CN115720893A - 一种甲状旁腺体外保存液和保存方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种甲状旁腺专用体外保存液，它是含有如下成分的水溶液：Ferrostatin‑1 50～70nM、Necrostatin‑1 5～15μM、K+ 5～25mM、Na+ 90～110mM、Mg2+ 10～20mM、Cl‑ 40～50mM、Ca2+ 0.2～0.5mM、组氨酸20～40mM、甘露醇50～70mM、谷氨酸盐10～30mM、乳糖醛酸盐70～90mM、还原型谷胱甘肽1～5mM。本发明保存液可有效减轻外界环境及甲状旁腺自身氧化损伤所致的损害，有利于保持甲状旁腺移植物功能，其保存效果优于UW液、HTK溶液、生理盐水的保存作用，甚至优于模拟移植后环境的肌肉保存的效果，作为临床应用的甲状旁腺自体移植术中临时保存液，提高移植成功率，具有巨大潜力和价值。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种甲状旁腺体外保存液和保存方法。
背景技术
甲状旁腺功能减退(Hypoparathyroidism，HP)是甲状腺术后最常见的并发症之一。误切、机械损伤、热损伤及血供损伤均是导致HP的原因。文献报道暂时性甲状旁腺功能减退(Temporary hypoparathyroidism，HP)和永久性甲状旁腺功能减退(Permanenthypoparathyroidism，PHP)发生率差异较大，分别介于10％～61％之间和1％～32％之间。THP仅表现为短时间内的低钙血症，常无临床症状，一般不会对机体造成太大的影响。而PHP患者常表现为口周或四肢麻木，严重时喉痉挛、全身抽搐导致呼吸困难危及生命，往往需要长期口服钙片或静脉补钙，对患者带来沉重的负担。
对于误切或血供损伤不能原位保留的甲状旁腺，自体移植为保存甲状旁腺功能提供了重要手段。Lahey是首位提出在人体甲状腺切除术中行甲状旁腺自体移植(Parathyroid autotransplantation，PA)，被认为是PA手术的开创者(Lahey F,Thetransplantation of parathyroids in partial thyroidectomy[J].Surg GynecolObstet,1926,62(13)：508-509)。后来Alveryd提出离体后的甲状旁腺整个腺体再植于肌肉组织当中仍能继续发挥作用(Alveryd A,Parathyroid glands in thyroidsurgery.I.Anatomy of parathyroid glands.II.Postoperative hypoparathyroidism--identification and autotransplantation of parathyroid glands[J].Actachirurgica Scandinavica,1968,389,1-120.)。Wells等更是提出了可将甲状旁腺分成小的组织碎片种植于前臂，增大甲状旁腺与肌肉组织接触面积的同时又便于血液检测功能(Wells S,Ellis G,Gunnells J,et al.,Parathyroid autotransplantation in primaryparathyroid hyperplasia[J].The New England journal of medicine,1976,295,p:57-62；Wells S,Gunnells J,Shelburne J,et al.,Transplantation of the parathyroidglands in man:clinical indications and results[J].Surgery,1975,78,p:34-44.)。PA发展至今，在临床上已经广泛应用，但是关于PA的时机、数目、部位、方法以及移植存活率上仍存在一些争议。
