CN115698710A - 使用自动化平台制备打印在载玻片上的生物标志物和罗曼诺夫斯基型染色的样品 - Google Patents

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K.K.穆伊
M.塔克
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Abstract

本公开一般地涉及用于检测、表征细胞样品中的生物标志物表达和形态分析的方法和系统。所述方法允许使用自动化平台进行对细胞的分子生物标志物染色以及罗曼诺夫斯基型染色以用于细胞形态分析。根据所公开的方法制备的细胞也可以用于某些病况的诊断中。

Description

使用自动化平台制备打印在载玻片上的生物标志物和罗曼诺 夫斯基型染色的样品
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月20日提交的美国临时专利申请号63/027,720的优先权，该美国临时专利申请全文以引用方式并入。
背景技术
本公开整体涉及用于对细胞样品中的生物标志物表达进行检测、表征和形态学分析的方法和系统。这些方法允许使用自动化平台进行对细胞的分子生物标志物染色以及罗曼诺夫斯基(Romanowsky)型染色以用于细胞形态分析。根据所公开的方法制备的细胞也可以用于某些病况的诊断中。
细胞样品可用于诊断，包括使用血液样品进行筛查和诊断。对于使用血液样品进行诊断，通常使用血液样品的一部分进行形态学分析。经染色以用于形态学分析的样品一般不可重复使用。利用流式细胞术评估血液样品的一个单独的部分来检测分子标志物。在将样品的一部分用于形态学分析并且将一个单独的部分用于流式细胞术分析的情况下，不可能在形态学异常的细胞与针对分子生物标志物染色的细胞之间进行一对一比较。另外，该工作流程既昂贵又费时。
因此，需要用于允许在形态学异常的细胞与针对分子生物标志物染色的细胞之间进行比较的样品制备和分析的组合物和方法。
发明内容
本公开整体涉及用于样品制备和分析的方法。这些方法有利地允许在形态学异常的细胞与针对分子生物标志物染色的细胞之间进行比较。这些方法允许使用自动化平台进行对细胞的分子生物标志物染色以及罗曼诺夫斯基型染色以用于细胞形态分析。根据所公开的方法制备的细胞也可以用于某些病况的诊断中。
附图说明
在考虑以下详细描述时，将更好地理解本发明，并且在上文所述的特征、方面和优势以外的其他特征、方面和优势将变得更加显而易见。此类详细描述参考了以下附图，其中：
图1示出体液样品中CD 45染色和罗曼诺夫斯基型染色的荧光图像。
图2示出使用多重染色方法的CD 45和CD 20染色的荧光图像。带框区域示出同一细胞的CD 45阳性/CD 20阴性染色。
图3A至3C示出用罗曼诺夫斯基染色剂(图3A)、CD 45生物标志物(图3B)和CD14APC(图3C)染色的细胞样品。Mon＝单核细胞；Lym＝淋巴细胞；Neu＝嗜中性粒细胞；Neu？＝可能的嗜中性粒细胞。
图4A和4B示出用罗曼诺夫斯基染色剂(图4A)和CD 45生物标志物(图4B)染色的细胞样品。
图5A和5B示出用罗曼诺夫斯基染色剂(图5A)和CD 45生物标志物(图5B)染色的细胞样品。
图6A和6B示出经CD 45(图6A)和罗曼诺夫斯基染色剂(图6B)染色的细胞样品。
图7A和7B示出经CD 45(图7A)和罗曼诺夫斯基染色剂(图7B)染色的细胞样品。
图8示出经CD 45染色的细胞样品。
图9A至9D示出经罗曼诺夫斯基染色(图9A)、经CD 45染色(图9B)、经CD3染色(图9C；淋巴细胞被圈出)以及C19染色(图9D)的细胞样品。
图10A至10D示出经罗曼诺夫斯基染色剂(图10A)、经CD 45染色(图10B)、经CD3染色(图10C)以及经C19染色(图10D；淋巴细胞被圈出)的细胞样品。
图11A至11D示出经罗曼诺夫斯基染色(图11A)、经CD 45染色(图11B)、经C19染色(图11C)、经CD3染色(图11D)以及经CD16和56染色(图11E)的细胞样品。
图12A至12E示出经罗曼诺夫斯基染色(图12A)、经CD 45染色(图12B)、经C19染色(图12C)、经CD3染色(图12D)以及经CD16和56染色(图12E)的细胞样品。
图13A至13E示出经罗曼诺夫斯基染色(图13A)、经CD 45染色(图13B)、经C19染色(图13C)、经CD3染色(图13D)以及经CD16和56染色(图13E)的细胞样品。
图14示出经罗曼诺夫斯基染色、经CD 45染色、经CD 19染色、经CD3染色以及经CD16和56染色的相同细胞样品。
图15A和15B示出经CD3、CD4、CD8、CD16和CD19染色(图15A)以及经罗曼诺夫斯基染色(图15B)的细胞样品。
图16示出经CD4(BV750)染色、经CD3(AF488)染色、经CD19(AF594)染色、经CD16(AF647)染色、经CD8(JF549)染色的细胞样品以及组合荧光图像。
图17A和17B示出经CD3、CD4、CD8、CD16和CD19染色(图17A)以及经罗曼诺夫斯基染色(图17B)的细胞样品。
图18示出经CD3(AF488)、CD4(BV750)、CD8(JF549)、CD16(AF647)、CD19(AF594)染色的细胞样品的单独的图以及组合荧光图像。
图19A和19B示出经CD3、CD4、CD8和CD16染色(图19A)以及经罗曼诺夫斯基染色(图19B)的细胞样品。
图20示出经CD3(AF488)、CD4(BV750)、CD8(JF549)、CD16(AF647)、CD19(AF594)染色的细胞样品的单独的图以及组合荧光图像。
图21A和21B示出经CD3、CD4、CD8和CD16染色(图21A)以及经罗曼诺夫斯基染色(图21B)的细胞样品。
