CN115698306A - 复制缺陷型禽腺病毒载体、其设计和用途 - Google Patents

Abstract

本文所公开的实施方案涉及基于禽腺病毒的复制缺陷型基因递送载体的设计、工程改造和生产。更具体地说，描述了所述载体在基因转移、细胞和动物的基因工程、蛋白质的表达和疫苗的开发中的用途。在一些实施方案中，公开了部分缺失的禽腺病毒载体的设计和包装。在其他实施方案中，公开了完全缺失的禽腺病毒载体的设计和包装、复制缺陷型禽腺病毒载体的繁殖以及宿主细胞的特征和工程改造。在其他实施方案中，描述了此类载体在兽医学中的用途。

Description

复制缺陷型禽腺病毒载体、其设计和用途

领域

本申请涉及基因转移载体的组合物和其用于将核酸转移至细胞、组织和器官中的用途，特别是用于兽医学中的应用，诸如动物的基因工程和疫苗接种。

背景

动物和人类腺病毒已被广泛研究为感染原，作为基础研究的主题，以及它们在基因医学中的潜在用途，诸如基因疗法和疫苗接种。腺病毒科存在五个属。它们是动物病毒属，即胸腺病毒(Atadenovirus)、禽腺病毒(AAd，鸟类)、肌腺病毒(Ichtadenovirus)、唾液腺病毒(Siadenovirus)和乳房腺病毒(Mastadenovirus)。研究得最好的实例是乳房腺病毒，即人类腺病毒，已鉴定出四十九种血清型并分为六个种或亚属(A到F)。禽腺病毒(AAd)或禽类腺病毒主要影响鸟纲或鸟类的动物。目前已鉴定出AAd的八个物种和十种血清型。

腺病毒基因组的两侧是反向末端重复序列(LITR和RITR)，这对于腺病毒的复制是必不可少的。称为ψ的包装信号位于LITR附近。腺病毒的感染周期分为早期和晚期，如标准腺病毒所例示，诸如血清型5的人类腺病毒。在早期阶段，病毒没有被包裹，并且基因组被运送至细胞核，之后早期基因区(E)E1、E2、E3和E4或其等效物变得具有转录活性。E1含有两个名为E1A和E1B的区域。E1A区(有时称为直接早期区)编码两种主要蛋白质，所述蛋白质参与宿主细胞周期的修饰和其他病毒转录区的激活。E1B区编码两种主要蛋白质19K和55K，所述两种蛋白质通过不同的途径防止由E1A蛋白的活性引起的细胞凋亡的诱导。另外，后期需要E1B-55K蛋白质用于选择性病毒mRNA转运和抑制宿主蛋白表达。E2也分为E2A和E2B区，所述区一起编码三种蛋白质。DNA结合蛋白、病毒聚合酶和前末端蛋白都参与病毒基因组的复制。E3区不是体外复制所需的，但其编码若干种蛋白质，这些蛋白质破坏宿主对病毒感染的防御机制。E4区编码至少六种蛋白质，这些蛋白质参与与病毒mRNA剪接和转运、宿主细胞mRNA转运、病毒和细胞转录和转化相关的若干种不同的功能。

形成病毒衣壳和包装病毒基因组所必需的晚期蛋白质均由在病毒DNA复制开始后变得完全活跃的主要晚期转录单位产生。差异剪接和多腺苷酸化的复杂过程产生了超过15种共享三联前导序列的mRNA物种。早期蛋白质E1B-55K和E4-Orf3以及Orf6在调节晚期mRNA加工和从细胞核转运中起关键作用。形成的病毒基因组在预制衣壳中的包装是由至少两种腺病毒蛋白介导，即晚期52/55k和中间蛋白1Va2，通过与位于Ad5基因组左端的病毒包装信号Ψ相互作用而实现。第二种中间蛋白pIX是衣壳的一部分，并且已知可稳定六邻体-六邻体相互作用。另外，pIX已被描述为含有反式激活TATA的启动子，如E1A启动子和主要晚期启动子(MLP)。

最明确定义的AAd中的一种是鸡胚胎致死性孤儿(chicken embryo lethalorphan，CELO)病毒，其代表AAd的血清型1。CELO病毒基因组长43,804bp，并且已完全测序，并且其转录组织已建立(图1)。病毒基因组的中心区域与其他腺病毒高度同源：下链编码复制功能(DNA聚合酶、DNA结合蛋白、pTP)，并且在单个主要晚期启动子(MLP)的控制下转录的上链编码衣壳结构蛋白。在所述中心部分的两侧，有两个编码至少22个开放阅读框(ORF)的区域，所述开放阅读框与哺乳动物腺病毒的E1、E3和E4区域没有序列同源性。仅研究了这22种基因中的2种：ORF8编码GAM-1蛋白，所述蛋白质被鉴定为与人类腺病毒E1B 19K蛋白的功能同源物，并且ORF22编码与视网膜母细胞瘤蛋白相互作用的蛋白质，所述蛋白质与人类腺病毒E1A蛋白类似，并且与GAM-1协同作用以激活E2F通路。

利用关于CELO的一些ORF的功能的信息，确定了哪些CELO基因组区段和ORF对于CELO病毒的病毒复制是必不可少的。还研究了此类基因组区段的保存是否提供了基于CELO的载体的复制能力，因此允许构建基于CELO的复制能力AAd基因转移载体。结果表明，可以将外来基因的表达盒插入所述区域，以产生适用于鸟类疫苗应用的复制能力基因递送载体。还发现基于CELO的复制能力载体感染了人类细胞，并因此也可能感染人类受试者，但后果尚不清楚。在其他研究中，鉴定了复制基因组所需的CELO基因组区段。还表明，缺失的片段ciykd可以反式提供，以驱动部分缺失的复制缺陷型CELO基因组的复制和包装。

基于腺病毒的载体和腺病毒包装细胞系

基于腺病毒的载体已被用作实现将高水平基因转移至各种细胞类型中，作为疫苗递送媒介的手段，用于将基因转移至用于基因疗法的组织移植物中，以及用作在原本难以高效转染的细胞系和组织中表达重组蛋白的手段。当前用于包装缺失E1的基于复制缺陷型人类腺病毒的载体的系统由宿主细胞和腺病毒晚期基因的来源组成。包括HEK293、OBI和PERC.6细胞的当前已知的人类宿主细胞系仅表达早期(非结构)腺病毒基因，而不表达包装所需的腺病毒(结构)基因。腺病毒晚期基因由腺病毒载体本身以顺式形式或由辅助腺病毒病毒以反式形式提供。提供自身衣壳化所必需的基因的腺病毒载体携带主要缺失E1，以及在一些情况下也确实E3和其他腺病毒区的最小修饰的腺病毒基因组。在复制能力腺病毒载体的情况下，已经使用了未经修饰的宿主细胞，诸如人类A549或鸡肝癌细胞(LMH)。在复制缺陷型腺病毒载体的情况下，向宿主细胞提供基因表达构建体，所述构建体递送腺病毒基因组左端的区段，诸如但不限于E1基因。

最近，不含所有病毒蛋白编码DNA序列的载体的完全缺失的“无肠”腺病毒载体已被开发出来。“无肠”腺病毒载体仅含有病毒基因组的末端(LITR和RITR)、目标基因(诸如治疗基因)和正常包装识别信号(ψ)，这使得所述基因组选择性地包装。然而，为了繁殖“无肠”腺病毒载体，需要辅助腺病毒，所述辅助腺病毒含有复制和病毒粒子组装所需的腺病毒基因以及LITR、RITR和ψ。虽然这种辅助病毒依赖型系统允许引入大量异源遗传物质，但在高达约35kb的完全缺失的人类腺病毒载体的情况下，辅助病毒会污染使用这种方法制备的“无肠”腺病毒载体。由于复制能力病毒并且由于宿主对辅助病毒中的腺病毒基因的免疫反应，污染的复制能力辅助病毒给基因疗法、疫苗和移植应用带来了严重的问题。在这种辅助病毒依赖型载体系统中减少辅助污染的一种方法是在包装识别信号(ψ)中引入条件基因缺陷使其DNA不太可能被包装至病毒粒子中。

在此类系统中产生的完全缺失的“无肠”腺病毒载体仍然具有明显的辅助病毒污染。一种新技术用包装表达质粒代替了辅助病毒，所述质粒缺失了包装信号ψ。载体基因组与包装表达质粒一起共转染至宿主细胞中用于起始载体衣壳化。所述系统先验地防止了辅助病毒的污染，同时限制了病毒重组，这通常导致出现复制能力病毒。能够在不具有辅助病毒污染的情况下产生“无肠”腺病毒基因转移载体消除辅助病毒污染，导致降低的人类受试者和动物毒性并延长基因表达。

据信，在最小修饰的腺病毒载体或腺病毒辅助病毒中携带的腺病毒基因，尤其腺病毒晚期基因：1)促进腺病毒介导的基因疗法后出现的炎症反应；2)在疫苗应用中降低对目标基因的免疫反应；3)干扰正常的细胞功能；以及4)在蛋白质表达应用中导致蛋白质污染物。此外，内源性腺病毒基因占据了最小修饰的腺病毒载体中的空间，这些载体可以有益地用于携带其他遗传信息。在过去十年中，腺病毒载体取得了显着进展，但严重的缺陷继续挑战着其使用。

用于基因疗法和蛋白质表达的腺病毒载体

基因递送或基因疗法是用于治疗获得性和遗传性疾病的有前景的方法。越来越多的异常表达与威胁生命的人类疾病相关的基因正在被克隆和鉴定。表达此类克隆基因的能力最终将允许预防和/或治愈许多重要的人类疾病，对于所述疾病目前的疗法要么不足，要么不存在。

在最初施用腺病毒载体后，针对主要病毒衣壳蛋白的表位产生血清型特异性抗体，即五邻体、六邻体和纤维。鉴于此类衣壳蛋白是腺病毒将自身附接至细胞并随后感染细胞的手段，因此此类抗体随后能够阻断或“中和”相同血清型的腺病毒或腺病毒载体对细胞的再感染。这可能需要使用不同血清型的腺病毒，以便在基因疗法和疫苗的背景下施用一个或多个后续剂量的外源治疗DNA。另外，当使用最小修饰的腺病毒载体或腺病毒辅助病毒污染的腺病毒载体制剂时，治疗和病毒基因产物都会在靶细胞上表达。这些抗原可以被细胞免疫反应识别，导致转导的细胞或组织的破坏，因此基因疗法和疫苗接种的有益效果可能会被否定。由于这些与免疫相关的障碍，最小修饰的病毒载体的广泛使用受到阻碍。

至少53种不同形式的人类腺病毒以及许多动物腺病毒已被表征。这些病毒之间的主要区别因素是对衣壳六邻体蛋白(由L3基因的各种等位基因编码)的体液免疫(即抗体)反应。事实上，不同六邻体蛋白之间的大部分变异发生在三个高变区；对腺病毒的体液免疫反应集中在这些高变区。其他结构，诸如腺病毒表面的纤维蛋白也可以被体液免疫系统识别。因此，可以通过在每次应用之间转换腺病毒血清型来减轻体液免疫反应对最小修饰的腺病毒载体活性的干扰。晚期腺病毒基因展示出较少的变异性，因此通过转换载体的腺病毒血清型无法避免由最小修饰的腺病毒载体或腺病毒辅助病毒诱导的T细胞反应。