在自体移植过程中，甲状旁腺从机体取出，再到种植回机体肌肉组织的过程中，存在一个体外临时保存的过程。长期以来，对该离体甲状旁腺的临时保存多采用室温生理盐水的纱布包裹保存半小时至数小时的方式。尽管该方法简单、易于操作，但甲状旁腺的临时保存作为自体移植中的一个重要环节，可能会对移植成功率造成重要的影响。
目前已有部分研究进行了对甲状旁腺体外临时保存条件的探索，例如苏艳军等人对临时保存甲状旁腺的生理盐水的温度条件和时间进行了研究，证实4℃的生理盐水保存，并在30min内完成移植，能够最大程度维持细胞活性，提高自体移植的成活率(苏艳军,刘彬,刁畅,等.甲状腺术中甲状旁腺体外保存后自体移植对其功能影响的研究[J].重庆医学,2017,46(8):1032-1035.)。又如吴英俊研究发现，采用4℃的DMEM细胞培养液作为临时保存液，比4℃的生理盐水保存能够更有利于保持甲状旁腺细胞活性，提高移植成活率(吴英俊.术中甲状旁腺体外临时保存的细胞活性影响因素研究[D].浙江:浙江大学,2015.)。
然而，直至目前，对于离体甲状旁腺的保存液和保存条件的研究依然较少，仍需要进一步深入探索。
发明内容
本发明的目的在于提供一种离体甲状旁腺专用体外保存液和保存方法。本发明提供一种甲状旁腺专用体外保存液，它是含有如下成分的水溶液：
Ferrostatin-1 50～70nM、Necrostatin-1 5～15μM、K+5～25mM、Na+90～110mM、Mg2+10～20mM、Cl-40～50mM、Ca2+0.2～0.5mM、组氨酸20～40mM、甘露醇50～70mM、谷氨酸盐10～30mM、乳糖醛酸盐70～90mM、还原型谷胱甘肽1～5mM。
进一步地，它是含有如下成分的水溶液：Ferrostatin-1 60nM、Necrostatin-110μM、K+15mM、Na+100mM、Mg2+13mM、Cl-41.5mM、Ca2+0.26mM、组氨酸30mM、甘露醇60mM、谷氨酸盐20mM、乳糖醛酸盐80mM、还原型谷胱甘肽3mM。
进一步地，上述保存液的pH为7.3～7.8，渗透压为320±5mOsmol/L，优选的，pH为7.3，渗透压为320mOsmol/L。
进一步地，上述保存液还含有pH调节剂和/或渗透压调节剂；优选地，所述pH调节剂为酸或碱，所述渗透压调节剂为氯化钠。
本发明还提供一种甲状旁腺的体外保存方法，包括将离体的甲状旁腺放入上述的甲状旁腺体外保存液中保存的步骤。进一步地，上述保存的温度为4℃。更进一步地，上述保存时的时间不超过120min，优选为不超过30min。
本发明的有益效果：本发明提供的甲状旁腺专用体外保存液，可有效减轻外界环境及甲状旁腺自身氧化损伤所致的损害，有利于保持甲状旁腺移植物功能，其保存效果优于UW液(目前临床广泛使用的器官移植保护供体器官的保存液)、HTK溶液(适用于心脏停搏，心肌保护，以及作为肝、肾等离体器官功能保护的器官保存液)、生理盐水的保存作用，甚至优于模拟移植后环境的肌肉保存的效果，作为临床应用的甲状旁腺自体移植术中临时保存液，提高移植成功率，具有巨大潜力和价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为正常甲状旁腺病理切片HE染色结果。
图2为在不同温度和时间下甲状旁腺专用保存液组的病理切片HE染色结果(40x)。
图3为在不同温度和时间下甲状旁腺专用保存液组的病理切片HE染色结果(400x)。
图4为在不同温度和时间下UW液组的病理切片HE染色结果(40x)。
图5为在不同温度和时间下UW液组的病理切片HE染色结果(400x)。
图6为在不同温度和时间下HTK溶液组的病理切片HE染色结果(40x)。
图7为在不同温度和时间下HTK溶液组的病理切片HE染色结果(400x)。
图8为在不同温度和时间下生理盐水组的病理切片HE染色结果(40x)。
