CN115715754A - 一种具有祛痘和修护功效的凝胶及其制备 - Google Patents
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Abstract
一种适用于轻、中度痤疮人群日常皮肤护理的祛痘修护凝胶及其制备。该凝胶采用苦参、三七、美洲大蠊、马齿苋等天然产物,以及胶态硫、包裹水杨酸等作为活性原料;同时采用芦荟凝胶汁、卡波姆、透明质酸钠等作为基质材料,使该凝胶具有多重功效:有针对性的温和抑菌、抗炎舒缓、修护皮肤屏障功能、控油、改善毛囊过度角质化。同时该祛痘修护凝胶采用对痤疮皮肤友好温和的成分配方,避免使用存在刺激性成分。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品领域,涉及一种可用于面部痤疮人群,具有针对性温和抑菌、抗炎舒缓、皮肤屏障修护、改善毛囊过度角质化和皮肤控油多重功效的祛痘修护凝胶剂及其制备。
背景技术
“痤疮”是多发于青春期人群面部毛囊皮脂腺单位的一种慢性炎症性皮肤病。在青春期,毛囊组织在雄激素刺激下,一方面诱导皮脂腺大量分泌脂质,另一方面导致毛囊皮脂腺导管角化异常使皮脂排出障碍。脂质大量聚集使原本属于皮肤正常菌群的痤疮丙酸杆菌在嗜脂及厌氧的环境中异常增殖,引发局部炎症和免疫反应,导致皮肤红肿,进而形成丘疹、脓包。炎症反应不断加重还会诱发毛囊壁断裂,脂质、微生物及毛发等进入真皮,产生异物样反应,即使在炎症消退后也常遗留红斑、色素沉着或瘢痕。中国人群痤疮发病率为8.1%,在青少年群体中普遍发病。由于青少年开始注重自身容貌外表,青春痘对面貌的影响可能会直接影响到他们的状态、情绪、心理和社交生活,严重的容貌焦虑可能会引起自卑、抑郁等心理疾病。
在临床上,按皮损的程度把痤疮分为三度四级:轻度(Ⅰ级,仅有粉刺),中度(Ⅱ级、Ⅲ级,有炎性丘疹、脓疱),重度(Ⅳ级有结节、囊肿)。其中,中、重度患者应以药物治疗为主,轻、中度患者则应以日常皮肤护理为主。痤疮人群需要基于医学理论选择护肤品,包括兼顾考虑多个功效:(1)有针对性的温和抑菌:对于金黄色葡萄球菌等皮肤致病菌具有较高的抑菌性避免感染,对于痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌等皮肤正常菌群抑菌性温和,防止大量增殖。(2)抗炎舒缓:抑制痤疮发生时炎症反应导致的红、肿、痛等,舒缓皮肤对各种刺激因素的高反应状态,提高皮肤对刺激的耐受。(3)修护皮肤屏障功能:提升皮肤角质层的“砖块+灰浆”结构自身修复能力,恢复皮肤屏障功能。(4)控油:抑制皮肤毛囊中皮脂腺过度分泌油脂。(5)改善毛囊过度角质化:软化和溶解角质,纠正毛囊导管口角化,维持毛囊健康状态。同时,痤疮人群使用的护肤品应该温和无刺激,避免使用存在刺激性的香精香料、防腐剂和表面活性剂。
发明内容
本发明提供一种适用于轻、中度痤疮人群日常皮肤护理的祛痘修护凝胶及其制备。该凝胶采用苦参、三七、美洲大蠊、马齿苋等天然产物,以及胶态硫、包裹水杨酸等作为活性原料;同时采用芦荟凝胶汁、卡波姆、透明质酸钠等作为基质材料,使该凝胶具有多重功效:有针对性的温和抑菌、抗炎舒缓、修护皮肤屏障功能、控油、改善毛囊过度角质化。同时该祛痘修护凝胶采用对痤疮皮肤友好温和的成分配方,避免使用存在刺激性成分。
为实现以上目的,本发明提供一种具有针对性温和抑菌、抗炎舒缓、皮肤屏障修护、改善毛囊过度角质化和皮肤控油多重功效的祛痘修护凝胶剂及其制备,并通过以下技术方案予以实现。
具体的,提供一种祛痘修护凝胶,含有以下重量百分比的活性成分:苦参提取物预配液1-5%、三七提取物预配液2-8%、美洲大蠊提取物0.1-0.8%、胶态硫0.02-0.3%、包裹水杨酸0.1-0.4%、马齿苋提取物0.05-2%、积雪草苷0.01-0.3%、甘草酸二钾0.01-0.08%、神经酰胺NP 0.4-3%、寡肽-10.1-0.8%。
进一步的,一种祛痘修护凝胶,含有以下重量百分比的活性成分:苦参提取物预配液1-3%、三七提取物预配液2-6%、美洲大蠊提取物0.15-0.4%、胶态硫0.05-0.15%、包裹水杨酸0.15-0.4%、马齿苋提取物0.12-0.8%、积雪草苷0.01-0.15%、甘草酸二钾0.02-0.06%、神经酰胺NP 0.8-1.5%、寡肽-10.2-0.6%。
进一步的,一种祛痘修护凝胶,含有以下表1重量百分比的活性成分:
表1.祛痘修护凝胶活性成分
进一步的,所述苦参提取物预配液为含苦参(SOPHORAANGUSTIFOLIA)提取物1%,1,3-丁二醇10%、丙二醇89%的混合溶液(重量百分比)。
进一步的,所述三七提取物预配液为含三七(PANAX NOTOGINSENG)提取物5%、丙二醇90%、PEG-40氢化蓖麻油5%的混合溶液(重量百分比)。
进一步的,所述美洲大蠊提取物为美洲大蠊(PERIPLANETA AMERICANA)提取物的浸膏粉,其中含多元醇类、肽类活性物质(包括18种氨基酸)≥82%、水≤18%(重量百分比)。
进一步的,所述胶态硫为单质硫75%、阿拉伯树胶25%(重量百分比);所述单质硫为由8个硫原子组成的八元环结构。
进一步的,所述包裹水杨酸为含水杨酸(SALICYLIC ACID)40%、支链淀粉25%、糊精20%、黄原胶15%的包裹粉末(重量百分比)。
进一步的,所述马齿苋提取物为含马齿苋(PORTULACA OLERACEA)提取物0.4%、水69.6%、丁二醇30%的混合溶液(重量百分比)。
进一步的,所述神经酰胺NP为含水58.8%、丁二醇30%、神经酰胺NP(CERAMIDENP)2.5%、磷脂酰胆碱7%、硬脂酰谷氨酸钠0.5%、1,2-己二醇1%、对羟基苯乙酮0.2%的混合溶液(重量百分比)。
进一步的,所述寡肽-1为含水39.5%、甘油60%、寡肽-1(OLIGOPEPTIDE-1)0.5%的混合溶液(重量百分比)。
进一步的,所述积雪草苷为积雪草苷(ASIATICOSIDE)。
进一步的,所述甘草酸二钾为甘草酸二钾(DIPOTASSIUM GLYCYRRHIZATE)。
进一步的,提供一种祛痘修护凝胶,还含有以下重量百分比的基质成分:芦荟凝胶汁35-80%、EDTA二钠0.02-0.08%、卡波姆0.1-0.7%、透明质酸钠0.02-0.08%、甘油1-4%、PHL0.4-1.5%、1,3-丁二醇2-8%、L-精氨酸0.1-0.7%、水3-7%。
进一步的,所涉及祛痘修护凝胶的基质成分配方信息如表2。
表2.祛痘修护凝胶基质成分
进一步的,所述芦荟凝胶汁为库拉索芦荟(ALOE BARBADENSIS)叶汁。
进一步的,所述透明质酸钠为寡聚糖HA(分子量104Da)。
进一步的,所述PHL为1,3-丙二醇65%、1,2-己二醇30%、辛酰羟肟酸5%的混合溶液。
进一步的,所述水为去离子水。
