CN115717159A - 从dha鸡蛋中提取磷脂型dha及副产物的深加工方法 - Google Patents

Abstract

一种从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，包括下述步骤：（1）提取磷脂型DHA：将DHA鸡蛋的蛋黄、蛋清分离；然后将蛋黄加入到乙醇中搅匀；提取蛋黄中的磷脂型DHA；（2）提取蛋黄油；（3）制取蛋黄蛋白肽液；（4）制取卵黄高磷蛋白磷酸肽液；（5）制取白蛋白肽液。采用这种方法能够从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA并充分利用DHA鸡蛋中的其他营养成分。

Description

从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法

技术领域

本发明涉及油脂加工技术领域，具体涉及一种从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法。

背景技术

当磷脂成分中的R1或R2脂酰基含有DHA时被称为磷脂型DHA。研究表明，磷脂型DHA在拥有磷脂和DHA各自功能特性的基础上具有多种生物学活性。磷脂型DHA具有增强DHA的抗氧化性，易于DHA储存；有利于DHA吸收；细胞膜透性增强；增强生物体抗逆性；抗炎作用等优势和功能。DHA和磷脂都是大脑和神经系统的重要组成成分和营养成分，都能促进大脑和神经系统的正常发育，保障神经系统的正常功能。在对冠心病、炎症、自身免疫病、糖尿病和阿尔茨海默氏综合症等疾病的预防和治疗，以及促进婴幼儿大脑和视觉发育等生理功能方面，都具有明显优势，在食品、营养、医药和保健品等领域具有重要的营养价值和广阔的应用前景。

目前获得磷脂型DHA的方法主要有天然提取法、化学合成法、微生物发酵法及酶法。天然的磷脂型DHA主要来自于海洋磷虾、深海鱼籽等海洋资源，通过有机萃取、柱层析、复合盐沉淀、超临界萃取、膜分离等方法进行分离生产。天然来源的磷脂型DHA面临着原材料枯竭、不利于可持续发展的问题，原料来源易波动且易受重金属污染，磷脂型DHA含量低，纯化成本高。通过化学催化剂催化制备磷脂型DHA，反应剧烈，副产物多，产物存在安全隐患，仍需进一步开发出条件温和、毒性低且催化效果好的化学催化剂体系。酶法生产提纯难度大，得率低，成本高，且技术要求高。

申请公布号CN112010892A的中国发明申请说明书公开了一种富含DHA蛋黄卵磷脂的提取方法，包括以下步骤： (1)分离蛋清、蛋壳和蛋黄，获得蛋清蛋白和蛋壳钙源功能材料，以及蛋黄鲜液。往蛋黄液中加入蛋白酶，酶解蛋黄蛋白，分离富含DHA卵磷脂，灭酶处理后，离心、冷冻干燥，制成酶酶解蛋黄粉，备用。(2)采用超临界CO2萃取酶解蛋黄粉，得到蛋黄油脂和脱脂蛋黄粉，分离出蛋黄油脂。 (3)添加食品级乙醇作夹带剂，继续超临界CO2萃取脱脂后的蛋黄粉，得到富含DHA蛋黄卵磷脂。该提取方法从鸡蛋中分离富含DHA卵磷脂，但对鸡蛋其他营养成分没有进行深加工，没能充分利用鸡蛋各种营养成分。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，采用这种方法能够从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA并充分利用DHA鸡蛋中的其他营养成分。采用的技术方案如下：

一种从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）磷脂型DHA提取

将DHA鸡蛋的蛋黄、蛋清分离；

然后将蛋黄加入到乙醇中搅匀；

接着常温搅拌下提取1-4小时（优选2小时）后抽滤，收集过滤液A，抽滤获得的滤渣A加入乙醇后再次常温搅拌下提取1-4小时（优选2小时），然后抽滤并收集过滤液A；提取、抽滤、收集过滤液A的过程进行2-4次；

合并各次收集的过滤液A，然后蒸发掉乙醇和水分，得到磷脂型DHA；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣B，备用；

（2）蛋黄油提取

将步骤（1）得到的滤渣B与正己烷混合，常温搅拌下提取1-4小时（优选2小时）后抽滤，收集过滤液B，抽滤获得的滤渣B加入正己烷后再次常温搅拌下提取1-4小时（优选2小时），抽滤并收集过滤液B；提取、抽滤、收集过滤液B的过程进行2-4次；

