CN115710272A - 一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法 - Google Patents
一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法。本发明以维生素B2为原料，合成含乙烯基和低聚PEG链的异咯嗪衍生物；再与其他单体通过共聚得到含异咯嗪侧基的氧化还原聚合物；最后将氧化还原聚合物与酶溶液混合，并将混合溶液滴于电极表面，制备葡萄糖氧化酶电极。本发明的含乙烯基的异咯嗪衍生物的化学结构中含有大量乙氧基以及多个活泼氢，能够在体系中形成氢键网络，电子亲合和离去的势能更低，从而形成更高效的电子传输，改善酶生物传感器的灵敏度。本发明所需原材料组分简单，合成工艺反应条件温和，简单易控，绿色环保，适于大规模工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及材料科学技术领域，具体涉及一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法。
背景技术
糖尿病是一个全球性的公共卫生问题，已经夺去了许多人的生命，并导致世界上许多其他人的残疾。由于胰岛素缺乏和高血糖，糖尿病患者的血糖浓度高于正常范围(4.4–6.6mM)，并有心脏病、肾衰竭或失明等严重并发症的风险。世界卫生组织估计，到2025年，糖尿病患者人数将超过3亿。通过严格监测血糖水平，糖尿病可以被及时发现并得到有效控制。
自Clark和Lyons于1962年首次制备酶电极，提出了酶生物传感器的概念。过去60年来，研究人员一直致力于开发具有良好灵敏度、稳定性和抗干扰能力强的高效葡萄糖生物传感器。第一代葡萄糖生物传感器的原理是通过测定H2O2的产生量，从而间接测定葡萄糖的含量。由于H2O2的检测电位高，血液中抗坏血酸、谷胱甘肽、尿素等许多还原性物质对检测结果有较大干扰。为克服第一代葡萄糖传感器存在的缺陷，研究人员开发了第二代葡萄糖生物传感器，其原理是在葡萄糖氧化酶电极中引入电子介体，电子介体从氧化形式的葡萄糖氧化酶的活性中心获得电子被氧化，然后在电极表面失去电子被还原，从而加强酶与电极之间的电子传递。若使用具有较低氧化电位的电子介体，在测定葡萄糖时，可以避免其他电活性物质的干扰，提高测定的灵敏度和准确性。为了制备具有高灵敏度和抗干扰性能强的葡萄糖传感器，上海交通大学朱新远教授团队根据葡萄糖氧化酶活性中心(FAD)的结构，首次报道了一系列含乙烯基的异咯嗪衍生物，并以其为电子介体应用于酶生物传感器，显著改善了酶生物传感器的灵敏度和抗干扰能力(Xinyuan Zhu,et al,Biosensors andBioelectronics,2021,174,112805；Xinyuan Zhu,et al,ACS Applied EnergyMaterials,2021,4,5034–5042)。但是合成的化合物中电子传输能力仍显不足，导致传感器的灵敏度还有待提升。因此，亟需开发一种性能更优的含乙烯基的异咯嗪衍生物。
发明人在前的专利CN202211443367.1，是在维生素B2类似物的NH上接枝短PEG，末端带有烯基，得到一种可聚合的维生素B2作为葡萄糖传感器酶电极的聚合物单体，但灵敏度还有进一步提高的空间。
发明内容
本发明针对现有技术中含乙烯基的异咯嗪衍生物在实际应用过程中对促进酶与电极之间电子传递的效果有限，提供一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法，可用于构建灵敏度高和抗干扰能力强的酶生物传感器。
本发明第一个目的是提供一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物，其结构如通式(I)所示：
其中，R1、R2、R3、R4独立地选自H、羟基、C1-4的烷基，C2-4的烯基，C1-4的烷氧基，或者R1、R2、R3、R4中相邻的基团构成一个稠合环；R2选自H、C1-4的烷基，C(O)-R3，R3选自C1-4的烷基；m为1～15之间的整数，比如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15。
