CN115710358A

CN115710358A - 聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115710358A
Application number: CN202211534655.8A
Authority: CN
Inventors: 毛宏理; 顾忠伟; 夏浩
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2022-12-02
Filing date: 2022-12-02
Publication date: 2023-02-24

Abstract

本发明属于多功能新材料技术领域，涉及聚6‑氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶及其制备方法与应用，将酰肼修饰的透明质酸、醛基修饰的透明质酸和多巴胺封端改性的聚6‑氨基己酸进行预交联反应，反应结束后，将反应体系置于氯化锶水溶液中浸泡稳定结构，即得。本发明所述的多巴胺改性的巯基封端的聚氨基己酸在水介质中解离H⁺，且酰肼改性的透明质酸在水介质中表现出吸收游离H⁺，表现出改变水介质pH值的行为。本发明制备得到的糖肽基水凝胶具有良好的机械性能，快速凝胶行为和生物相容性，具有优秀的抗炎及抗菌性能。

Description

聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于多功能新材料技术领域，涉及聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶及其制备方法与应用。

背景技术

皮肤是人体抵御外部入侵的第一道防线，糖尿病患者由于血管的神经性退变，其末端皮肤组织有很大可能会出现溃烂性伤口，炎症的过量表达阻碍了皮肤组织愈合，使得皮肤创伤丧失正常修复能力，严重者面临截肢风险。在这种情况下，临床手段已经无法实现皮肤伤口的修复。因此，出现了越来越多种新型治疗手段，例如光热治疗，氧气释放，伤口敷料治疗和基于工程化干细胞的疗法。其中水凝胶疗法由于类似细胞外基质的结构被广泛关注，大多数水凝胶敷料通过负载生长因子或活细胞达到对皮肤伤口的免疫调控，但是负载生长因子或活细胞的水凝胶由于价格昂贵，操作复杂不利于临床使用。因此构建一款内在免疫调节的多功能水凝胶敷料对于糖尿病末端溃疡修复具有重要意义。

透明质酸(HA)是一种天然的非硫酸化糖胺聚糖，它是一种无毒，可生物降解且具有生物相容性的天然聚合物。作为细胞外基质的主要成分，透明质酸中二葡萄糖羧醛的结构使其具备了高度活性氧(ROS)清除性能，在调节炎症方面起到至关重要的作用；6-氨基己酸在临床上被用作止血药物，但其末端短疏水侧链和大量羧基存在的使得其在调节pH环境中有优秀的表现，pH环境的改变诱使细胞发生免疫调节作用获得调节炎症的效果并且在pH调节的过程中产生了大量季胺结构获得抗菌能力。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种抗炎、抗菌的聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶。

本发明还要解决的技术问题是提供上述聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶的制备方法。

本发明进一步地要解决的技术问题是提供上述聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶的应用。

发明思路：本发明中，由己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA-ADH)，醛基修饰的透明质酸(OHA)和多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸(PADA)混合制备出具有抗炎抗菌性质的复合水凝胶。首先，在混合过程中HA-ADH、OHA中的醛基和酰肼之间会形成希夫碱键并在室温条件下缔合形成水凝胶，随后在锶离子的作用下，进一步通过PADA中酚羟基和锶离子之间的金属络合反应形成稳定的结构。具有富-COOH的PADA可以在中性条件下释放H⁺，H⁺被酰肼捕获形成季胺结构，这种在动态调节过程中形成的季胺结构不仅保留了其抗菌特性且不会影响水凝胶的生物相容性，并且通过具有优异生物学功能的透明质酸和动态pH环境调节协同抗炎。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

本发明公开了聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶的制备方法，将酰肼修饰的透明质酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第一预聚液；将醛基修饰的透明质酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第二预聚液；将多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第三预聚液；将第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液混合进行预交联反应，反应结束后，将反应体系置于氯化锶水溶液中浸泡稳定结构，即得复合水凝胶。

其中，所述的磷酸盐缓冲液，缓冲液中磷酸二氢钾的浓度为1.5mmol/L，缓冲液中磷酸氢二纳的浓度为8mmol/L，缓冲液中NaCl的浓度为0.2mol/L，缓冲液中KCl的浓度为2.7mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH＝7.4。