进一步的,提供的一种祛痘修护凝胶,含有苦参提取物预配液1kg、三七提取物预配液2.5kg、芦荟凝胶汁37.41kg、EDTA二钠0.025kg、包裹水杨酸0.15kg、卡波姆0.245kg、透明质酸钠0.025kg、甘油1.5kg、甘草酸二钾0.025kg、神经酰胺NP 0.5kg、寡肽-10.25kg、美洲大蠊提取物0.15kg、马齿苋提取物0.5kg、胶态硫0.05kg、积雪草苷0.05kg、PHL 0.6kg、1,3-丁二醇2.5kg、L-精氨酸0.255kg、水2.265kg。
所述的一种祛痘修护凝胶其制备方法包括以下步骤:
(1)将配方用量的芦荟凝胶汁加到乳化锅后,再将EDTA二钠、甘草酸二钾加到乳化锅中,搅拌至完全溶解。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(2)用配方用量的甘油、卡波姆、神经酰胺NP分散后再加到(1)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(3)将配方用量的苦参提取物预配液、三七提取物预配液、包裹水杨酸、透明质酸钠、寡肽-1、美洲大蠊提取物、马齿苋提取物、胶态硫、积雪草苷、PHL、1,3-丁二醇加入(2)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(4)将配方用量的L-精氨酸溶解于水中,制得溶液。
(5)将(4)制得的溶液加入到(3)所述的乳化锅中,搅拌混合30min,制得凝胶。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm,真空度为-0.06MPa。
(6)将(5)所制得凝胶用200目滤布过滤后出料,制得透明凝胶。
(7)对(6)所制得透明凝胶进行感官、理化、微生物指标检测。外观应为透明或者半透明凝胶状,无异物;符合特定香型;pH值5.5-6.5;总菌落数≤500CFU/;霉菌酵母≤50CFU/g。
(8)采用半自动灌装机将(7)中检验合格的透明凝胶灌装到软管中,用封口机对软管封口,制得祛痘修护凝胶。
本发明所涉及的祛痘修护凝胶的特点:
1.有针对性的温和抑菌
面部发生痤疮时易感染的细菌有金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌,其中表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌属于寄生在皮肤的正常菌群。痤疮丙酸杆菌能分解正常皮肤产生的油脂,释放脂肪酸,让皮肤表面维持弱酸性环境,起到抵御致病菌的作用。只有当痤疮丙酸杆菌在被堵塞的毛囊中过度繁殖时才会引发皮肤的局部炎症。表皮葡萄球菌也是一种寄生在人体皮肤上的正常微生物,当其数量在正常范围时,能够起到刺激和调节皮肤免疫反应的作用,但异常过度增殖也会引发皮肤炎症。金黄色葡萄球菌则是一种具有较高传染性的致病菌,主要感染皮肤表面的微小创口,并形成小脓疱,对于皮肤屏障功能脆弱的部位(如干燥、抓挠、挤痘导致的皮损)更受到金黄色葡萄球菌的感染。
本凝胶成分中的苦参提取物具有抑菌作用,能对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌均有明显的抑制作用。经测试,本凝胶对致病性的表皮葡萄球菌的抑制性较强,抑制率>80%;而对属皮肤正常菌群的表皮葡萄球菌和痤疮丙酸杆菌的抑制相对温暖和,抑制率在25-50%之间。
2.抗炎舒缓
炎症反应贯穿了痤疮发生的全过程,痤疮丙酸杆菌等微生物的大量繁殖,使皮肤的微生态环境遭到破坏,毛囊中的微生物和一些异常的脂质通过活化Toll样受体(TLRs)使之产生多种白细胞介素(如IL-6、IL-1β等)。同时,活化后的巨噬细胞介导释放肿瘤坏死因子(TNF-α),诱导和加强局部炎症反应,从而导致皮肤出现红、肿、痛等一系列炎症反应。
该凝胶成分中的三七提取物和苦参提取物都具有抗炎舒缓作用,能有效抑制细胞释放上述炎症因子。经测试,本凝胶对炎症因子TNF-α、IL-6和IL-1β的抑制率分别为38%、83%和39%,能有效抑制因痤疮引发的皮肤局部炎症反应所导致的红肿和疼痛,也能起到舒缓作用,提高应对各种刺激的耐受能力。
3.皮肤屏障修护
皮肤屏障主要靠皮肤角质层的“砖块+灰浆”结构实现,其中“砖块”指由角质形成细胞,细胞外成分彼此紧密嵌合交联,形成非水溶性的坚韧外膜即角质包膜;“灰浆”指细胞间隙中的脂质,严密砌合连接可限制水分在细胞内外或细胞间随意流动。该屏障结构防止体内水分和电解质流失,阻止外界有害物质入侵,维持机体内环境稳定。痤疮的发生和发展过程中的炎症反应和微生物感染等因素均会造成皮肤屏障功能损伤,降低皮肤抵御外源刺激物和有害物质侵袭的能力。
本凝胶中的美洲大蠊提取物、透明质酸、神经酰胺等成分的组合能有效修复受损皮肤的屏障功能,有预防痤疮的复发的作用。经皮水分丢失(TEWL)和角质层含水量(SCH)是评价皮肤屏障功能的重要指标。经人体测试,持续使用本凝胶28天,能显著提升受试者皮肤的SCH和显著降低TEWL,具有皮肤屏障修护功效。
4.控油
皮肤皮脂腺分泌旺盛是痤疮发生的诱因,控制皮肤油脂分泌是预防痤疮/粉刺复发的又一重要因素。此过程中,5α-还原酶可直接催化睾酮(T)转化为双氢睾酮(DHT),后者促使皮脂腺细胞过度增殖,还会促进皮脂腺细胞分泌促炎因子。
本凝胶中的苦参提取物中的黄酮成分,有抑制5α-还原酶活性的作用,抑制皮脂腺大量分泌油脂,可以降低毛囊堵塞风险,防止痤疮丙酸杆菌的异常增殖。经测试,该凝胶对5α-还原酶的抑制率以为53%,具有控油功效。
5.改善毛囊过度角质化
胶态硫中的硫单质能与存在于角质层中的半胱氨酸相互作用形成硫化氢,促进角蛋白分解和脱落。包裹水杨酸能持续释放低浓度水杨酸,能软化毛囊角质,促进角质剥脱。
6.温和、无刺激性
痤疮的发生和发展过程中的炎症反应和微生物感染等因素均会造成皮肤屏障功能损伤,降低皮肤抵御外源刺激物和有害物质侵袭的能力。适用于痤疮人群的护肤品应温和、无刺激性,应避免使用香精香料,尽可能选对皮肤较温和的防腐剂和表面活性剂。
本凝胶通过其中的多元醇(1,3-丁二醇、甘油、1,3-丙二醇、1,2-己二醇)和芦荟凝胶汁中的天然表面活性分子对活性成分助溶的作用,未额外添加表面活性剂。另外,加入卡波姆增稠,起到稳定分散的作用。本凝胶也未添加香精香料。经按《化妆品安全技术规范》(2015年版)中的安全评价测试,该凝胶无皮肤刺激性。
7.稳定性高
本祛痘修护凝胶中含有大量水分和一定浓度的肽类及氨基酸,为避免滋生微生物导致变质,本祛痘修护凝胶选择微量辛酰羟肟酸作为防腐剂。在常规十万级净化车间生产,经常规PET软管密封包装,保证出厂时微生物指标符合《化妆品安全技术规范》(2015年版)的限度要求。经加速稳定实验验证,该凝胶的理化性状及微生物指标符合保质期36个月的要求。
附图说明
图1.对比各测试样品OD450
图2.不同浓度测试样对三种供试菌的抑菌圈
A:痤疮丙酸杆菌B:表皮葡萄球菌C:金黄色葡萄球菌
图3.部分受试者VISIA成像图片
具体实施方式
实施例1祛痘修护凝胶的制备(500g)
以下实施例使用的试剂和仪器如下:
试剂:
