CN115711993A - 一种检测肿瘤标志物的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测肿瘤标志物的方法及试剂盒，属于肿瘤标志物检测技术领域。所述的检测肿瘤标志物的方法依据待测溶液的反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，以及将上述已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物和待测溶液的反应产物在相同波长下检测；将已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物的检测值制作标准曲线，依据标准曲线和待测溶液的反应产物的检测值，得到待测溶液中的肿瘤标志物的浓度。依据该检测方法，本发明还提供了一种检测肿瘤标志物的试剂盒。本发明提供的方法，简单、便宜、快速且灵敏。

Description

一种检测肿瘤标志物的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及肿瘤标志物检测技术领域，特别涉及一种检测肿瘤标志物的方法及试剂盒。

背景技术

恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害人类的健康，是威胁人类生命的一大杀手。从世界范围来看，发展中国家面临着更大的疾病负担，我国作为一个发展中大国，恶性肿瘤面临的形势也愈发严峻。

肿瘤标志物是一类反映肿瘤存在和生长的物质，由肿瘤细胞基因表达产生，或者由机体对肿瘤细胞免疫产生。对肿瘤标志物的检测，在肿瘤的早期筛查、辅助诊断、疗效观察、病情监测、预后判断及分子靶向治疗等方面具有重要的实用价值。

酶联免疫吸附法(ELISA)是肿瘤标志物检测最常见的一种方法，该方法根据抗原与抗体之间产生特异性结合现象，以及酶与底物之间发生催化作用以对待测物品进行定量测量，既可以用于测定抗原也可用于测定抗体。常用的标记酶是辣根过氧化物酶。随着人类生活水平的提高，常规的以辣根过氧化物酶为标记物的酶联免疫吸附法灵敏度很难满足早期检测肿瘤标志物要求，因此，发展一种新型、高灵敏度的酶联免疫检测方法及试剂盒对肿瘤标志物的检测具有重要意义。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种检测肿瘤标志物的方法。

本发明的第二个目的在于提供一种检测肿瘤标志物的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种检测肿瘤标志物的方法，该方法用于非诊断目的，该方法包括以下步骤：

(1)将若干个不同浓度的肿瘤标志物溶液密封温育；

(2)弃去液体，甩干，得到样品1，向样品1中加入生物素标记的肿瘤标志物抗体，密封温育，弃去液体，甩干，加入洗涤液浸泡，甩干，得到产物1；

(3)向产物1中加入葡萄糖氧化酶(GOx)标记的链霉亲和素，密封温育，洗涤，甩干，得到免疫复合物；

(4)向免疫复合物中加入葡萄糖溶液，密封温育后再加入2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)溶液和乙酸溶液，密封孵育，得到已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物；

用待测溶液原液或者稀释液替换步骤(1)中的已知浓度的肿瘤标志物溶液进行上述操作，得到待测溶液的反应产物；

(5)依据待测溶液的反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物存在时，待测溶液的反应产物显绿色；当肿瘤标志物不存在时，待测溶液的反应产物不显色；肿瘤标志物浓度越大，待测溶液的反应产物显绿色越明显；

(6)将上述已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物和待测溶液的反应产物在相同波长下检测；将已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物的检测值制作标准曲线，依据标准曲线和待测溶液的反应产物的检测值，得到待测溶液中的肿瘤标志物的浓度。

肿瘤标志物是反映肿瘤存在的化学物质。

所述的肿瘤标志物包括但不限于癌胚蛋白、肿瘤相关抗原、酶、激素和原癌基因、抑癌基因及其产物中的至少一种。

所述的癌胚蛋白包括但不限于甲胎蛋白和癌胚抗原中的至少一种。

所述的肿瘤相关抗原包括但不限于CA19-9和CA125中的至少一种。

所述的酶优选包括但不限于乳酸脱氢酶、神经元特异性烯醇化酶和前列腺酸性磷酸酶中的至少一种。

所述的激素优选包括但不限于降钙素、绒毛膜促性腺激素和促肾上腺皮质激素中的至少一种。

所述的肿瘤标志物包括但不限于癌胚抗原(CEA)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)和甲胎蛋白中的至少一种。