图9为在不同温度和时间下生理盐水组的病理切片HE染色结果(400x)。
图10为在不同温度和时间下肌肉保存组的病理切片HE染色结果(40x)。
图11为在不同温度和时间下肌肉保存组的病理切片HE染色结果(400x)。
图12为在不同温度和时间下空白对照组的病理切片HE染色结果(40x)。
图13为在不同温度和时间下空白对照组的病理切片HE染色结果(400x)。
图14为经保存液保存30min后甲状旁腺自体移植术后的病理切片HE染色结果(40x)。
图15为经保存液保存30min后甲状旁腺自体移植术后的病理切片HE染色结果(400x)。
图16为正常甲状旁腺透射电子显微镜结果。
图17为在不同温度和时间下甲状旁腺专用保存液组的透射电子显微镜结果(x1.5K)。
图18为在不同温度和时间下甲状旁腺专用保存液组的透射电子显微镜结果(x8.0K)。
图19为在不同温度和时间下UW液组的透射电子显微镜结果(x1.5K)。
图20为在不同温度和时间下UW液组的透射电子显微镜结果(x8.0K)。
图21为在不同温度和时间下HTK溶液组的透射电子显微镜结果(x1.5K)。
图22为在不同温度和时间下HTK溶液组的透射电子显微镜结果(x8.0K)。
图23为在不同温度和时间下生理盐水组的透射电子显微镜结果(x1.5K)。
图24为在不同温度和时间下生理盐水组的透射电子显微镜结果(x8.0K)。
图25为在不同温度和时间下肌肉保存组的透射电子显微镜结果(x1.5K)。
图26为在不同温度和时间下肌肉保存组的透射电子显微镜结果(x8.0K)。
图27为在不同温度和时间下空白对照组的透射电子显微镜结果(x1.5K)。
图28为在不同温度和时间下空白对照组的透射电子显微镜结果(x8.0K)。
具体实施方式
本发明实验所用家兔(甲状旁腺专用保存液在术中对离体甲状旁腺的保护作用：36只家兔，每组6只；甲状旁腺专用保存液对术后甲状旁腺功能恢复的作用：18只家兔，每组3只)，2000g～3000g，雌雄不限，购于成都市武侯区华西试验动物服务站。
除另有说明外，本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
实施例1、本发明甲状旁腺专用离体保存液和保存方法
保存液组成如表1所示。
表1
| 成分 | 含量 |
| Ferrostatin-1(Fer-1) | 60nM |
| Necrostatin-1 | 10uM |
| K<sup>+</sup> | 15mmol/L |
| Na<sup>+</sup> | 100mmol/L |
| Mg<sup>2+</sup> | 13mmol/L |
| Cl- | 41.5mmol/L |
| Ca<sup>2+</sup> | 0.26mmol/L |
| 组氨酸 | 30mmol/L |
| 甘露醇 | 60mmol/L |
| 谷氨酸盐 | 20mmol/L |
| 乳糖醛酸盐 | 80mmol/L |
| 还原型谷胱甘肽 | 3mmol/L |
注：PH 7.3；渗透压320mOsmol/kg H2O
保存方法：
家兔甲状旁腺离体后迅速将甲状旁腺置于上述保存液中存4℃保存15min、30min、60min、90min或120min。
对比例1、室温保存
使用实施例1所述的保存液，家兔甲状旁腺离体后迅速将甲状旁腺置于实施例1所述的保存液中，室温保存30min。
对比例2、UW液
UW液组成如表2所示。
表2
注：PH 7.4±0.1；渗透压316±3mOsmol/kg H2O
保存方法：
家兔甲状旁腺离体后迅速将甲状旁腺置于UW液中，4℃保存15min、30min、60min、90min或120min，或室温保存30min。
对比例3、HTK溶液
HTK溶液组成如表3所示。
表3
| 成分 | 含量 |
| NaCl | 15mmol/L |
| KCl | 10mmol/L |