苦参提取物预配液、三七提取物预配液自行配置。芦荟凝胶汁、EDTA-2Na、包裹水杨酸、卡波姆、透明质酸钠、甘油、甘草酸二钾、神经酰胺NP、寡肽-1、美洲大蠊提取物、马齿苋提取物、胶态硫、积雪草苷、PHL、1,3-丁二醇、L-精氨酸购自云南柏妮兰资源开发有限公司。
仪器:
实验室真空均质乳化机,购自上海化烁智能设备有限公司,型号1
电子天平,购自Mettler Toledo,型号PL1002E/02
封口机,广州市常信包装材料有限公司
含有苦参提取物预配液10g、三七提取物预配液25g、芦荟凝胶汁375g、EDTA二钠0.25g、包裹水杨酸1.5g、卡波姆2.5g、透明质酸钠0.25g、甘油15g、甘草酸二钾0.25g、神经酰胺NP 5g、寡肽-12.5g、美洲大蠊提取物1.5g、马齿苋提取物5g、胶态硫0.5g、积雪草苷0.5g、PHL 6g、1,3-丁二醇25g、L-精氨酸2.5g、水2.3g。
制备方法:
(1)将配方用量的芦荟凝胶汁加到乳化锅后,再将EDTA二钠、甘草酸二钾加到乳化锅中,搅拌至完全溶解。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(2)用配方用量的甘油、卡波姆、神经酰胺NP分散后再加到(1)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(3)将配方用量的苦参提取物预配液、三七提取物预配液、包裹水杨酸、透明质酸钠、寡肽-1、美洲大蠊提取物、马齿苋提取物、胶态硫、积雪草苷、PHL、1,3-丁二醇加入(2)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(4)将配方用量的L-精氨酸溶解于水中,制得溶液。
(5)将(4)制得的溶液加入到(3)所述的乳化锅中,搅拌混合30min,制得凝胶。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm,真空度为-0.06MPa。
(6)将(5)所制得凝胶用200目滤布过滤后出料,制得透明凝胶。
(7)对(6)所制得透明凝胶进行感官、理化、微生物指标检测。外观应为透明或者半透明凝胶状,无异物;符合特定香型;pH值5.5。
实施例2祛痘修护凝胶的制备(50kg)
以下实施例使用的试剂和仪器如下:
试剂:
苦参提取物预配液、三七提取物预配液自行制备。芦荟凝胶汁、EDTA-2Na、包裹水杨酸、卡波姆、透明质酸钠、甘油、、甘草酸二钾、神经酰胺NP、寡肽-1、美洲大蠊提取物、马齿苋提取物、胶态硫、积雪草苷、PHL、1,3-丁二醇、L-精氨酸购自云南柏妮兰资源开发有限公司。
仪器:
100升真空均质乳化锅,购自江苏省高邮市仪器厂,型号XY-A
电子台秤,购自厦门佰伦斯科技,型号TCS-T01R-150
电子天平,购自Mettler Toledo,型号PL1002E/02
半自动灌装机,购自上海佳爵机械有限公司,型号GFC-25
封口机,广州市常信包装材料有限公司
含有苦参提取物预配液1kg、三七提取物预配液2.5kg、芦荟凝胶汁37.41kg、EDTA二钠0.025kg、包裹水杨酸0.15kg、卡波姆0.245kg、透明质酸钠0.025kg、甘油1.5kg、甘草酸二钾0.025kg、神经酰胺NP 0.5kg、寡肽-10.25kg、美洲大蠊提取物0.15kg、马齿苋提取物0.5kg、胶态硫0.05kg、积雪草苷0.05kg、PHL 0.6kg、1,3-丁二醇2.5kg、L-精氨酸0.255kg、水2.265kg。
制备方法:
(1)本次制备在十万级净化车间生产,制备前确保现场功能间已清场,设备可正常运行,设备已清洗消毒。
(2)将配方用量的芦荟凝胶汁加到乳化锅后,再将EDTA二钠、甘草酸二钾加到乳化锅中,搅拌至完全溶解。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(3)用配方用量的甘油、卡波姆、神经酰胺NP分散后再加到(2)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(4)将配方用量的苦参提取物预配液、三七提取物预配液、包裹水杨酸、透明质酸钠、寡肽-1、美洲大蠊提取物、马齿苋提取物、胶态硫、积雪草苷、PHL、1,3-丁二醇加入(3)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm。
(5)将配方用量的L-精氨酸溶解于水中,制得溶液。
(6)将(5)制得的溶液加入到(4)所述的乳化锅中,搅拌混合30min,制得凝胶。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm,真空度为-0.06MPa。
(7)将(6)所制得凝胶用200目滤布过滤后出料,制得透明凝胶。
(8)对(7)所制得透明凝胶进行感官、理化、微生物指标检测。外观应为透明或者半透明凝胶状,无异物;符合特定香型;pH值5.5;总菌落数≤500CFU/;霉菌酵母≤50CFU/g。
(9)采用半自动灌装机将(8)中检验合格的透明凝胶灌装到软管中,15g/支,用封口机对软管封口,制得祛痘修护凝胶。
以下将通过试验例来说明本申请中的祛痘修护凝胶的效果。
试验例一评价祛痘修护凝胶的皮肤刺激性
测试目的
按照《化妆品安全技术规范》(2015版)的标准方法,评价祛痘修护凝胶(由实施例2制备)的多次皮肤刺激性。
测试方法动物:家兔(日本大二白兔),普通级,4只(雄性2只,雌性2只),体重2-2.3kg。饲养:温度17-25℃,湿度40-60%,12/12h昼夜明暗交替。喂以实验动物标准配合饲料,饮用水自由饮用。
测试物:祛痘修护凝胶(由实施例2制备)。
阴性对照:纯净水。
备皮:试验前24h将实验动物背部脊柱两侧被毛减掉,去毛范围各为3×3cm,涂抹面积2.5×2.5cm。
给药:选择备皮部无创伤、斑块、丘疹的家兔4只作为试验动物,取祛痘修护凝胶约0.5g涂抹在动物左侧皮肤上,右侧涂纯净水作为阴性对照,每天涂抹1次,连续涂抹14d。从第二天开始,每次涂抹前应剪毛,用温水清除残留测试物。一小时后观察结果,按表3和表4进行评分。
表3.皮肤刺激反应评分表
表4.积分均值与刺激强度对应表
测试结果
每天涂抹1次,连续给药及观察14天。试验期间,动物给药侧和对照测皮肤均未见异常结果。见表5。
表5.测试样品对家兔多次皮肤刺激及反应评分表
结论
按《化妆品安全技术规范》(2015年版)要求可判定祛痘修护凝胶对家兔多次皮肤刺激性为:无刺激性。
试验例二 祛痘修护凝胶的控油功效评价
测试目的
应用基于抑制5α还原酶活性的Elisa控油功效检测评价的实验室方法,评价祛痘修护凝胶(由实施例2制备)的控油功效。
原理
油性皮肤是因人体皮脂腺分泌旺盛、皮脂腺功能失常所产生的。皮脂腺分泌异常通常是雄性激素过多导致的,睾酮(T)和双氢睾酮(DHT)都属于雄性激素,DHT结合雄激素受体的能力比T高5倍以上。在T转变为DHT的过程中,5α-还原酶是直接的催化酶,二者都可以促使皮脂腺细胞过度增殖同时双氢睾酮还会促进皮脂腺细胞分泌促炎因子,进一步导致痤疮和脂溢性皮炎等皮肤疾病。