图22示出经CD3(AF488)、CD4(BV750)、CD8(JF549)、CD16(AF647)、CD19(AF594)染色的细胞样品的单独的图以及组合荧光图像。
具体实施方式
除非另外定义，否则本文所用的所有科学技术术语的含义与本公开所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本公开的实践或检测中，但是下文描述了优选的方法和材料。
在介绍本公开的要素或其各种版本、实施例或方面时，“一(a)”、“一个/一种(an)”、“该(the)”和“所述(said)”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含(comprising/comprise/comprises)”、“包括(including)”、“具有(having)”旨在具有包含性的含义，并且意指可以存在除所列要素以外的附加要素。
如本文所用，术语“受试者”或“个体”是哺乳动物。合适的哺乳动物包括例如驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。
如本文所用，“样品”是指从能够被检测生物标志物的存在或不存在的受试者获得的任何材料。如本文所用，术语“细胞样品(cellular sample/cell sample)”是指任何含有完整细胞的样品，诸如细胞培养物、体液样品和手术样品，采集该细胞样品以用于病理、组织学或细胞学解释。合适的样品包括例如体液样品(诸如全血、骨髓、尿液、精液、唾液、痰、乳头溢液、母乳、5滑液、脑脊髓液(CSF)、腹水、腹膜液、心包液、胆汁、胃液、粘液、淋巴液、汗液、泪液、呕吐物、胸膜液、耳垢、鼻腔排出物或分泌物、或skene腺液)，体液级分(诸如血液级分，包括血浆、血沉棕黄层和红细胞级分)，细针抽吸物(诸如骨髓抽吸物)，洗涤液(诸如支气管灌洗液、支气管肺泡灌洗液、鼻腔灌洗液、冲洗液或灌肠剂)，以及刮片或取样刷采集的样品(诸如用刮片或取样刷从子宫颈、肛门、口腔、食道、胃或细支气管采集的样品)。
如本文所用，“可检测部分”是指可产生指示沉积在样品上的可检测部分的存在(即定性分析)和/或浓度(即定量分析)的可检测信号(诸如视觉、电子或其他方式)的分子或材料。可以通过任何已知的或尚待发现的机制生成可检测信号，所述机制包括光子(包括射频、微波频率、红外频率、可见光频率和紫外频率光子)的吸收、发射和/或散射。术语“可检测部分”包括：显色的、荧光的、磷光的和发光的分子和材料，将一种物质转换为另一种物质以提供可检测差异的催化剂(诸如酶)(诸如通过将无色物质转换为有色物质，反之亦然，或通过产生沉淀或增加样品浊度)。在一些实例中，可检测部分是荧光团，其属于几种常见的化学类别，包括香豆素类、荧光素类(或荧光素衍生物和类似物)、若丹明类、试卤灵类、发光团类和花青类。荧光分子的其他实例可参见：Molecular Probes Handbook—A Guide toFluorescent Probes and Labeling Technologies,Molecular Probes,Eugene,OR,TheroFisher Scientific，第11版。在其他实施例中，可检测部分是通过明场显微术可检测的分子，诸如染料，包括二氨基联苯胺(DAB)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺(DABSYL)、四甲基若丹明(DISCOVERY紫色)、N,N'-双羧基戊基-5,5'-二磺基-吲哚-二羰花青(Cy5)和若丹明110(若丹明)。在其他实例中，可检测部分是纳米颗粒，诸如金纳米颗粒或银纳米颗粒。其他可检测部分也存在或将来可能被开发，并且应被视为在“可检测部分”的范围内。
如本领域的技术人员已知的，罗曼诺夫斯基型染色剂是指一种用于对细胞学样品进行染色的异染性染色剂，其中该染色剂包括阳离子噻嗪类染料(诸如多色亚甲基蓝、天青A、天青B、天青C、天青IV、对二甲基硫堇、硫堇、亚甲基紫伯恩斯汀、甲基硫堇、甲苯胺蓝以及它们的组合)和阴离子卤代荧光素染料(诸如曙红A、曙红Y、曙红G以及它们的组合)。合适的罗曼诺夫斯基型染色剂包括例如罗曼诺夫斯基染色剂、Malachowski染色剂、Giemsa染色剂、May-Gruenwald染色剂、May-Gruenwald-Giemsa(MGG)染色剂、Jenner染色剂、Wright染色剂、Leishman染色剂和DIFF-QUICK(专有的改良Wright染色剂)。对于罗曼诺夫斯基型染色，样品可固定在固定剂中。合适的固定剂包括例如基于醇的固定剂(例如，甲醇)和基于醛固定剂(例如，甲醛，诸如缓冲福尔马林)。
如本文所用，“检测试剂”是指用于在结合至细胞样品的生物标志物特异性试剂的附近沉积染色剂的任何试剂。合适的检测试剂包括例如一级检测试剂(诸如直接缀合至抗体的可检测部分)、二级检测试剂(诸如能够与一级抗体结合的二级抗体)、三级检测试剂(诸如能够与二级抗体结合的三级抗体)、与生物标志物特异性试剂直接或间接缔合的酶、与此类酶可反应以影响荧光或显色染色剂的沉积的化学品、染色步骤之间所用的洗涤试剂等。