具体地，所述的第一预聚液中酰肼修饰的透明质酸的浓度为0.5～3％g/mL；所述的第二预聚液中醛基修饰的透明质酸的浓度为1～3％g/mL；所述的第三预聚液中多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的浓度为1～3％g/mL；所述的氯化锶水溶液中氯化锶的浓度为0.005％～0.05％g/mL，优选为0.01％g/mL；所述的第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液的体积比为0.5～1：0.5～1：0.5～1。

其中，将第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液混合进行预交联反应，反应结束后得到成胶的水凝胶，随后需要将成胶的水凝胶浸泡在氯化锶水溶液中浸泡稳定结构，所以氯化锶水溶液的用量为过量，需要将成胶的水凝胶浸没。

具体地，所述的预交联反应，反应温度为室温，反应时间为1～3min，优选为2min；所述的浸泡，浸泡温度为室温，浸泡时间为1～10min。

具体地，所述的酰肼修饰的透明质酸的制备方法为：所述的酰肼修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸、缩合剂与己二酸二酰肼反应得到酰肼修饰的透明质酸，在总反应时间的前48h内控制反应体系的pH值在7.5～7.8之间，在总反应时间72h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45。

优选地，所述的酰肼修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水，得到混合液A；向混合液A中加入缩合剂进行活化，得到混合液B；向混合液B中加入己二酸二酰肼进行第一反应，在总反应时间的前48h内控制反应体系的pH值在7.5～7.8之间，在总反应时间72h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45，将反应液透析，冻干，即得。

其中，控制反应体系的pH值，通过向体系中添加1mol/L的氢氧化钠水溶液和1mol/L的盐酸水溶液来调节pH值。

具体地，所述的缩合剂为1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；所述的混合液A中透明质酸的浓度为5～20mg/mL，优选为10mg/mL；所述的透明质酸与1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.2～1.5：1.2～1.5，优选为1：1.2：1.2；所述的透明质酸中羧基与己二酸二酰肼中氨基的摩尔比为1：50～80；所述的活化，活化温度为室温，活化时间为10～30min；所述的第一反应，反应温度为室温。

其中，1-羟基苯并三唑的缩写为HOBT，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的缩写为EDC。

具体地，所述的醛基修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸与高碘酸钠反应，淬灭，即得。

优选地，所述的醛基修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水，得到混合液C；向混合液C中加入高碘酸钠进行第二反应，反应结束后淬灭反应，将反应液透析，冻干，即得。

具体地，所述的透明质酸中羧酸环与高碘酸钠的摩尔比为1：1～2.5，优选为1：1.5；所述的第二反应，避光反应，反应温度为室温，反应时间为4～8h；所述的淬灭反应，通过向反应液中加入乙二醇淬灭反应，透明质酸与乙二醇的质量体积比为1g：1～5mL。

其中，在混合液C中，去离子水的用量为：将混合液中的透明质酸溶解且混合液的粘度适中即可。

具体地，所述的多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的制备方法包括如下步骤：

(1)将6-氨基己酸、氢氧化钠与丙烯酰氯反应，得到6-丙烯酰基氨基己酸；

(2)将β-巯基乙醇、过硫酸铵、四甲基乙二胺、氢氧化钠与步骤(1)得到的6-丙烯酰基氨基己酸反应，得到聚6-氨基己酸；

(3)将1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、多巴胺盐酸盐与步骤(2)得到的聚6-氨基己酸反应，即得。

优选地，所述的多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的制备方法包括如下步骤：

(1)将6-氨基己酸与氢氧化钠溶于去离子水，得到混合液D；将丙烯酰氯溶于有机溶剂，得到混合液E；将混合液D与混合液E混合进行第三反应，得到6-丙烯酰基氨基己酸；

(2)将步骤(1)得到的6-丙烯酰基氨基己酸与氢氧化钠溶于去离子水，得到混合液F；将β-巯基乙醇、过硫酸铵与四甲基乙二胺溶于去离子水，得到混合液G；将混合液F与混合液G混合进行第四反应，得到聚6-氨基己酸；

(3)将步骤(2)得到的聚6-氨基己酸与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺溶于去离子水，得到混合液H；将多巴胺盐酸盐溶于去离子水，得到混合液I；将混合液H与混合液I混合进行第五反应，反应结束后，将反应液透析，冻干，即得；

步骤(2)和步骤(3)在惰性气体保护下进行。

具体地，步骤(1)中，所述的有机溶剂为四氢呋喃；所述的混合液D中6-氨基己酸的浓度为0.05～0.25g/mL；所述的6-氨基己酸、氢氧化钠与丙烯酰氯的摩尔比为1：1～1.2：1～1.2，优选为1：1.1：1.1；所述的第三反应，反应温度为-4～4℃，反应时间为8～12h。