人类群体已经暴露于某些腺病毒血清型的天然腺病毒感染。因此，这些受试者携带由这些腺病毒和基于这些血清型的腺病毒的腺病毒载体表达的体液和细胞免疫反应定向基因。有两个进展试图克服这些问题。所述进展是使用“无肠”(完全缺失)腺病毒载体和使用基于表达稀有或动物血清型的稀有或动物腺病毒的腺病毒载体。虽然使用“无肠”腺病毒载体从治疗载体中去除了诸如L3的腺病毒基因，但这些“无肠”腺病毒载体的繁殖需要仍携带腺病毒基因的辅助腺病毒的存在。这些辅助病毒是“无肠”腺病毒载体制剂中的重要污染物。使用基于稀有或动物血清型的最小修饰的腺病毒载体可以避免先前已暴露于给定血清型腺病毒的受试者中预先存在的体液免疫和可能在较小程度上避免预先存在的细胞免疫的问题。尽管如此，由于最小修饰的腺病毒载体表达腺病毒基因，包括高免疫原性L3，所述基因可能会诱导对这些腺病毒基因的有效体液和细胞免疫反应。因此，不可能重复应用给定血清型的最小修饰的腺病毒载体。

因此，已经研究了动物来源的腺病毒载体。所述腺病毒载体在治疗人类时可能有用，因为它们可能没有暴露于动物病毒血清型。另外，动物腺病毒载体可能更适合用于相应的动物，因为已选择腺病毒来有效感染所述动物。例如，基于禽腺病毒的载体作为鸟类疫苗载剂可能比基于人类腺病毒的腺病毒载体更有效。此外，如果基于禽腺病毒的载体限制了感染人类的能力，尤其当它们被设计为复制缺陷型载体时，它们可能具有额外的安全边际。

作为疫苗载体的腺病毒

腺病毒载体已经从用于基因替代疗法的工具转变为真正的疫苗递送媒介。他们是有吸引力的疫苗载体，因为其在哺乳动物宿主中诱导先天性和适应性免疫反应。腺病毒载体已经过测试，以作为亚单位疫苗系统递送给多种感染传染病，诸如疟疾、肺结核、埃博拉病毒(Ebola)和HIV-1。另外，已探索所述腺病毒载体作为针对不同的肿瘤相关抗原的疫苗。迄今为止，大多数腺病毒载体疫苗已被构建为人类和动物血清型的最小修饰的腺病毒载体。

腺病毒基因表达的动态使得腺病毒包装系统的设计变得困难：腺病毒早期功能转录区(E1A)基因的表达诱导腺病毒晚期基因(结构性、免疫原性基因)的表达，这反过来又杀死细胞。

因此，组成型表达腺病毒早期基因的宿主细胞不能携带野生型腺病毒晚期顺反子。先前用于繁殖腺病毒载体的宿主细胞不是真正的“包装”细胞，诸如但不限于仅表达早期(非结构的)腺病毒基因，而不表达包装所需的腺病毒晚期基因的人类细胞，即293、QBI和PERC 6细胞。必须提供腺病毒晚期和早期基因。所述基因先前由最小修饰的腺病毒载体以顺式形式或辅助腺病毒以反式形式提供。

在最小修饰的腺病毒载体或污染性辅助腺病毒中发现的腺病毒基因有助于对腺病毒载体制剂的炎症和免疫反应；降低对基于腺病毒的疫苗的目标基因的免疫反应；干扰正常的细胞功能；以及基于腺病毒的蛋白质表达中的污染。

腺病毒载体主要用于人类疗法和作为人类疫苗的载剂。人类以及灵长类动物腺病毒载体均已被证明能高效诱导广泛的体液和细胞免疫反应。尽管基于人类腺病毒载体的疫苗已在动物(诸如鸟类)中展示出免疫原性，但事实证明它们的效力低，需要高剂量，因此成本高。因此，有必要制定策略以从给定动物物种中产生用于所述物种的腺病毒基因转移载体。这种方法将导致生产高效和强效的疫苗载剂。此外，将这些疫苗作为完全缺失的“有肠”疫苗生产将集中免疫反应并限制抗腺病毒免疫反应的诱导。此外，完全缺失的“有肠”腺病毒载体提供了很大的有效负载，可以递送针对若干种疾病的若干种转基因。因此，单一构建体可用作广泛组合疫苗的基础。

发明内容

正在描述一种高容量基因转移载体系统，用于鸟纲或鸟类动物的兽医应用。这些载体基于禽腺病毒(AAd)。在一方面，本发明描述了这些载体的一般设计，如诸如但不限于基于CELO AAd的基因转移载体所例示。在另一方面，这些载体基于其他AAd病毒，诸如但不限于已鉴定的AAd的八个物种和十种血清型。此类AAd病毒的非限制性实例是鸡禽腺病毒A、鹘禽腺病毒A、鹌鹑支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、出血性肠炎病毒、大理石脾病病毒和包涵体肝炎病毒。

在一方面，本发明描述了基于部分以及完全缺失的AAd的载体的构建和用途，这些载体被设计为复制缺陷型载体，以增强其递送治疗性转基因(诸如异源基因序列)的能力，并加强其安全概况。尤其考虑使用此类载体作为疫苗载剂。

在一方面，本发明还部分基于对用于不同的复制缺陷型AAd载体的复制和衣壳化的宿主细胞的鉴定和遗传修饰。在一方面，本发明还描述了此类基于AAd的载体在鸟类以及包括人类在内的其他动物中用作基因转移载体的用途。特别考虑使用此类载体来开发疫苗。

在一方面，本发明提供了在其基因组中携带一种或多种转基因表达构建体的疫苗构建体。疫苗构建体设计为具有启动子、转基因或由内部核糖体进入位点和多腺苷酸化位点隔开的一组转基因的表达盒。转基因可以来源于不同的感染性病原体，诸如但不限于病毒、细菌、原虫、朊病毒和线虫。转基因可以编码一种或多种蛋白质，其表达与恶性肿瘤生长相关。所述转基因序列可以在腺病毒主要晚期启动子(Major Late Promoter，MLP)、腺病毒三联前导(adenoviral tripartite leader，TPL)序列、腺病毒剪接受体序列和/或腺病毒多腺苷酸化信号序列的控制下或与其可操作地连接。在某些实施方案中，转基因表达盒包含非腺病毒转录和/或翻译控制序列和/或受其控制，诸如来自巨细胞病毒(CMV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)或猿猴病毒40(SV40)的增强子、启动子、内含子序列和/或前导序列，或此类元件的任何组合。在某些实施方案中，转基因序列被修饰以增加表达。例如，转基因序列可以进行密码子优化和/或修饰以包括共有Kozak序列。在某些实施方案中，转基因序列编码来自感染性病原体，诸如流感病毒、人类乳头状瘤病毒(HPV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、芽孢杆菌属、志贺菌属、分枝杆菌属、疟原虫属等的免疫原性多肽。在某些实施方案中，转基因序列编码来自感染性病原体的至少两种单独的多肽和/或免疫原性表位的多聚体。

其他目标和特征将在下文中部分地显而易见并被部分地指出。

附图描述

图1是血清型2和5的CELO禽腺病毒和人类腺病毒的基因组的图解表示。

图2是CELO禽腺病毒基因组和CELO AAd衍生的复制能力和复制缺陷型基因转移载体的图解表示。

图3是转染至宿主细胞中的互补基因构建体的图解表示，所述构建体能够复制和产生部分缺失的复制缺陷型CELO AAd衍生的载体。

图4是CELO包装表达质粒的图解表示，所述质粒能够复制和生产CELO AAd衍生的完全缺失的“有肠”载体。

图5是构建腺病毒和CELO基因组片段以增强包装或宿主细胞功能的图解表示。

图6是完全缺失的“有肠”CELO衍生的禽腺病毒载体的复制和包装的图解表示。

详细说明

如本文所用，以下术语应具有以下含义。

术语“腺病毒载体”是指野生型、突变和/或重组腺病毒基因组，以及包含这种基因组的腺病毒。腺病毒载体可以包含任何腺病毒血清型的全部或部分基因组，以及其组合(即杂交基因组)。

术语“禽腺病毒载体”是指来源于腺病毒的腺病毒载体，所述腺病毒优先在鸟纲或鸟类动物中发现。

术语“感染性病原体”是指能够感染并导致健康恶化和/或触发免疫反应的任何试剂。在某些实施方案中，感染性病原体是病毒，例如流感病毒、逆转录病毒(例如HIV、劳斯肉瘤病毒(RSV)、人类内源性逆转录病毒K(HERV-K))、人类内源性逆转录病毒K(HERV-K)、乳头状瘤病毒(例如人类乳头状瘤病毒)、微小核糖核酸病毒(例如肝炎A、脊髓灰质炎病毒)、肝脱氧核糖核酸病毒(例如肝炎B)、黄病毒(例如肝炎C、黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus)、西尼罗病毒(West Nile virus))、披膜病毒(例如基孔肯亚病毒(chikungunya virus)、东方马脑炎(Eastern equine encephalitis，EEE)病毒、西方马脑炎(Western equine encephalitis，WEE)病毒、委内瑞拉马脑炎(Venezuelanequine encephalitis，VEE)病毒)、疱疹病毒(例如巨细胞病毒)、副黏病毒(例如副流感病毒、肺炎病毒、细支气管炎病毒、感冒病毒、麻疹病毒、流行性腮腺炎病毒)、弹状病毒(例如狂犬病毒)、丝状病毒(例如埃博拉病毒(Ebola virus))、布尼亚病毒(bunyavirus)(例如汉坦病毒(Hantavirus)、裂谷热病毒(Rift Valley Fever virus))、杯状病毒(calicivirus)(例如诺如病毒)或呼肠孤病毒(例如轮状病毒、EB病毒(Epstein-Barr virus)、1&2型单纯疱疹病毒)。

在其他实施方案中，感染性病原体是原核生物，诸如革兰氏阴性细菌(gram-negative bacterium)、革兰氏阳性细菌或其他类型的细菌。此类原核生物包括但不限于芽孢杆菌(例如炭疽杆菌)、分枝杆菌(例如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌)、志贺菌(例如宋氏志贺菌(Shigella sonnei)、痢疾志贺菌、福氏志贺菌)、螺杆菌(例如幽门螺杆菌)、沙门氏菌(例如肠沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)、奈瑟菌(例如淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌)、莫拉菌(例如卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis))、嗜血杆菌(例如流感嗜血杆菌)、克雷伯菌(例如肺炎克雷伯菌)、军团菌(例如嗜肺军团菌)、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌)、不动杆菌(例如鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii))、李斯特菌(例如单核细胞增生性李斯特菌)、葡萄球菌(例如耐甲氧西林、耐多药或耐苯唑西林金黄色葡萄球菌)、链球菌(例如肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌)、棒状杆菌(例如白喉棒状杆菌)、梭菌(例如肉毒梭菌、破伤风梭菌、艰难梭菌)、衣原体(例如肺炎衣原体、沙眼衣原体)、弯曲杆菌(例如空肠弯曲杆菌)、博德特氏菌(例如百日咳博德特氏菌)、肠球菌(例如粪肠球菌、乳酸肠球菌、耐万古霉素肠球菌(Vancomycin-resistant enterococcus，VRE))、弧菌(例如霍乱弧菌)、耶尔森菌(例如鼠疫耶尔森菌)、伯克霍尔德菌(例如洋葱伯克霍尔德菌复合体)、柯克斯体(例如蒲氏柯克斯体(Coxiella burnetti))、弗朗西丝菌(例如土拉热弗朗西丝菌)和埃希菌(例如肠产毒性、肠出血性或产志贺毒素的大肠杆菌，诸如ETEC、EHEC、EPEC、EIEC和EAEC))。