合并各次收集的过滤液B，然后蒸发掉正己烷，得到蛋黄油；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣C，备用；

（3）制取蛋黄蛋白肽液

向步骤（2）得到的滤渣C加入纯化水，得到滤渣C质量百分比浓度为8-20%（优选10%）的料液A；然后向料液A中加入酸性蛋白酶，酸性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的1-3%wt，并用盐酸调节料液的pH值为3-5，在温度45-55℃下酶解2-4小时；再调节料液A的pH值为7-9，向料液A中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的1-3%，在温度45-55℃下酶解2-4小时，得到酶解液A；然后将酶解液A升温至80-85℃灭酶20-30min；

灭酶完成后将酶解液A的pH值调节至3.8-4.5（优选pH值调节至4），静置10-30min后用离心机离心，液相为蛋黄蛋白肽液，固相为卵黄高磷蛋白；

（4）制取卵黄高磷蛋白磷酸肽液

将步骤（3）获得的固相卵黄高磷蛋白与氢氧化钠溶液混合，然后调节其混合液的pH值为6.5-7.5（优选pH值调节至7），然后过滤（优选板框压滤），滤渣即为脱磷卵黄高磷蛋白；

向脱磷卵黄高磷蛋白中加入纯化水，得到脱磷卵黄高磷蛋白质量百分比浓度为10-15%的料液B；然后向料液B中加入复合酶A，复合酶A的添加量为脱磷卵黄高磷蛋白干重的1-3%；然后调节料液的pH 值为7-9（优选pH值调节至8），在温度55-60℃下酶解4-8小时，得到酶解液B；然后将酶解液B升温至80-85℃灭酶20-30min；

酶解液B灭酶完成后用离心机离心，所得液相为卵黄高磷蛋白磷酸肽液；

（5）制取白蛋白肽液

向步骤（1）得到的蛋清中加入0.5-1倍质量的纯化水，混合后得到蛋清液；然后向蛋清液中加入复合酶B，复合酶B的添加量为蛋清干重的2-4%；再调节蛋清液的pH 值为7-9，在温度55-60℃下酶解4-8小时，得到酶解液C；然后将酶解液C升温至80-85℃灭酶20-30min；

酶解液C灭酶完成后用离心机离心，所得液相为白蛋白肽液。

通过以上方法，能够提取DHA鸡蛋中所含的磷脂型DHA，并利用蛋黄其他成分和蛋白，深加工获得蛋黄油、蛋黄蛋白肽、卵黄高磷蛋白磷酸肽液和白蛋白肽液。

优选步骤（1）中，蛋黄与乙醇的质量比例为1:5-8。优选步骤（1）中，每次对滤渣A进行提取时，滤渣A与乙醇的质量比例为1:5-8。优选步骤（1）中，采用薄膜蒸发器蒸发掉乙醇和水分。

优选步骤（2）中，每次对滤渣B进行提取时，滤渣B与正己烷的质量比例为1:5-8。优选步骤（2）中，采用薄膜蒸发器蒸发掉正己烷。

优选步骤（3）中，酸性性蛋白酶的活力单位为5-20万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为30-80万U/g。

优选步骤（3）中，酶解液A用碟式离心机离心。碟式离心机转速为4500-8500rpm。

优选步骤（4）中，氢氧化钠溶液的质量是卵黄高磷蛋白的3-6倍（优选5倍），氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为0.3-0.6%；向卵黄高磷蛋白加入氢氧化钠溶液后，在40-60℃（优选50℃）下搅拌2-6小时（优选3小时）后用盐酸调节其混合液的pH值为6.5-7.5（优选pH值调节至7）。

优选步骤（4）中，酶解液B用碟式离心机离心。碟式离心机转速为4500-8500rpm。

优选步骤（4）中，复合酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶的组合。更优选复合酶A中碱性蛋白酶与中性蛋白酶的质量比例为3:1-1:2（优选1:1）。更优选中性蛋白酶的活力单位为20-40万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为30-80万U/g。

优选步骤（5）中，酶解液C用碟式离心机离心。碟式离心机转速为4500-8500rpm。

优选步骤（5）中复合酶B为碱性蛋白酶和风味蛋白酶的组合。更优选复合酶B中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比例为6:1-2:1（优选3:1）。更优选风味蛋白酶的活力单位为2-5万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为30-80万U/g。