如本文所用，“特异性检测试剂”是指任何能够与在细胞样品的背景下的靶标化学结构特异性地结合的物质的组合物。如本文所用，术语“特异性结合”、“特异性结合至”或“对……具有特异性”或其他类似迭代是指在存在分子(包括生物分子)的异质群体的情况下靶标与确定靶标的存在的特异性检测试剂之间可测量和可再现的相互作用。例如，与靶标特异性结合的抗体是与其结合其他10种靶标相比以更大亲和力、亲合力、更容易和/或以更长持续时间结合该靶标的抗体。在一个实施例中，特异性检测试剂与无关靶标的结合程度为该抗体与靶标的结合的小于约10％，例如，通过放射免疫分析(RIA)所测量。在某些实施例中，与靶标特异性结合的生物标志物特异性试剂的解离常数(Kd)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。在另一实施例中，特异性结合可以包括但不要求排他结合。示例性的特异性检测试剂包括：对特定核苷酸序列具有特异性的核酸探针；抗体及其抗原结合片段；以及工程化的特异性结合组分，包括ADNECTIN(基于第10FN3纤连蛋白的支架；Bristol-Myers-Squibb Co.)、AFFIBODY(基于来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的Z结构域的支架；Affibody AB,Solna,Sweden)、AVIMER(基于结构域A/LDL受体的支架；Amgen,ThousandOaks,CA)、dAb(基于VH或VL抗体结构域的支架；GlaxoSmithKline PLC,Cambridge,UK)、DARPin(基于锚蛋白重复蛋白的支架；Molecular Partners AG,Zürich,CH)、ANTICALIN(基于脂质运载蛋白的支架；Pieris AG,Freising,DE)、NANOBODY(基于VHH的支架(骆驼Ig)；Ablynx N/V,Ghent,BE)、TRANS-BODY(基于转铁蛋白的支架；Pfizer Inc.,New York,NY)、SMIP(Emergent Biosolutions,Inc.,Rockville,MD)以及TETRANECTIN(基于C型凝集素结构域的支架(CTLD)，四连接素；Borean Pharma A/S,Aarhus,DK)。由Wurch等人，Development of Novel Protein Scaffolds as Alternatives to Whole Antibodiesfor Imaging and Therapy:Status on Discovery Research and Clinical Validation,Current Pharmaceutical Biotechnology，第9卷，第502-509页(2008)对此类工程化特异性结合结构的描述进行综述，其内容通过引用并入。
如本领域的普通技术人员所已知的，荧光标记为适于荧光显微术的生物标志物染色的可检测部分。实例包括荧光和磷光染料以及纳米材料(诸如量子点)。
如本文所用，术语“生物标志物”应指在生物样品中发现的可用于对生物样品或从其获得生物样品的受试者进行表征的任何分子或分子组。例如，生物标志物可以是一种分子或分子组，其存在、缺失或相对丰度为：特定细胞或组织类型或状态的特征；和/或特定病理状况或状态的特征；和/或指示病理状况的严重程度、病理状况进展或消退的可能性、和/或病理状况将对特定治疗有应答的可能性。作为另一实例，生物标志物可为细胞类型或微生物(诸如细菌、分枝杆菌、真菌、病毒等)，或者取代基分子或其分子的组。
如本文所用，“生物标志物特异性试剂”是指能够直接与细胞样品中的生物标志物特异性地结合的特异性检测试剂。实例包括与样品的生物标志物免疫反应的一级抗体以及与样品的核酸生物标志物互补的核酸杂交探针。
如本文所用，“明场标记”是指适于明场显微术的细胞样品染色的可检测部分。实例包括显色染料、金相染料和含发色团的染料，它们能够从不附着于细胞样品的物种转变为能够附着于细胞样品的物种(诸如DAB)。
如本文所用，“直接测定”是指一种过程，该过程涉及通过将与可检测部分直接缀合的生物标志物特异性试剂与样品内的生物标志物结合，对细胞样品中的生物标志物进行染色，该方式使得含有生物标志物的样品的区域可以通过观察可检测部分而被显微镜检测到。实例包括免疫组织化学(IHC)法、免疫细胞化学(ICC)法、显色原位杂交(CISH)、荧光原位杂交(FISH)以及用直接标记的缀合物的银染原位杂交(SISH)。直接测定的优势包括减少所用的试剂量，从而降低成本，缩短完成测定的时间，以及能够检测生物标志物以及相同细胞上的罗曼诺夫斯基或其他染色剂。
如本文所用，“亲和力测定”是指一种过程，该过程涉及通过以某种方式将生物标志物特异性试剂与样品内的生物标志物结合而对细胞样品中的生物标志物进行染色，该方式是在样品上将可检测部分沉积在与其结合的生物标志物特异性试剂附近，从而使含有生物标志物的样品区域可以通过显微镜被检测到。实例包括免疫组织化学(IHC)法、免疫细胞化学(ICC)法、显色原位杂交(CISH)、荧光原位杂交(FISH)和银染原位杂交(SISH)。
如本文所用，“免疫酶测定”是指一种亲和酶测定法，其中生物标志物特异性试剂为抗体。
如本文所用，“多重染色”是指一种亲和力测定法，其中将与不同生物标志物结合的多种生物标志物特异性试剂施加于单个细胞样品并且用不同颜色的染色剂进行染色。
如本文所用，“亲和酶反应”是指一种亲和力测定法，其中生物标志物特异性试剂将一种酶(诸如过氧化物酶或磷酸酶)定位到含有生物标志物的样品区域，并且使一组检测试剂与该酶反应以在该样品上沉积染料。
如本文所用，“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原结合活性即可。
如本文所用，“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包括完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
术语“单克隆抗体”根据本领域的技术人员理解的一般含义使用，是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变体抗体(例如，含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量形式存在)之外，包括该群体的单个抗体具有同一性和/或结合相同表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，有待根据本发明进行使用的单克隆抗体可以通过多种技术来制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法、或这些方法的组合。