在又其他实施方案中，感染性病原体是真核生物。真核生物的实例包括但不限于原生生物，诸如疟原虫(例如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、腹泻疟原虫)；和真菌，诸如念珠菌(例如白色念珠菌)、曲霉(例如烟曲霉)、隐球菌(例如新型隐球菌)、组织胞浆菌(例如荚膜组织胞浆菌)、肺囊虫(例如杰氏肺囊虫)和粗球孢子菌(例如厌酷球孢子菌)。

术语“癌症”、“癌性的”、“恶性肿瘤”和“恶性的”是指以特定细胞群的增殖异常增加为特征的医学病状。癌细胞可以来源于任何组织或器官，包括例如皮肤、肌肉、肺、心脏、肝脏、肾脏、神经组织等。在某些实施方案中，癌症是良性的(例如良性肿瘤)。在其他实施方案中，癌症是恶性的(例如恶性肿瘤)。在某些实施方案中，癌症是转移性的(即癌细胞能够从它们的起源地迁移到另一个组织或器官)。

在整个说明书中，应根据需要定义额外术语。

本发明涉及重组腺病毒疫苗。本发明部分地基于对高水平表达异源序列或转基因的新颖的重组腺病毒载体的开发。本发明还部分地基于旨在改善宿主免疫反应并规避预先存在的中和抗体的新颖的重组腺病毒载体的开发。本发明还部分地基于用作抗原特异性和/或通用流感疫苗的新颖的重组腺病毒载体的开发。

因此，在一个方面，本发明提供了一种包含转基因序列的腺病毒载体。如本文所用，“转基因序列”是在整合到腺病毒载体中时产生腺病毒序列与核酸序列的非天然存在的并列的核酸序列。通常，转基因序列包含非腺病毒来源的核酸序列。例如，转基因序列的来源可以是完全、大部分或部分非腺病毒(例如腺病毒和非腺病毒序列的嵌合体)来源。然而，在一些情况下，转基因序列可以完全来源于腺病毒，例如来自一种类型的腺病毒的腺病毒序列可以整合到由不同类型的腺病毒产生的腺病毒载体中。例如，编码来自一种类型的腺病毒的六邻体或纤维蛋白的腺病毒序列可以整合至从不同类型的腺病毒产生的腺病毒载体中以产生具有来自不同血清型的纤维蛋白的重组腺病毒和/或具有嵌合六邻体和纤维蛋白的腺病毒。包含转基因序列的腺病毒载体可能是有用的，例如作为针对感染性病原体或癌细胞的疫苗。因此，转基因序列可以编码来自感染性病原体的抗原。或者，转基因序列可以编码与癌细胞相关的抗原。

在某些实施方案中，转基因序列编码由感染性病原体产生的全部或部分蛋白质。蛋白质或其片段(例如裂解产物、结构域、二级结构的一个或多个单元、B细胞表位、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位、辅助T淋巴细胞(HTL)表位等)可以位于感染性病原体的表面。例如，蛋白质或其片段可以是高度抗原性的，参与细胞靶向和/或参与细胞进入。或者，蛋白质或其片段(例如裂解产物、结构域、二级结构的一个或多个单元、HTL或CTL表位等)可以位于感染性病原体的内部。例如，蛋白质或其片段可以是胞内蛋白质、包膜病毒的衣壳或核蛋白、无包膜病毒的核蛋白等。

在某些实施方案中，表位、结构域或二级结构单元在进化上是保守的。如本文所用，术语“进化上保守的”是指序列在特定感染性病原体的多种毒株中至少约50％保守。对于病毒，多种毒株包括来自每个已鉴定的亚类(例如血清型)的至少一种分离毒株，所述分离毒株能够感染并因此在疫苗的目标人群中引起疾病或生病，或具有代表性数量的感染性分离毒株涵盖此类毒株中已知的多样性。例如，在某些实施方案中，多种流感毒株包括与人、猪和/或鸟类疾病相关的代表性毒株，包括H1N1毒株(例如A/Wilson-Smith/33、A/NewCalcdonia/20/99、A/猪Korea/S10/2004、A/Brevig Mission/1/1918、A/Pureto Rico/8/34/Mount Sinai、A/California/7/2009、A/California/05/2009、A/Califomia/08/2009、A/Texas/04/2009、A/猪/Saskatchewan/18789/02、A/野鸭/Alberta/130/2003、A/野鸭/Alberta/2001、A/猪/Cotes d'Armor/1482/99、A/猪/Betzig/2/2001和/或A/火鸡/Germany/3/91)、H3N2毒株(例如A/Perth/16/2009)、H2N2毒株(例如A/Japan/305/57、A/AnnArbor/6/60、A/Canada/720/05、A/野鸭/NY/6750/78、A/野鸭/Potsdam/177-4/83和/或A/鸭/Hokkaido/95/2001)、N3N2毒株(例如A/Hong Kong/1/66、A/Charlottesville/03/2004、A/Canterbury/129/2005、A/Fujian/411/01-like、A/鸭/Korea/S9/2003、A/猪/Texas/4199-2/98、A/火鸡/Ohio/313053/2004和/或A/火鸡/North Carolina/12344/03)、H5N1毒株(例如A/猪/Shandong/2/03、A/鹅/Guangdong/1/96、A/鸭/Hunan/114/05、A/VietNam/1203/2004、A/VietNam/DT-036/2005、A/Vietnam/1194/2004、A/Vietnam/1203/2004、A/Anhui/1/2005、A/Egypt/2321/2007、A/Egypt/3300-NAMRU3/2008、A/鸊鷉/Novosibirsk/29/2005、A/Bar-headed鹅/Mondolia/1/05、A/猫/Thailand/KU-02/04、A/Hong Kong/213/03、A/鸡/Guangdong/174/04和/或A/HK/159/97)、H6N1毒株(例如A/水鸭/Hong Kong/1073/99)、H6N2毒株(例如A/鸡/California/0139/2001和/或A/guillemot/Sweden/3/2000)、H6N9毒株(例如A/鹅/Hong Kong/W217/97)、H7N1毒株(例如A/FPV/Rostock/34)、H7N3毒株(例如A/鸡/British Columbia/04和/或A/火鸡/Italy/220158/2002)、H7N7毒株(例如A/鸡/Netherlands/1/2003、A/Netherlands/219/03、A/FPV/Dobson/27和/或A/鸡/FPV/Weybridge)、H9N2毒株(例如A/水鸟/Delaware/9/96、A/猪/Korea/S452/2004、A/鸭/HongKong/Y439/97、A/Hong Kong/1073/99、A/HK/2108/2003、A/鹌鹑/Hong Kong/Gl/97、A/鸭/Hong Kong/Y280/97、A/鸡HK/FY23/03和/或A/鸡HK/G9/97)，以及乙型流感毒株(例如B/Brisbane/60/2008)。在某些实施方案中，多种流感毒株包括所有上述毒株以及已知与人、猪或鸟类疾病相关的额外流感毒株。对于细胞病原体，诸如细菌、原生生物、真菌等，多种毒株包括来自每个物种的至少一个分离毒株，所述分离毒株能够感染并因此在疫苗的目标人群中引起疾病或生病，或具有代表性数量的感染性分离毒株涵盖此类毒株中已知的多样性。在某些实施方案中，表位和/或结构基序是至少60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％保守的或更保守的。

在某些实施方案中，转基因序列编码来自流感病毒的抗原。合适的流感抗原可以是表面抗原，诸如血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、M2或其片段(例如一个或多个HTL或CTL表位)。其他合适的流感抗原包括M1、NP、NS1、NS2、PA、PB1和PB2，或其片段(例如一个或多个HTL或CTL表位)。

转基因序列可以编码来自本文所公开的任何感染性病原体的免疫原性蛋白或抗原。例如，在一些实施方案中，转基因序列编码来自病毒、细菌、原生生物和/或真菌的免疫原性蛋白。在一个实施方案中，转基因序列编码来自流感病毒、脊髓灰质炎病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类乳头状瘤病毒(HPV)、基孔肯亚病毒和/或登革热病毒的免疫原性蛋白。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自芽孢杆菌(例如炭疽杆菌)、分枝杆菌(例如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌)、志贺菌(例如宋氏志贺菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌)、链球菌和/或埃希菌(例如肠产毒性、肠出血性或产志贺毒素的大肠杆菌)。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠致病性大肠杆菌(EPEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)和/或肠聚集性大肠杆菌(EAEC)的免疫原性蛋白。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自伯克霍尔德菌(例如洋葱伯克霍尔德菌复合体)、假单胞菌(例如铜绿假单胞菌)、梭菌(例如肉毒梭菌、破伤风梭菌、艰难梭菌)、葡萄球菌(例如耐甲氧西林、耐多药或耐苯唑西林金黄色葡萄球菌)、肠球菌(例如粪肠球菌、乳酸肠球菌、耐万古霉素肠球菌(VRE))、链球菌(例如肺炎链球菌、酿脓链球菌、无乳链球菌)和/或弧菌(例如霍乱弧菌)的免疫原性蛋白。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自弯曲杆菌(例如空肠弯曲杆菌)、博德特氏菌(例如百日咳博德特氏菌)、衣原体(例如肺炎衣原体、沙眼衣原体)、棒棒状杆菌(例如白喉棒状杆菌)、军团菌(例如嗜肺军团菌)、李斯特菌(例如单核细胞增生性李斯特菌)、奈瑟菌(例如淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌)、沙门氏菌(例如肠沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌)、耶尔森菌(例如鼠疫耶尔森菌)、嗜血杆菌(例如流感嗜血杆菌)、螺杆菌(例如幽门螺杆菌)、柯克斯体(例如蒲氏柯克斯体)和/或弗朗西丝菌(例如土拉热弗朗西丝菌)的免疫原性蛋白。在某些实施方案中，转基因序列编码来自流感、HIV、HPV、炭疽杆菌、疟原虫和/或志贺菌的免疫原性蛋白。在其他实施方案中，转基因序列编码来自流感、HIV和/或炭疽杆菌的免疫原性蛋白。