本实验利用“一步夹心法”检测受试物对5α-还原酶的抑制率。抑制因子(可能存在于样品中的物质)作用于吸附在抗体(抗体已固着在酶标板凹孔)上5α-还原酶,使其活性受到抑制。处理后微孔上仍然存留的5α-还原酶与HRP标记的免疫酶连接,催化底物显色,终止反应后测试吸光值。做阴性对照组(不加任何样品或抑制剂),阳性对照组(本试验用一定物质的量浓度的EGCG),通过比较分析数据,来评估受试物对5α-还原酶的抑制效果。并以此数据科学合理的评价化妆品的控油功效。
测试方法
1.实验试剂:
儿茶素没食子酸酯(CAS:981-51-5),浓度3μg/μL,储藏于18-26℃;
5α-还原酶,浓度>80U/ml,本次实验酶的效价约为100U/ml,储藏于-20℃;
Tris-HCl缓冲液(CAS:1185-53-1)浓度0.1M,pH=7.0-7.2。
2.试验材料、仪器:
酶标分析仪;5α还原酶抗原Elisa试剂检测盒。
3.试验环境:温度环境20-25℃,相对湿度在50-70%
4.测试分组:见表6
表6.试验分组设计
备注:阳性对照和样品的物质的量浓度比例应恰当,其摩尔浓度参照样品的“摩尔质量”(考虑配方中质量浓度在前列的几种原料的摩尔质量,剩余原料/植物原料的摩尔质量以葡萄糖摩尔质量代替)计算设置,试验员认为本试验理想的情况为:样品物质的量浓度:阳性对照物质的量浓度约为1:0.372,并参考其他因素调整。
5.测试步骤
(1)将样品用0.1M tris-HCl缓冲液稀释N倍(20<N<50),作为下步试验用样品;从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
(2)设置空白、阳性对照孔、样品孔、阴性对照孔;除空白组不加酶,其他组每孔各加50μL的5α-还原酶,37℃恒温箱温育10min;样品孔加的样品,阳性对照孔加阳性对照;注意样品和阳性对照之间的物质的量浓度比例应适当(至少小于10倍);将加样后的微孔板孵育10min,洗板5次(洗板液由试剂盒提供,将原洗液稀释20倍待用)。
(3)阴性对照组、阳性对照组和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100uL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
(4)弃去液体,吸水纸上拍干,洗板机洗板3次。
(5)每孔加入底物A、B各50uL,37℃避光孵育15min。
(6)每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
6.5α-还原酶抑制率计算
(1)样品抑制率的百分比计算公式如下:
抑制率(%)=100×(OD空白+OD阴性对照-OD样品)/(OD空白+OD阴性对照)
(2)阳性对照抑制率的百分比计算公式如下:
抑制率(%)=100×(OD空白+OD阴性对照-OD阳性对照)/(OD空白+OD阴性对照)
测试结果:
测试样品对5α-还原酶的抑制情况如,图1和表7所示。
表7.各测试样品对5α-还原酶的抑制情况
祛痘修护凝胶对5α-还原酶抑制的OD平均值为0.481,明显低于使用一定物质的量浓度EGCG的阳性对照组(0.851)和阴性对照组(0.701)。经计算,测试样品对5α-还原酶抑制率=52.95%,阳性对照5α-还原酶抑制率=16.73%,样品抑制率>30%,认为样品对5α-还原酶有抑制性。
结论
在本试验的条件下,祛痘修护凝胶(由实施例2制备)对5α-还原酶有抑制作用,抑制率为54.43%。说明该测试样品具有控油功效。
试验例三评价祛痘修护凝胶的抑菌性
测试目的
评价由实施例2制备的祛痘修护凝胶对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌性。
原理
1.纸片法
该方法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上,纸片中的药物在琼脂中扩散,随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少,从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。同时,纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长,而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长,在纸片的周围形成抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度。
2.比色法
当光束通过悬浊液时,由于被散射或吸收而降低其透过量,细菌悬液的浓度在一定范围内与光密度成正比,与透光度成反比。参照文献的方法,通过酶标仪测定的6×108cfu菌悬液在600nm波长处的光密度值OD600,以此表示细菌悬液浓度,以验证测试样品对所选用供试菌的抑制敏感度。比色法是利用细菌的吸光来测量细菌培养液的浓度,估计细菌的生长情况,所以通常用来指菌体细胞密度,是追踪液体培养物中微生物密度的标准指标,指示菌体细胞密度。
测试方法
1.细菌
痤疮丙酸杆菌(ATCC11827)、表皮葡萄球菌(ATCC 12228)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)来源于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。
2.仪器
细菌培养箱(金坛市杰瑞尔电机公司,MJ-150B),多功能酶标仪(美国贝克曼DTX800),厌氧培养袋(日本三菱力久化学株式会社)
3.测试样品
由实施例2制备的祛痘修护凝胶
4.测试步骤
(1)纸片法:将不同稀释浓度的受试样品以无水乙醇为溶剂溶,对半稀释,浓度梯度为:原液、50%、25%、12.5%、6.25%,6mm纸片浸润于不同浓度受试样品中,6.0×108CFU/mL铺板,将纸片按图1依次贴于琼脂平板中。痤疮丙酸杆菌置于厌氧培养盒37℃恒温培养箱中孵育48h,表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌置于37℃恒温培养箱中孵育24h,观察并测量抑菌圈大小,实验重复3次并判断结果。
(2)比色法:实验组取20μl测试样品加入96孔板,再加入菌悬液180μl;阳性组取20μl莫匹罗星软膏加入96孔板,再加入菌悬液180μl;空白组为200μl空白液体培养基;对照组为200μl菌液。痤疮丙酸杆菌置于厌氧培养盒37℃恒温培养箱中孵育48h,表皮葡萄球菌,金黄色葡萄球菌置于37℃恒温培养箱中孵育24h,酶标仪测定600nm的OD值,按以下方法计算生长抑制率=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD),实验重复3次并判断结果。
测试结果
1.纸片法测试抑菌圈
见图2。