进一步地，所述用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物结构如下通式(II)所示：
其中，m＝1～13之间的整数。
进一步地，所述用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物为以下化合物之一：
本发明第二个目的是提供一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物的制备方法，合成路线如下：
按照上述制备方法得到式(II)所示的含乙烯基的异咯嗪衍生物，式(I)所示化合物可以通过带有相应基团的维生素B2衍生物制备得到，也可以再得到式(II)化合物后，对其进行R1，R2基团的取代反应得到。
进一步地，所述用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物的制备方法，包括以下步骤：
S1.将维生素B2加入到稀硫酸中搅拌，冰浴，缓慢滴加氧化剂溶液；待滴加结束后，移除冰浴，室温反应，待反应结束，经提纯，真空干燥得中间体FMF，其结构式为：
S2.将步骤S1中的FMF和冰醋酸加入溶剂，升温反应，缓慢滴加单体1，待反应，反应结束后降温至室温，加入还原剂，待反应结束，经提纯，真空干燥得到含有可聚合基团乙烯基改性的异咯嗪衍生物；
其中，m＝1～13的整数。
进一步地，所述氧化剂选自高碘酸、高碘酸钠和高碘酸钾中的至少一种；所述还原剂为硼氢化钠和氰基硼氢化钠中的至少一种。
更进一步地，维生素B2，氧化剂，还原剂摩尔比为1：2-6：1-5。
进一步地，步骤S2中所述溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4二氧六环、丙酮和乙腈中的至少一种；步骤S3中所述溶剂为乙醇、甲醇、1,4二氧六环和四氢呋喃中的至少一种。
进一步地，FMF和单体1的摩尔比为1：2-7，优选1:4-6。单体1成本低，因此单体1过量，有利于提高化合物FMF的转化率。
进一步地，所述单体1是通过包括以下步骤的制备方法得到：将双端氨基低聚乙二醇(NH2-PEGm-NH2)加入溶剂中，加入碱，搅拌，冰浴反应，缓慢滴加丙烯酰氯溶液，滴加完成后撤去冰浴，待反应结束，经提纯，油泵抽干得单体1，其结构通式为：
其中，m＝1～13的整数。
所述碱选自三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氟化铯、正丁基锂、叔丁醇钾、叔丁醇纳、六甲基二硅基胺基锂合氢化钠中的至少一种；所述双端氨基低聚乙二醇，丙烯酰氯和碱的摩尔比为1：0.9-1:1-2。
进一步地，步骤S1、S2中所述提纯方式为硅胶层析法，所述真空干燥温度40～120℃，所述干燥时间为6～30h。
优选地，步骤S1、S2中所述干燥温度60～80℃，所述干燥时间为18～24h。
本发明第三个目的是提供一种氧化还原共聚物，所述氧化还原共聚物的单体包括上述乙烯基的异咯嗪衍生物，丙烯酰胺，N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺；更进一步地，含乙烯基的异咯嗪衍生物，丙烯酰胺，N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为3-5:10-15:1-1.5。
所述氧化还原共聚物通过包括以下步骤的制备方法得到：将含乙烯基的异咯嗪衍生物、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)聚合得到氧化还原聚合物；优选地，聚合反应条件是在DMSO中，惰性气氛下，加入引发剂升温反应；所述升温是升温至50-60℃，聚合反应时间2-4h，所述引发剂为过硫酸钠，过硫酸钾，过硫酸铵中的至少一种；聚合反应结束后用截留分子量为10000-13000的透析袋进行透析，2-4h换一次透析液，除去未反应的单体、副产物以及部分低聚物；最终冷冻干燥得到氧化还原聚合物。