| MgCl<sub>2</sub> | 4mmol/L |
| 色氨酸 | 2mmol/L |
| α-酮戊二酸 | 1mmol/L |
| 组氨酸 | 180mmol/L |
| 组氨酸盐 | 18mmol/L |
| 甘露醇 | 30mmol/L |
注：PH 7.3；渗透压310～320mOsmol/kg H2O
保存方法：
家兔甲状旁腺离体后迅速将甲状旁腺置于HTK溶液中，4℃保存15min、30min、60min、90min或120min，或室温保存30min。
对比例4、生理盐水
组成：0.9％的氯化钠水溶液。
保存方法：
家兔甲状旁腺离体后迅速将甲状旁腺置于生理盐水中，4℃保存15min、30min、60min、90min或120min，或室温保存30min。
对比例5、肌肉保存
家兔甲状旁腺离体后包埋于家兔颈部肌肉中，(家兔体温)保存15min、30min、60min、90min或120min。
对比例6、空白对照
家兔甲状旁腺离体后置于空气中不做处理。
以下通过实验例证明本发明的有益效果。
实验例1、
1、实验方法
1.1甲状旁腺自体移植术
(1)离体甲状旁腺
经过称重、麻醉、消毒、铺巾，离体单侧上位甲状旁腺。
(2)体外保存甲状旁腺
将离体的甲状旁腺分别按照实施例1、对比例1～6的各项条件进行保存。
(3)肌肉“口袋”包埋
用镊子使带状肌间隙游离开，形成一个小“口袋”，将经过不同保存液处理30min的甲状旁腺分别进行包埋移植。
(4)缝合标记移植点
用4-0丝线缝合小“口袋”。
(5)逐层关闭切口
用1-0丝线逐层缝合气管前肌肉、皮下、皮肤。
(6)消毒切口
再次消毒缝合后的切口。
(7)抗生素抗感染
用庆大霉素点滴于切口上及皮下，进行预防性抗感染。
(8)无菌纱布覆盖伤口
(9)家兔术后管理
术后每三天对家兔伤口进行换药，直至伤口愈合，并且每次换药时于伤口周围点滴庆大霉素，于术后1天、14天、30天行耳中央动脉采血。提取血浆，进行血清钙离子检测和甲状旁腺激素(PTH)检测。
1.2收集甲状旁腺样本
饲养家兔1月后，通过称重、备皮、麻醉、消毒、铺巾、切开陈旧性伤口，根据标记寻找移植的甲状旁腺，并将之游离，将取材标本分别置于组织固定液和3％戊二醛固定液中固定保存。后进行甲状旁腺石蜡切片、HE染色、透射电子显微镜检测。分组如下：
(1)A0组甲状旁腺专用保存液移植组(实施例1、对比例1)；
(2)B0组UW液移植组(对比例2)；
(3)C0组HTK溶液移植组(对比例3)；
(4)D0组生理盐水移植组(对比例4)；
(5)E0组空白对照移植组(对比例6)；
(6)F0组肌肉保存移植组(对比例5)。
2、实验结果
2.1甲状旁腺移植物术中保存后的病理结果
如图1，正常甲状旁腺成梭形，以主细胞为主，主细胞排列有序，细胞质、细胞核清晰可见，在HE染色下细胞质呈淡红色、细胞核呈深紫色，胞质丰富，细胞核大且圆，腺体外层可见纤维结缔组织及脂肪组成的被膜，腺体内部及被膜周围可见穿行小血管。
不同温度和时间下使用本发明实施例1的保存液保存的病理切片HE染色结果如图2、图3所示；不同温度和时间下使用本发明对比例1的UW液保存的病理切片HE染色结果如图4、图5所示；不同温度和时间下使用本发明对比例3的HTK溶液保存的病理切片HE染色结果如图6、图7所示；不同温度和时间下使用本发明对比例4的生理盐水保存的病理切片HE染色结果如图8、图9所示；不同温度和时间下对比例5的肌肉保存的病理切片HE染色结果如图10、图11所示；不同温度和时间下对比例6的空白组的病理切片HE染色结果如图12、图13所示。
结果对比如表4所示：
表4
从以上结果对比可以看出，使用本发明保存液进行保存，可以在相对更长(30min)的4℃保存条件下，保持甲状旁腺的细胞排列有序性、细胞膜完整性、维持细胞核形态，减轻细胞质水肿。其余对照组则在较短时间内就会出现细胞排列紊乱、细胞膜断裂、细胞质水肿和细胞核固缩的情况。体现出本发明保存液的优异保存效果。