图2表示不同浓度测试样品对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌的抑菌环,100%和50%浓度测试样品对三种供试菌均出现明显抑菌。具体抑菌圈对比如表8所示。
表8.不同浓度祛痘修护凝胶对各供试菌的抑菌圈
注:“*”表示与无水乙醇组比较P<0.05,“**”表示P<0.01。
经t-检验分析,100%浓度的测试样品对三种供试菌的抑菌作用均高于无水乙醇,该差异有统计学意义(痤疮丙酸杆菌P<0.01、金黄色葡萄球菌P<0.05,表皮葡萄球菌P<0.01);50%浓度的测试样对表皮葡萄球菌的抑菌作用也显著高于无水乙醇(P<0.05)。在其他低浓度组中,测试样品对三种供试菌的抑菌作用于无水乙醇相比,并无显著性差异。
2.比色法测试结果
表9所示为经比色法测试计算所得测试样品及阳性组(莫匹罗星软膏)对三种供试菌的抑制作用对比。结果显示测试样品对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌和金黄色葡萄球菌均有抑制作用,抑制率分别为25.7%,41.4%和84.1%。
表9.测试样品对供试菌的抑制率对比
备注:抑制率=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-空白组OD)
结论
通过纸片法和比色法两种方法测试,在本实验条件下祛痘修护凝胶对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌均有显著的抑菌作用,其中对金黄色葡萄球菌抑制作用较强,对痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌的抑菌性相对温和。试验例四评价制备凝胶的舒缓抗炎活性
测试目的
应用脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞系炎症细胞(RAW264.7)分泌炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量的抗炎功效模型,评价祛痘修护凝胶(由实施例2制备)的抗炎舒缓功效。
原理
LPS诱导RAW264.7,是研究炎症因子的经典细胞模型。LPS与巨噬细胞表面抗原识别受体结合,可诱导巨噬细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6等多种炎症因子。
1.TNF-α可激活Caspase蛋白酶、JNK和转录因子NF-κB三条信号通路,实现其细胞毒性,抗病毒、免疫调节和细胞凋亡等生物学功能。
2.IL-1β是炎症反应的重要介质,当机体处于炎症状态或发生免疫反应时可参与多种细胞活动,包括细胞增殖、分化和凋亡等。IL-1β还可以通过激活内皮细胞、引起骨髓中性粒细胞动员(白细胞增多)以及激活各类白细胞等方式,引发急性期反应蛋白如C反应蛋白等增多,从而导致全身炎症。
3.IL-6在不同炎症中产生的模式不同。在传染性炎症的早期阶段,不同病原体通过相关分子模式(PAMP)的Toll样受体(TLR),刺激单核细胞和巨噬细胞产生IL-6。在非感染性炎症(如烧伤或创伤性损伤),通过损伤相关分子模式(DAMP)的TLR,刺激损伤细胞产生IL-6。这种急性IL-6表达通过刺激各种细胞群体在宿主防御中起着核心作用。
本方法通过比较阴性对照与祛痘修护凝胶给药后RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6含量的差异,评价祛痘修护凝胶抑制TNF-α、IL-1β和IL-6分泌的作用。含量测定采用酶联免疫方法(ELISA),具体原理为(以TNF-α为例):炎症因子TNF-α与包被在酶标板上的TNF-α抗体特异性结合后,带有底物标记的抗TNF-α抗体结合,底物被催化后,生成有色产物,TNF-α含量与有色产物在450nm波长下测定光密度(OD值)计算其TNF-α的含量。
测试方法
1.细胞:小鼠单核巨噬细胞白血病细胞系RAW264.7,细胞株来源于中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库,选用型号为KCB 200603YJ。
2.培养条件:DMEM培养基,胎牛血清,胰蛋白酶/EDTA溶液(0.25%胰酶溶液与0.02mol/L EDTA溶液1:1混合),磷酸盐缓冲液(PBS),细胞培养瓶。
3.刺激物:细菌脂多糖(LPS大肠杆菌来源)
4.阳性对照:地塞米松(索莱宝D8040)
5.材料、仪器:96孔板;TNF-αELISA检测试剂盒、IL-1βELISA检测试剂盒、IL-6ELISA检测试剂盒(ELISA试剂盒);CCK-8细胞毒检测试剂盒(索莱宝CA1210);酶标仪;超净工作台;二甲基亚砜(DMSO)。
6.测试样品:祛痘修护凝胶,由实施例2制备。
7.测试分组
表10.试验分组设计
8.测试步骤(1)细胞准备:
a.细胞复苏:
1)将水浴锅预热至37℃,准备好干净的一次性PE手套,一个无菌离心管内加入9ml无菌DMEM培养基;
2)将细胞从液氮罐中取出放入PE手套中,迅速没入水浴锅,摇晃冻存管加速溶解,以1分钟内全部溶解为宜;
3)在超净台中将复苏好的细胞液加入到装有PBS培养基的离心管内,
1000rpm/min离心3分钟,离心完毕去掉上清;
4)用6ml含10%血清的DMEM培养基重悬细胞,接入到T25培养瓶中,补充培养基到5ml,放入培养箱培养。
b.细胞消化及传代:
采用胰蛋白酶/EDTA(浓度宜为0.25%),T25培养瓶胰酶用量1ml,T75培养瓶胰酶用量3mL消化细胞。显微镜下观察,至大部分细胞变圆并处于悬浮状态时,加入约胰酶体积2-3倍的含10%血清的DMEM培养基终止消化,并收集至离心管中,1000r/min离心5min,离心结束后,弃掉上清液,向离心管中加入含10%血清的DMEM培养基,吸管吹打混匀细胞后传入两个T25培养瓶中。
(2)祛痘修护凝胶溶液准备
在测试前,乳液样品用DMSO溶解,水浴超声5分钟,配置成浓度0.8mg/ml的祛痘修护凝胶溶液,溶液均一,无沉淀或絮状物存在。水相样品直接用原液作为测试溶液。
(3)CCK-8细胞活力检测
接种细胞到96孔板中,每孔200μl细胞悬液(每孔8万个细胞)。在培养箱中培养24h,向培养板中加入不同浓度待测物质,孵育24h,吸取上清液丢弃,每孔加入100μl培养基和10μlCCK-8溶液混合物,孵育2h,用酶标仪测450nm处吸光度值。
(4)刺激物溶液准备
LPS贮备液(5mg/ml)的配制:用2000μlPBS将10mgLPS溶解,涡旋混匀5min,用0.22μm滤膜过滤除菌,-80℃超低温冰箱,冷冻保存。
LPS工作液(1μg/ml)的配制:按照1:5000稀释比例,采用高糖DMEM培养基进行配制。
(5)阳性对照溶液准备:
地塞米松贮备液(100mg/ml)的配制:用1000μlDMSO溶解100mg地塞米松,震摇2h,充分混匀,按照20μl/支的体积进行分装,保存至-80℃,配好后用0.22μm滤膜过滤除菌备用。