由转基因序列编码的流感抗原可以来自任何当前存在或随后分离的流感毒株，包括例如与1918年西班牙流感(H1N1)、1957年亚洲流感(H2N2)、1968年香港流感(H3N2)、1997年香港流感(H5N1)、2004年越南流感(H5N1)、2009年猪流感(H1N1)等相关的毒株。因此，例如，HA抗原可以是H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16或B HA抗原，而NA抗原可以是例如N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9 NA抗原。在一些实施方案中，HA抗原是H1、H3、H5或B HA抗原。可以作为本发明的异源序列基础的流感毒株的非限制性实例包括：A/鹅/Guangdong/1/96(H5N1)；A/Brevig Mission/1/1918(H1N1)；A/Wilson-Smith/33(H1N1)；A/Puerto Rico/8/34/Mount Sinai(H1N1)；A/Fort Monmouth/1/47(H1N1)；A/USSR/90/1977(H1N1)；A/New Calcdonia/20/1999(H1N1)；A/Solomon Islands/3/2006(H1N1)；A/Brisbane/59/2007(H1N1)；A/California/7/2009(H1N1)；A/Califomia/14/2009(H1N1)；A/California/08/2009(H1N1)；A/Califomia/05/2009(H1N1)；A/Texas/04/2009(H1N1)；A/Mexico/InDRE4114/2009(H1N1)；A/New York/1669/2009(H1N1)；A/Canada-AB/RVl532/2009(H1N1)；A/Leningrad/134/47/57(H2N2)；A/Ann Arbor/6/60(H2N2)；A/Berlin/3/64(H2N2)；A/Tokyo/3/67(H2N2)；A/Singapore/1/57(H2N2)；A/Hong Kong/1/68(H3N2)；A/Albany/1/76(H3N2)；A/Panama/2007/99(H3N2)；A/Wisconsin/67/05(H3N2)；A/Hong Kong/1774/99(H3N2)；A/Moscow/10/99(H3N2)；A/Hiroshima/52/2005(H3N2)；A/California/7/2004(H3N2)；A/New York/55/2004(H3N2)；A/Brisbane/10/2007(H3N2)；A/Perth/16/2009(H3N2)；A/鹅/Guiyang/337/2006(H5N1)Glade 4；A/HK/156/97(H5N1)；A/HK/483/97(H5N1)；A/VietNam/1194/2004(H5N1)Glade 1；A/VietNam/1203/2004(H5N1)Glade 1；A/鸭/NCVDl/07(H5N1)；A/鸡/VietNam/NCVD-21/07(H5N1)；A/Indonesia/5/05(H5N1)Glade 2.1；A/火鸡/65-596/06(H5N1)Glade 2.2；A/鸡/India/NIV33487/2006(H5N1)Glade 2.2；A/火鸡/Turkey/1/2005(H5N1)Glade 2.2；A/Egypt/902782/2006(H5N1)；A/Egypt/2321/2007(H5N1)；A/Egypt/3300-NAMRU3/2008(H5N1)；A/Anhui/1/2005(H5N1)；A/China/GD01/2006(H5N1)；A/喜鹊/Hong Kong/50525/07(H5N1)Glade 2.3.2；A/暗绿绣眼鸟/Hong Kong/1038/2006(H5N1)Glade 2.3.4；A/鸡/VietNam/NCVD-15/2007(H5N1)；A/鸡/Italy/2335/2000(H7N1)；A/火鸡/Italy/3675/99(H7N1)；A/鸡/New York/21211-2/05(H7N2)；A/New York/107/03(H7N2)；A/鸡/British Columbia/GSC human B/04(H7N3)；A/Canada/rv504/04(H7N3)；A/鸡/British Columbia/CN-6/04(H7N3)；A/马/SanPaulo/4/76(H7N7)；A/海豹/Mass/1/1980(H7N7)；A/鸡/Victoria/1/1985(H7N7)；A/鸡/Netherlands/2586/2003(H7N7)；A/野鸭/California/HKWF 1971/2007(H7N7)；A/鸡/Beijing/1/94(H9N2)；A/鹌鹑/Hong Kong/Gl/1997(H9N2)；A/Korea/KBNP-0028/2000(H9N2)；A/鸡/Hong Kong/G9/97(H9N2)；A/鸡/Hong Kong/CSWl53/2003(H9N2)；A/鸡/Shantou/6781/2005(H9N2)；A/鸡/Jiangsu/Ll/2004(H9N2)；A/Hong Kong/1073/99(H9N2)；A/Hong Kong/2108/2003(H9N2)；A/鸡/Shiraz/AIV-IR004/2007(H9N2)；A/鸡/Zibo/L2/2008(H9N2)；A/鸡/Henan/L1/2008(H9N2)；A/禽/Israel/313/2008(H9N2)和B/Brisbane/60/2008。本领域技术人员可以容易地鉴定额外流感毒株。

在某些实施方案中，转基因序列编码选自H1、H3、H5或B流感病毒的流感HA抗原。在一些实施方案中，HA抗原可以来源于一种或多种选自由以下组成的组的毒株：A/Vietnam/1194/2004、A/Vietnam/1203/2004、A/Anhui/1/2005、A/Egypt/2321/2007、A/Egypt/3300-NAMRU3/2008、A/Perth/16/2009、A/Califomia/05/2009或B/Brisbane/60/2008。在一些实施方案中，转基因序列编码流感NP或M1抗原。在一个实施方案中，NP或M1抗原来源于A/Texas/04/2009或A/Califomia/08/2009流感毒株。

在其他实施方案中，转基因序列编码来自人类乳头状瘤病毒(HPV)的抗原。HPV可以是任何已知或后来发现的毒株(例如HPV-1、HPV-2、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-45等)。在一个实施方案中，转基因序列编码来自HPV-16或HPV-18毒株的抗原。在某些实施方案中，HPV抗原是表面抗原，诸如全长L1蛋白或其片段(例如进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在一个实施方案中，转基因序列编码完全或部分密码子优化的全长L1蛋白。在其他实施方案中，HPV抗原是全长L2或其片段(例如进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，HPV抗原是L1杂交多肽或L1/L2杂交多肽。例如，在一个具体实施方案中，HPV抗原是包含L2多肽片段的L1多肽(例如L2片段可以插入L1多肽的环中)。在其他实施方案中，HPV抗原是全长E6或E7蛋白，或其片段(例如进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，HPV抗原是包含L1、L2和/或E6和E7蛋白的融合蛋白。例如，在一些实施方案中，HPV抗原是包含与E7蛋白融合的L1/L2杂交多肽的融合蛋白。在其他实施方案中，HPV抗原是包含与E6蛋白融合的L1/L2杂交多肽的融合蛋白。

在其他实施方案中，转基因序列编码来自人类免疫缺陷病毒(HIV)的抗原。HIV可以具有任何已知的或后来发现的毒株(例如HIV-1、HIV-2等)。在某些实施方案中，HIV抗原是表面抗原，例如全长Env蛋白(例如gp160)或其片段或寡聚体(例如gp140、gp120、gp41、进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，HIV抗原是全长衣壳蛋白(p24)、基质蛋白(p17)或其片段(例如进化上保守的表位和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，HIV抗原是Tat(例如p16或p14)、Rev(p19)、Vif(p23)、Vpr(p14)、Nef(p27)、Vpu(p16)或Gag蛋白。HIV抗原可以是任何HIV蛋白，全长或其他蛋白，诸如HTL或CTL表位，并且可以是任何进化上保守的序列。在一些实施方案中，HIV抗原序列可以被工程改造以含有异源三聚化结构域(例如来自酵母GCN，诸如来自GCN4和T4噬菌体纤维蛋白-FT基序)或用于翻译后修饰的某些信号序列，诸如糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定位点。例如，在一个实施方案中，可以修饰诸如gp140或gp120的HIV包膜蛋白以含有GPI锚定位点。在另一个实施方案中，可以修饰HIVgp140序列以含有异源GCN三聚化结构域和/或GPI锚定位点。在一些实施方案中，将GCN三聚化结构域或GPI锚定位点与HIV包膜蛋白序列(例如HIV gp140序列)的羧基末端融合。

在其他实施方案中，转基因序列编码来自芽孢杆菌属细菌的抗原。芽孢杆菌可以是许多致病物种中的任一种(例如炭疽杆菌、蜡样芽孢杆菌等)，并且可以是此类物种的任何已知或后来发现的分离毒株。在某些实施方案中，芽孢杆菌属抗原是表面抗原，诸如驻留在细胞膜中的蛋白质，或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，芽孢杆菌属抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，芽孢杆菌属抗原与宿主细胞进入相关。例如，抗原可以是靶细胞结合蛋白(例如保护性抗原(PrAg或PA))、金属肽酶(例如致死因子(LF))、腺苷酸环化酶(例如水肿因子(EF))或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在一些实施方案中，芽孢杆菌属抗原可以被修饰以缺失嗜热菌蛋白酶裂解位点或含有GPI锚。在一个实施方案中，转基因序列编码保护性抗原或已被修饰以去除嗜热菌蛋白酶裂解位点或含有GPI锚的修饰的保护性抗原。

在其他实施方案中，转基因序列编码来自志贺菌属细菌的抗原。志贺菌可以是许多致病物种中的任一种(例如宋氏志贺菌、痢疾志贺菌、福氏志贺菌等)，并且可以是此类物种的任何已知或后来发现的分离毒株。在某些实施方案中，志贺菌属抗原是表面抗原，诸如驻留在细胞膜中或与细胞膜相关的蛋白质，诸如整合膜蛋白或外周膜蛋白，或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。例如，抗原可以是外膜蛋白，例如卡普毒株p56。在其他实施方案中，志贺菌属抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，志贺菌属抗原与宿主细胞进入相关，诸如侵袭蛋白IpaB、IpaC或IpaD蛋白。在另一个实施方案中，志贺菌属抗原是包含IcsP和/或SigA多肽的通用抗原。

在其他实施方案中，转基因序列编码来自分枝杆菌属的抗原。分枝杆菌可以是许多致病物种中的任一种(例如结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、弥漫型麻风分枝杆菌等)，并且可以是此类物种的任何已知或后来发现的分离毒株。在某些实施方案中，分枝杆菌属抗原是表面抗原，诸如驻留在细胞膜中或与细胞膜相关的蛋白质，诸如整合膜蛋白或外周膜蛋白，或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，分枝杆菌属抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，分枝杆菌属抗原选自由Ag85A、Ag85B、Ag85C、ESAT-6、CFP-10、HspX和其组合组成的组。

在其他实施方案中，转基因序列编码来自疟原虫的抗原。疟原虫可以是许多致病物种中的任一种(例如恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫等)，并且可以是此类物种的任何已知或后来发现的分离毒株。在某些实施方案中，疟原虫抗原是表面抗原，诸如驻留在细胞膜中或与细胞膜相关的蛋白质，诸如整合膜蛋白或外周膜蛋白，或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，疟原虫抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，疟原虫抗原选自由CS、CSP(未裂解的)、MSP1、MSP2(c-末端p42)、LSA1、EBA-175、AMA1、FMP1、Pfs48/45和MSPS组成的组。

在某些实施方案中，转基因序列编码来自肺炎链球菌(例如肺炎球菌)的抗原。在某些实施方案中，肺炎链球菌抗原是表面抗原，诸如驻留在细胞膜中或与细胞膜相关的蛋白质，诸如整合膜蛋白或外周膜蛋白，或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在其他实施方案中，肺炎链球菌抗原是细胞内蛋白质或其片段(例如进化上保守的表位，和/或HTL或CTL表位)。在某些实施方案中，肺炎链球菌抗原选自由以下组成的组：肺炎球菌表面蛋白(例如PspA、PspC)、肺炎球菌溶血素(Ply)、神经氨酸酶(例如NanA、NanB)、自溶素A(LytA)、肺炎球菌组氨酸-三联体蛋白、PiaA、PiuA、果糖-二磷酸醛缩酶(FBA)、黏附蛋白A和肺溶素。