优选方案中，向步骤（4）制取的卵黄高磷蛋白磷酸肽液中加入CaCl₂，CaCl₂ 的添加量为卵黄高磷蛋白磷酸肽液干重的0.6-1.5%，调节pH 值为5.5-5.6；然后加入乙醇并搅拌均匀，乙醇的体积为卵黄高磷蛋白磷酸肽液体积的50-80%，在温度2-6℃下沉淀6-12小时，过滤（优选板框过滤）后获得的滤渣即为卵黄高磷蛋白磷酸肽，然后采用流化床在50-70℃温度下烘干2-4小时。

优选方案中，步骤（3）制取的蛋黄蛋白肽液和步骤（5）制取的白蛋白肽液分别进行纳滤，去除部分盐离子和水分，分别得到蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液；蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液分别均质、灭菌处理后喷雾干燥，分别得到蛋黄蛋白肽粉、白蛋白肽粉。优选上述纳滤使用的纳滤膜孔径为150-300Da，压力为1.5-3.5Mpa，截留液即为蛋黄蛋白肽浓缩液或白蛋白肽浓缩液。优选上述均质处理的压力为20-40MPa，均质1-3次，每次均质20-30min。均质处理后在85-90℃下灭菌20-30min。优选采用压力喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾压力为10-20MPa，进料温度 45-65℃，进风温度为170-180℃，出风温度为75-85℃，喷雾干燥所得粉为蛋黄蛋白肽粉或白蛋白肽粉。

DHA鸡蛋可采用现有技术获得，例如申请公布号CN113261628A的中国发明专利申请说明书“用于生产富含磷脂酰胆碱DHA鸡蛋的饲料添加剂及应用”、 申请公布号CN113974017 A的中国发明专利申请说明书“一种使鸡蛋中富集磷脂酰乙醇胺型DHA的饲料添加剂，其制备方法和应用”中采用喂鸡、下蛋的方法。

优选方案中，DHA鸡蛋采用下述方法获得：在蛋鸡饲料基料中添加1-3%DHA藻油，混合后造粒制成DHA饲料，按正常养殖饲喂下蛋蛋鸡，连续喂养7～10天后，就可获得稳定的DHA鸡蛋。我们通过多批养殖实验，在蛋鸡饲料基料添加1-3%DHA，混合后造粒制成DHA饲料喂鸡，连续喂养7～10天后，每颗鸡蛋中DHA的含量可稳定达到200毫克以上，并且90%以上的DHA在蛋黄卵磷脂中，是磷脂型DHA，因此通过对蛋鸡营养强化获得DHA型卵磷脂，是一种绿色安全天然，低成本的可行渠道。

鸡蛋的可食用部分可以分成蛋清和蛋黄两部分。蛋清中大约 87.5%是水分，10.5%是蛋白质，主要由卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵类黏蛋白、溶菌酶以及球蛋白等组成。本发明利用从DHA鸡蛋中分离出的蛋清，采用复合酶法酶解获得白蛋白肽，白蛋白肽具有较强的生物活性及多种生物学作用，其主要作用有抑制肿瘤细胞活性，防止细胞癌变恶化、增强人体免疫功能、增强人体综合机能、抗疲劳、对化学性肝损伤具有辅助保护作用等。而且白蛋白肽也可以作为转运载体，促进人体各个器官对钙、铁、锌等营养物质的吸收。另外,白蛋白肽可很好的参与人体内白蛋白的合成，有效改善低蛋白血症及调节人体。

蛋黄中50%左右是水分，固形物中主要含有40%的蛋白质以及60%的脂类。蛋黄中的蛋白质主要是低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、球蛋白以及卵黄高磷蛋白，脂类物质中主要是蛋黄油、卵磷脂以及胆固醇。本发明利用DHA鸡蛋蛋黄通过两次萃取法，第一次采用极性溶剂（乙醇）萃取得到磷脂型DHA，第二次通过非极性溶剂（正己烷）萃取蛋黄粉中的甘油三酯和胆固醇（蛋黄油）；剩余的脱脂蛋黄粉中主要含有低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、球蛋白以及卵黄高磷蛋白等蛋白类物质，通过两次酶解分别获得蛋黄蛋白肽和蛋黄磷酸肽。