步骤(1)中，所述的密封温育的条件优选为：在密封条件下于37℃孵育80～100min；更优选为：在密封条件下于37℃孵育90min。

步骤(2)中，所述的生物素标记的肿瘤标志物抗体与不同浓度的肿瘤标志物溶液优选按体积比1:0.5～1.5计算；更优选按体积比1:1计算。

步骤(2)中，所述的密封温育的条件优选为：在密封条件下于37℃孵育50～70min；更优选为：在密封条件下于37℃孵育60min。

步骤(2)中，所述的洗涤液优选为：10～100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

所述的浸泡的时间优选为1～3min；更优选为2min。

步骤(3)中，所述的GOx标记的链霉亲和素与生物素标记的肿瘤标志物抗体优选按体积比1:0.5～1.5计算；更优选按体积比1:1计算。

步骤(3)中，所述的密封温育的条件优选为：在密封条件下于37℃孵育20～40min；更优选为：在密封条件下于37℃孵育30min。

步骤(3)中，所述的洗涤优选为用10～100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤。

步骤(3)中，所述的洗涤的时间优选为20～40s；更优选为30s。

步骤(4)中，所述的葡萄糖溶液的浓度优选为0.1～50mM；进一步优选为0.5～10mM；更进一步优选为0.5mM、1mM、2mM、5mM和10mM中的至少一种；更优选为1mM。

步骤(4)中，所述的葡萄糖溶液与GOx标记的链霉亲和素优选按体积比1:1.5～2.5计算；更优选按体积比1:2计算。

步骤(4)中，所述的密封温育的温度优选为10～50℃；进一步优选为25～40℃；更优选为37℃。

步骤(4)中，所述的密封温育的时间优选为5～50min；进一步优选为5～15min；更优选为10min。

步骤(4)中，所述的ABTS溶液的浓度优选为0.1～10mM；进一步优选为0.5～2mM；更优选为0.5mM、1mM或2mM。

步骤(4)中，所述的乙酸溶液的浓度优选为0.1mM～5M；进一步优选为1～5mM；更优选为1mM、2mM或5mM。

步骤(4)中，所述的葡萄糖、ABTS和乙酸优选按摩尔比1:0.5～1:1～5计算。

步骤(4)中，所述的乙酸溶液的溶剂优选为水。

步骤(4)中，所述的密封孵育的温度优选为50～100℃；进一步优选为70～90℃；更优选为70～80℃。

步骤(4)中，所述的密封孵育的时间优选为1～10min；进一步优选为3～7min；更优选为3～5min。

步骤(6)中，所述的波长为400～450nm；进一步优选为410～430nm；更优选为415nm。

一种检测肿瘤标志物的试剂盒，是基于上述方法设计得到，包括以下组分：生物素标记的肿瘤标志物抗体、葡萄糖氧化酶标记的链霉亲和素、葡萄糖溶液、ABTS溶液、乙酸溶液、肿瘤标志物标准溶液和洗涤液。

所述的肿瘤标志物标准溶液为已知浓度的肿瘤标志物溶液。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明的显色体系是基于乙酸水溶液在一定温度下具有很高的催化活性，能快速催化H₂O₂(葡萄糖在葡萄糖氧化酶的作用下生成的)与2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)水溶液的反应。当肿瘤标志物存在时，待测溶液的反应产物显绿色；当肿瘤标志物不存在时，待测溶液的反应产物不显色；肿瘤标志物浓度越大，待测溶液的反应产物显绿色越明显；从而做出的发明创造。本发明利用待测溶液的反应产物的颜色变化可以定性或半定量检测肿瘤标志物的含量，利用酶标仪可以定量检测肿瘤标志物的含量。

(2)本发明提供的方法，简单、便宜、快速且灵敏。相比于现有商业试剂盒，检出限低100倍以上。

(3)本发明可以应用于医学检测、肿瘤标志物研究等各个领域，具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是本发明检测肿瘤标志物的方法的试验原理图。

图2为实施例1的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

癌胚抗原(CEA)、生物素标记的抗癌胚抗原单克隆抗体、GOx标记的链霉亲和素、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、生物素标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体、甲胎蛋白(AFP)和生物素标记的抗甲胎蛋白抗体均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