(6)细胞接种
用细胞培养基稀释细胞至接种密度(接种后24h融合度达到45%-60%,8万个/孔),接种至96孔板中,每孔液量为200μl。接种结束后,放置于CO2培养箱中培养24h。保证细胞在接种24小时后,融合度在45-60%范围。
(7)诱导及给药
弃掉96孔板中的培养基,受试物孔中加入含有一定浓度受试物和LPS(1μg/ml)的培养基,阴性对照孔中加入含有LPS的细胞培养基,阳性对照孔中需要加入含有阳性对照和LPS的培养基,空白/溶剂对照孔中加入细胞培养基,每孔200μl,祛痘修护凝胶浓度为3.2mg/ml给药完毕后将96孔板放置于CO2培养箱中培养24h。
(8)细胞上清收集
孵育培养结束后,收集200μl细胞培养上清液于1.5ml无菌离心管中,置于-80℃超低温冰箱,冷冻保存。
(9)ELISA检测:
a.检测前准备:
1)请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒,以平衡至室温。
2)用双蒸水将20×浓缩洗涤液稀释成1×工作液。未用完的放回4℃。
3)标准品:开盖前1000rpm离心1min。加入标准品&标本通用稀释液0.5ml至冻干标准品中,静置15分钟,待其充分溶解后,轻轻混匀(浓度为2000
pg/ml)。然后根据需要进行稀释(本检测标准曲线使用以下浓度:500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813pg/ml)。
4)生物素化抗体工作液:按当次试验所需要的用量,使用前20分钟,用生物素化抗体稀释液将30×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作液。当日使用。
5)酶结合物工作液:按当次试验所需要的用量,使用前20分钟,用酶结合物稀释液将30×浓缩酶结合物稀释成1×工作液。当日使用。
b.操作步骤:
1)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条,未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压实自封条,密封口袋,放回4℃。
2)空白孔加标准品&标本通用稀释液,其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100μl/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃恒温箱,避光孵育90分钟。
3)提前20分钟准备生物素化抗体工作液。
4)洗板5次。
5)空白孔加生物素化抗体稀释液,其余孔加入生物素化抗体工作液(100μl/孔)。用新封板胶纸封住反应孔,37℃恒温箱,避光孵育60分钟。
6)提前20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25℃)放置。
7)洗板5次。
8)空白孔加酶结合物稀释液,其余孔加入酶结合物工作液(100μl/孔)。
用新封板胶纸封住反应孔,37℃恒温箱,避光孵育30分钟。
9)打开酶标仪电源,预热仪器,设置好检测程序。
10)洗板5次。
11)加入显色底物(TMB)100μl/孔,37℃恒温箱,避光孵育15分钟。
12)加入反应终止液(100μl/孔),混匀后即刻测量OD450nm值(3分钟内)。c.结果判断:
每个标准品和标本的OD值应减去空白孔的OD值。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,软件绘制并选取最佳拟合曲线,推荐使用二次多项式方程拟合。通过标本的OD值可在标准曲线上查出其浓度。
9.TNF-α、IL-1β和IL-6含量和抑制率计算
(1)含量
分别将TNF-α、IL-1β和IL-6的标准品配置成标准溶液,并按比例逐级稀释成一系列已知浓度的溶液,用上述ELISA方法测出其在450nm的OD值(OD450),经拟合制作标准曲线的回归方程式,将各个祛痘修护凝胶的OD450值带人方程式,计算该祛痘修护凝胶中的TNF-α、IL-1β和IL-6含量结果。各组平行测试3个复孔,计算平均值和标准差(SD)。应用SPSS统计软件对上述试验所测得各样品组的TNF-α、IL-1β和IL-6含量与阴性对照组进行t-检验分析,以P<0.05为差异有统计学意义。
(2)TNF-α、IL-1β和IL-6抑制率
抑制率(%)=(1-T/C)×100%,其中T为各样品组TNF-α、IL-1β或IL-6含量平均值,C为阴性对照组TNF-α、IL-1β或IL-6含量平均值。
研究测试结果
1.CCK-8细胞活力检测
采用CCK-8试剂盒测试不同剂量的祛痘修护凝胶对RAW264.7细胞活力的影响如表11所示:
表11.不同浓度祛痘修护凝胶对RAW264.7细胞活力的影响对比
按照标准T/SHRH033-2020的要求,应祛痘修护凝胶的剂量浓度应控制在能保证细胞活力≥90%的范围内,因此选择3.2mg/ml作为后续炎症因子含量测试的剂量浓度。
2.对炎症因子TNF-α的含量及抑制率检测
表12.祛痘修护凝胶对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子TNF-α的抑制情况
备注:抑制率(%)=(1-T/C)×100%
T——样品组TNF-α含量平均值
C——阴性对照组TNF-α含量平均值
表12对比了各测试组对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α含量和抑制率的情况。使用3.2mg/ml祛痘修护凝胶对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α含量为74.10pg/ml,明显低于阴性对照组(119.76pg/ml,p<0.05),TNF-α抑制率为38.12%;使用100mg/ml地塞米松的阳性对照组对LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α含量为37.25g/ml,也明显低于阴性对照组(p<0.05),TNF-α抑制率为68.90%。
3.对炎症因子IL-1β的含量及抑制率检测
表13.祛痘修护凝胶对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-1β的抑制情况
备注:抑制率(%)=(1-T/C)×100%
T——样品组IL-1β含量平均值
C——阴性对照组IL-1β含量平均值
表13对比了各测试组对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β含量和抑制率的情况。使用3.2mg/ml祛痘修护凝胶对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β含量为2.73pg/ml,明显低于阴性对照组(16.36pg/ml,p<0.05),IL-1β抑制率为83.29%;使用100mg/ml地塞米松的阳性对照组对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β含量为3.18pg/ml,也明显低于阴性对照组(p<0.05),IL-1β抑制率为80.56%。