在又其他实施方案中，转基因序列编码表面抗原、内部蛋白、毒素、侵袭相关蛋白、蛋白酶或其他酶、热休克蛋白或来自任何其他感染性病原体的其他抗原。例如，表面抗原可以来自感染性病原体，所述病原体选自由以下组成的组：百日咳杆菌、肺炎衣原体(例如膜蛋白D、外膜蛋白)、沙眼衣原体(例如膜蛋白D、外膜蛋白)、嗜肺军团菌、金黄色葡萄球菌(包括耐甲氧西林、耐多药或耐苯唑西林毒株(例如IsdA、IsdB、SdrD、SdrE))、肺炎链球菌(例如PsPA)、铜绿链球菌(例如鞭毛Ag、孔蛋白))、酿脓链球菌(例如M蛋白、纤连蛋白结合蛋白Sfb1)、无乳链球菌、肠出血性大肠杆菌(例如紧密黏附素、FimH黏附蛋白)、流感嗜血杆菌(例如Pili、P1、P2、P4、P6)、念珠菌(例如Alsip、Als3p)、厌酷球孢子菌(例如Ag2)、铜绿假单胞菌(例如鞭毛抗原、孔蛋白)、劳斯肉瘤病毒(例如F蛋白、G蛋白)、人类内源性逆转录病毒K(例如黑色素瘤抗原HERV-K-MEL)、疱疹病毒(例如糖蛋白D2)、登革热病毒(例如DEN1、DEN2、DEN3、DEN4包膜蛋白，四价4倍EDIII结构域蛋白)等。毒素可以选自由以下组成的组：空肠弯曲杆菌的不稳定毒素、艰难梭菌的毒素A和B、酿脓链球菌的致热外毒素和内毒素、霍乱弧菌的毒素B、肠出血性大肠杆菌的志贺毒素(例如Stx-1、Stx-2)、来自铜绿假单胞菌的外毒素A等。蛋白酶或其他酶可以选自由以下组成的组：衣原体的分泌蛋白酶因子、肺炎链球菌的肺炎球菌溶血素、自溶素或神经氨酸酶、来自酿脓链球菌的半胱氨酸蛋白酶或C5a肽酶、来自幽门螺杆菌的脲酶、厌酷球孢子菌的脲酶、His-62、H抗原、荚膜组织胞浆菌的hsp70等。

在某些实施方案中，转基因序列编码由癌细胞产生的全部或部分蛋白质。蛋白质或其片段(例如裂解产物、结构域、二级结构的单元、B细胞表位、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位、辅助T淋巴细胞(HTL)表位等)可以位于癌细胞的表面。例如，蛋白质或其片段可以是高度抗原性的和/或癌细胞的标志物(例如癌细胞特异性标志物或在癌细胞上高度富集的抗原)。或者，蛋白质或其片段(例如裂解产物、结构域、二级结构的单元、HTL或CTL表位等)可以位于癌细胞的内部。例如，蛋白质或其片段可以是胞质蛋白质、核蛋白等。

在某些实施方案中，转基因序列包含至少一个完整的开放阅读框(ORF)，其中所述至少一个完整的ORF编码能够在被腺病毒载体感染的宿主细胞中表达的离散多肽。在某些实施方案中，转基因序列包含两个或更多个完整的ORF，每个都编码能够在被腺病毒载体感染的宿主细胞中表达的离散多肽。如上文所描述，一种或多种离散多肽可以是全长蛋白质或其片段。同样，如上文所描述，一种或多种离散多肽可以是蛋白质结构域、结构基序或表位(例如B细胞、HTL或CTL表位)的多聚体。例如，在某些实施方案中，转基因序列包含编码全长蛋白质(例如流感HA)的第一ORF和编码蛋白质结构域、结构基序或表位的多聚体(例如一种或多种流感M2序列的多聚体、一种或多种流感B细胞表位的多聚体、一种或多种流感HTL表位的多聚体或一种或多种流感CTL表位的多聚体)的第二ORF。

因此，在一些实施方案中，转基因序列编码融合蛋白。融合蛋白可以包含一个或多个表位或来自抗原蛋白的片段或来自相同感染性病原体或不同感染性病原体的全长蛋白。例如，在一个实施方案中，融合蛋白包含如本文所描述的与HPV的E6或E7蛋白融合的HPV的L1/L2杂交多肽。在一些实施方案中，融合蛋白包含与E7蛋白融合的源自HPV-16的L1/L2杂交多肽(例如，具有插入L1环中的HPV-16 L2片段的全长HPV-16 L1蛋白)。在其他实施方案中，融合蛋白包含与E6蛋白融合的源自HPV-18的L1/L2杂交多肽(例如，具有插入L1环中的HPV-18 L2片段的全长HPV-18 L1蛋白)。在另一个实施方案中，融合蛋白包含融合在一起的流感HA和NA蛋白的免疫原性片段(例如，如本文所描述的流感HA或NA蛋白的中和表位)。在另一个实施方案中，融合蛋白包含与全长流感NA蛋白融合的如本文所描述的流感HA蛋白的一个或多个中和表位。在又一个实施方案中，融合蛋白可以是如本文所描述的各种表位的多聚体。例如，融合蛋白可以是HTL表位的多聚体，其中每个表位通过接头序列连接(参见代表性多聚体的实施例13)。在一些实施方案中，由转基因序列编码的融合蛋白包含来自感染性病原体的两个或更多个物种或血清型的抗原。例如，融合蛋白可以包含来自四种登革热病毒血清型1-4中每一种的包膜蛋白的EDIII结构域。

在某些实施方案中，转基因序列包含两个完整的ORF，其中第一和第二ORF平行取向(例如从头到尾)。在某些相关实施方案中，转基因序列还包含位于第一ORF的终止密码子3'和第二ORF起始密码子5'的内部核糖体进入序列(IRES)，从而允许由第一和第二ORF编码的多肽从单个mRNA转录物翻译。本领域技术人员可以容易地鉴定在哺乳动物(例如人类)细胞中起作用的合适的IRES序列以及应该如何定位此类序列以确保第二ORF的充分翻译。

在某些相关实施方案中，转基因序列包含两个完整的ORF，其中第一和第二ORF平行取向(例如从头到尾)，并且还包含位于第一ORF的终止密码子3'和第二ORF起始密码子5'的剪接接纳体，从而允许由第一和第二ORF编码的多肽从单个mRNA转录物翻译或作为两个单独的mRNA转录物翻译。本领域技术人员可以鉴定剪接元件并以正确的方式将它们合并起来。剪接接纳体可以是共有序列(诸如SV40剪接位点)或非共有序列(诸如Ad5 ADP剪接接纳体)，取决于所需的结果。例如，在腺病毒主要晚期转录单位中，具有非典型多嘧啶束的3'剪接位点在病毒感染晚期是优选的。参见例如Muhlemann等人.(1995),J.Virology 69(11):7324。

在某些相关实施方案中，转基因序列包含两个完整的ORF，其中第一和第二ORF平行取向(例如从头到尾)，并且还包含位于在第一ORF的3'末端(去除终止密码子)与第二ORF的起始密码子5'之间的框架内的2A跳过元件(核糖体内自加工)，从而允许由第一和第二ORF编码的多肽从单个mRNA转录物翻译为在A2元件位置“跳过”肽键的单个肽并由此产生两个多肽。本领域技术人员可以鉴别2A跳过元件，诸如源自口蹄疫病毒(FMDV)和小核糖核酸病毒的那些，并将它们组织成两个ORF形成单个连续肽。

在某些实施方案中，转基因序列包含两个完整的ORF，其中第一和第二ORF是首尾相连取向的。例如，第一ORF的3'端可以与第二ORF的3'端邻接。或者，第一ORF的5'端可以与第二ORF的5'端邻接。

一般来说，转基因序列是转录单位的一部分，其最低限度地含有转录增强子和/或启动子以及多腺苷酸化序列。在某些实施方案中，转录单位还包含一个或多个内含子、一个或多个剪接增强子、前导序列、共有Kozak序列、一种或多种增加RNA稳定性和/或加工的元件，或其任何组合。

在某些实施方案中，转基因序列在腺病毒转录和/或翻译控制序列的控制下或与其可操作地连接。如本文在此上下文中使用的，“在控制下”和“可操作地连接”意指包含在异源序列中的ORF的转录和/或翻译受到控制序列的影响。因此，例如，ORF的转录和/或翻译可以由于腺病毒转录和/或翻译控制序列而增加。在某些实施方案中，“可操作地连接”表示控制序列和异源序列彼此非常接近。例如，在某些实施方案中，与异源序列可操作地连接的腺病毒控制序列位于距异源序列一端约100bp内、约100至约200bp、约200至约300bp、约300至约400bp或约400至约500bp。

如本文所用，“腺病毒转录和/或翻译控制序列”是涉及源自腺病毒的转录和/或翻译调节的核酸序列。此类序列包括但不限于腺病毒启动子(例如主要晚期启动子(MLP)或主要晚期转录单位(MLTU)内的启动子)、腺病毒转录增强子、腺病毒剪接接纳体位点、腺病毒剪接增强子、腺病毒前导序列(例如三联前导(TPL)序列)、增加RNA稳定性和/或加工的腺病毒元件(例如顺式作用RNA输出元件)和腺病毒聚A信号序列。腺病毒转录和/或翻译控制序列可以来自任何腺病毒毒株。因此，本发明的腺病毒载体可以包含源自不同腺病毒毒株的腺病毒转录和/或翻译控制序列。腺病毒转录和/或翻译控制序列可以具有野生型序列(即在天然存在的腺病毒中发现的序列)或其变体序列。本领域已经描述了腺病毒转录和/或翻译控制序列。例如，在美国专利申请2006/0115456中描述了腺病毒TPL序列；在Massie等人.(1995),Biotechnology 13(6):602中描述了增强子；以及在Bhat和Wold(1986),J.Virology 57(3):1155中讨论了多腺苷酸化序列。本领域技术人员可以鉴别额外的腺病毒转录和/或翻译控制序列。

在某些实施方案中，转基因序列在腺病毒MLP之下(即在其控制之下)。如本文所用，“主要晚期启动子(MLP)”可与主要晚期转录单位(MLTU)启动子互换使用。在其他实施方案中，转基因序列在腺病毒MLP和腺病毒TPL之下。在其他实施方案中，转基因序列在腺病毒MLP之下并且与腺病毒剪接接纳体序列可操作地连接。在又其他实施方案中，转基因序列在腺病毒MLP和腺病毒TLP之下，并且与腺病毒剪接接纳体序列可操作地连接。在某些实施方案中，腺病毒剪接接纳体序列是非共有序列。不希望受理论的限制，据信当非共有剪接接纳体与腺病毒MLP结合使用时，它们比共有剪接接纳体表现更好。在任何前述实施方案中，转基因序列可以还与腺病毒多腺苷酸化信号序列可操作地连接。

在某些实施方案中，转基因序列在内源性腺病毒转录和/或翻译控制序列之下(即在其控制下)。如本文所用，“内源性”腺病毒转录和/或翻译控制序列是参与转录和/或翻译调控的核酸序列，其对腺病毒载体来说是天然的并且没有借助于重组技术被引入或移动到新位置。