其中，在步骤(1)中，混合液E中有机溶剂的用量为：将混合液中的丙烯酰氯固体溶解且混合液粘度适中即可。

具体地，步骤(2)中，所述的6-丙烯酰基氨基己酸、氢氧化钠、β-巯基乙醇、过硫酸铵与四甲基乙二胺的摩尔比为50：50～60：0.1～2：0.1～1：0.1～1，优选为50：50：1.185：0.41：1；所述的第四反应，反应温度为22～27℃，反应时间为8～12h。

其中，在步骤(2)中，去离子水的用量为：将混合液中的固体溶解且混合液粘度适中即可。

具体地，步骤(3)中，所述的聚6-氨基己酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与多巴胺盐酸盐的摩尔比为10：1～3：0.5～2：1～3，优选为10：2：1：2；所述的第五反应，避光反应，反应温度25～35℃，反应时间为8～12h。

其中，N-羟基琥珀酰亚胺的缩写为NHS。

其中，在步骤(3)中，去离子水的用量为：将混合液中的固体溶解且混合液粘度适中即可。

上述的制备方法制备得到的聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶也在本发明的保护范围之内。

具体地，所述的复合水凝胶中，酰肼修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，醛基修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL。

上述的聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶在制备抗炎、抗菌医用材料中的应用也在本发明的保护范围之内。

有益效果：

(1)本发明的复合水凝胶，成胶时间快，机械性能和细胞相容性良好。

(2)现有技术中的水凝胶通过负载抗菌药物或纳米来达到抗菌效果，但是这类负载药物潜在的生物毒性不利于应用。本发明所述的复合水凝胶，可以在使用过程中动态生成季胺结构，在不损失抗菌效果的情况下，大大的提升了水凝胶的生物相容性。

(3)本发明选用透明质酸为基体材料，引入聚6-氨基己酸，随着聚6-氨基己酸末端的-COOH和透明质酸末端的-NH₂的质子化和脱质子化，季胺结构动态生成。

(4)本发明选用透明质酸为水凝胶原料，透明质酸中的葡萄糖二羧醛的结构，促进了水凝胶对ROS的清除效果，并且原料已实现商业化。因此，其选用及对此类凝胶方法的建立、推广和促进其在再生医学中的应用具有非常重要的价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为己二酸二酰肼修饰的透明质酸和醛基修饰的透明质酸的核磁氢谱图。

图2为多巴胺封端的聚6-氨基己酸的核磁图谱。

图3为复合水凝胶的模量-频率曲线图。

图4为复合水凝胶的抗菌效果图像。

图5为复合水凝胶对TNF-α分泌抑制的图像。

图6为复合水凝胶对IL-6分泌抑制的图像。

图7为复合水凝胶对IL-1β分泌抑制的图像。

图8为醛基修饰的透明质酸的FTIR外红谱图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明的实施例中所用的磷酸盐缓冲液(PBS)，缓冲液中磷酸二氢钾的浓度为1.5mmol/L，缓冲液中磷酸氢二纳的浓度为8mmol/L，缓冲液中NaCl的浓度为0.2mol/L，缓冲液中KCl的浓度为2.7mmol/L，磷酸盐缓冲液的pH＝7.4。

实施例1：己二酸二酰肼修饰的透明质酸的制备

(1)称取4g透明质酸(HA，Mw：1100kDa)溶于400mL去离子水中，待充分溶解形成混合液A(混合液A中透明质酸的浓度为10mg/mL)。向混合液A中加入1.62g HOBT和2.3g EDC，在室温下活化30min，得到混合液B。向混合液B中加入43.55g己二酸二酰肼(ADH)，在室温下反应，反应过程中向反应液中添加1mol/L的氢氧化钠水溶液和1mol/L的盐酸水溶液调节反应液的pH，在总反应时间的前48h内控制反应体系的pH值在7.5～7.8之间，在总反应时间72h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45，将反应液置于透析袋(8000～14000Da)中透析3天，前两天每4h换一次水，后几天每天换三次水。将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状样品，即己二酸二酰肼修饰的透明质酸(HA-ADH)，保存至干燥器中备用。