2.2甲状旁腺经体外保存后再自体移植术后的病理结果
如表5和图14、图15所示：
表5
可见，使用本发明实施例1的甲状旁腺专用保存液保存后的甲状旁腺在进行自体移植后，仍表现出最好的组织形态。
2.3甲状旁腺移植物术中保存后的电镜结果
如图16所示，可见正常甲状旁腺的主细胞在电子显微镜下细胞质丰富，线粒体形态正常，可见嵴，粗面内质网和高尔基体形态正常，未发现溶酶体分泌。
不同温度和时间下使用本发明实施例1的保存液保存的病理切片HE染色结果如图17、图18所示；不同温度和时间下使用本发明对比例1的UW液保存的病理切片HE染色结果如图19、图20所示；不同温度和时间下使用本发明对比例3的HTK溶液保存的病理切片HE染色结果如图21、图22所示；不同温度和时间下使用本发明对比例4的生理盐水保存的病理切片HE染色结果如图23、图24所示；不同温度和时间下对比例5的肌肉保存的病理切片HE染色结果如图25、图26所示；不同温度和时间下对比例6的空白组的病理切片HE染色结果如图27、图28所示。
结果对比如表6所示：
表6
可见，使用本发明实施例1的甲状旁腺专用保存液保存的甲状旁腺，相比于其它保存液，可在较长的时间(30min)内维持丰富的细胞质，正常的线粒体形态，可见嵴，正常的粗面内质网和高尔基体形态，控制溶酶体分泌。
综上，本发明提供了一种甲状旁腺专用体外保存液，可有效减轻外界环境及甲状旁腺自身氧化损伤所致的损害，有利于保持甲状旁腺移植物功能，其保存效果优于UW液(目前临床广泛使用的器官移植保护供体器官的保存液)、HTK溶液(适用于心脏停搏，心肌保护，以及作为肝、肾等离体器官功能保护的器官保存液)、生理盐水的保存作用，甚至优于模拟移植后环境的肌肉保存的效果，作为临床应用的甲状旁腺自体移植术中临时保存液，提高移植成功率，具有巨大潜力和价值。
Claims (10)
1.一种甲状旁腺专用体外保存液，其特征在于，它是含有如下成分的水溶液：
Ferrostatin-1 50～70nM、Necrostatin-1 5～15μM、K+ 5～25mM、Na+ 90～110mM、Mg2+10～20mM、Cl- 40～50mM、Ca2+ 0.2～0.5mM、组氨酸20～40mM、甘露醇50～70mM、谷氨酸盐10～30mM、乳糖醛酸盐70～90mM、还原型谷胱甘肽1～5mM。
2.如权利要求1所述的保存液，其特征在于，它是含有如下成分的水溶液：
Ferrostatin-1 60nM、Necrostatin-1 10μM、K+ 15mM、Na+ 100mM、Mg2+13mM、Cl-41.5mM、Ca2+ 0.26mM、组氨酸30mM、甘露醇60mM、谷氨酸盐20mM、乳糖醛酸盐80mM、还原型谷胱甘肽3mM。
3.如权利要求1或2所述的保存液，其特征在于，它的pH为7.3～7.8，渗透压为320±5mOsmol/L。
4.如权利要求3所述的保存液，其特征在于，它的pH为7.3，渗透压为320mOsmol/L。
5.如权利要求3所述的保存液，其特征在于，它还含有pH调节剂和/或渗透压调节剂。
6.如权利要求5所述的保存液，其特征在于，所述pH调节剂为酸或碱，所述渗透压调节剂为氯化钠。
7.一种甲状旁腺的体外保存方法，其特征在于，包括将离体的甲状旁腺放入权利要求1～6任一项所述的甲状旁腺体外保存液中保存的步骤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述保存的温度为4℃。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述保存时的时间不超过120min。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述保存时的时间不超过30min。
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