4.对炎症因子IL-6的含量及抑制率检测
表14祛痘修护凝胶对LPS诱导RAW264.7细胞分泌炎症因子IL-6的抑制情况
备注:抑制率(%)=(1-T/C)×100%
T——样品组IL-6含量平均值
C——阴性对照组IL-6含量平均值
表14对比了各测试组对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-6含量和抑制率的情况。使用3.2mg/ml祛痘修护凝胶对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-6含量为9.87pg/ml,明显低于阴性对照组(16.17pg/ml,p<0.05),IL-6抑制率为38.96%;使用100mg/ml地塞米松的阳性对照组对LPS诱导RAW264.7细胞分泌IL-1β含量为0.11pg/ml,也明显低于阴性对照组(p<0.05),IL-1β抑制率为99.31%。小结:
在本试验的条件下,3.2mg/ml的祛痘修护凝胶对RAW264.7细胞的CCK-8细胞活力为95.98%,对由LPS诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α、IL-1β和IL-6都具有抑制作用,抑制率分别为38.12%、83.29%和38.96%,祛痘修护凝胶具有舒缓抗炎功效。
试验例五祛痘修护凝胶的安全评估祛痘功效的人体评价
测试目的
通过亚洲成年受试者正常情况下使用由实施例2制备的祛痘修护凝胶14天和28天,通过皮肤科医生对受试者面部的粉刺、丘疹、脓疱、结节进行临床评估,受试者面部高清拍照成像和受试者自评,评估该祛痘修护凝胶在的安全性和祛痘功效。
测试方法
1.测试样品:祛痘修护凝胶,由实施例2制备。
2.受试者:亚洲成年人,20-35岁,其中男性22人,女性11人,均为易长粉刺人群,脸部有可见痘痘(包括白头和黑头)。测试开始一周前,受试者停用化妆品或外用药物,测试前一天晚上,受试者在家洗脸后脸上不再涂抹任何护肤品。测试当天早上,在家用清水洗脸后脸上不涂抹任何护肤品。
3.使用部位:粉刺及痘痘部位。
4.使用方法:挤出适量祛痘修护凝胶,涂抹于痘痘处,每天使用两次,在连续使用的第14天和第28天请受试者回访,进行自我评估,并请皮肤科医生进行临床评估。
5.功效性临床评估
在连续使用祛痘修护凝胶的第14天和第28天,由皮肤科医生分别记录受试者面部的皮损(粉刺、丘疹、脓疱、结节)的数量,以总积分的形式对皮损的炎症程度和数量进行全面评估。
评估前,受试者在温度21±1℃,相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟。随后皮肤科医生使用面部高清成像仪VISIA-CR对受试者剂型面部图像采集。
计算各时间点面部各类皮损(粉刺、丘疹、脓疱、结节)变化率。各个受试者使用前后收集项数据进行Shapiro-Wilk正态分布检验和方差齐性检验,有统计学意义后再进行配对样本t-检验,检验水准取a=0.05,p<0.05表明差异具有显著性。
6.安全性评估
通过受试者使用,测试祛痘修护凝胶对人体皮肤的安全性(如引起皮肤干燥、脱屑、发红、丘疹等)。受试者回访,仔细询问、检测并记录受试者在使用祛痘修护凝胶期间所发生的任何不良事件,包括不良事件的发现、发生时间、处理措施及转归,并对不良事件与使用祛痘修护凝胶的关系作出判断。
表15人体试用试验皮肤反应分级标准
备注:皮肤不良反应分级按照《化妆品安全技术规范》(2015版)中规定的人体试用试验皮肤反应分级标准判断。
表16.不良事件与测试样品关系的判断标准
7.受试者自我评估
受试者根据连续14和28天使用祛痘修护凝胶的情况,填写使用日志,记录其对皮肤造成的不良反应。
表17.受试者自我评估标准
测试结果
1.皮肤可医生临床评估
表18.祛痘功效临床评估
备注:变化率=[(使用后-使用前)/使用前]×100%
2.安全性临床评估
表19.不良反应汇总表
整个测试过程中,33名受试者对使用该祛痘修护凝胶未产生不适感。
3.受试者自我评估
表20.使用样品前受试者自我评估满意度表
表21.使用样品第14天受试者自我评估满意度表
表22.使用样品第28天受试者自我评估满意度表
表23.使用样品第14和28天受试者自我评估满意度表
使用祛痘修护凝胶28天后,33名受试者对该祛痘修护凝胶的整体满意度为56.6%。
结论
在皮肤科医生控制下,通过观查通过33名年龄20-35随的亚洲成年受试者在正常情况下连续使用祛痘修护凝胶28天,评价其引起的人体皮肤不良反应的潜在可能性,结果表明,33名受试者在连续使用祛痘修护凝胶28天后均未出现不良反应,提示该祛痘修护凝胶有较好的安全性。
通过33名年龄20-35随的亚洲成年受试者在正常情况下连续使用祛痘修护凝胶14天和28天,通过皮肤科医生对受试者面部粉刺、丘疹、脓疱、结节进行临床评估,结果显示该祛痘修护凝胶在14天和28天具有祛痘效果。
试验例六 祛痘修护凝胶屏障修护功效的人体评价
测试目的
通过亚洲成年受试者在正常情况下连续使用祛痘修护凝胶(由实施例2制备)28天,通过测量皮肤角质层含水量、皮肤经皮水分流失(TEWL值),评估该测试样品的保湿和修护功效。
测试方法
1.测试样品:祛痘修护凝胶,由实施例2制备。
2.受试者:健康受试者,亚洲健康成年人,年龄22-50岁。受试者自我评估面部皮肤为敏感性皮肤,一侧面颊区域的皮肤角质层含水量<60C.U.,一侧面颊区域的经表皮失水率>12g/m2·h,且测试区域的皮肤无明显皮损、伤疤、毛发等情况。要求受试者能很好按试验方案的要求配合测试,在测试期间能保持生活的规律性。
3.使用部位:脸部。
4.使用方法:全脸涂抹使用,没量使用两次,连续使用28天。
5.功效测试
在使用祛痘之前和连续使用祛痘修护凝胶的第28天,由皮肤科医生使用皮肤水分测试仪(Corneometer CM825,Courage+Khazaka,德国)测量受试者同一侧面颊的皮肤角质层含水量。同时,用皮肤水分流失测试探头(Tewameter TM300,Courage+Khazaka,德国)测试受试者面颊皮肤经表皮水分流失。评估前,受试者在温度21±1℃,相对湿度50±10%RH的环境中休息30分钟。
计算各时间点面部皮肤角质层含水量和经表皮水分流失的变化率。各个受试者使用前后收集项数据进行Shapiro-Wilk正态分布检验和方差齐性检验,有统计学意义后再进行配对样本t-检验,检验水准取a=0.05,p<0.05表明差异具有显著性。
测试结果
表24.受试者使用祛痘修护凝胶28天皮肤生理对比
结论
通过30名年龄22-50岁的亚洲成年受试者在正常情况下连续使用祛痘修护凝胶28天,通过测试皮肤角质层水分含量、皮肤经表皮水分流失TEWL值,结果显示该祛痘修护凝胶在28天后具有保湿和修护功效。
