酸序列；

图9为MS/MS鉴定42.0351min组分的分子量和氨基酸序列；

图10为MS/MS鉴定44.7485min组分的分子量和氨基酸序列；

图11为IVYPWTQR对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症反应的影响；A-B为经过LPS或者LPS与活性肽处理后对TLR4、CD14、MD-2、NF-KB、p-NF-KB、IKKβ蛋白表达水平的影响；C-E为经过LPS或者LPS与活性肽处理后对TLR4/NF-kB/iNOS通路的影响；

图12为IVYPWTQR对LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞氧化应激反应的影响；A-C为经LPS或者LPS与活性肽处理后对ROS、SOD和GSH-Px表达水平的影响；D-E为经LPS或者LPS与活性肽处理后对Keap-1/NrF2/HO-1信号通路的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1一种预防非病毒性肝炎的组合物的制备方法，包括以下步骤：

一、活性肽提取与分离鉴定

1、粗肽的提取

将家禽血液(鸡血、鸭血、鹅血一种或多种具有相同效果，以鹅血为例，下同)进行收集，冻干成粉。取100g血粉溶于2000mL PBS(pH 7.2)，在37℃条件下，用胃蛋白酶进行酶解4小时(血粉：胃蛋白酶＝400：1W/W)，然后在20000rpm均质5次，每次40s。12000×g离心30min，取上清液，通过分子量为3kDa的滤膜进行超滤，取滤过液，冻干，即为粗肽提取物备用。

2、分离与鉴定

(1)采用尺寸排阻色谱法，对上述获得的家禽血液粗肽提取物进行分离，洗脱条件为：流动相为0.1mol/L的HCl，流速为1mL/min，用280nm紫外检测器检测各馏分，并用自动馏分收集器收集每种馏分；馏分于真空冷冻干燥机中干燥待用。

真空冷冻干燥的工艺条件为：-40℃～-50℃，24h。

(2)采用离子交换色谱对(1)得到的预防非病毒性肝炎最有效的组分进行进一步分离。20mM Tris-HCl用作起始缓冲液，20mM Tris-HCl/1M NaCl用作洗脱液，流速设定为5mL/min。通过紫外检测器280nm处收集馏分并获得最具有预防非病毒性肝炎的组分；该组分于真空冷冻干燥机中干燥待用。

(3)采用反相高效液相色谱将(2)得到的预防非病毒性肝炎最有效的组分进行分离纯化，获得预防非病毒性肝炎最有效的组分。具体分离过程为：将冻干的样品溶于1mL蒸馏水中，配制浓度为10mg/mL，注入RP-HPLC系统，进行梯度洗脱，流速为0.5mL/min，洗脱液A：0.065％TFA(溶于2％乙腈)，洗脱液B：0.050％TFA(溶于80％乙腈)，洗脱程序设置如下：0-30min，100％A；30-60min，80％B；60-80min，100％A；用紫外检测器在280nm处检测并收集各组分，得到六个组分，冷冻干燥后检测各个组分预防非病毒性肝炎的效果，得到预防非病毒性肝炎最有效的组分。

(4)采用质谱对(3)中分离得到的预防非病毒性肝炎最有效的组分进行分析鉴定，得到预防非病毒性肝炎的粗肽序列为：IIe-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg(IVYPWTQR)。具体分离过程为：将步骤(3)分离得到的最具预防非病毒性肝炎的组分进行鉴定，采用LC-MS/MS，利用反相BEH C18色谱柱分离该组分，梯度洗脱程序设置如下：0-30min，100％A；30-60min，80％B；60-80min，100％A；流速为0.5mL/min，紫外检测波长280nm；柱温保持在25℃；流量直接进入MS/MS系统进行多反应测量；前体离子记录的质量范围为m/z＝200-4000；使用Mass Lynx V4.1操作仪器，分析质谱图信息。