本发明第四个目的是提供一种酶修饰电极，是混合酶溶液滴加在电极上表面干燥得到，所述混合酶溶液的溶质包括上述氧化还原共聚物和葡萄糖氧化酶，所述氧化还原共聚物的单体包括上述用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物。
进一步地，葡萄糖氧化酶占氧化还原共聚物质量的1-3wt％。
进一步地所述电极是羧基化碳纳米管修饰的玻碳电极。
进一步地，所述酶修饰电极是通过包括以下步骤的制备方法得到：
(1)将含乙烯基的异咯嗪衍生物、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)聚合得到氧化还原聚合物；
(2)氧化还原聚合物和葡萄糖氧化酶溶于缓冲溶液中，得到混合酶溶液；
(3)羧基化碳纳米管(cMWCNTs)分散液滴加在玻碳电极上，干燥，再滴加混合酶溶液，在2-5℃下干燥，得到葡萄糖氧化酶修饰电极。
进一步地，步骤(2)中，所述缓冲溶液是pH为7.2-7.4的PBS缓冲溶液。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计合成了一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物，此类化合物可与其他单体共聚制备可用作电子介体的氧化还原聚合物，具有一下优势：
(1)本发明涉及的含乙烯基的异咯嗪衍生物的化学结构中含有大量乙氧基以及多个仲胺，能够在体系中形成氢键网络，在多氢键环境中，电子亲合和离去的势能更低，从而形成更高效的电子传输，改善酶生物传感器的灵敏度。
(2)相较于C-C键，在C-O键中，氧原子周围没有其它的原子和基团，C-O键的存在使非近邻原子之间的距离比C-C键上非近邻原子问的距离大，内旋转容易，从而有利于传递电子。
(3)PEG链段通过空间排斥和表面水合作用而具有优异的防污性能，可以有效阻碍干扰源在酶修饰电极表面的非特异性结合，提高传感器的抗干扰能力。
本发明所提出的用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物所需原材料组分简单，合成工艺反应条件温和，简单易控，绿色环保。制备的产品易纯化，杂质较少，产率较高，因而适于大规模工业生产。
附图说明
图1是实施例2制得产物FMF-N-PEG-3的核磁氢谱图；
图2是实施例1酶修饰电极在电解液(pH＝7.4的PBS缓冲液)中加入葡萄糖前后酶修饰电极的CV曲线；
图3是实施例2酶修饰电极在电解液(pH＝7.4的PBS缓冲液)中加入葡萄糖前后酶修饰电极的CV曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明实施例使用的各种原料均可以通过常规市购得到，或根据本领域的常规方法制备得到，所用设备为实验常用设备。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人员所熟悉的意义相同。
实施例1
本实施例提供一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法，具体步骤包括：
S1.FMF-N-PEG-1的合成：
S11.合成中间体7,8-二甲基-10-乙醛基-异咯嗪(FMF)：
将5.6g(14.9mmoL,1eq)维生素B2添加到140mL的稀硫酸(1:35(v/v))中，0℃搅拌成悬浮液。接着，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加90mL高碘酸水溶液(12.50g,54.8mmoL,3.7eq)；待溶液滴加完成后，室温过夜反应。待反应结束后，加入2g活性炭，缓慢搅拌30分钟。随后，将反应液过滤，收集滤液，用饱和的Na2CO3溶液将滤液的pH值调整到3.9，析出黄色物质。然后，高速离心得到黄色沉淀，并依次用甲醇，水和乙醚洗涤，最后60℃真空干燥24h，产率为50％。该中间体结构如下：
S12.合成NH2-PEG-1：