(2)将10.00mg HA和10.00mg HA-ADH分别溶解在D₂O(1000μL)中，用核磁共振波谱仪记录样品的¹H NMR谱图。

(3)在透明质酸(HA)和HA-ADH的核磁谱图(图1)中可以看出经ADH接枝后的HA会在δ＝1.65ppm(b)和2.39ppm(a)左右出现两个新的信号峰，分别是己二酸二酰肼上亚甲基的核磁峰，这证明透明质酸已被成功己二酸二酰肼化。

实施例2：醛基修饰的透明质酸的制备

(1)称取3g透明质酸(HA，Mw：1100kDa)溶于300mL去离子水中，待充分溶解形成混合液C；向混合液C中加入2.53g高碘酸钠(NaIO₄)，在室温下避光反应6h；反应结束后，向反应液中加入15mL乙二醇淬灭反应，随后将反应溶液置于透析袋(8000～14000Da)中透析3天，前两天每4h换一次水，后几天每天换三次水。将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状样品，即醛基修饰的透明质酸(OHA)，避光保存至干燥器中。

(2)OHA的红外表征采用溴化钾压片法，取适量产物与溴化钾研磨成细粉压片，Thermo Scientific Nicolet iS5 500～4000cm^-1范围内扫描。通过FT-IR分析证实了所得产物的化学结构，OHA的红外谱图如图8所示，1725cm^-1处出现了C＝O双键的振动峰，表明醛基基团的成功接枝。同时，通过¹H NMR分析证实了所得产物的化学结构，OHA的核磁谱图如图1所示，5.0ppm附近的三重峰(a、b和c峰)表明醛基基团的成功接枝，表明醛基修饰的透明质酸的成功制备。

实施例3：多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的制备

(1)称取13.17g 6-氨基己酸(AA)和4.4g氢氧化钠(NaOH)将其放入茄型烧瓶中，在0℃冰浴环境下加入80mL去离子水，充分搅拌均匀，得到混合液D；另称取10g丙烯酰氯(AC)溶解在15mL四氢呋喃中，得到混合液E。将混合液E加入到50mL恒压滴液漏斗中，缓慢滴加到混合液D中，在0℃下反应8h，待反应结束后，向反应液中加入50mL乙酸乙酯萃取反应液，在分液漏斗中静至分层，收集有机相，水相用1M盐酸调节pH＝2～3，再用乙酸乙酯萃取水相，将有机相合并用无水硫酸钠干燥过夜、砂芯漏斗进行抽滤、抽滤得到的有机相进行旋蒸，旋至粘稠状态即可，用石油醚/乙酸乙酯体系进行柱层析色谱提纯，得到白色粉末6-丙烯酰氨基己酸(AACA)，将AACA放入真空干燥箱干燥过夜，随后放入干燥器保存备用。

(2)称取2g AACA放入两口烧瓶中，抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入含有0.432g氢氧化钠的去离子水溶液15mL，充分搅拌均匀，得到混合液F；另称取0.02gβ-巯基乙醇、0.02g过硫酸铵、0.025g四甲基乙二胺(TEMED)溶于1mL去离子水中，充分搅拌均匀，得到混合液G。将混合液G加入到混合液F中，在25℃下反应12h。反应结束后，将反应液进行透析，三天后将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状产物(PACA)，即聚6-氨基己酸，避光保存至干燥器中。

(3)称取0.5g PACA放入两口烧瓶中，抽真空30min通氮气5min，重复此步骤两遍，加入含有0.1035g EDC和0.031g NHS的去离子水溶液50mL，充分搅拌均匀，得到混合液H；另称取0.1024g多巴胺盐酸盐溶于1mL去离子水中，充分搅拌均匀，得到混合液I。将混合液I加入到混合液H中，在25℃下避光反应12h。反应结束后，将反应液进行透析，三天后将透析完成的产物放入冷冻干燥机中冻干，最终得到白色海绵状产物(PADA)，即多巴胺封端的聚6-氨基己酸，避光保存至干燥器中。

(3)取10.00mg AA、10.00mg PACA和10.00mg PADA分别溶解在CDCl₃、D₂O、D₂O(1000μL)中。用核磁共振波谱仪记录样品的¹H NMR谱图。

从图2可知，AACA的核磁谱图中在δ＝5.9-6.5ppm左右出现多个新的信号峰，是丙烯上-CH₂-的核磁峰。在PADA的核磁图中，δ＝6-7ppm处则是多巴胺上苯环的核磁峰，这证明了PADA的成功合成。