Claims (10)
1.一种祛痘修护凝胶,含有以下重量百分比的活性成分:苦参提取物预配液1-5%、三七提取物预配液2-8%、美洲大蠊提取物0.1-0.8%、胶态硫0.02-0.3%、包裹水杨酸0.1-0.4%、马齿苋提取物0.05-2%、积雪草苷0.01-0.3%、甘草酸二钾0.01-0.08%、神经酰胺NP 0.4-3%、寡肽-10.1-0.8%。
2.权利要求1所述的一种祛痘修护凝胶,含有以下重量百分比的活性成分:苦参提取物预配液1-3%、三七提取物预配液2-6%、美洲大蠊提取物0.15-0.4%、胶态硫0.05-0.15%、包裹水杨酸0.15-0.4%、马齿苋提取物0.12-0.8%、积雪草苷0.01-0.15%、甘草酸二钾0.02-0.06%、神经酰胺NP 0.8-1.5%、寡肽-10.2-0.6%。
3.权利要求1或2所述的一种祛痘修护凝胶,其中,所述苦参提取物预配液为含苦参(SOPHORAANGUSTIFOLIA)提取物1%,1,3-丁二醇10%、丙二醇89%的混合溶液;和/或
所述三七提取物预配液为含三七(PANAXNOTOGINSENG)提取物5%、丙二醇90%、PEG-40氢化蓖麻油5%的混合溶液;和/或
所述美洲大蠊提取物为美洲大蠊(PERIPLANETA AMERICANA)提取物的浸膏粉,其中含多元醇类、肽类活性物质(包括18种氨基酸)≥82%、水≤18%;和/或
所述胶态硫为单质硫75%、阿拉伯树胶25%;和/或
所述单质硫为由8个硫原子组成的八元环结构;和/或
所述包裹水杨酸为含水杨酸(SALICYLIC ACID)40%、支链淀粉25%、糊精20%、黄原胶15%的包裹粉末;和/或
所述马齿苋提取物为含马齿苋(PORTULACAOLERACEA)提取物0.4%、水69.6%、丁二醇30%的混合溶液;和/或
所述神经酰胺NP为含水58.8%、丁二醇30%、神经酰胺NP(CERAMIDE NP)2.5%、磷脂酰胆碱7%、硬脂酰谷氨酸钠0.5%、1,2-己二醇1%、对羟基苯乙酮0.2%的混合溶液;和/或
所述寡肽-1为含水39.5%、甘油60%、寡肽-1(OLIGOPEPTIDE-1)0.5%的混合溶液。
4.权利要求1或2所述的一种祛痘修护凝胶,还含有以下重量百分比的基质成分:芦荟凝胶汁35-80%、EDTA二钠0.02-0.08%、卡波姆0.1-0.7%、透明质酸钠0.02-0.08%、甘油1-4%、PHL0.4-1.5%、1,3-丁二醇2-8%、L-精氨酸0.1-0.7%、水3-7%。
5.权利要求4所述的一种祛痘修护凝胶,其中,所述芦荟凝胶汁为库拉索芦荟(ALOEBARBADENSIS)叶汁;和/或
所述透明质酸钠为分子量104Da的寡聚糖;和/或
所述PHL为1,3-丙二醇65%、1,2-己二醇30%、辛酰羟肟酸5%的混合溶液;和/或
所述水为去离子水。
6.权利要求1或2所述的一种祛痘修护凝胶,含有苦参提取物预配液1kg、三七提取物预配液2.5kg、芦荟凝胶汁37.41kg、EDTA二钠0.025kg、包裹水杨酸0.15kg、卡波姆0.245kg、透明质酸钠0.025kg、甘油1.5kg、甘草酸二钾0.025kg、神经酰胺NP 0.5kg、寡肽-10.25kg、美洲大蠊提取物0.15kg、马齿苋提取物0.5kg、胶态硫0.05kg、积雪草苷0.05kg、PHL 0.6kg、1,3-丁二醇2.5kg、L-精氨酸0.255kg、水2.265kg。
7.权利要求6所述的一种祛痘修护凝胶,其制备方法包括以下步骤:
(1)将配方用量的芦荟凝胶汁加到乳化锅后,再将EDTA二钠、甘草酸二钾加到乳化锅中,搅拌至完全溶解;该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm;
(2)用配方用量的甘油、卡波姆、神经酰胺NP分散后再加到(1)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm;
(3)将配方用量的苦参提取物预配液、三七提取物预配液、包裹水杨酸、透明质酸钠、寡肽-1、美洲大蠊提取物、马齿苋提取物、胶态硫、积雪草苷、PHL、1,3-丁二醇加入(2)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm;
(4)将配方用量的L-精氨酸溶解于水中,制得溶液;
(5)将(4)制得的溶液加入到(3)所述的乳化锅中,搅拌混合30min,制得凝胶。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm,真空度为-0.06MPa;
(6)将(5)所制得凝胶用200目滤布过滤后出料,制得透明凝胶。
8.权利要求7所述的一种祛痘修护凝胶,其制备方法还包括以下步骤:
(7)对(6)所制得透明凝胶进行感官、理化、微生物指标检测;外观应为透明或者半透明凝胶状,无异物;符合特定香型;pH值5.5-6.5;总菌落数≤500CFU/;霉菌酵母≤50CFU/g;
(8)采用半自动灌装机将(7)中检验合格的透明凝胶灌装到软管中,用封口机对软管封口,制得祛痘修护凝胶。
9.权利要求1-8任一项所述的一种祛痘修护凝胶的制备方法,包括以下步骤:
(1)将配方用量的芦荟凝胶汁加到乳化锅后,再将EDTA二钠、甘草酸二钾加到乳化锅中,搅拌至完全溶解;该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm;
(2)用配方用量的甘油、卡波姆、神经酰胺NP分散后再加到(1)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm;
(3)将配方用量的苦参提取物预配液、三七提取物预配液、包裹水杨酸、透明质酸钠、寡肽-1、美洲大蠊提取物、马齿苋提取物、胶态硫、积雪草苷、PHL、1,3-丁二醇加入(2)所述的乳化锅中,搅拌至混合均匀。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm;
(4)将配方用量的L-精氨酸溶解于水中,制得溶液;
(5)将(4)制得的溶液加入到(3)所述的乳化锅中,搅拌混合30min,制得凝胶。该过程中温度为室温,搅拌速度为20rpm,真空度为-0.06MPa;
(6)将(5)所制得凝胶用200目滤布过滤后出料,制得透明凝胶;
(7)对(6)所制得透明凝胶进行感官、理化、微生物指标检测;外观应为透明或者半透明凝胶状,无异物;符合特定香型;pH值5.5-6.5;总菌落数≤500CFU/;霉菌酵母≤50CFU/g;
(8)采用半自动灌装机将(7)中检验合格的透明凝胶灌装到软管中,用封口机对软管封口,制得祛痘修护凝胶。
10.权利要求1-8任一项所述的一种祛痘修护凝胶的用途,其用于制备抑菌、抗炎舒缓、皮肤屏障修护、改善毛囊过度角质化和/或皮肤控油的产品。
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