在某些实施方案中，转基因序列包含外源性转录和/或翻译控制序列。如本文所用，“外源性”转录和/或翻译控制序列是指非腺病毒转录和/或翻译控制序列或腺病毒转录和/或翻译控制序列从其野生型环境中取出并置于异源序列中的新环境中。外源性转录和/或翻译控制序列的实例包括但不限于在哺乳动物细胞中起作用的启动子(例如组成型启动子，诸如CMV启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)LTR启动子、SV40启动子、二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子、β-肌动蛋白启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、EF1.α启动子(Invitrogen)等)、在哺乳动物细胞中起作用的增强子序列(例如CMV或RSV增强子序列)、剪接信号、剪接增强子、前导序列、Kozak序列、增加RNA稳定性和/或加工的序列(例如顺式作用的RNA输出元件、土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(WPRE))、聚A信号序列(例如牛生长激素(BGH)或SV40聚A信号序列)等。现有技术中已经描述了各种合适的转录和/或翻译控制序列。例如，已经在美国专利申请2006/0115456中描述了合适的CMV启动子。已经在Donello等人.(1998),J.Virology72(6):5085中描述了WPRE元件。WPRE元件必须位于ORF信息内，通常位于基因的3'末端与5'多腺苷酸序列之间。不希望受理论的限制，据信WPRE通过增加mRNA从细胞核易位的效率以及增加RNA翻译和稳定性来发挥作用。也已经在例如Kozak,Nucleic Acid Res 15(20),8125-48(1987)中描述Kozak序列。

合适的转录和/或翻译控制序列，无论是腺病毒的还是其他的，包括天然存在的序列以及此类序列的修饰形式。此类修饰形式可以包括一种或多种碱基改变(例如缺失、插入、取代)，所述改变被设计以增强与转录和/或翻译控制序列相关的所需活性或降低或消除与内源性腺病毒转录和/或翻译控制序列相关的非所需活性。

在某些实施方案中，转基因序列包含多个转录或翻译控制序列。例如，转基因序列可以包含足够的转录或翻译控制序列，以确保在腺病毒载体感染适当的细胞(例如人类细胞)时ORF在转基因序列中的表达。在某些实施方案中，转基因序列包含启动子(例如CMV启动子)和腺病毒TPL序列。在其他实施方案中，转基因序列包含启动子(例如CMV启动子)、腺病毒TPL和腺病毒聚A信号序列(例如Ad5 E3 A聚A信号序列)。结合任何前述实施方案，转基因序列可以还包含Kozak序列。

在某些实施方案中，转基因序列包含用于两个或更多个ORF中的每一个的一个或多个转录或翻译控制序列。例如，转基因序列可以包含足够的转录或翻译控制序列以确保两个或更多个ORF中的每一个的表达。因此，在某些实施方案中，转基因序列包含用于两个ORF中的每一个的启动子和聚A信号序列。对于ORF中的每一个，转基因序列可以还包含腺病毒TPL和/或Kozak序列。或者，在某些实施方案中，转基因序列可以包含足够的转录或翻译控制序列以确保一个ORF(例如启动子和/或增强子和聚A信号序列)的表达，同时包含受内源性腺病毒转录或翻译控制序列控制或与其可操作地连接的第二ORF。

在某些实施方案中，已优化转基因序列以增加或最大化至少一个ORF的表达和/或翻译。例如，在某些实施方案中，转基因序列中的ORF已被密码子优化(例如用于在哺乳动物细胞，诸如人类细胞中表达)。在一个实施方案中，转基因序列已经过密码子优化并且在非腺病毒启动子，诸如CMV启动子的控制之下。在其他实施方案中，与ORF可操作地连接的Kozak序列是已经被优化以产生例如共有Kozak序列的转基因序列。在又其他实施方案中，转基因序列已被优化以去除潜在的抑制序列，诸如外显子剪接沉默子或绝缘子序列(例如用以组织染色质和阻断启动子和/或增强子的长距离作用的序列)。密码子优化和其他类型的序列优化在本领域中是常规的并且技术人员将容易理解如何进行这样的优化。

在转基因序列在MLP启动子的控制之下的一些实施方案中，转基因序列不是密码子优化的——即，转基因序列是来自感染性病原体的天然序列。例如，在一个实施方案中，腺病毒载体包含在腺病毒MLP启动子控制之下的非密码子优化的转基因序列，其中腺病毒载体具有复制能力并且具有部分E3缺失。

在一些实施方案中，AAd衍生的复制缺陷型基因转移载体是基于AAd病毒。在AAd衍生载体的一个实施方案中，AAd基因组左侧区域的一部分缺失，使得所得AAd基因组不能再复制，除非缺失的基因组由另一种基因构建体部分或完全以反式提供(图2C)。在另一个实施方案中，AAd基因组左侧区域的这部分的这些缺失部分或全部被一种或多种转基因构建体替换。

在AAd衍生的复制缺陷型基因转移载体的另一个实施方案中，AAd基因组以下列方式缺失：1)AAd基因组右侧区域的一部分以其本身不会阻止所述AAd基因组在不存在任何互补基因构建体的情况下复制的方式来缺失；2)AAd基因组左侧区域的一部分缺失，因此所得AAd基因组不能再复制，除非缺失的基因组部分或完全由另一种基因构建体以反式形式提供(图2C)。在另一个实施方案中，AAd基因组的这些缺失部分或全部被一种或多种转基因构建体替换。

在AAd衍生的复制缺陷型基因转移载体的另一个实施方案中，删除AAd基因组以使得所得AAd基因组不能再复制，除非缺失的基因组由另一种基因构建体部分或完全以反式提供(图2D)。在另一个实施方案中，AAd基因组的这些缺失部分或全部被一种或多种转基因构建体替换。在AAd衍生的复制缺陷型基因转移载体的另一个实施方案中，AAd基因组中的所有内源性AAd基因都缺失，因此只有左和右ITR连同包装信号ψ一起保留(图2D)。在完全缺失的“有肠”AAd载体的这些实施方案中，缺失的区域部分或全部被惰性填充序列替换。在其他实施方案中，缺失被惰性填充序列部分替换，并且被一种或多种转基因构建体部分替换。

在这些AAd衍生的复制缺陷型基因转移的其他实施方案中，CELO AAd基因组用作所描述的AAd衍生的基因转移载体的基础。在这些AAd衍生的复制缺陷型基因转移的其他实施方案中，其他AAd病毒用作所描述的AAd衍生基因转移载体的基础。所述病毒是但不限于鸡禽腺病毒A、鹘禽腺病毒A、鹌鹑支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、出血性肠炎病毒、大理石脾病病毒和包涵体肝炎病毒。

在其他实施方案中，介导部分缺失的AAd衍生载体的复制和包装所需的互补的AAd衍生基因组片段由从部分缺失的复制缺陷型AAd衍生载体中缺失的部分构成(图5)。在其他实施方案中，介导部分缺失的AAd衍生载体的复制和包装所需的互补的AAd衍生基因组片段由从部分缺失的复制缺陷型AAd衍生载体中缺失的一些或全部部分构成。在其他实施方案中，介导部分缺失的AAd衍生载体的复制和包装所需的互补的AAd衍生基因组片段由从部分缺失的复制缺陷型AAd衍生载体中缺失的一些或全部部分的一种或多种基因构建体提供。

在其他实施方案中，互补的AAd衍生基因组片段源自CELO AAd基因组。在其他实施方案中，互补的AAd衍生基因组片段源自其他AAd基因组。所述病毒是但不限于鸡禽腺病毒A、鹘禽腺病毒A、鹌鹑支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、出血性肠炎病毒、大理石脾病病毒和包涵体肝炎病毒。

在其他实施方案中，使完全缺失的“有肠”AAd衍生载体复制所需的称为包装构建体的互补的AAd衍生基因组片段在所有情况下都由缺失包装信号ψ的全部或部分AAd衍生基因组构成(图3和图6)。在其他实施方案中，使完全缺失的“有肠”AAd衍生载体复制所需的称为包装构建体的互补的AAd衍生基因组片段在所有情况下都由缺失一个或两个ITR和缺失包装信号ψ的全部或部分AAd衍生基因组构成(图3和图6)。

在其他实施方案中，用于复制和衣壳化AAd衍生的基因转移载体的宿主细胞是真核细胞，诸如但不限于人类细胞。在其他实施方案中，用于复制和衣壳化AAd衍生的基因转移载体的宿主细胞是来源于鸟纲或鸟类动物的真核细胞。在其他实施方案中，用于复制和衣壳化AAd衍生的基因转移载体的宿主细胞是细胞，诸如化学诱导的鸡肝癌细胞系(LMH)。

在其他实施方案中，介导复制缺陷型AAd衍生载体的复制和包装所需的互补的AAd衍生基因组片段在宿主细胞中瞬时表达。在其他实施方案中，介导复制缺陷型AAd衍生载体的复制和包装所需的互补的AAd衍生基因组片段在宿主细胞中稳定表达。

在其他实施方案中，用于复制和衣壳化AAd衍生的基因转移载体的宿主细胞被修饰以稳定携带表达盒，所述表达盒携带AAd基因组左侧的遗传物质(图4)。所述表达盒含有启动子，诸如但不限于PGK启动子和多腺苷酸化位点，诸如但不限于HSV多腺苷酸化位点。在其他实施方案中，用于修饰宿主细胞的AAd基因组来源于AAd病毒，诸如但不限于CELO病毒、鸡禽腺病毒A、鹘禽腺病毒A、鹌鹑支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、出血性肠炎病毒、大理石脾病病毒和包涵体肝炎病毒。

在其他实施方案中，用于复制和衣壳化AAd衍生的基因转移载体的宿主细胞被修饰以稳定携带表达盒，所述表达盒携带非AAd基因组左侧的遗传物质，诸如但不限于来自另一类动物的腺病毒。

在其他实施方案中，以下列方式产生部分缺失的AAd衍生的复制缺陷型载体：1)将AAd衍生的基因组从其克隆载体中释放出来，使其由以左右ITR为界的线性DNA分子组成；2)使复制缺陷型AAd衍生基因组能够复制所需的AAd衍生的互补基因构建体从其克隆载体中释放出来；3)将两种基因构建体共转染至宿主细胞中；4)将转染的宿主细胞以AAd衍生的复制缺陷型载体复制并衣壳化的方式孵育；和5)从细胞中释放衣壳化的AAd载体并收获。

在另一个实施方案中，宿主细胞被修饰以稳定地携带和表达使复制缺陷型AAd衍生基因组能够复制所必需的AAd衍生的互补基因构建体。将从其克隆载体释放的AAd衍生基因组转染至所述修饰的宿主细胞中，将转染的宿主以使AAd衍生复制缺陷型载体复制和衣壳化的方式进行细胞孵育；并且从细胞中释放衣壳化的AAd载体并收获。