(5)结果

利用尺寸排阻色谱法分离时，组分A由于分子量最大最先被洗脱出来，组分F最后被洗脱出来。收集所有组分，冷冻干燥待用。对A-F(图2的A)的抗炎活性进行评估，利用试剂盒测定炎症因子1L-1β、IL-6、TNF-α的水平。组分E明显表现出最强的抗炎活性，其IL-1β(291.17±34.53pg/mL)、IL-6(228.15±5.38pg/mL)、TNF-α(179.27±6.26pg/mL)水平显著低于其他组分(图2的B-D)。因此GBP-E具有最强的抗炎活性。为了进一步分析，GBP-E在真空冷冻干燥机中干燥。

采用离子交换色谱法对E组分进行进一步分离，根据不同的阴离子交换能力分离E组分。总共分离得到E1和E2两个馏分，馏分E1表示较弱的阴离子交换能力，E2表示较强的阴离子交换能力(图3的A)。将分离的馏分冻干，测定其在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎活性(图3的B-D)。E-1组中IL-1β(275.01±12.37pg/mL)、IL-6(205.14±13.22pg/mL)、TNF-α(164.76±6.80pg/mL)，这些炎症因子的水平要显著低于E2组。因此，E1具有最强的抗炎活性。将E1于真空冷冻干燥机中干燥。

采用反相高效液相色谱对E1组分进一步纯化。根据疏水性的差异对其分离纯化，得到六个馏分E-1-I、E-1-Ⅱ、E-1-Ⅲ、E-1-Ⅳ、E-1-Ⅴ、E-1-Ⅵ(图4的A)。将分离的馏分冻干，测定其在LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎活性(图4的B-D)。E-1-V中IL-1β(245.09±12.65pg/mL)、IL-6(180.14±8.42pg/mL)、TNF-α(160.04±11.36pg/mL)，这些炎症因子水平明显低于其他组分。因此，E-1-V具有最强的抗炎活性，最后收集E-1-V并冷冻干燥以供进一步分析。

采用Acquity(Waters Inc.)高效液相色谱系统，利用反相BEH C18色谱柱(即反相高效液相色谱质谱联用LC-MS/MS)对E-1-V进行结构鉴定(图5的B-C)，经分析得到一个目标肽(图5的A)，其氨基酸序列为IIe-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg(IVYPWTQR)。

3、抗炎活性鉴定

(1)由生物合成公司采用固相合成IVYPWTQR，对该肽体外验证其在LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎活性。

体外模拟：NaCl：胃蛋白酶为1：1.6，溶于800mL超纯水中，用6mmol/L HCl调节溶液的pH至3.0后，用超纯水将溶液体积补充至1L，以此溶液模拟胃液。将0.68g磷酸二氢钾溶于70mL超纯水中，加入7.7mL 0.2mol/L NaOH溶液充分混合，加入1g胰蛋白酶和6g胆盐，用0.2mol/L NaOH溶液调节pH至7.6后，将溶液体积补充至1L，以此溶液作为模拟肠液。设置对照组和实验组，对照组为LPS，试验组为LPS+IVYPWTQR、LPS+IVYPWTQR(pepsin)、LPS+IVYPWTQR(trypsin)。多肽液浓度设置为400μg/mL，pH调节至3.0。向溶液中加入5mL模拟胃液，37℃水浴2h，100℃加热10min终止模拟胃液消化，将混合液pH调节至7.2，加入5mL模拟肠液，37℃2h。消化液经4℃、8500g离心，脱盐冻干。

本发明研究了LPS和GBP对RAW264.7巨噬细胞的毒性，以便于确定LPS的半致死浓度和GBP的浓度。随着LPS处理浓度的增加，RAW264.7巨噬细胞的活力显著低于空白组(图1的A)，并确定了LPS半致死浓度为1.0μg/mL。添加GBP后，RAW264.7巨噬细胞的活力没有显著降低，证明GBP没有毒性作用(图1的B)。LPS+GBP组RAW264.7巨噬细胞活力显著增加，炎症因子水平显著降低，确定GBP可以改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症(图1的C-F)。