如本文所用，“二级检测试剂”是指能够与生物标志物特异性试剂特异性地结合的特异性检测试剂。
如本文所用，“单一染色”是指一种亲和力测定法，其中施加于样品的每种生物标志物特异性试剂都用相同的染色剂进行染色。
当用作名词时，术语“染色剂(stain)”是指任何可用于使用于显微分析(包括明场显微术、荧光显微术、电子显微术等)的细胞样品中的特定分子或结构可视化的物质。当用作动词时，术语“染色(stain)”是指任何引起染色剂沉积在细胞样品上的过程。
通常，固体支持物可实现为多种不同的样品载体的任何一种。样品载体可以是平面的(例如显微镜载玻片、盖玻片、板、托盘和在二维上延伸且厚度相对较薄的其他构件)。可替代地，样品载体可以是非平面的并且可实现为杯、管、小瓶和其他类似的容器，其横截面形状包括但不限于圆形、椭圆形、方形、矩形、三角形和其他多边形形状。所使用的样品载体的类型可以取决于样品类型和制备工作流程中的工艺要求。例如，为了支持组织样品，可以使用平面显微镜载玻片和盖玻片。在样品包括相对高比例的液体的情况下，具有一个或多个孔或杯的样品载体(例如，单孔或多孔样品板)可能更方便。
在某一实施例中，固体支持物与显微评估兼容。在某一实施例中，固体支持物与明场或荧光显微术兼容，并允许目标细胞的大部分在本文所述的整个染色过程中保持粘附于固体支持物。在某一实施例中，固体支持物是显微镜载玻片。
直接染色可通过将样品直接与具有直接缀合的标记的一种或多种生物标志物特异性试剂混合来进行。在孵育期后，可将样品直接放置到固体支持物上以进行进一步的分析和染色。样品可未经修饰(例如，全血或体液)，也可以经过预处理(例如，从全血制剂中裂解的红细胞)。样品和试剂的分配可以手动完成，也可以使用自动化平台进行。
亲和染色和罗曼诺夫斯基染色可使用自动化高级染色平台进行。自动化高级染色平台通常包括至少：用于染色方案中的各种试剂的储存器、与储存器进行流体连通以用于将试剂分配至固体支持物的试剂分配单元、用于从固体支持物上移除使用过的试剂和其他废料的废料移除系统、以及协调试剂分配单元和废料移除系统的活动的控制系统。除了执行染色步骤外，许多自动化高级染色平台还可以执行染色辅助步骤(或与执行此类辅助步骤的单独系统兼容)，包括：载玻片烘烤(用于将样品粘附到载玻片上)、脱蜡(也称为脱石蜡)、抗原修复、复染、脱水和清除以及盖上盖玻片。Prichard(通过引用整体并入本文)描述了自动化高级染色平台的若干具体实例及其各种特征，其包括intelliPATH(BiocareMedical)、WAVE(Celerus Diagnostics)、DAKO OMNIS和DAKO AUTOSTAINER LINK 48(Agilent Technologies)、BENCHMARK(Ventana Medical Systems,Inc.)、Leica BOND以及Lab Vision Autostainer(Thermo Scientific)自动化载玻片染色仪。此外，公开了用于执行自动化分析的系统和方法的多项美国专利包括美国专利号：5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029，以及美国公开专利申请号：20030211630和20040052685，它们中各自的全文以引用方式并入本文。市售染色装置通常按照以下原理之一运行：(1)打开单个载玻片染色，其中载玻片水平放置，并且试剂作为包含组织样品的载玻片表面上的潭(puddle)分配(诸如在DAKO AUTOSTAINER Link 48(AgilentTechnologies)和intelliPATH(Biocare Medical)染色器上实现)；(2)液体覆盖技术，其中试剂被沉积在样品上的惰性流体层覆盖或通过沉积在样品上的惰性流体层分配(诸如在VENTANA BenchMark和DISCOVERY染色器上实现)；(3)毛细间隙染色，其中将载玻片表面放置靠近另一个表面(其可能是另一个载玻片或盖板)以形成狭窄的间隙，毛细管力通过该间隙吸引液体试剂并使液体试剂与样品接触(诸如DAKO TECHMATE、Leica BOND和DAKO OMNIS染色器所使用的染色原理)。毛细管间隙染色的一些迭代不会将间隙中的流体混合(诸如，在DAKO TECHMATE和Leica BOND上)。在称为动态间隙染色的毛细管间隙染色的变体中，使用毛细管力将样品施加到载玻片上，然后将平行表面彼此相对平移以在孵育期间搅动试剂以实现试剂混合(诸如，在DAKO OMNIS载玻片染色器(Agilent)上实施的染色原理)。在平移间隙染色中，可平移头部位于载玻片上。该头部的下表面与载玻片间隔开足够小的第一间隙，以允许在载玻片平移期间由载玻片上的液体形成液体弯液面。横向尺寸小于载玻片宽度的混合延伸部从可平移头部的下表面延伸以在混合延伸部和载玻片之间限定小于第一间隙的第二间隙。在头部平移期间，混合延伸部的横向尺寸足以5在载玻片上的液体中产生沿基本上从第二间隙延伸到第一间隙的方向的横向运动。参见WO 2011-139978 A1。最近有提议使用喷墨技术在载玻片上沉积试剂。参见WO 2016-170008 A1。此染色技术列表并不旨在具有全面性，并且旨在经由亲和染色的任何用于执行生物标志物染色的全自动化或半自动化系统。