在其他实施方案中，以下列方式产生完全缺失的“有肠”AAd衍生的复制缺陷型载体：1)将完全缺失的“有肠”AAd衍生的基因组从其克隆载体中释放出来，使其由以左右ITR为界的线性DNA分子组成；2)将使完全缺失的“有肠”AAd衍生载体能够复制所需的称为包装构建体的互补的AAD衍生的基因组片段在其表达载体中提供；3)将两种基因构建体共转染至宿主细胞中，所述宿主细胞被修饰以稳定携带和表达使完全缺失的“有肠”AAd衍生的基因组能够复制所必需的AAd衍生的互补基因构建体；4)以AAd衍生的复制缺陷载体被复制和衣壳化的方式来孵育转染的宿主细胞；和5)将衣壳化的AAd载体从细胞中释放并收获。

在一些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含在腺病毒启动子(例如主要晚期启动子)控制下的转基因序列，其中转基因序列编码来自流感、芽孢杆菌、HIV、HPV、披膜病毒(例如登革热病毒)、志贺、分枝杆菌、链球菌或疟原虫的抗原。在一个实施方案中，转基因序列编码来自流感的H1 HA、H3 HA、H5 HA或B HA抗原。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自炭疽杆菌的保护性抗原或修饰的保护性抗原。在另一个实施方案中，转基因序列编码包膜蛋白(例如gp160、gp140、gp120)、修饰的包膜蛋白或来自HIV的gag蛋白。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自HPV，包括HPVI6和HPV18的L1蛋白、L2蛋白、E6蛋白、E7蛋白或其融合物。在又另一个实施方案中，转基因序列编码来自疟原虫的CSP、Pfs48/45、MSP1、MSP(C-端，p42)或LSA1。在一些实施方案中，转基因序列编码来自分枝杆菌的Ag85、ESAT、HspX或其组合。在其他实施方案中，转基因序列编码来自志贺菌的PSSP、r56Karp蛋白或侵袭蛋白(例如IpaB、IpaC或IpaD蛋白)。在又其他实施方案中，腺病毒载体可以还包含腺病毒三联前导序列。例如，转基因序列可以在腺病毒MLP和三联前导的控制下，其中转基因序列编码来自流感、芽孢杆菌、HIV、HPV、披膜病毒(例如登革热病毒)、志贺菌、分枝杆菌、链球菌或疟原虫的抗原。

在其他实施方案中，本发明的腺病毒载体包含在非腺病毒启动子(例如CMV启动子、RSV LTR启动子、SV40启动子、DHFR启动子、β-肌动蛋白启动子、PGK启动子、EF1.α启动子)控制下的转基因序列，其中转基因序列编码来自流感、芽孢杆菌、HIV、HPV、披膜病毒(例如登革热病毒)、志贺菌、分枝杆菌、链球菌或疟原虫的抗原。例如，在一个实施方案中，转基因序列在CMV启动子的控制下并编码来自流感、芽孢杆菌或HIV的抗原。在一个具体实施方案中，转基因序列是来自流感、芽孢杆菌或HIV的密码子优化序列。在另一个实施方案中，转基因序列是来自流感、芽孢杆菌或HIV的天然序列。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自流感的H1 HA、H3 HA、H5 HA、B HA、NP或M1抗原。在另一个实施方案中，转基因序列编码来自炭疽杆菌的保护性抗原或修饰的保护性抗原。在又另一个实施方案中，转基因序列编码包膜蛋白(例如gpl60、gp140、gp120)、修饰的包膜蛋白或来自HIV的gag蛋白。在一些实施方案中，腺病毒载体可以还包含腺病毒三联前导序列。例如，转基因序列可以在CMV启动子和腺病毒三联前导的控制下，其中转基因序列编码来自流感、芽孢杆菌、HIV、HPV、披膜病毒(例如登革热病毒)、志贺菌、分枝杆菌、链球菌或疟原虫的抗原。

在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含第二转基因序列。因此，在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含转基因序列和第二转基因序列。或者，本发明的腺病毒载体可以包含第二转基因序列来代替转基因序列。

转基因序列可以具有上文所描述的转基因序列的结构，并且可以以上文所描述的任何方式插入腺病毒基因组中。因此，在某些实施方案中，转基因序列可以编码全长抗原或其片段(例如结构域、二级结构的单元、保守表位、B细胞、HTL或CTL表位，或其组合)。在一些实施方案中，转基因序列编码治疗蛋白(诸如细胞因子或生长因子)或刺激免疫系统的其他蛋白质。例如，在一个实施方案中，转基因序列编码刺激白细胞的蛋白质，诸如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，转基因序列编码来自感染性病原体的抗原并且转基因序列编码治疗蛋白。在一个具体实施方案中，转基因序列编码流感抗原(例如H1 HA、H3 HA、H5 HA或B HA抗原)，并且转基因序列编码刺激白细胞的蛋白质(例如GM-CSF)。在某些实施方案中，将转基因序列插入与转基因序列相同的腺病毒载体区中(例如使得第一序列和转基因序列位于彼此附近)。在其他实施方案中，第一序列和转基因序列被插入腺病毒载体的不同区中。

转基因序列也可以整合至腺病毒ORE中。在某些实施方案中，腺病毒ORF编码腺病毒结构蛋白(例如衣壳蛋白，诸如六邻体蛋白或纤维蛋白)。因此，在某些实施方案中，将转基因序列整合至腺病毒六邻体ORF中，其中所得六邻体ORF和异源序列的融合物编码嵌合六邻体蛋白。在其他实施方案中，将转基因序列整合至腺病毒纤维ORF中，其中纤维ORF和异源序列的所得融合物编码嵌合纤维蛋白。大体上，本发明的嵌合六邻体或纤维蛋白将保留六邻体或纤维功能(例如形成六邻体壳粒或纤维并有助于衣壳形成)，同时呈递所得腺病毒表面的新抗原。本发明的重组腺病毒表面的新抗原呈递是有利的，因为它有助于避免普通人群中预先存在的腺病毒免疫问题，这会降低基于腺病毒的疫苗的功效。另外，来自感染性病原体的抗原在重组腺病毒表面的呈递可以通过将更多种类的感染性病原体抗原呈递给接种疫苗的受试者的免疫系统来扩大由本发明的基于腺病毒的疫苗刺激的免疫反应。

因此，在某些实施方案中，转基因序列被整合至腺病毒结构蛋白(例如衣壳蛋白，诸如六邻体或蛋白质)的ORF中，其中转基因序列编码来自感染性病原体的抗原。感染性病原体和其抗原可以如上文所描述的。在某些实施方案中，抗原来自流感表面蛋白，诸如M2(例如M2的外部结构域、片段或表位)。在某些实施方案中，M2抗原选自一组M2肽序列。在某些实施方案中，转基因序列编码表4中列出的超过一种的M2肽序列。例如，转基因序列可以编码来自H1、H2和/或H3流感毒株、H5流感毒株、H7流感毒株或H9流感毒株的至少两个M2序列。或者，转基因序列可以编码来自多种不同流感血清型的M2序列。在其他实施方案中，转基因序列可以编码流感基质序列或流感NP序列的一个或多个拷贝。在其他实施方案中，流感抗原是HTL或CTL表位。例如，转基因序列可以编码一个或多个HTL表位。

可插入单个六边形HVR的序列量取决于特定的HVR(例如HVR1、HVR2等)和HVR的长度。大体上，插入可以编码对应于HVR多肽序列长度的多肽序列(如果HVR序列被替换)加上额外的0至75、1至70、2至65、3至60、4至55或5至50个氨基酸。已描述六邻体HVR插入，例如，在Matthews等人.(2008),Virology Journal 5:98中的Ad5。

编码来自感染性病原体的抗原的序列可以替代六邻体HVR，使得六邻体序列和抗原序列彼此相邻。如本文在此上下文中使用的，术语“相邻”是指六邻体编码序列与抗原编码序列之间的框内融合，其中不存在连接六邻体和抗原序列的接头序列。或者，可以使用接头序列连接六邻体和抗原序列。在某些实施方案中，接头序列是编码三肽“LGS”的序列。接头序列可以包括在例如抗原序列的开始和结束处，如图12中所示。不希望受理论束缚，据信LGS接头序列提供结构灵活性、提高所得六邻体融合蛋白的稳定性和/或降低六邻体蛋白序列与由异源序列编码的蛋白质序列之间的衔接免疫原性。在其他实施方案中，接头序列编码肽序列“GAAA”(SEQ ID NO:352)或“NAA”。此类接头序列可以与例如在由异源序列编码的蛋白质的N末端上的GAAA序列和C末端上的“NAA”序列组合使用。本领域技术人员可以鉴定其他适合的接头序列。

在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含第三异源序列。因此，在某些实施方案中，本发明的腺病毒载体包含第一、第二和第三异源序列。或者，本发明的腺病毒载体可以包含第二和第三异源序列。第三异源序列可以如具有上文所描述的转基因序列或转基因序列的结构，并且可以上文所描述的任何方式插入腺病毒基因组中。

在下文列出的实施例中公开用于构建、遗传操作和繁殖重组腺病毒载体的技术。也参见例如WO 2008/010864、美国专利申请2006/0115456和美国专利号6,127,525，其内容以引入的方式并入本文。

在另一方面，本发明提供了包含一种或多种本发明的腺病毒载体的疫苗。如本文所用，术语“疫苗”是指包含本发明的腺病毒载体和载剂的组合物。在某些实施方案中，腺病毒载体是病毒。在其他实施方案中，腺病毒载体是单独的基因组并且不包括腺病毒衣壳。在某些实施方案中，载剂是佐剂。此类佐剂的实例包括但不限于盐，诸如磷酸钙、磷酸铝、氢氧化钙和氢氧化铝；天然聚合物，诸如藻类葡聚糖(例如β葡聚糖)、壳聚糖或结晶菊糖；合成聚合物，诸如聚丙交酯、聚乙交酯、聚丙交酯-共-乙交酯或丙烯酸甲酯聚合物；形成胶束的阳离子或非离子嵌段共聚物或表面活性剂，诸如Pluronic、L121、122或123、Tween 80或NP-40；基于脂肪酸、脂质或脂质和蛋白质的囊泡，诸如脂质体、脂蛋白体、ISCOM和脂质卷结构；和由合成或天然油和水溶液构成的表面活性剂稳定的乳液。在某些实施方案中，本发明的疫苗在施用受试者后能够在受试者中刺激免疫反应(例如体液免疫反应、细胞免疫反应或两者)。在某些实施方案中，免疫反应包括对由插入或整合至疫苗的腺病毒载体中的异源序列编码的表位的可测量的反应(例如可测量的体液或细胞免疫反应，或其组合)。在某些实施方案中，本发明的疫苗能够提供针对感染性病原体或针对癌症的保护。例如，在某些实施方案中，疫苗能够刺激针对一种或多种抗原(例如由异源序列编码)的免疫反应，使得在随后遇到这种抗原时，接受疫苗的受试者具有比以前没有接种过疫苗的情况更强的免疫反应。在一些实施方案中，本发明的疫苗能够在具有预先存在的对腺病毒的免疫力的受试者中提供针对感染性病原体或癌症的保护。在其他实施方案中，本发明的疫苗能够改善病原体感染或癌症和/或减轻病原体感染或癌症的至少一种症状。例如，在一个实施方案中，本发明的疫苗诱导针对由异源序列编码的一种或多种抗原的治疗性免疫反应，使得病原体感染或癌症的症状和/或并发症将在患有这种感染或癌症的受试者中得到缓解、减轻或改善。