本发明的预防非病毒性肝炎的活性肽能够有效改善LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症。并且膳食补充GBP(鹅血肽)可以预防或减轻LPS诱导的炎症，这提供了一种膳食干预策略来预防肝细胞炎症。

(2)胃蛋白酶-胰蛋白酶模拟GI(胃肠道)消化对IVYPWTQR稳定性的影响

胃肠道消化是影响生物活性肽结构和功能的主要因素。在体外模拟了胃肠道消化模型以探究IVYPWTQR在胃肠道消化过程中的稳定性。设置对照组和实验组(LPS、LPS+IVYPWTQR、LPS+IVYPWTQR(pepsin)、LPS+IVYPWTQR(trypsin))，检测IL-Iβ、IL-6及TNF-α的释放水平。

如图6的A-C，在试验组LPS+IVYPWTQR(pepsin)中，IL-Iβ、IL-6及TNF-α这些炎症因子的水平相比试验组LPS+IVYPWTQR中的IL-Iβ、IL-6、TNF-α的水平略有增加，但是仍显著低于LPS试验组中IL-Iβ、IL-6、TNF-α的水平。试验组LPS+IVYPWTQR(trypsin)中IL-Iβ(336.33±12.58pg/mL)、IL-6(232.34±9.56pg/mL)、TNF-α(197.44±13.01pg/mL)的水平相较于试验组LPS+IVYPWTQR(pepsin)中炎症因子的水平没有显著增加，这表明IVYPWTQR具有较强的抵抗胰蛋白酶消化的能力。

如图7-图10，IVYPWTQR在胃蛋白酶处理后部分被分解成更小的片段，包括IVYP(16.85％)、WTQR(16.74％)，表明胃蛋白酶可以特异性切割肽段中色氨酸残基的N端肽键。大部分的肽段并未被水解，并显示出很强的抗炎活性。这些结果表明IVYPWTQR具有较强的稳定性和抗GI消化的能力。

(3)上述结果可知，IVYPWTQR可以改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症。LPS通常被认为是关键激活剂，会被细胞膜上的受体蛋白(TLR4)和辅助受体(CD14和MD-2)特异性识别，随后IKB激酶(IKK)磷酸化过程加速以激活NF-KB信号转导通路，进而产生过量的炎症因子。炎症因子TNF-α作为炎症的关键促炎介质，可激活iNOS信号转导通路以加剧炎症。利用Western blot检测相关蛋白的表达情况。

如图11的A-B，与对照组相比，经过LPS处理的TLR4、CD14、MD-2、NF-KB、p-NF-KB、IKKβ蛋白表达水平显著提高，而经过IVYPWTQR处理后上述蛋白的表达水平显著降低。与对照组相比，LPS处理后iNOS蛋白表达水平显著提高，NO水平提高，而经过IVYPWTQR处理后，其水平显著下降，这些结果表明IVYPWTQR可以通过下调TLR4/NF-kB/iNOS通路减少NO、IL-Iβ、IL-6及TNF-α的产生从而改善LPS诱导的炎症反应(图11的C-E)。

(4)上述结果表明IVYPWTQR改善LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞氧化应激。LPS介导的炎症使巨噬细胞产生过量的活性氧化物(ROS)，通过氧化应激加速免疫功能障碍。Keap-1/NrF2/HO-1介导的通路被认为是激活和调节SOD和GSH-Px参与抗氧化防御的关键因素。利用试剂盒检测活性氧化物(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽氧化酶(GSH-Px)的水平。

与对照组相比，经过LPS处理后，ROS水平(61.96±2.27U/mg prot)显著增加，SOD((24.43±1.41U/mg prot)和GSH-Px(44.63±2.72U/mg prot)水平下降。而经过IVYPWTQR处理后，ROS水平(36.32±3.69U/mg prot)显著降低，并增加了SOD(38.68±1.68U/mgprot)和GSH-Px(79.14±3.41U/mg prot)的水平(图12的A-C)。上述结果表明，IVYPWTQR可以通过改善氧化应激抑制ROS的产生。