实施例4

(1)将实施例1中制备的HA-ADH溶于PBS中，得到第一预聚液(HA-ADH的浓度为2％g/mL)；将实施例2中制备的OHA溶于PBS中，得到第二预聚液(OHA的浓度为2％g/mL)；将第一预聚液和第二预聚液按照体积比1：1进行混合静至成胶，得到OHA/HA-ADH水凝胶，水凝胶中HA-ADH的最终浓度为1％g/mL，OHA的最终浓度为1％g/mL。

(2)将实施例3制备得到的PADA和SrCl₂溶于PBS中静至成胶，得到PADA/Sr水凝胶，水凝胶中PADA的浓度为1％g/mL，氯化锶的浓度为0.01％g/mL。

(3)将实施例1中制备的HA-ADH溶于PBS中配成含有HA-ADH的预聚液，得到第一预聚液，HA-ADH在第一预聚液中的浓度为3％g/mL；将实施例2中制备的OHA溶于PBS中配成含有OHA的预聚液，得到第二预聚液，OHA在第二预聚液中的浓度为3％g/mL。将实施例3中制备的PADA溶于PBS中配成含有PADA的预聚液，得到第三预聚液，PADA在第三预聚液中的浓度为3％g/mL。将上述预聚液按照1：1：1的体积进行混合后加入到玻璃瓶中进行预交联反应，反应温度为室温，静至交联2min，随后将交联成胶的水凝胶置于含有0.01％g/mL Sr离子的氯化锶水溶液中，在室温下浸泡5min，浸泡结束后取出水凝胶并用PBS清洗，得到PADA/OHA/HA-ADH水凝胶，PADA/OHA/HA-ADH水凝胶中HA-ADH的最终浓度为1％g/mL，OHA的最终浓度为1％g/mL，PADA的最终浓度为1％g/mL。

(4)使用流变仪中上夹具为20mm进行水凝胶的压缩性能测试，将500μL水凝胶注入2mL玻璃瓶中，经成胶后加入到平行板中。以10.0μm/s压缩试样，37℃下以0.1％的应变在0.1～100Hz的频率范围测试，获得模量-频率曲线。见图3为水凝胶的模量-频率曲线(G'代表材料存储弹性变形能量的能力，G"代表材料在遭受不可逆形变下而损耗的能量)，其可以反映出水凝胶的力学性能；其中，PADA/OHA/HA-ADH水凝胶表现出较高的储存模量，这可能是因为双网络的引入提高了水凝胶的交联密度，从而提高了水凝胶的机械性能。

实施例5

(1)将实施例4中制备的OHA/HA-ADH、PADA/Sr、PADA/OHA/HA-ADH水凝胶应用于本实施例。

(2)对照组(Control)：将PBS和细菌在孔板中共培养12h，直接离心弃上清，加入10倍量的生理盐水吹打均匀后，分别取10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍稀释后的液体，然后每个倍数滴10uL各3组平行样滴到琼脂板上培养12小时。

水凝胶组：采用

模具制作圆形水凝胶样品，将水凝胶和细菌在孔板中共培养12h，加入10倍量的生理盐水，破碎后涡旋2min，然后吸出液体备用，依次稀释到原液的10倍、100倍、1000倍、10000倍、100000倍，然后每个倍数吸取10uL每组各3个平行样滴在琼脂板上培养12小时。

从图4可知，与对照组相比，PADA/OHA/HA-ADH复合水凝胶表现出明显的细菌抑制效果，这是由于季胺和醛基基团协同酸性环境抗菌。OHA/HA-ADH、PADA/Sr水凝胶表现出不同的菌落抑制效果，分别通过醛基和酸性微环境抑制细菌增殖。此外，由于大肠杆菌由于双层细胞膜结构的原因，因此酸性手段对其没有效果，只能通过基团杀菌。其中，图4中的PADA组就是PADA/Sr水凝胶。

实施例6

(2)将培养处于对数增长期的巨噬细胞吹打、离心，以每孔2×10⁴的细胞数加入到24孔板中培养至贴壁。加入含有LPS(5ug/mL)的培养基对其诱导24h。将水凝胶加入到其中共培养24h后，取出水凝胶，将巨噬细胞吹打、离心，取上清液得溶液L，放置-20℃冰箱备用。

其中，Noraml组(阴性对照组)和LPS组(阳性对照组)不含水凝胶；Normal组：培养基和巨噬细胞共培养；LPS组：含有LPS(脂多糖)的培养基和巨噬细胞共培养。