具体合成过程如下：将104.2mg(1mmol)2,2'-氧双(乙胺)、101.2mg(1mmol)三乙胺和10mL超干的乙酸乙酯加入到25mL的单口瓶中，冰浴磁力搅拌，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加90.5mg(1mmol)丙烯酰氯，滴加完毕后，室温反应24h。TLC跟踪反应，待反应结束后，抽滤得到滤液；接着将反应液减压蒸去溶剂，产物以石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1(体积比)为流动相，以硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到无色液体，油泵抽干，得到110.7mg产物，产率为70％。该中间体结构如下：
S13.合成FMF-N-PEG-1：
具体合成过程如下：将400mg(1.41mmol)FMF加入到60mL甲醇中，磁力搅拌形成良好的分散液，再加入0.28mL冰醋酸，油浴加热至50℃后缓慢滴加8.34mmol NH2-PEG-1，反应2h，获得褐色的席夫碱中间体。移除油浴，待反应液冷却到室温，加入220mg NaBH3CN(3.5mmoL)，室温下反应16h。TLC跟踪反应，待反应结束后，将反应液减压蒸去溶剂，产物以乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1(体积比)为流动相、硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到橘红色固体，60℃真空干燥24h，产率为50％。
S2.共聚物poly(FMF-N-PEG-1-AM)的合成
将FMF-N-PEG-1、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)加入二甲基亚砜(DMSO)中，将反应液混合均匀，持续氮气鼓泡30min，尽可能排除溶液中氧气；缓慢加入四甲基乙二胺(TEMED)后，迅速加入过硫酸铵(APS)，将混合物加热至50℃反应2小时；待反应结束后，采用截留分子量为10000的透析袋在DMSO中透析，2h换一次透析液，除去未反应的单体、副产物以及部分低聚物；接着在去离子水中透析，完成溶剂置换，待置换完成后，将共聚物的水溶液冷冻干燥得到共聚物poly(FMF-N-PEG-1-AM)。聚合反应中各个反应物的摩尔比参照表1。
表1共聚物poly(FMF-N-PEG-1-AM)的合成参数
| FMF-N-PEG-1 | AAm | NAS | APS | TEMED |
| 2000 | 6000 | 600 | 400 | 1000 |
*所有数字均表示摩尔比
S3.酶修饰电极的制备
取10mg poly(FMF-N-PEG-1-AM)和10mg葡萄糖氧化酶溶于1mL pH＝7.4的PBS缓冲液，混合均匀，反应1小时。同时，将玻碳电极(GCE)(直径3mm)依次用300nm和50nm粒径的氧化铝浆料进行打磨，然后依次用超纯水和乙醇进行清洗。接着将10μL羧基化碳纳米管(cMWCNTs)分散液(1mg/mL)滴加在抛光的GCE表面，并将电极在室温下干燥，所得电极表示为cMWCNT/GCE。接着，取10μl混合酶溶液滴加到cMWCNT/GCE表面，在4℃下干燥，得到葡萄糖氧化酶修饰电极1。
S4.酶修饰电极的葡萄糖响应性：
选用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极和上述自制酶修饰电极作为工作电极构建三电极体系，使用循环伏安法测试20mM glucose溶液(pH＝7.4的PBS缓冲液)对应的响应电流。
实施例2
本实施例提供一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法，具体步骤包括：
S1.FMF-N-PEG-3的合成：
S11.合成NH2-PEG-3：