在多重方法中，生物标志物特异性试剂和检测试剂以允许对不同生物标志物进行差异性标记的方式进行施加。一种完成不同生物标志物的差异标记的方法是选择生物标志物特异性试剂和检测试剂的组合，这些组合不会导致不同生物标志物特异性试剂或检测试剂之间的脱靶交叉反应性(称为“组合染色”)。例如，在使用一级检测试剂的情况下，每种生物标志物特异性试剂具有独特的可检测部分，该可检测部分能够在检测时通过光谱区分。也可例如通过选择来源于不同动物物种(诸如小鼠、兔、大鼠和山羊抗体)的一级抗体来最大程度减小生物标志物特异性试剂之间的交叉反应性。
完成不同生物标志物的差异标记的另一方法是依次对每种生物标志物进行样品染色。在一些实施例中，可首先使用试剂混合物来应用直接染色，可将样品转移至底物，然后可以将额外的生物标志物施加于底物上的细胞。
如本领域技术人员将理解的，可以将组合染色法和顺序染色法进行组合。例如，在只有一部分生物标志物特异性试剂与组合染色兼容的情况下，可以修饰顺序染色法，其中使用组合染色法将与组合染色兼容的生物标志物特异性试剂施加于样品，并且其余的生物标志物特异性试剂采用顺序染色法进行施加。
在一些实施例中，多重方法是荧光多重方法。在一些实施例中，多重方法是明场多重方法。在一些实施例中，多重方法是纳米颗粒检测方法。也可使用多重方法的组合。
对于用生物标志物特异性试剂和一组检测试剂对样品进行染色，从而在样品上得到在该样品中所含的生物标志物附近的可检测部分。
在一些实施例中，可检测部分与生物标志物特异性试剂直接缀合，因此在生物标志物特异性试剂与其靶标结合时沉积在样品上(通常称为直接标记方法)。直接标记法通常是更直接地可量化的，但可能对二级标记具有较低的检测灵敏度。
在其他实施例中，可检测部分的沉积通过使用与生物标志物特异性试剂缔合的二级检测试剂来实现(通常称为间接标记法)。间接标记法增加了可沉积在生物标志物特异性试剂附近的可检测部分的数量，并因此通常比直接标记法更敏感，尤其是与染料结合使用时。间接法的一个实例使用定位于生物标志物特异性试剂上的酶促反应来沉积可检测部分。用于此类反应的合适的酶是众所周知的，并且包括例如氧化还原酶、水解酶和过氧化物酶。明确包括的特定酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、酸性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶和β-内酰胺酶。酶可以与生物标志物特异性试剂直接缀合，或者可以通过标记缀合物而与生物标志物特异性试剂间接关联。如本文所用，“标记缀合物”包括：(a)特异性检测试剂；以及(b)与特异性检测试剂缀合的酶，其中酶在适当的反应条件下与生色团或荧光团、信号传导缀合物或酶活性染料反应，以实现染料的原位生成和/或染料在组织样品上的沉积。标记缀合物的合适的特异性检测试剂可为二级检测试剂(诸如与一级抗体结合的物类特异性二级抗体、与半抗原缀合性一级抗体结合的抗半抗原抗体、或与生物素化一级抗体结合的生物素结合蛋白)、三级检测试剂(诸如与二级抗体结合的物类特异性三级抗体、与半抗原缀合性二级抗体结合的抗半抗原抗体、或与生物素化二级抗体结合的生物素结合蛋白)或其他此类布置。如此定位于样品结合生物标志物特异性试剂的酶然后可用于多种方案以沉积可检测部分。在某些情况下，酶会与显色化合物/底物反应。显色化合物/底物的特定非限制性实例包括：4-硝基苯基磷酸盐(pNPP)、固红、溴氯吲哚磷酸盐(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、BCIP/NBT、固红、AP橙、AP蓝、四甲基联苯胺(TMB)、2,2'-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸盐](ABTS)、邻联茴香胺、4-氯萘酚(4-CN)、硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)、邻苯二胺(OPD)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(XGal)、甲基伞形酮-β-D-吡喃半乳糖苷(MU-Gal)、对硝基苯基-α-D-吡喃半乳糖苷(PNP)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gluc)、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、洋红、碘硝基四唑(INT)、四唑蓝或四唑紫。
在一些实施例中，酶可用于金相检测方案。金相检测方法包括使用酶(诸如碱性磷酸酶)与水溶性金属离子和酶的无氧化还原活性底物的组合。在一些实施例中，底物被酶转换为氧化还原活性剂，并且氧化还原活性剂还原金属离子，使其形成可检测的沉淀物。(参见，例如，于2004年12月20日提交的美国专利申请号11/015,646、PCT公开号2005/003777和美国专利申请号2004/0265922；它们中各自的全文以引用方式并入本文)。金相检测方法包括使用氧化还原酶(诸如辣根过氧化物酶)以及水溶性金属离子、氧化剂和还原剂，再次形成可检测的沉淀物。(参见，例如，美国专利号6,670,113，该专利的全文以引用方式并入本文)。在一些实施例中，酶促作用发生在酶和染料本身之间，其中反应将染料从非结合性物种转换为沉积在样品上的物种。例如，DAB与过氧化物酶(诸如辣根过氧化物酶)的反应会氧化DAB，使其沉淀。在其他实施例中，可检测部分通过包括潜在反应性部分的信号缀合物来沉积，所述潜在反应性部分被配置成与酶反应以形成可与样品或其它检测组分结合的反应性物种。这些反应性物种能够在它们产生的附近(即酶附近)与样品反应，但迅速转换为非反应性物种，使得信号缀合物不会沉积在远离酶沉积位点的位点。潜在反应性部分的实例包括：醌甲基化物(QM)类似物，诸如WO2015124703A1中描述的那些，以及酪酰胺缀合物，诸如WO2012003476A2中描述的那些，上述文献各自的全文以引用方式并入本文。在一些实例中，潜在反应性部分与染料直接缀合，所述染料诸如N,N'-双羧基戊基-5,5'-二磺基-吲哚-二羰花青(Cy5)、4-(二甲氨基)偶氮苯-4'-磺酰胺(DABSYL)、四甲基若丹明(DISCO紫)和若丹明110(若丹明)。在其他实例中，潜在反应性部分与特异性结合对的一个成员缀合，并且染料与特异性结合对的另一个成员连接。在其他实例中，潜在反应性部分与特异性结合对的一个成员连接，并且酶与特异性结合对的另一个成员连接，其中酶(a)与显色底物可反应以影响染料的产生，或(b)与染料可反应以影响染料(诸如DAB)的沉积。