(3)通过Elisa试剂盒对溶液L进行TNF-α、IL-1β、IL-6相关蛋白的测试，将酶标仪的程序设置在450nm处测量孔板内各组的OD值，空白孔作为背景板，用于扣除相应OD值。如图5、图6、图7所示，各组水凝胶均表现出对炎性因子的降低作用，其中PADA/OHA/HA-ADH水凝胶具备最佳抗炎效果。

其中，在图5、图6和图7中，PADA/HA-ADH//OHA水凝胶就是PADA/OHA/HA-ADH水凝胶；PADA组就是PADA/Sr水凝胶。

本发明提供了聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims

1.聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶的制备方法，其特征在于，将酰肼修饰的透明质酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第一预聚液；将醛基修饰的透明质酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第二预聚液；将多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸与磷酸盐缓冲液混合，得到第三预聚液；将第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液混合进行预交联反应，反应结束后，将反应体系置于氯化锶水溶液中浸泡稳定结构，即得复合水凝胶。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的第一预聚液中酰肼修饰的透明质酸的浓度为0.5～3％g/mL；所述的第二预聚液中醛基修饰的透明质酸的浓度为1～3％g/mL；所述的第三预聚液中多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的浓度为1～3％g/mL；所述的氯化锶水溶液中氯化锶的浓度为0.005％～0.05％g/mL；所述的第一预聚液、第二预聚液与第三预聚液的体积比为0.5～1：0.5～1：0.5～1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的预交联反应，反应温度为室温，反应时间为1～3min；所述的浸泡，浸泡温度为室温，浸泡时间为1～10min。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酰肼修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水，得到混合液A；向混合液A中加入缩合剂进行活化，得到混合液B；向混合液B中加入己二酸二酰肼进行第一反应，在总反应时间的前48h内控制反应体系的pH值在7.5～7.8之间，在总反应时间72h后，反应体系的pH值保持在中性7.35～7.45，将反应液透析，冻干，即得。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的缩合剂为1-羟基苯并三唑和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐；所述的混合液A中透明质酸的浓度为5～20mg/mL；所述的透明质酸与1-羟基苯并三唑、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐的摩尔比为1：1.2～1.5：1.2～1.5；所述的透明质酸中羧基与己二酸二酰肼中氨基的摩尔比为1：50～80；所述的活化，活化温度为室温，活化时间为10～30min；所述的第一反应，反应温度为室温。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的醛基修饰的透明质酸的制备方法为：将透明质酸溶于去离子水，得到混合液C；向混合液C中加入高碘酸钠进行第二反应，反应结束后淬灭反应，将反应液透析，冻干，即得。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述的透明质酸中羧酸环与高碘酸钠的摩尔比为1：1～2.5；所述的第二反应，避光反应，反应温度为室温，反应时间为4～8h；所述的淬灭反应，通过向反应液中加入乙二醇淬灭反应，透明质酸与乙二醇的质量体积比为1g：1～5mL。

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的制备方法包括如下步骤：

步骤(2)和步骤(3)在惰性气体保护下进行。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的有机溶剂为四氢呋喃；所述的混合液D中6-氨基己酸的浓度为0.05～0.25g/mL；所述的6-氨基己酸、氢氧化钠与丙烯酰氯的摩尔比为1：1～1.2：1～1.2；所述的第三反应，反应温度为-4～4℃，反应时间为8～12h。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述的6-丙烯酰基氨基己酸、氢氧化钠、β-巯基乙醇、过硫酸铵与四甲基乙二胺的摩尔比为50：50～60：0.1～2：0.1～1：0.1～1；所述的第四反应，反应温度为22～27℃，反应时间为8～12h。

11.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的聚6-氨基己酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与多巴胺盐酸盐的摩尔比为10：1～3：0.5～2：1～3；所述的第五反应，避光反应，反应温度25～35℃，反应时间为8～12h。

12.权利要求1～11中的任意一项所述的制备方法制备得到的聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶。

13.根据权利要求12所述的聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶，其特征在于，所述的复合水凝胶中，酰肼修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，醛基修饰的透明质酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL，多巴胺封端改性的聚6-氨基己酸的最终浓度为0.3％～1％g/mL。

14.权利要求12所述的聚6-氨基己酸/透明质酸基多功能复合水凝胶在制备抗炎、抗菌医用材料中的应用。