本发明的试验原理如图1所示。

实施例1：

一种检测肿瘤标志物的试剂盒，包括以下组分：100μL生物素标记的抗癌胚抗原单克隆抗体、100μL葡萄糖氧化酶(GOx)标记的链霉亲和素、50μL 1mM葡萄糖溶液、50μL 1mMABTS溶液和50μL 1mM乙酸溶液、0.1g/mL癌胚抗原(CEA)标准溶液和300μL 10mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液。

预先计算好所需的板条数，实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温。

对待测溶液中的肿瘤标志物的检测步骤如下：

标准曲线的绘制：

(1)分别准确吸取100μL不同浓度的癌胚抗原(CEA)溶液(CEA溶液浓度依次为：10pg/mL，20pg/mL，40pg/mL，80pg/mL，160pg/mL，200pg/mL)加入到对应的反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育90min；

(2)弃去液体，甩干，每个孔中加入100μL生物素标记的抗癌胚抗原单克隆抗体，封板后于37℃孵箱孵育60min，弃去液体，甩干，每个反应孔中加入300μL 10mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液，浸泡2min，甩干洗涤液，重复4次；

(3)每个反应孔中加入100μL GOx标记的链霉亲和素，封板后于37℃孵箱孵育30min，每个反应孔中加入300μL 10mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液洗涤，洗涤30s后，甩干洗涤液，重复4次，得到免疫复合物；

(4)每个反应孔中加入50μL 1mM的葡萄糖溶液，封板后于37℃孵箱孵育10min，每个反应孔中加入50μL 1mM的ABTS显色剂溶液和50μL 1mM的乙酸水溶液，封板后于80℃孵箱孵育3min，得到不同浓度的癌胚抗原(CEA)溶液反应产物；

(5)用酶标仪在415nm波长下分别测量不同浓度的癌胚抗原(CEA)溶液反应产物的OD值。

以不同浓度的癌胚抗原(CEA)溶液浓度为横坐标，不同浓度的癌胚抗原(CEA)溶液反应产物的吸光度OD值为纵坐标；用软件绘制标准曲线(作图时去掉空白组的值。

标准曲线如图2所示，标准曲线为：y＝0.0041x+0.1624，线性相关系数R²＝0.9984。CEA的线性浓度为10-200pg/mL，CEA的检测限为1pg/mL。相比于癌胚抗原(CEA)ELISA试剂盒(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，检测范围0.16-10ng/mL，检测限0.1ng/mL)，灵敏度高100倍。

试验发现：可以依据不同浓度的癌胚抗原溶液反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物癌胚抗原存在时，待测溶液反应产物(不同浓度的癌胚抗原溶液反应产物)显绿色；当肿瘤标志物癌胚抗原不存在时，待测溶液反应产物不显色；而且，癌胚抗原溶液浓度越大，癌胚抗原反应产物显绿色越明显。

用待测溶液原液或者稀释液(若待测溶液的反应产物的OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后检测，计算肿瘤标志物浓度时再乘以稀释倍数)替换步骤(1)中的已知浓度的癌胚抗原溶液进行上述操作，得到待测溶液的反应产物；肉眼观察，可以初步判定待测溶液中是否含有肿瘤标志物癌胚抗原。利用酶标仪在415nm波长处检测，得到的数值，依据标准曲线，即可得到待测溶液中肿瘤标志物癌胚抗原的含量。

试验发现：可以依据待测溶液的反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物存在时，待测溶液的反应产物显绿色；当肿瘤标志物不存在时，待测溶液的反应产物不显色；肿瘤标志物浓度越大，待测溶液的反应产物显绿色越明显。

实施例2：

一种检测肿瘤标志物的试剂盒，包括以下组分：100μL生物素标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体、100μL葡萄糖氧化酶(GOx)标记的链霉亲和素、50μL 1mM葡萄糖溶液、50μL 0.5mM ABTS溶液和50μL 5mM乙酸溶液、1mM神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准溶液和300μL 20mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液。

预先计算好所需的板条数，实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温。

对待测溶液中的肿瘤标志物的检测步骤如下：

标准曲线的绘制：

(1)分别准确吸取100μL不同浓度的神经元特异性烯醇化酶(NSE)溶液(NSE溶液浓度依次为：10pg/mL，20pg/mL，40pg/mL，80pg/mL，160pg/mL，200pg/mL)加入到对应的反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育90min；