为获得细胞样品薄层，将细胞样品以获得细胞学制片的方式施加到固体支持物上。在某一实施例中，细胞学制片是薄层细胞学制片。从细胞样品获得薄层细胞学制片的示例性方法包括细胞离心、过滤器转移、重力沉降和细胞打印。在细胞离心技术中，提供细胞样品作为液体样品(诸如在载体溶液中的悬浮液或诸如体液样品)，将其放置成与固体支持物接触，然后进行离心。通过离心生成的力使细胞沉降在固体支持物的表面上，从而形成细胞学制片。通过细胞离心获得的薄层的品质和内容物可以通过例如在离心之前处理样品来优化，例如通过调节细胞浓度、液化或稀释粘性样品、去除沉淀物或碎片、溶解血液样品中的红细胞、固定样品等。通常参见Stokes。典型的细胞离心系统包括离心室组件和转子。离心室组件通常包括固体支持物和用于承载细胞样品的悬浮液的容器。当组装时，容器使悬浮液的表面与固体支持物的表面接触。离心室通常可分为两类：在沉降过程中有助于去除流体的室(例如，通过在容器和固体支持物之间的界面附近放置吸收性材料)以及在整个离心过程中有助于保留液体的室(例如，通过在容器和固体支持物表面之间的界面周围放置密封件)。可在F1的Stokes看到此类布置的图示，通过引用并入本文。在操作中，组装的离心室以一定的方向附接到转子，使得转子的旋转引起细胞样品的细胞沉降在固体支持物的表面上。示例性可商购获得的细胞离心系统包括来自Thermo Scientific的CYTOSPIN系统。用于执行细胞离心的示例性方案可在例如Koh找到。在一些具体实施例中，样品是通过细胞离心到显微镜载玻片上来制备的。
在细胞打印法中，将少量体积(例如，0.1μl至10μl)的液体细胞样品沉积在固体支持物的表面上离散的位置处，并且将沉积的样品在该表面上干燥，以获得细胞学制片。例如，液体样品可流动通过相对于固体支持物的表面(例如，在固体支持物的表面上以平行的行或以同心圆)移动的施加器尖端，从而形成固体支持物的表面上的具有基本上均匀的细胞分布的单层。用于执行细胞打印的示例性系统通常包括至少一个施加器尖端(该施加器尖端用于分配已知体积的液体细胞样品)以及用于改变施加器尖端相对于固体支持物的表面的位置的装置(例如，用于移动该尖端的装置，用于移动固体支撑物的装置，或两者)。示例性可商购获得的细胞打印系统包括Roche的COBAS m 511集成式血液分析仪，其各个方面在美国专利号8,815,537、25 9,116,087、9,217,695和9,602,777中进行了描述，其中每个专利均通过引用整体并入本文。使用细胞打印系统来生成细胞学载玻片的示例性方法可在Bruegel找到。在一些具体实施例中，样品是打印在载玻片上的体液样品。在一些具体实施例中，样品是打印在载玻片上的全血样品。在诸如COBAS m 511系统的细胞打印系统中，以液体培养基中的细胞悬浮液为特征的样品在样品载体(诸如显微镜载玻片)上进行制备以用于分析。在样品对应于全血样品或流体中的血液成分的悬浮液的情况下，细胞打印系统会在样品载体上制备细胞层。在某些实施例中，有效沉积的细胞层对应于其中细胞近似均匀地分布的单层。细胞层可包括红细胞、白细胞和血小板中的任何一者或多者。为了将样品沉积在样品载体上，系统可任选地稀释样品(例如，用缓冲溶液、染色剂溶液或更通常地，任何稀释剂材料)，并且将稀释的样品的等分试样施加到样品载体上。施加样品后，样品内的细胞开始沉降到样品载体的表面。如果在某些条件下施加，则沉降的细胞不会重叠，而是形成所需的单层。通常，诸如COBAS m 511集成式血液分析仪的细胞打印系统包括施加器以及支撑样品载体的载物台。当在施加器和载物台之间发生相对运动时，样品从施加器中释放。通过仔细控制施加器和载物台的相对位置(以及各种其他系统参数)，可以以可再现的方式将样品施加到样品载体上。
表1提供了用于执行本公开的方法的示例性方案，其中生物标志物染色是在载玻片上进行的。
表1.针对载玻片上CD标志物的方案
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表2提供了用于执行本公开的方法的示例性方案，其中生物标志物染色是在管中进行的。
表2.管中的CD标志物染色
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CD实验
材料
不同浓度(例如，2mg/ml和200μg/ml)的抗体。购自Roche Penzberg的浓度为2mg/ml的CD45。CD20(Santa Cruz Biotechnology,Inc.,Dallas,TX)
用于抗体稀释的孵育缓冲液(3％ BSA，在PBS中，含有0.02％叠氮化钠)。
全血样品
方案1.浓度为2mg/ml的单一抗体：(例如CD45)。
将1μl加入99μl孵育缓冲液中，以得到20μg/ml抗体的储备液1。将5μl储备液1与45μl全血混合，以使最终抗体浓度为约2μg/ml。将混合物在室温避光孵育15分钟，然后放置到Cobas m 511上并且得到载玻片以用于成像。
方案2.浓度为200μg/ml的单一抗体(例如CD20)。
将20μl加入180μl孵育缓冲液中，以得到20μg/ml抗体的储备液2。将5μl储备液2与45μl全血混合，以使最终抗体浓度为约2μg/ml。将混合物在室温避光孵育15分钟，然后放置到COBAS m 511上并且得到载玻片以用于成像。