具体合成过程如下：将192.3mg(1mmol)氨基-三聚乙二醇-氨基、84mg(1mmol)碳酸氢钠和10mL超干的乙酸乙酯加入到25mL的单口瓶中，冰浴磁力搅拌，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加90.5mg(1mmol)丙烯酰氯，滴加完毕后，室温反应24h。TLC跟踪反应，待反应结束后，抽滤得到滤液；接着将反应液减压蒸去溶剂，产物以石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1(体积比)为流动相，以硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到无色液体，油泵抽干，得到160.1mg产物，产率为65％。该中间体结构如下：
S12.合成FMF-N-PEG-3：
具体合成过程如下：将400mg(1.4mmol)FMF加入到60mL甲醇中，磁力搅拌形成良好的分散液，再加入0.28mL冰醋酸，油浴加热至50℃后缓慢滴加8.34mmol NH2-PEG-3，反应2h，获得褐色的席夫碱中间体。移除油浴，待反应液冷却到室温，加入220mg NaBH3CN(3.5mmoL)，室温下反应18h。TLC跟踪反应，待反应结束后，将反应液减压蒸去溶剂，产物以乙酸乙酯∶甲醇＝10∶1(体积比)为流动相、硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到橘红色固体，80℃真空干燥24h，得到231.6mg产物，产率为45％。
S2.共聚物poly(FMF-N-PEG-3-AM)的合成
将FMF-N-PEG-3、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)加入二甲基亚砜(DMSO)中，将反应液混合均匀，持续氮气鼓泡30min，尽可能排除溶液中氧气；缓慢加入四甲基乙二胺(TEMED)后，迅速加入过硫酸铵(APS)，将混合物加热至50℃反应2小时；待反应结束后，采用截留分子量为10000的透析袋在DMSO中透析，2h换一次透析液，除去未反应的单体、副产物以及部分低聚物；接着在去离子水中透析，完成溶剂置换，待置换完成后，将共聚物的水溶液冷冻干燥得到共聚物poly(FMF-N-PEG-3-AM)。聚合反应中各个反应物的摩尔比参照表2。
表2共聚物poly(FMF-N-PEG-3-AM)的合成参数
| FMF-N-PEG-3 | AAm | NAS | APS | TEMED |
| 2000 | 6000 | 600 | 400 | 1000 |
*所有数字均表示摩尔比
S3.酶修饰电极的制备
取10mg poly(FMF-N-PEG-3-AM)和10mg葡萄糖氧化酶溶于1mL pH＝7.4的PBS缓冲液，混合均匀，反应1小时。同时，将玻碳电极(GCE)(直径3mm)依次用300nm和50nm粒径的氧化铝浆料进行打磨，然后依次用超纯水和乙醇进行清洗。接着将10μL cMWCNTs分散液(1mg/mL)滴加在抛光的GCE表面，并将电极在室温下干燥，所得电极表示为cMWCNT/GCE。接着，取10μl混合酶溶液滴加到cMWCNT/GCE表面，在4℃下干燥，得到葡萄糖氧化酶修饰电极2。
S4.酶修饰电极的葡萄糖响应性：
选用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极和上述自制酶修饰电极作为工作电极构建三电极体系，使用循环伏安法测试20mM glucose溶液(pH＝7.4的PBS缓冲液)对应的响应电流。
实施例3
本实施例提供一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物及其制备方法，具体步骤包括：
S1.FMF-N-PEG-13的合成：
S11.合成NH2-PEG-13：
具体合成过程如下：将632.8mg(1mmol)氨基-十三聚乙二醇-氨基、84mg(1mmol)碳酸氢钠和10mL超干的四氢呋喃加入到25mL的单口瓶中，冰浴磁力搅拌，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加90.5mg(1mmol)丙烯酰氯，滴加完毕后，室温反应24h。TLC跟踪反应，待反应结束后，抽滤得到滤液；接着将反应液减压蒸去溶剂，产物以石油醚∶乙酸乙酯＝5∶1(体积比)为流动相，以硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到无色液体，油泵抽干，得到412.1mg产物，产率为60％。该中间体结构如下：