(2)弃去液体，甩干，每个孔中加入100μL生物素标记的神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体，封板后于37℃孵箱孵育60min，弃去液体，甩干，每个反应孔中加入300μL 20mMpH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液，浸泡2min，甩干洗涤液，重复4次；

(3)每个反应孔中加入100μL GOx标记的链霉亲和素，封板后于37℃孵箱孵育30min，每个反应孔中加入300μL 20mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液洗涤，洗涤30s后，甩干洗涤液，重复4次，得到免疫复合物；

(4)每个反应孔中加入50μL 1mM的葡萄糖溶液，封板后于37℃孵箱孵育10min，每个反应孔中加入50μL 0.5mM的ABTS显色剂溶液和50μL 5mM的乙酸水溶液，封板后于70℃孵箱孵育5min，得到不同浓度的神经元特异性烯醇化酶(NSE)溶液反应产物；

(5)用酶标仪在415nm波长下分别测量不同浓度的神经元特异性烯醇化酶(NSE)溶液反应产物的OD值。

以不同浓度的神经元特异性烯醇化酶(NSE)溶液浓度为横坐标，不同浓度的神经元特异性烯醇化酶(NSE)溶液反应产物的吸光度OD值为纵坐标；用软件绘制标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

标准曲线为：y＝0.0042x+0.1616，线性相关系数R²＝0.9956。NSE的线性浓度为10-200pg/mL，NSE的检测限为1pg/mL。相比于辣根过氧化物酶试剂盒(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，检测范围0.31-20ng/mL，检测限0.19ng/mL)，灵敏度高100倍以上。

试验发现：可以依据不同浓度的神经元特异性烯醇化酶溶液反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶存在时，待测溶液反应产物(不同浓度的神经元特异性烯醇化酶溶液反应产物)显绿色；当肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶不存在时，待测溶液反应产物不显色；而且，神经元特异性烯醇化酶溶液浓度越大，神经元特异性烯醇化酶溶液反应产物显绿色越明显。

用待测溶液原液或者稀释液(若待测溶液的反应产物的OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后检测，计算肿瘤标志物浓度时再乘以稀释倍数)替换步骤(1)中的已知浓度的神经元特异性烯醇化酶溶液进行上述操作，得到待测溶液的反应产物；肉眼观察，可以初步判定待测溶液中是否含有肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶。利用酶标仪在415nm波长处检测，得到的数值，依据标准曲线，即可得到待测溶液中肿瘤标志物神经元特异性烯醇化酶的含量。

试验发现：可以依据待测溶液的反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物存在时，待测溶液的反应产物显绿色；当肿瘤标志物不存在时，待测溶液的反应产物不显色；肿瘤标志物浓度越大，待测溶液的反应产物显绿色越明显。

实施例3：

一种检测肿瘤标志物的试剂盒，包括以下组分：100μL生物素标记的抗甲胎蛋白抗体、100μL葡萄糖氧化酶(GOx)标记的链霉亲和素、50μL 1mM葡萄糖溶液、50μL 1mM ABTS溶液和50μL 1mM乙酸溶液、1mM甲胎蛋白(AFP)标准溶液和300μL 100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液。

预先计算好所需的板条数，实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温。

对待测溶液中的肿瘤标志物的检测步骤如下：

标准曲线的绘制：

(1)分别准确吸取100μL不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液(AFP溶液浓度依次为：10pg/mL，20pg/mL，40pg/mL，80pg/mL，160pg/mL，200pg/mL)加入到对应的反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育90min；

(2)弃去液体，甩干，每个孔中加入100μL生物素标记的抗甲胎蛋白抗体，封板后于37℃孵箱孵育60min，弃去液体，甩干，每个反应孔中加入300μL 100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液，浸泡2min，甩干洗涤液，重复4次；

(3)每个反应孔中加入100μL GOx标记的链霉亲和素，封板后于37℃孵箱孵育30min，每个反应孔中加入300μL 100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液洗涤，洗涤30s后，甩干洗涤液，重复4次，得到免疫复合物；