两次脱脂获得的蛋黄蛋白采用两次酶解的方法，第一次酶解将除卵黄高磷蛋白外的其余蛋白蛋白水解成小分子蛋黄蛋白肽，然后调节pH值到卵黄高磷蛋白的等电点附近，使得未被酶解的卵黄高磷蛋白沉淀，澄清分离后澄清液为蛋黄蛋白肽，截留物为卵黄高磷蛋白，对其进行部分去磷酸化，暴露出卵黄高磷蛋白的蛋白酶作用位点，进而对部分去磷酸化的卵黄高磷蛋白进行第二次酶解，得到卵黄高磷蛋白磷酸肽液，通过乙醇钙法提纯蛋黄磷酸肽，最后通过干燥得到卵黄高磷蛋白磷酸肽。

卵黄高磷蛋白磷酸肽是卵黄高磷蛋白部分去磷酸化后水解制备的含有磷酸基团的短肽。卵黄高磷蛋白磷酸肽可以具有螯合钙、锌等金属离子，能有效提高人体钙、铁、锌等二价矿物质的摄入量以及吸收和利用率，还具有固齿、健齿、修复龈齿的作用。卵黄高磷蛋白磷酸肽与维生素D相比吸收率高，无毒副作用，更能提高其它锌、铁等二价矿物质的吸收率。卵黄高磷蛋白磷酸肽可以抑制矿物质在肠道中的沉淀，从而促进小肠下部不可饱和钙的被动扩散吸收，这种吸收不因年龄而变化。卵黄高磷蛋白磷酸肽还具有抗菌、抗炎、抗氧化、提高免疫力等一系列生理活性。

蛋黄蛋白肽是由蛋黄中的高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、球蛋白等蛋黄蛋白水解成的小分子肽段。蛋黄蛋白肽具有抗氧化、降血压、促进矿物质元素吸收、免疫调节等多种生理功能，可广泛地应用于食品、保健品和药品等相关领域。

本发明具有如下有益效果：

1、从DHA鸡蛋中提取纯化获得磷脂型DHA，进一步充分利用其他原材料，从蛋清中通过酶解、浓缩等工序（可进一步脱色、喷雾干燥）获得白蛋白肽，从蛋黄中提取磷脂型DHA和蛋黄油后剩下的蛋黄蛋白中，经两次酶解分别获得蛋黄蛋白肽和蛋黄磷酸肽。

2、利用DHA鸡蛋蛋黄通过两次萃取法，第一次采用极性溶剂（乙醇）萃取得到磷脂型DHA，第二次通过非极性溶剂（正己烷）萃取蛋黄粉中的甘油三酯和胆固醇（蛋黄油）。

3、卵黄高磷蛋白先部分脱磷，可大大提高卵黄高磷蛋白磷酸肽的得率，进一步通过乙醇钙沉淀法获得高纯度卵黄高磷蛋白磷酸肽。

具体实施方式

实施例1

本实施例中，从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法包括下述步骤：

（1）磷脂型DHA提取

DHA鸡蛋采用下述方法获得：在蛋鸡饲料基料中添加1.5%DHA藻油，混合后造粒制成DHA饲料，按正常养殖饲喂下蛋蛋鸡，连续喂养10天后，就可获得稳定的DHA鸡蛋（分别在第10天、第20天、第30天随机取10颗鸡蛋，分别检测DHA含量，其平均DHA含量分别为：223.2mg；227.5mg；220.8mg）；

将DHA鸡蛋的蛋黄、蛋清分离；

然后将蛋黄加入到乙醇中搅匀；

接着常温搅拌下提取2小时后抽滤，收集过滤液A，抽滤获得的滤渣A加入乙醇后再次常温搅拌下提取2小时，然后抽滤并收集过滤液A；提取、抽滤、收集过滤液A的过程进行2次；

合并各次收集的过滤液A，然后蒸发掉乙醇和水分（采用薄膜蒸发器蒸发掉乙醇和水分），得到磷脂型DHA（经检测磷脂含量为95.23%，DHA含量为20.38%）；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣B，备用；

本步骤（1）中，蛋黄与乙醇的质量比例为1:6；每次对滤渣A进行提取时，滤渣A与乙醇的质量比例为1:6；

（2）蛋黄油提取

将步骤（1）得到的滤渣B与正己烷混合，常温搅拌下提取2小时后抽滤，收集过滤液B，抽滤获得的滤渣B加入正己烷后再次常温搅拌下提取2小时，抽滤并收集过滤液B；提取、抽滤、收集过滤液B的过程进行3次；

合并各次收集的过滤液B，然后蒸发掉正己烷（采用薄膜蒸发器蒸发掉正己烷），得到蛋黄油；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣C，备用；