S12.合成FMF-N-PEG-13：
具体合成过程如下：将400mg(1.41mmol)FMF加入到60mL甲醇中，磁力搅拌形成良好的分散液，再加入0.28mL冰醋酸，油浴加热至50℃后缓慢滴加8.34mmol NH2-PEG-13，反应2h，获得褐色的席夫碱中间体。移除油浴，待反应液冷却到室温，加入220mg NaBH3CN(3.5mmoL)，室温下反应18h。TLC跟踪反应，待反应结束后，将反应液减压蒸去溶剂，产物以乙酸乙酯∶甲醇＝5∶1(体积比)为流动相、硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到橘红色固体，80℃真空干燥24h，得到615.1mg产物，产率为46％。
S2.共聚物poly(FMF-N-PEG-13-AM)的合成
将FMF-N-PEG-13、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)加入二甲基亚砜(DMSO)中，将反应液混合均匀，持续氮气鼓泡30min，尽可能排除溶液中氧气；缓慢加入四甲基乙二胺(TEMED)后，迅速加入过硫酸铵(APS)，将混合物加热至50℃反应2小时；待反应结束后，采用截留分子量为10000的透析袋在DMSO中透析，2h换一次透析液，除去未反应的单体、副产物以及部分低聚物；接着在去离子水中透析，完成溶剂置换，待置换完成后，将共聚物的水溶液冷冻干燥得到共聚物poly(FMF-N-PEG-13-AM)。聚合反应中各个反应物的摩尔比参照表3。
表3共聚物poly(FMF-N-PEG-13-AM)的合成参数
| FMF-N-PEG-13 | AAm | NAS | APS | TEMED |
| 2000 | 6000 | 600 | 400 | 1000 |
*所有数字均表示摩尔比
S3.酶修饰电极的制备
取10mg poly(FMF-N-PEG-13-AM)和10mg葡萄糖氧化酶溶于1mL pH＝7.4的PBS缓冲液，混合均匀，反应1小时。同时，将玻碳电极(GCE)(直径3mm)依次用300nm和50nm粒径的氧化铝浆料进行打磨，然后依次用超纯水和乙醇进行清洗。接着将10μL cMWCNTs分散液(1mg/mL)滴加在抛光的GCE表面，并将电极在室温下干燥，所得电极表示为cMWCNT/GCE。接着，取10μl混合酶溶液滴加到cMWCNT/GCE表面，在4℃下干燥，得到葡萄糖氧化酶修饰电极3。
S4.酶修饰电极的葡萄糖响应性：
选用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极和上述自制酶修饰电极作为工作电极构建三电极体系，使用循环伏安法测试20mM glucose溶液(pH＝7.4的PBS缓冲液)对应的响应电流。
对比例1
S1.HEF-C-13的合成
S11.合成11-溴丙烯酸癸酯：
具体合成过程如下：将502.4mg(2mmol)11-溴-1-十一醇、303.6mg(3mmol)三乙胺和10mL超干的THF加入到25mL的单口瓶中，冰浴磁力搅拌，通过恒压滴液漏斗缓慢滴加362mg(4mmol)丙烯酰氯，滴加完毕后，室温反应24h。TLC跟踪反应，待反应结束后，抽滤得到滤液；接着将反应液减压蒸去溶剂，产物以石油醚∶乙酸乙酯＝20∶1(体积比)为流动相，以硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到无色液体，油泵抽干，得到427mg产物，产率为70％。11-溴丙烯酸癸酯的结构如下：
S2.合成HEF-C-13：
具体合成过程如下：将286.3mg(1mmol)HEF、691mg(5mmol)碳酸钾和60mL DMF加入到150mL的单口瓶中，磁力搅拌，油浴加热至60℃后，加入1526.3mg(5mmol)11-bromoundecyl acrylate，避光反应18h。TLC跟踪反应，待反应结束后，加入100mL DMF，抽滤得到滤液；接着将反应液减压蒸去溶剂，产物以石油醚∶乙酸乙酯＝1∶10(体积比)为流动相，以硅胶为固定相作柱色谱提纯，收集产物并旋干得到黄色固体，在60℃真空中干燥24h，得到306mg产物，产率为60％。