(4)每个反应孔中加入50μL 1mM的葡萄糖溶液，封板后于37℃孵箱孵育10min，每个反应孔中加入50μL 1mM的ABTS显色剂溶液和50μL 1mM的乙酸水溶液，封板后于80℃孵箱孵育3min，得到不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液反应产物；

(5)用酶标仪在415nm波长下分别测量不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液反应产物的OD值。

以不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液浓度为横坐标，不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液反应产物的吸光度OD值为纵坐标；用软件绘制标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

标准曲线为：y＝0.0043x+0.1724，线性相关系数R²＝0.9944。AFP的线性浓度为10-200pg/mL，AFP的检测限为1pg/mL。相比于甲胎蛋白试剂盒(购于生工生物工程(上海)股份有限公司，检测范围1.56-100ng/mL，检测限0.94ng/mL)，灵敏度高100倍。

试验发现：可以依据不同浓度的甲胎蛋白溶液反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物甲胎蛋白存在时，待测溶液反应产物(不同浓度的甲胎蛋白溶液反应产物)显绿色；当肿瘤标志物甲胎蛋白不存在时，待测溶液反应产物不显色；而且，甲胎蛋白溶液浓度越大，甲胎蛋白溶液反应产物显绿色越明显。

用待测溶液原液或者稀释液(若待测溶液的反应产物的OD值高于标准曲线上限，应做适当稀释后检测，计算肿瘤标志物甲胎蛋白浓度时再乘以稀释倍数)替换步骤(1)中的已知浓度的甲胎蛋白溶液进行上述操作，得到待测溶液的反应产物；肉眼观察，可以初步判定待测溶液中是否含有肿瘤标志物甲胎蛋白。利用酶标仪在415nm波长处检测，得到的数值，依据标准曲线，即可得到待测溶液中肿瘤标志物甲胎蛋白的含量。

试验发现：可以依据待测溶液的反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物存在时，待测溶液的反应产物显绿色；当肿瘤标志物不存在时，待测溶液的反应产物不显色；肿瘤标志物浓度越大，待测溶液的反应产物显绿色越明显。

对比例1：

一种检测肿瘤标志物的试剂盒，包括以下组分：100μL生物素标记的抗甲胎蛋白抗体、100μL葡萄糖氧化酶(GOx)标记的链霉亲和素、50μL 1mM葡萄糖溶液、50μL 1mM ABTS溶液和50μL 1mM硫酸溶液、1mM甲胎蛋白(AFP)标准溶液和300μL 100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液。

预先计算好所需的板条数，实验前30min，拿出试剂盒，恢复至室温。

对待测溶液中的肿瘤标志物的检测步骤如下：

标准曲线的绘制：

(1)分别准确吸取100μL不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液(AFP溶液浓度依次为：100pg/mL，200pg/mL，400pg/mL，600pg/mL，800pg/mL，1000pg/mL)加入到对应的反应孔中，封板后于37℃孵箱孵育90min；

(2)弃去液体，甩干，每个孔中加入100μL生物素标记的抗甲胎蛋白抗体，封板后于37℃孵箱孵育60min，弃去液体，甩干，每个反应孔中加入300μL 100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液，浸泡2min，甩干洗涤液，重复4次；

(3)每个反应孔中加入100μL GOx标记的链霉亲和素，封板后于37℃孵箱孵育30min，每个反应孔中加入300μL 100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤液洗涤，洗涤30s后，甩干洗涤液，重复4次；

(4)每个反应孔中加入50μL 1mM的葡萄糖溶液，封板后于37℃孵箱孵育10min，每个反应孔中加入50μL 1mM的ABTS显色剂溶液和50μL 1mM硫酸溶液，封板后于80℃孵箱孵育3min，得到不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液反应产物；

(5)用酶标仪在415nm波长下分别测量不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液反应产物的OD值。

以不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液浓度为横坐标，不同浓度的甲胎蛋白(AFP)溶液反应产物的吸光度OD值为纵坐标；用软件绘制标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

标准曲线为：y＝0.0013x+0.1834，线性相关系数R²＝0.9934。AFP的线性浓度为100-1000pg/mL，AFP的检测限为10pg/mL。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测肿瘤标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将若干个不同浓度的肿瘤标志物溶液密封温育；