方案3：多重抗体研究(例如CD45和CD20)。
使用来自方案1和2的储备液1和储备液2。将5μl储备液1和5μl储备液2与40μl全血混合，以使每种抗体的最终抗体浓度为约2μg/ml。将混合物在室温避光孵育15分钟，然后放置到COBAS m 511上并且得到载玻片以用于成像。
如图1A所示，对于CD 45和罗曼诺夫斯基型染色，细胞经阳性染色。
如图1B所示，该方法区分了同一载玻片上的CD 45阳性/CD 20阳性细胞与CD 45阳性/CD 20阴性细胞。
实例：CD 45和CD 14-APC
CD 45-PerCP以1.26mg/ml的浓度获自Roche Penzberg。使用浓度为55.44μg/ml的CD 45储备液(将4.4μL加入95.4μl BSA封闭缓冲液(3％，在PBS中，含0.02％叠氮化钠))，在样品中的最终浓度为5μg/ml。CD 14-APC获自Beckman Coulter(REF IM2580)，并且以10μl/100μl样品的推荐浓度使用。检测的样品：100μl EDTA血液+10μl储备液CD 45+10μl CD 14。将混合物在室温避光孵育15分钟，然后将载玻片打印在COBAS m511上。在荧光检测/成像后，在COBAS m511上对载玻片进行罗曼诺夫斯基染色，并且在明场显微镜上成像。
实例：来自Roche Penzberg的CD 45如上所述进行使用-载玻片1。使用来自BioLegend目录号368506的CD 45：50μl EDTA血液+10μl CD 45-载玻片2。对于单独的每个载玻片：将混合物在室温避光孵育15分钟，然后将载玻片打印在COBAS m511上。在荧光检测/成像后，在COBAS m511上对载玻片进行罗曼诺夫斯基染色，并且在明场显微镜上成像。
实例：CD 45-PerCP以1.26mg/mL的浓度获自Roche Penzberg：储备液：浓度为30ug/mL(在样品中的最终浓度为5μg/ml)。CD 19-APC以0.47mg/ml的浓度获自RochePenzberg：储备液：浓度为120μg/ml(在样品中的最终浓度为20μg/ml)。CD 3-AlexaFluor488以1.7mg/ml的浓度获自Roche Penzberg：储备液：浓度为60μg/ml(在样品中的最终浓度为10μg/ml)。
通过加入2.4μl CD 45、25.5μl CD19、3.5μl CD3和68.6μl PBS缓冲液，制备含有上述浓度的所有3种CD标志物的储备液：检测的样品：50μl EDTA血液+10μl储备液。将混合物在室温避光孵育15分钟，然后将载玻片打印在COBAS m511上。在荧光检测/成像后，在COBAS m511上对载玻片进行罗曼诺夫斯基染色，并且用明场显微术成像。
实例：BD Multitest 6色TBNK(目录号644611)
检测的样品：50μl EDTA血液+10μl BD Multitest 6色TBN。将混合物在室温避光孵育15分钟，然后将载玻片打印在COBAS m511上。在荧光检测/成像后，在COBAS m511上对载玻片进行罗曼诺夫斯基染色，并且用明场显微术成像。
图15至22示出经CD3、CD4、CD8、CD16和CD19与罗曼诺夫斯基染色的多重染色，用明场显微镜进行成像。
从受试者采集全血样品后，将生物标志物检测试剂(对每种特异性生物标志物的荧光标记的一级抗体)加入样品中。然后将样品的等分试样打印在显微镜载玻片上，并且通过荧光显微镜成像。获得样品的荧光图像后，将样品固定到显微镜载玻片上并且进行罗曼诺夫斯基染色。然后利用明场显微术获得罗曼诺夫斯基染色的样品中的细胞形态。将荧光图像与明场图像合并并且进行比较。
在其他实验中，将全血样品中含有的红细胞裂解。然后按照裂解步骤洗涤样品，以去除全血样品中含有的细胞碎片和材料，并且浓缩样品中的白细胞。然后将洗涤后的细胞样品用生物标志物检测试剂染色，洗涤以去除任何未结合的试剂，打印在显微镜载玻片上，并且成像以进行荧光染色，然后制备以进行罗曼诺夫斯基染色和成像以用于细胞形态分析。
本公开的组合物和方法有利地允许对经一种或多种生物标志物染色的细胞和经罗曼诺夫斯基染色的细胞进行并排比较以分析细胞形态。由于减少了所用的试剂的量和类型，因此这些方法不太复杂并且降低了成本。这些方法显著缩短了孵育时间，并且使用的处理步骤更少。

Claims (33)

1.一种用于检测细胞样品中的生物标志物和形态的方法，所述方法包括：
使细胞样品与特异性结合至所述细胞样品中的生物标志物的一种或多种生物标志物特异性试剂接触；
将生物标志物染色的细胞样品沉积在固体支持物上；
针对一种或多种生物标志物分析所述生物标志物染色的细胞样品；用罗曼诺夫斯基型染色对所述生物标志物染色的细胞样品进行染色以获得罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品；以及
分析所述罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品，以确定所述罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品中的至少一种细胞的形态。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物特异性试剂包含荧光标记、明场标记、纳米颗粒标记以及它们的组合。
3.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述细胞样品与特异性结合所述一种或多种生物标志物特异性试剂的一种或多种检测试剂接触。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂包含荧光标记、明场标记、纳米颗粒标记以及它们的组合。