S2.共聚物poly(HEF-C-13-AM)的合成
将HEF-C-13、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)加入二甲基亚砜(DMSO)中，将反应液混合均匀，持续氮气鼓泡30min，尽可能排除溶液中氧气；缓慢加入四甲基乙二胺(TEMED)后，迅速加入过硫酸铵(APS)，将混合物加热至50℃反应2小时；待反应结束后，采用截留分子量为10000的透析袋在DMSO中透析，2h换一次透析液，除去未反应的单体、副产物以及部分低聚物；接着在去离子水中透析，完成溶剂置换，待置换完成后，将共聚物的水溶液冷冻干燥得到共聚物poly(HEF-C-13-AM)。聚合反应中各个反应物的摩尔比参照表4。
表4共聚物poly(HEF-C-13-AM)的合成参数
| HEF-C-13 | AAm | NAS | APS | TEMED |
| 2000 | 6000 | 600 | 400 | 1000 |
*所有数字均表示摩尔比
S3.酶修饰电极的制备
取10mg poly(HEF-C-13-AM)和10mg葡萄糖氧化酶溶于1mL pH＝7.4的PBS缓冲液，混合均匀(poly(HEF-C-13-AM)在1mL pH＝7.4的PBS缓冲液中只能溶解0.5g)，反应1小时。同时，将玻碳电极(GCE)(直径3mm)依次用300nm和50nm粒径的氧化铝浆料进行打磨，然后依次用超纯水和乙醇进行清洗。接着将10μL cMWCNTs分散液(1mg/mL)滴加在抛光的GCE表面，并将电极在室温下干燥，所得电极表示为cMWCNT/GCE。接着，取10μl混合酶溶液滴加到cMWCNT/GCE表面，在4℃下干燥，得到葡萄糖氧化酶修饰电极5。
S4.酶修饰电极的葡萄糖响应性：
使用电化学工作站测试在电解液(pH＝7.4的PBS缓冲液)中加入葡萄糖前后酶修饰电极的CV曲线。
对比例2
S1.酶修饰电极的制备
取10mg葡萄糖氧化酶溶于1mL pH＝7.4的PBS缓冲液，混合均匀，反应1小时；取10μl酶溶液滴加到cMWCNT/GCE表面，在4℃下干燥，得到葡萄糖氧化酶修饰电极4。
S2.酶修饰电极的葡萄糖响应性：
选用Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极和上述自制酶修饰电极作为工作电极构建三电极体系，使用循环伏安法测试20mM glucose溶液(pH＝7.4的PBS缓冲液)对应的响应电流。
将前后CV曲线中氧化峰电流密度的增加定义为催化电流(ΔIp)，结果如下表5所示：
表5
由图2和图3可知，以含异咯嗪环的氧化还原聚合物为电子介体构建的酶修饰电极具有较高的催化电流和较低的氧化还原电位。由表5可知，本发明制备的酶修饰电极对葡萄糖都具有优异的响应性，且实施例均优于对比例1，而且催化电流(ΔIp)随着PEG链长度的增加而增大，我们认是因为含乙烯基的异咯嗪衍生物的化学结构中含有大量乙氧基以及多个仲胺，能够在体系中形成氢键网络，在多氢键环境中，电子亲合和离去的势能更低，从而形成更高效的电子传输；此外，相较于C-C键，在C-O键中，氧原子周围没有其它的原子和基团，C-O键的存在使非近邻原子之间的距离比C-C键上非近邻原子问的距离大，内旋转容易，从而有利于传递电子；这些因素都有助于改善酶生物传感器的灵敏度。
Claims (10)
1.一种用于酶生物传感器的含乙烯基的异咯嗪衍生物，其特征在于，所述衍生物结构如通式所示：
其中，m＝1～13。
2.权利要求1所述含乙烯基的异咯嗪衍生物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S11.将维生素B2加入到稀硫酸中搅拌，冰浴，缓慢滴加强氧化剂溶液；待滴加结束后，移除冰浴，室温反应，待反应结束，经提纯，真空干燥得到7,8-二甲基-10-乙醛基-异咯嗪(FMF)，其结构式为：
S12.将含有两个氨基取代的低聚乙二醇加入溶剂中，加入碱，搅拌，冰浴反应，缓慢滴加丙烯酰氯溶液，滴加完成后撤去冰浴，待反应结束，经提纯，油泵抽干得中间单体1，其结构通式为：