(2)弃去液体，甩干，得到样品1，向样品1中加入生物素标记的肿瘤标志物抗体，密封温育，弃去液体，甩干，加入洗涤液浸泡，甩干，得到产物1；

(3)向产物1中加入葡萄糖氧化酶标记的链霉亲和素，密封温育，洗涤，甩干，得到免疫复合物；

(4)向免疫复合物中加入葡萄糖溶液，密封温育后再加入2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐溶液和乙酸溶液，密封孵育，得到已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物；

用待测溶液原液或者稀释液替换步骤(1)中的已知浓度的肿瘤标志物溶液进行上述操作，得到待测溶液的反应产物；

(5)依据待测溶液的反应产物是否显绿色，判断待测溶液中是否存在肿瘤标志物，判断标准如下：当肿瘤标志物存在时，待测溶液的反应产物显绿色；当肿瘤标志物不存在时，待测溶液的反应产物不显色；肿瘤标志物浓度越大，待测溶液的反应产物显绿色越明显；

(6)将上述已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物和待测溶液的反应产物在相同波长下检测；将已知浓度的肿瘤标志物溶液反应产物的检测值制作标准曲线，依据标准曲线和待测溶液的反应产物的检测值，得到待测溶液中的肿瘤标志物的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(2)中，所述的生物素标记的肿瘤标志物抗体与不同浓度的肿瘤标志物溶液按体积比1:0.5～1.5计算；

步骤(3)中，所述的GOx标记的链霉亲和素与生物素标记的肿瘤标志物抗体按体积比1:0.5～1.5计算；

步骤(4)中，所述的葡萄糖溶液与GOx标记的链霉亲和素按体积比1:1.5～2.5计算；

步骤(4)中，所述的葡萄糖、ABTS和乙酸按摩尔比1:0.5～1:1～5计算。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的葡萄糖溶液的浓度为0.1～50mM；

步骤(4)中，所述的ABTS溶液的浓度为0.1～10mM；

步骤(4)中，所述的乙酸溶液的浓度为0.1mM～5M。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述的葡萄糖溶液的浓度为0.5～10mM；

步骤(4)中，所述的ABTS溶液的浓度为0.5～2mM；

步骤(4)中，所述的乙酸溶液的浓度为1～5M。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤标志物包括但不限于癌胚蛋白、肿瘤相关抗原、酶、激素和原癌基因、抑癌基因及其产物中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述的癌胚蛋白包括但不限于甲胎蛋白和癌胚抗原中的至少一种；

所述的肿瘤相关抗原包括但不限于CA19-9和CA125中的至少一种；

所述的酶包括但不限于乳酸脱氢酶、神经元特异性烯醇化酶和前列腺酸性磷酸酶中的至少一种；

所述的激素包括但不限于降钙素、绒毛膜促性腺激素和促肾上腺皮质激素中的至少一种。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的肿瘤标志物包括但不限于癌胚抗原、神经元特异性烯醇化酶和甲胎蛋白中的至少一种。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(1)中，所述的密封温育的条件为：在密封条件下于37℃孵育80～100min；

步骤(2)中，所述的密封温育的条件为：在密封条件下于37℃孵育50～70min；

步骤(3)中，所述的密封温育的条件为：在密封条件下于37℃孵育20～40min；

步骤(4)中，所述的密封温育的温度为10～50℃；

步骤(4)中，所述的密封温育的时间为5～50min；

步骤(4)中，所述的密封孵育的温度为50～100℃；

步骤(4)中，所述的密封孵育的时间为1～10min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

步骤(6)中，所述的波长为400～450nm；

步骤(3)中，所述的洗涤为用10～100mM pH7.4乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗涤；

步骤(3)中，所述的洗涤的时间为20～40s；

步骤(4)中，所述的乙酸溶液的溶剂为水。

10.一种检测肿瘤标志物的试剂盒，其特征在于，是基于权利要求1～9任一项所述的方法设计得到，包括以下组分：生物素标记的肿瘤标志物抗体、葡萄糖氧化酶标记的链霉亲和素、葡萄糖溶液、ABTS溶液、乙酸溶液、肿瘤标志物标准溶液和洗涤液。

Images