本步骤（2）中，每次对滤渣B进行提取时，滤渣B与正己烷的质量比例为1:6；

（3）制取蛋黄蛋白肽液

向步骤（2）得到的滤渣C加入纯化水，得到滤渣C质量百分比浓度为10%的料液A；然后向料液A中加入酸性蛋白酶（酸性性蛋白酶的活力单位为10万U/g），酸性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的2%wt，并用盐酸调节料液的pH值为3，在温度45℃下酶解3小时；再调节料液A的pH值为8，向料液A中加入碱性蛋白酶（碱性蛋白酶的活力单位为40万U/g），碱性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的2%，在温度45℃下酶解4小时，得到酶解液A；然后将酶解液A升温至85℃灭酶20min；

灭酶完成后将酶解液A的pH值调节至4，静置10min后用离心机离心（酶解液A用碟式离心机离心；碟式离心机转速为6500rpm），液相为蛋黄蛋白肽液，固相为卵黄高磷蛋白；

（4）制取卵黄高磷蛋白磷酸肽液

将步骤（3）获得的固相卵黄高磷蛋白与氢氧化钠溶液混合（氢氧化钠溶液的质量是卵黄高磷蛋白的5倍，氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为0.4%），然后调节其混合液的pH值为7（向卵黄高磷蛋白加入氢氧化钠溶液后，在50℃下搅拌3小时后用盐酸调节其混合液的pH值为7），然后过滤（采用板框压滤），滤渣即为脱磷卵黄高磷蛋白；

向脱磷卵黄高磷蛋白中加入纯化水，得到脱磷卵黄高磷蛋白质量百分比浓度为15%的料液B；然后向料液B中加入复合酶A（复合酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶的组合；复合酶A中碱性蛋白酶与中性蛋白酶的质量比例为1:1；中性蛋白酶的活力单位为40万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为60万U/g），复合酶A的添加量为脱磷卵黄高磷蛋白干重的3%；然后调节料液的pH 值为8，在温度55℃下酶解6小时，得到酶解液B；然后将酶解液B升温至85℃灭酶20min；

酶解液B灭酶完成后用离心机离心（酶解液B用碟式离心机离心；碟式离心机转速为6500rpm），所得液相为卵黄高磷蛋白磷酸肽液；

（5）制取白蛋白肽液

向步骤（1）得到的蛋清中加入0.5倍质量的纯化水，混合后得到蛋清液；然后向蛋清液中加入复合酶B（复合酶B为碱性蛋白酶和风味蛋白酶的组合；复合酶B中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比例为3:1；风味蛋白酶的活力单位为5万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为80万U/g），复合酶B的添加量为蛋清干重的2%；再调节蛋清液的pH 值为8，在温度55℃下酶解4小时，得到酶解液C；然后将酶解液C升温至85℃灭酶30min；

酶解液C灭酶完成后用离心机离心（酶解液C用碟式离心机离心；碟式离心机转速为6500rpm。），所得液相为白蛋白肽液。

向步骤（4）制取的卵黄高磷蛋白磷酸肽液中加入CaCl₂，CaCl₂ 的添加量为卵黄高磷蛋白磷酸肽液干重的1%，调节pH 值为5.5；然后加入乙醇并搅拌均匀，乙醇的体积为卵黄高磷蛋白磷酸肽液体积的60%，在温度4℃下沉淀12小时，过滤（采用板框过滤）后获得的滤渣即为卵黄高磷蛋白磷酸肽，然后采用流化床在60℃温度下烘干2小时。经检测，卵黄高磷蛋白磷酸肽的含量为86.78%。

步骤（3）制取的蛋黄蛋白肽液和步骤（5）制取的白蛋白肽液分别进行纳滤，去除部分盐离子和水分，分别得到蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液；蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液分别均质、灭菌处理后喷雾干燥，分别得到蛋黄蛋白肽粉、白蛋白肽粉。上述纳滤使用的纳滤膜孔径为200Da，压力为2.5Mpa，截留液即为蛋黄蛋白肽浓缩液或白蛋白肽浓缩液。上述均质处理的压力为40MPa，均质1次，每次均质30min。均质处理后在85℃下灭菌20min。采用压力喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾压力为20MPa，进料温度65℃，进风温度为175℃，出风温度为75℃，喷雾干燥所得粉为蛋黄蛋白肽粉或白蛋白肽粉。经检测，蛋黄蛋白肽粉的蛋白质含量为91.42%，蛋白质中小于1000Da肽含量为90.16%；白蛋白肽粉的蛋白质含量为93.25%，蛋白质中小于1000Da肽含量为93.28%。