其中，m＝1～13；
S13.将步骤S11中的FMF和冰醋酸加入溶剂，升温反应，缓慢滴加步骤S12中的单体1，待反应一定时间后，将至室温，加入还原剂，待反应结束，经提纯，真空干燥得到含乙烯基的异咯嗪衍生物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S11中维生素B2与强氧化剂的摩尔比为1:2～1:6；所述步骤S12中两个氨基取代的低聚乙二醇与丙烯酰氯的摩尔比为1:0.5～1:1.2，碱与丙烯酰氯的摩尔比为1:1～1:2；所述步骤S13中FMF与单体1的摩尔比为1:2～1:7，还原剂与FMF的摩尔比为1:1～1:5。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S11中所述强氧化剂为高碘酸、高碘酸钠或高碘酸钾中的一种或几种；步骤S12中所述碱为三乙胺、碳酸钠、碳酸钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氟化铯、正丁基锂、叔丁醇钾、叔丁醇纳、六甲基二硅基胺基锂或氢化钠中的一种或几种；步骤S13中所述还原剂为硼氢化钠或者氰基硼氢化钠；
优选地，步骤S12中所述溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4二氧六环、丙酮或乙腈中的一种或几种；步骤S13中所述溶剂为乙醇、甲醇、1,4二氧六环或四氢呋喃中的一种或几种。
5.权利要求1所述含乙烯基的异咯嗪衍生物的应用，其特征在于，用于构建灵敏度高和抗干扰能力强的酶生物传感器。
6.一种氧化还原共聚物，其特征在于，所述氧化还原共聚物的单体包括权利要求1所述的含乙烯基的异咯嗪衍生物，丙烯酰胺，N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺；进一步地，含乙烯基的异咯嗪衍生物，丙烯酰胺，N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺的摩尔比为3-5:10-15:1-1.5。
7.权利要求6所述氧化还原共聚物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将含乙烯基的异咯嗪衍生物、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)聚合得到氧化还原聚合物；优选地，聚合反应条件是在DMSO中，惰性气氛下，加入引发剂升温反应；所述升温是升温至50-60℃，聚合反应时间2-4h，所述引发剂为过硫酸钠，过硫酸钾，过硫酸铵中的至少一种；聚合反应结束后用截留分子量为10000-13000的透析袋进行透析，2-4h换一次透析液，除去未反应的单体、副产物以及部分低聚物；最终冷冻干燥得到氧化还原聚合物。
8.一种酶修饰电极，是混合酶溶液滴加在电极上表面干燥得到，其特征在于，所述混合酶溶液的溶质包括氧化还原共聚物和葡萄糖氧化酶；所述氧化还原共聚物为权利要求7所述的氧化还原共聚物，或者氧化还原共聚物的单体包括权利要求1所述的含乙烯基的异咯嗪衍生物。
9.根据权利要求8所述的酶修饰电极，其特征在于，葡萄糖氧化酶占氧化还原共聚物质量的1-3wt％；
进一步地，所述电极是羧基化碳纳米管修饰的玻碳电极。
10.权利要求8或9所述的酶修饰电极的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将含乙烯基的异咯嗪衍生物、丙烯酰胺(AAm)和N-丙烯酰氧基琥珀酰亚胺(NAS)聚合得到氧化还原聚合物；
(2)氧化还原聚合物和葡萄糖氧化酶溶于缓冲溶液中，得到混合酶溶液；
(3)羧基化碳纳米管(cMWCNTs)分散液滴加在玻碳电极上，干燥，再滴加混合酶溶液，在2-5℃下干燥，得到葡萄糖氧化酶修饰电极；
进一步地，步骤(2)中，所述缓冲溶液是pH为7.2-7.4的PBS缓冲溶液。
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