5.根据权利要求2和3所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物特异性试剂和所述一种或多种检测试剂为染料。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品为体液样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物标志物选自细胞外生物标志物、细胞内生物标志物以及它们的组合。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述固体支持物选自显微镜载玻片、盖玻片、板、托盘、杯、管、小瓶以及它们的组合。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞样品以单层沉积在所述固体支持物上。
10.根据权利要求1所述的方法，其中通过将所述细胞样品打印在所述固体支持物上，将所述细胞样品沉积在所述固体支持物上。
11.根据权利要求1所述的方法，其在自动化染色平台上进行。
12.一种用于检测细胞样品中的生物标志物和形态的自动化方法，所述方法包括：
使细胞样品与特异性结合至所述细胞样品中的生物标志物的一种或多种生物标志物特异性试剂接触，以获得生物标志物染色的细胞样品；
将所述生物标志物染色的细胞样品沉积在固体支持物上；
针对一种或多种生物标志物分析所述生物标志物染色的细胞样品；用罗曼诺夫斯基型染色对所述生物标志物染色的细胞样品进行染色以获得罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品；以及
分析所述罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品，以确定所述罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品中的至少一种细胞的形态。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物特异性试剂包含荧光标记、明场标记、纳米颗粒标记以及它们的组合。
14.根据权利要求12所述的方法，其进一步包括使所述细胞样品与特异性结合所述一种或多种生物标志物特异性试剂的一种或多种检测试剂接触。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂包含荧光标记、明场标记、纳米颗粒标记以及它们的组合。
16.根据权利要求13和14所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物特异性试剂和所述一种或多种检测试剂为染料。
17.根据权利要求12所述的方法，其中所述样品为体液样品。
18.根据权利要求12所述的方法，其中所述生物标志物选自细胞外生物标志物、细胞内生物标志物以及它们的组合。
19.根据权利要求12所述的方法，其中所述固体支持物选自显微镜载玻片、盖玻片、板、托盘、杯、管、小瓶以及它们的组合。
20.根据权利要求12所述的方法，其中所述细胞样品以单层沉积在所述固体支持物上。
21.根据权利要求12所述的方法，其中通过将所述细胞样品打印在所述固体支持物上，将所述细胞样品沉积在所述固体支持物上。
22.根据权利要求12所述的方法，其在自动化染色平台上进行。
23.一种用于检测细胞样品中的生物标志物和形态的方法，所述方法包括：
使细胞样品与特异性结合至所述细胞样品中的生物标志物的一种或多种生物标志物特异性试剂接触；
将生物标志物染色的细胞样品沉积在固体支持物上；
使载玻片上的细胞样品与特异性结合至所述细胞样品中的生物标志物的一种或多种额外的生物标志物特异性试剂接触；
针对一种或多种生物标志物分析所述生物标志物染色的细胞样品；用罗曼诺夫斯基型染色对所述生物标志物染色的细胞样品进行染色以获得罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品；以及
分析所述罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品，以确定所述罗曼诺夫斯基型染色的细胞样品中的至少一种细胞的形态。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物特异性试剂包含荧光标记、明场标记、纳米颗粒标记以及它们的组合。
25.根据权利要求23所述的方法，其进一步包括使所述细胞样品与特异性结合所述一种或多种生物标志物特异性试剂的一种或多种检测试剂接触。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述一种或多种检测试剂包含荧光标记、明场标记、纳米颗粒标记以及它们的组合。
27.根据权利要求24和25所述的方法，其中所述一种或多种生物标志物特异性试剂和所述一种或多种检测试剂为染料。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述样品为体液样品。
29.根据权利要求23所述的方法，其中所述生物标志物选自细胞外生物标志物、细胞内生物标志物以及它们的组合。
30.根据权利要求23所述的方法，其中所述固体支持物选自显微镜载玻片、盖玻片、板、托盘、杯、管、小瓶以及它们的组合。
31.根据权利要求23所述的方法，其中所述细胞样品以单层沉积在所述固体支持物上。
32.根据权利要求23所述的方法，其中通过将所述细胞样品打印在所述固体支持物上，将所述细胞样品沉积在所述固体支持物上。
33.根据权利要求23所述的方法，其在自动化染色平台上进行。
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