实施例2

本实施例中，从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法包括下述步骤：

（1）磷脂型DHA提取

DHA鸡蛋采用下述方法获得：在蛋鸡饲料基料中添加2%DHA藻油，混合后造粒制成DHA饲料，按正常养殖饲喂下蛋蛋鸡，连续喂养10天后，就可获得稳定的DHA鸡蛋（分别在第10天、第20天、第30天随机取10颗鸡蛋，分别检测DHA含量，其平均DHA含量分别为：245.2mg；242.8mg；243.8mg）；

将DHA鸡蛋的蛋黄、蛋清分离；

然后将蛋黄加入到乙醇中搅匀；

接着常温搅拌下提取2小时后抽滤，收集过滤液A，抽滤获得的滤渣A加入乙醇后再次常温搅拌下提取2小时，然后抽滤并收集过滤液A；提取、抽滤、收集过滤液A的过程进行2次；

合并各次收集的过滤液A，然后蒸发掉乙醇和水分（采用薄膜蒸发器蒸发掉乙醇和水分），得到磷脂型DHA（经检测，磷脂含量为96.21%，DHA含量为22.35%）；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣B，备用；

本步骤（1）中，蛋黄与乙醇的质量比例为1:7；每次对滤渣A进行提取时，滤渣A与乙醇的质量比例为1:7；

（2）蛋黄油提取

将步骤（1）得到的滤渣B与正己烷混合，常温搅拌下提取2小时后抽滤，收集过滤液B，抽滤获得的滤渣B加入正己烷后再次常温搅拌下提取2小时，抽滤并收集过滤液B；提取、抽滤、收集过滤液B的过程进行3次；

合并各次收集的过滤液B，然后蒸发掉正己烷（采用薄膜蒸发器蒸发掉正己烷），得到蛋黄油；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣C，备用；

本步骤（2）中，每次对滤渣B进行提取时，滤渣B与正己烷的质量比例为1:7；

（3）制取蛋黄蛋白肽液

向步骤（2）得到的滤渣C加入纯化水，得到滤渣C质量百分比浓度为12%的料液A；然后向料液A中加入酸性蛋白酶（酸性性蛋白酶的活力单位为10万U/g），酸性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的3%wt，并用盐酸调节料液的pH值为4，在温度45℃下酶解4小时；再调节料液A的pH值为8，向料液A中加入碱性蛋白酶（碱性蛋白酶的活力单位为40万U/g），碱性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的2%，在温度45℃下酶解3小时，得到酶解液A；然后将酶解液A升温至80℃灭酶30min；

灭酶完成后将酶解液A的pH值调节至4，静置20min后用离心机离心（酶解液A用碟式离心机离心；碟式离心机转速为6500rpm），液相为蛋黄蛋白肽液，固相为卵黄高磷蛋白；

（4）制取卵黄高磷蛋白磷酸肽液

将步骤（3）获得的固相卵黄高磷蛋白与氢氧化钠溶液混合（氢氧化钠溶液的质量是卵黄高磷蛋白的5倍，氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为0.6%），然后调节其混合液的pH值为7（向卵黄高磷蛋白加入氢氧化钠溶液后，在50℃下搅拌3小时后用盐酸调节其混合液的pH值为7），然后过滤（采用板框压滤），滤渣即为脱磷卵黄高磷蛋白；

向脱磷卵黄高磷蛋白中加入纯化水，得到脱磷卵黄高磷蛋白质量百分比浓度为12%的料液B；然后向料液B中加入复合酶A（复合酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶的组合；复合酶A中碱性蛋白酶与中性蛋白酶的质量比例为1:1；中性蛋白酶的活力单位为40万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为60万U/g），复合酶A的添加量为脱磷卵黄高磷蛋白干重的3%；然后调节料液的pH 值为8，在温度55℃下酶解4小时，得到酶解液B；然后将酶解液B升温至85℃灭酶20min；

酶解液B灭酶完成后用离心机离心（酶解液B用碟式离心机离心；碟式离心机转速为6500rpm），所得液相为卵黄高磷蛋白磷酸肽液；

（5）制取白蛋白肽液

向步骤（1）得到的蛋清中加入0.6倍质量的纯化水，混合后得到蛋清液；然后向蛋清液中加入复合酶B（复合酶B为碱性蛋白酶和风味蛋白酶的组合；复合酶B中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比例为3:1；风味蛋白酶的活力单位为5万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为80万U/g），复合酶B的添加量为蛋清干重的3%；再调节蛋清液的pH 值为7.5，在温度57℃下酶解5小时，得到酶解液C；然后将酶解液C升温至85℃灭酶20min；