如图12的D，LPS处理显著降低Keap-1、NrF2、HO-1的表达，但是经过IVYPWTQR处理后，Keap-1、NrF2、HO-1的表达水平显著提高，表明IVYPWTQR可以通过上调Keap-1/NrF2/HO-1的信号通路，增强细胞的抗氧化防御，减少ROS的积累并改善LPS介导的炎症反应。

二、脂质的制备

(1)将家禽油脂部分进行收集，在120℃条件下精炼提取20分钟，过滤，弃去油渣，然后按比例加入棕榈酸酯和硬脂酸酯(家禽油脂：棕榈酸酯：硬脂酸酯＝80:13:7)，制备脂质，备用；

(2)乳化均质，取40％步骤(1)中制备的脂质，以及实施例1中制备的60％的粗肽，6％的聚甘油蓖麻醇酸酯，以25000rpm转数进行高速剪切，使乳液分散成纳米颗粒，形成一个油包水(W/O)的乳液体系，备用；

(3)辅料的制备：将山梨糖醇、维生素C、水果香精、果糖、乳糖、卡拉胶，进行混合搅拌，上述辅料包括以下重量份的组分：水果香精0.1份、果糖1份、卡拉胶0.3份、山梨糖醇0.5份、维生素C 0.5份、乳糖1份；

(4)取步骤(2)中乳液和步骤(3)中辅料按照质量比60：40混合，搅拌均匀，置于药物剂型制备设备或者模具中，制备成颗粒状或者粉状冲剂、片剂、软糖等(以软糖为例，混合搅拌均匀后，置于模具中冷却成型制备成软糖))。

实施例2一种预防非病毒性肝炎的组合物的制备方法，包括以下步骤：

一、活性肽的制备与分离鉴定

1、粗肽的提取

将家禽血液进行收集，冻干成粉。取100g血粉溶于2000mL PBS(pH 7.2),在37℃条件下，用胃蛋白酶进行酶解4小时(血粉：胃蛋白酶＝400：1W/W)，然后在21000rpm/min均质4次，每次50s。14000g离心30min，取上清液，通过分子量为3kDa的滤膜进行超滤，取滤过液，冻干，即为粗肽备用。

利用粗肽分离得到活性肽，其活性肽的分离与鉴定方法同实施例1。采用固相合成法合成IVYPWTQR，采用同实施例1中“3、抗炎活性鉴定”的方法体外验证其在LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎活性，获取了同实施例1相同的结果。

二、脂质的制备

(1)将家禽油脂部分进行收集，在140℃条件下精炼提取30分钟，过滤，弃去油渣，然后按比例加入棕榈酸酯和硬脂酸酯(家禽油脂：棕榈酸酯：硬脂酸酯＝81：12：7)，制备脂质，备用；

(2)乳化均质：取50％步骤(1)中制备的脂质，50％实施例1中提取的粗肽，7％的聚甘油蓖麻醇酸酯，以28000rpm转数进行高速剪切，使乳液分散成纳米颗粒，形成一个油包水(W/O)的乳液体系，备用；

(3)辅料的制备：将淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、乳糖进行混合搅拌，上述辅料包括以下重量份的组分：淀粉0.6份、麦芽糊精2份、微晶纤维素0.8份、乳糖1份；

(4)取(2)中乳液和(3)中的辅料，按照质量比70:30混合，搅拌均匀，置于药物剂型制备设备或者模具中，制备成颗粒状或者粉状冲剂、片剂、软糖等(以颗粒状冲剂为例，采用60％的乙醇为润湿剂，混合搅拌均匀后，先挥发水分至手握能成团、按之即散的程度，制成软材，然后软材压过适宜的筛网即成颗粒)。