酶解液C灭酶完成后用离心机离心（酶解液C用碟式离心机离心；碟式离心机转速为6500rpm。），所得液相为白蛋白肽液。

向步骤（4）制取的卵黄高磷蛋白磷酸肽液中加入CaCl₂，CaCl₂ 的添加量为卵黄高磷蛋白磷酸肽液干重的1.2%，调节pH 值为5.5；然后加入乙醇并搅拌均匀，乙醇的体积为卵黄高磷蛋白磷酸肽液体积的70%，在温度4℃下沉淀12小时，过滤（采用板框过滤）后获得的滤渣即为卵黄高磷蛋白磷酸肽，然后采用流化床在60℃温度下烘干2小时。经检测，卵黄高磷蛋白磷酸肽的含量为89.35%。

步骤（3）制取的蛋黄蛋白肽液和步骤（5）制取的白蛋白肽液分别进行纳滤，去除部分盐离子和水分，分别得到蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液；蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液分别均质、灭菌处理后喷雾干燥，分别得到蛋黄蛋白肽粉、白蛋白肽粉。上述纳滤使用的纳滤膜孔径为300Da，压力为3Mpa，截留液即为蛋黄蛋白肽浓缩液或白蛋白肽浓缩液。上述均质处理的压力为40MPa，均质1次，每次均质30min。均质处理后在85℃下灭菌20min。采用压力喷雾干燥机进行喷雾干燥，喷雾压力为20MPa，进料温度 55℃，进风温度为180℃，出风温度为85℃，喷雾干燥所得粉为蛋黄蛋白肽粉或白蛋白肽粉。经检测，蛋黄蛋白肽粉的蛋白质含量为90.59%，蛋白质中小于1000Da肽含量为90.35%；白蛋白肽粉的蛋白质含量为92.58%，蛋白质中小于1000Da肽含量为92.67%。

磷脂含量检测：依据GB/T 5537-2008 粮油检验 磷脂含量的测定。

DHA含量检测：DHA含量按GB 5009.168-2016 食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定 中规定的方法测定。

卵黄高磷蛋白磷酸肽含量检测方法：参照GB31617-2014酪蛋白磷酸肽。

蛋白质含量检测：依据GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定。

蛋白肽分子量分布测量：根据GB 31645-2018 食品安全国家标准 胶原蛋白肽采用高效体积排阻色谱法测定。

Claims (10)

1.一种从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征在于包括下述步骤：

（1）磷脂型DHA提取

将DHA鸡蛋的蛋黄、蛋清分离；

然后将蛋黄加入到乙醇中搅匀；

接着常温搅拌下提取1-4小时后抽滤，收集过滤液A，抽滤获得的滤渣A加入乙醇后再次常温搅拌下提取1-4小时，然后抽滤并收集过滤液A；提取、抽滤、收集过滤液A的过程进行2-4次；

合并各次收集的过滤液A，然后蒸发掉乙醇和水分，得到磷脂型DHA；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣B，备用；

（2）蛋黄油提取

将步骤（1）得到的滤渣B与正己烷混合，常温搅拌下提取1-4小时后抽滤，收集过滤液B，抽滤获得的滤渣B加入正己烷后再次常温搅拌下提取1-4小时，抽滤并收集过滤液B；提取、抽滤、收集过滤液B的过程进行2-4次；

合并各次收集的过滤液B，然后蒸发掉正己烷，得到蛋黄油；

本步骤最后一次抽滤获得滤渣C，备用；

（3）制取蛋黄蛋白肽液

向步骤（2）得到的滤渣C加入纯化水，得到滤渣C质量百分比浓度为8-20%的料液A；然后向料液A中加入酸性蛋白酶，酸性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的1-3%wt，并用盐酸调节料液的pH值为3-5，在温度45-55℃下酶解2-4小时；再调节料液A的pH值为7-9，向料液A中加入碱性蛋白酶，碱性蛋白酶的添加量为滤渣C干重的1-3%，在温度45-55℃下酶解2-4小时，得到酶解液A；然后将酶解液A升温至80-85℃灭酶20-30min；

灭酶完成后将酶解液A的pH值调节至3.8-4.5，静置10-30min后用离心机离心，液相为蛋黄蛋白肽液，固相为卵黄高磷蛋白；

（4）制取卵黄高磷蛋白磷酸肽液

将步骤（3）获得的固相卵黄高磷蛋白与氢氧化钠溶液混合，然后调节其混合液的pH值为6.5-7.5，然后过滤，滤渣即为脱磷卵黄高磷蛋白；

向脱磷卵黄高磷蛋白中加入纯化水，得到脱磷卵黄高磷蛋白质量百分比浓度为10-15%的料液B；然后向料液B中加入复合酶A，复合酶A的添加量为脱磷卵黄高磷蛋白干重的1-3%；然后调节料液的pH 值为7-9，在温度55-60℃下酶解4-8小时，得到酶解液B；然后将酶解液B升温至80-85℃灭酶20-30min；

酶解液B灭酶完成后用离心机离心，所得液相为卵黄高磷蛋白磷酸肽液；

（5）制取白蛋白肽液

向步骤（1）得到的蛋清中加入0.5-1倍质量的纯化水，混合后得到蛋清液；然后向蛋清液中加入复合酶B，复合酶B的添加量为蛋清干重的2-4%；再调节蛋清液的pH 值为7-9，在温度55-60℃下酶解4-8小时，得到酶解液C；然后将酶解液C升温至80-85℃灭酶20-30min；

酶解液C灭酶完成后用离心机离心，所得液相为白蛋白肽液。

2.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：

步骤（1）中，蛋黄与乙醇的质量比例为1:5-8；

步骤（1）中，每次对滤渣A进行提取时，滤渣A与乙醇的质量比例为1:5-8；步骤（1）中，采用薄膜蒸发器蒸发掉乙醇和水分。

3.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：

步骤（2）中，每次对滤渣B进行提取时，滤渣B与正己烷的质量比例为1:5-8；步骤（2）中，采用薄膜蒸发器蒸发掉正己烷。

4.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：步骤（3）中，酸性性蛋白酶的活力单位为5-20万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为30-80万U/g。

5.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：步骤（4）中，氢氧化钠溶液的质量是卵黄高磷蛋白的3-6倍，氢氧化钠溶液的质量百分比浓度为0.3-0.6%；向卵黄高磷蛋白加入氢氧化钠溶液后，在40-60℃下搅拌2-6小时后用盐酸调节其混合液的pH值为6.5-7.5。

6.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：步骤（4）中，复合酶A为碱性蛋白酶和中性蛋白酶的组合。

7.根据权利要求6所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：所述复合酶A中碱性蛋白酶与中性蛋白酶的质量比例为3:1-1:2；中性蛋白酶的活力单位为20-40万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为30-80万U/g。

8.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：步骤（5）中复合酶B为碱性蛋白酶和风味蛋白酶的组合；复合酶B中碱性蛋白酶与风味蛋白酶的质量比例为6:1-2:1；风味蛋白酶的活力单位为2-5万U/g，碱性蛋白酶的活力单位为30-80万U/g。

9.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：

向步骤（4）制取的卵黄高磷蛋白磷酸肽液中加入CaCl₂，CaCl₂ 的添加量为卵黄高磷蛋白磷酸肽液干重的0.6-1.5%，调节pH 值为5.5-5.6；然后加入乙醇并搅拌均匀，乙醇的体积为卵黄高磷蛋白磷酸肽液体积的50-80%，在温度2-6℃下沉淀6-12小时，过滤后获得的滤渣即为卵黄高磷蛋白磷酸肽，然后采用流化床在50-70℃温度下烘干2-4小时；

步骤（3）制取的蛋黄蛋白肽液和步骤（5）制取的白蛋白肽液分别进行纳滤，去除部分盐离子和水分，分别得到蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液；蛋黄蛋白肽浓缩液、白蛋白肽浓缩液分别均质、灭菌处理后喷雾干燥，分别得到蛋黄蛋白肽粉、白蛋白肽粉。

10.根据权利要求1所述的从DHA鸡蛋中提取磷脂型DHA及副产物的深加工方法，其特征是：所述DHA鸡蛋采用下述方法获得：在蛋鸡饲料基料中添加1-3%DHA藻油，混合后造粒制成DHA饲料，按正常养殖饲喂下蛋蛋鸡，连续喂养7～10天后，就可获得稳定的DHA鸡蛋。