实施例3一种预防非病毒性肝炎的组合物的制备方法，包括以下步骤：

一、活性肽的提取与分离鉴定

1、粗肽的提取

将家禽血液进行收集，冻干成粉。取100g血粉溶于2000mL PBS(pH 7.2),在37℃条件下，用胃蛋白酶进行酶解4小时(血粉：胃蛋白酶＝400：1W/W)，然后在22000rpm/min均质3次，每次60s。15000g离心30min，取上清液，通过分子量为3kDa的滤膜进行超滤，取滤过液，冻干，即为粗肽备用。

利用粗肽分离得到活性肽，其活性肽的分离与鉴定方法同实施例1。采用固相合成法合成IVYPWTQR，采用同实施例1中“3、抗炎活性鉴定”的方法体外验证其在LPS(脂多糖)诱导的RAW264.7巨噬细胞中的抗炎活性，获取了同实施例1相同的结果。

2、脂质的制备：

(1)将家禽油脂部分进行收集，在150℃条件下精炼提取20分钟，过滤，弃去油渣，然后按比例加入棕榈酸酯和硬脂酸酯(家禽油脂：棕榈酸酯：硬脂酸酯＝82：11：7)，制备脂质，备用；

(2)乳化均质：取60％(1)中所述的脂质，40％实施例1中提取的粗肽，8％的聚甘油蓖麻醇酸酯，以30000rpm转数进行高速剪切，使乳液分散成纳米颗粒，形成一个油包水(W/O)的乳液体系，备用；

(3)辅料的制备：将淀粉、麦芽糊精、微晶纤维素、乳糖，进行混合搅拌，上述辅料包括以下重量份的组分：淀粉0.8份、麦芽糊精3份、微晶纤维素1份、乳糖1.2份；

(4)取(2)中乳液和(3)中辅料，按照重量比80:20混合，搅拌均匀，置于药物剂型制备设备或者模具中，制备成颗粒状或者粉状冲剂、片剂、软糖等(以片剂为例，同制备颗粒状冲剂的方法，不同在于选择的筛网网孔大小不同)。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种预防非病毒性肝炎的组合物，其特征在于，所述组合物包括粗肽，所述粗肽氨基酸序列为IIe-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括脂质和辅料，所述粗肽和所述脂质形成油包水的乳化体系，所述乳化体系和所述辅料混合形成所述组合物。

3.如权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述粗肽源自于家禽血液，所述脂质包括家禽油脂。

4.一种如权利要求1-3所述的组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)粗肽的提取

将源于家禽血液的血粉酶解后，离心、超滤，得到粗肽提取物；

所得粗肽提取物依次经过尺寸排阻色谱法、离子交换色谱以及反相高效液相色谱分离，获取粗肽；

(2)脂质的制备

收集家禽油脂，在高温条件下精炼提取，过滤弃油渣后，与棕榈酸酯和硬脂酸酯混合，制成脂质；

(3)乳化均质

将步骤(1)制备的粗肽、步骤(2)制备的脂质，以及聚甘油蓖麻醇酸酯混合，高速剪切，形成油包水的乳液体系；

(4)将步骤(3)制备的乳液体系和辅料，混合搅拌均匀，得到预防非病毒性肝炎的组合物。

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，酶解条件为：所述血粉和胃蛋白酶按照质量比400:1混合，在37℃条件下酶解4小时。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，精炼提取条件为：120-150℃条件下精炼提取20-40分钟；

所述家禽油脂、棕榈酸酯和硬脂酸酯的质量比为(80-82):(11-13):7。

7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述粗肽、脂质和聚甘油蓖麻醇酸酯的质量比为(40-60):(40-60):(6-8)；

高速剪切条件为：以25000-30000rpm/min转速高速剪切，使乳液分散成纳米颗粒。

8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述乳化体系和所述辅料的质量比为(60-80):(20-40)。

9.如权利要求1所述的组合物在制备预防非病毒性肝炎药物中的应用。

10.一种食品或者药物，其特征在于，包括权利要求1所述的组合物。

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