用于疫苗的腺病毒载体可以按照本领域熟知的技术制备和配制以施用哺乳动物。已经开发了用于肠胃外施用的制剂，诸如但不限于肌肉内、静脉内、皮下和皮内或肠内施用，诸如但不限于已经开发了用于腺病毒载体的口服施用。

口服施用可以由以下组成：含有预定量的本发明的重组腺病毒载体的胶囊或片剂；液体溶液，诸如将有效量的药物溶解在可摄取的稀释剂中，诸如水、盐水、橙汁等；在适当的液体中的悬浮液；和合适的乳液。如前所述，本发明的腺病毒载体可以例如配制为用于口服施用的肠溶包衣胶囊，以绕过上呼吸道并允许病毒在肠道中复制。参见例如Tacket等人,Vaccine 10:673-676,1992；Horwitz,in Fields等人编,Fields Virology,第三版,第2卷,第2149-2171页,1996；Takafuji等人,J.Infec.Dis.140:48-53,1979；和Top等人,J.Infec.Dis.124:155-160,1971。或者，可以将腺病毒载体配制在常规溶液中，诸如无菌盐水中，并且可以掺入一种或多种药学上可接受的载剂或赋形剂。药物组合物可以还包含其他活性剂。

在某些实施方案中，本发明的制剂包含缓冲溶液，所述缓冲溶液包含在药学上可接受的载剂中的腺病毒载体(例如病毒)。可以使用多种载剂，诸如缓冲盐水、水等。这些溶液大体是无菌的并且不含不合需要的物质。这些组合物可以通过众所周知的常规灭菌技术灭菌，或者可以经历无菌过滤。组合物可含有模拟生理条件所需要的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。

药学上可接受的载剂可以含有生理学上可接受的化合物，其用以例如使组合物稳定或增加或减少病毒和/或药物组合物的吸收。生理上可接受的化合物可以包括例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质；减少任何共施用剂的清除或水解的组合物；或赋形剂；或其他稳定剂和/或缓冲剂。洗涤剂也可以用于稳定组合物或增加或减少吸收。本领域的技术人员将理解，选择药学上可接受的载剂(包括生理上可接受的化合物)取决于例如腺病毒制剂的施用途径和任何共施用剂的具体物理化学特征。

腺病毒载体也可以在脂质制剂中施用，更特别地与脂质体复合或与脂质/核酸复合物复合或在脂质体中衣壳化。单独的或与其他合适的组分组合的本发明的载体也可制成通过吸入施用的气溶胶制剂。还可以配制疫苗，用于通过鼻通道施用。适合用于经鼻施用的制剂(其中载剂是固体)包括具有例如在约10微米至约500微米范围内的粒度的粗糙粉末，所述粗糙粉末以其中采用鼻吸的方式来施用，即通过鼻通道从靠近鼻子的粉末的容器中快速吸入。其中载剂是液体的用于以例如鼻腔喷雾剂、滴鼻液的形式或通过气雾剂来施用或通过喷雾器施用的合适的制剂包括活性成分的水性或油性溶液。在一些实施方案中，本发明的腺病毒载体可以配制成栓剂，例如用于直肠或阴道施用。

在另一个方面，本发明提供了一种在受试者中诱导对本文所描述的任何感染性病原体的免疫反应的方法，其包括向受试者施用本发明的疫苗。在一个实施方案中，本发明提供了一种为受试者接种针对感染性病原体的疫苗的方法，其包括向有被感染性病原体感染风险的受试者施用足量的本发明的疫苗。在另一个实施方案中，受试者患有由感染性病原体诱导的感染。因此，例如，在一个实施方案中，本发明提供了一种在经历由感染性病原体诱导的感染的受试者中诱导治疗性免疫反应的方法。在一些实施方案中，在施用疫苗后受试者中感染的一种或多种症状或并发症减少或减轻。本发明的疫苗可用于为人类或兽医受试者接种疫苗。

本发明的疫苗可以单独施用，或可以与其他免疫学、抗原性、疫苗或治疗性组合物共施用或依序施用。此类组合物可以包括增强或扩大免疫反应的其他剂，例如IL-2或可以以特定时间间隔施用或连续施用的其他细胞因子(参见例如Smith等人,N Engl J Med1997年4月24日；336(17):1260-1；和Smith,Cancer J Sci Am.1997年12月；增刊3 1:S137-40)。疫苗或载体也可以与其他疫苗或载体一起施用。例如，本发明的腺病毒可以在施用不同血清型的腺病毒之前或之后施用。也可以使用腺病毒制剂，例如用于在使用额外疫苗剂的疫苗方案中引发。

腺病毒制剂可以全身、区域或局部递送。区域施用是指施用至特定的解剖空间，诸如腹膜内、鞘内、硬膜下或特定器官等。局部施用是指将组合物施用至有限的或限定的解剖空间，诸如肿瘤内注射至肿瘤块中、皮下注射、肌肉内注射等。技术人员理解局部施用或区域施用也可以导致病毒制剂进入循环系统。典型的递送途径包括肠胃外施用，例如，皮内、肌肉内或皮下途径。其他途径包括口服施用，包括向口腔黏膜(例如扁桃体)、鼻内、舌下、膀胱内(intravesical)(例如膀胱内)、直肠和阴道内途径施用。对于腺病毒的递送，通常可以通过吸入进行施用。例如，气溶胶制剂可以置入加压的药学上可接受的推进剂中，诸如二氯二氟甲烷、氮气等。它们也可被配制成药物用于非加压制备，诸如在喷雾器或雾化器中。通常，这种施用是在如上文所描述的水性药理学上可接受的缓冲液中。例如，也可以使用支气管镜完成向肺的递送。

本发明的疫苗可以多种单位剂型施用，取决于预期用途，例如预防性疫苗或治疗方案，以及施用途径。关于治疗用途，每个患者的具体病状或疾病以及一般医疗状况将影响给药方案。

病毒的量和浓度以及给定剂量或“治疗有效”剂量的配方可以由兽医或临床医生确定。疫苗的治疗有效剂量是一定量的腺病毒，其将刺激对病毒载体中包含的异源核酸编码的一种或多种蛋白质的免疫反应。剂量安排，即给药方案，将取决于多种因素，例如患者健康的一般状态、身体状况、年龄等。现有技术允许临床医生确定每个个体患者的剂量方案。腺病毒多年来一直被安全地用于人类疫苗。参见例如Franklin等人，同上；Jag-Ahmade等人,J.Virol.,57:267,1986；Ballay等人,EMBO J.4:3861,1985；PCT公开WO 94/17832。当实施本发明的方法时，这些说明性实施例也可用作确定剂量方案的指导。

腺病毒制剂的单次或多次施用可以作为预防性或治疗性疫苗施用。在一个实施方案中，向受试者施用多次剂量(例如两剂或更多剂、三剂或更多剂、四剂或更多剂、或五剂或更多剂)以诱导或增强保护性或治疗性免疫反应。两次或更多次剂量可以以周期性间隔分开，例如一周、两周、三周、一个月、两个月、三个月或六个月的间隔。

在又另一个方面，本发明还提供了含有本发明的载体、载体系统或疫苗的试剂盒。例如，试剂盒还可以含有用于本发明的腺病毒生长的细胞。试剂盒还可以包括使用试剂盒生成腺病毒的教学材料教示方法，并且对于疫苗，可以包括指示剂量、施用途径和方法等的说明。

以下实施例说明了本发明的各种方面。当然，所述实施例应理解为仅是对本发明的某些实施方案的说明，而不是对本发明范围的限制，本发明的范围是由附在本说明书末尾的权利要求限定。

已经详细描述了本公开，显而易见的，在不脱离权利要求的范围的情况下，修改和变化是可能的。

实施例

提供以下非限制性实施例以进一步说明本公开。

实施例1

重组复制缺陷型CELO AAd衍生的基因转移载体的构建。

禽腺病毒CELO的基因组是长度为大约44kb的线性DNA(图1)。它的边界是长度为大约120bp的反向末端重复(ITR)。从左侧ITR的上游，包装信号ψ大约位于核苷酸70至200内。

其他人已经证明，CELO基因组的核苷酸400065至43684可以在不破坏CELO基因组复制和包装在宿主细胞中的能力的情况下缺失或替换转基因构建体(图2A)。这个上游基因组区域松散地对应于开放阅读框9、10和11。

CELO基因组在核苷酸938与2300之间的缺失或替换消除了CELO基因组自身复制的能力(图2B)。这个下游基因组区域松散地对应于开放阅读框1、15和2。这种部分缺失的CELO基因组的复制和衣壳化可以通过互补CELO基因组片段的存在来实现，所述片段由涵盖开放阅读框1、15和2的基因组片段组成，其中的启动子序列位于开放阅读框1的上游。例如，这种互补CELO基因组片段可以由但不限于涵盖核苷酸1到3100或250到3100的两个CELO基因组片段组成。

如图2C中以图解方式所描绘的，可以通过缺失CELO基因组下游侧的基因组片段来构建称为CELrd的基于复制缺陷型CELO的禽腺病毒载体，所述基因组片段在功能上和/或部分缺失开放阅读框1、15和2或松散地对应于由核苷酸794到2829构成的基因组片段。可以将转基因构建体整合到这种缺失中，所述转基因构建体要么携带它们自己的启动子和多腺苷酸化位点，要么使用在CELO基因组的所述区域中发现的相应位点。

如图2C中以图解方式所描绘的，可以构建另一种基于复制缺陷型CELO的禽腺病毒载体，其携带上述下游缺失的第二缺失。CELO基因组也可以缺失CELO基因组上游侧上的基因组片段，所述基因组片段在功能上和/或部分缺失开放阅读框9、10和11或松散地对应于由核苷酸40037到42365构成的基因组片段。可以将转基因构建体整合到这种缺失中，所述转基因构建体要么携带它们自己的启动子和多腺苷酸化位点，要么使用在CELO基因组的所述区域中发现的相应位点。限制酶位点将被放置在与ITR相邻的载体构建体之外，以便可以通过限制酶酶切释放载体基因组。

实施例2

完全缺失的“有肠”复制缺陷型CELO AAd衍生的基因转移载体的构建。

如图2D中以图解方式所描绘的，可以通过缺失CELO基因组的大片段并用非腺病毒填充序列替换它们来构建CELO AAd衍生的基因转移载体。缺失的片段可以被转基因构建体替换，所述转基因构建体由与启动子和多腺苷酸化位点连接的目标转基因构成，或使用CELO基因组内发现的启动子和多腺苷酸化位点。可以将超过一种转基因构建体整合至缺失的CELO基因组中。CELO基因组可以缺失所有CELO基因，留下ITR、包装信号ψ和非编码CELO序列。缺失的序列被惰性填充物和/或转基因表达构建体替换。此类CELO载体表示完全缺失和/或“有肠”，称为CELfd。剩余的CELO序列松散地对应于核苷酸1到200或1到350以及缺失核苷酸43604到43804的CELO基因组。限制酶位点将被放置在与ITR相邻的载体构建体之外，以便可以通过限制酶酶切释放载体基因组。

实施例3

互补基因构建体的构建使得复制缺陷型CELO AAd衍生的载体能够复制和衣壳化。

为了使实施例1中所描述的CELrd型的部分缺失的CELO AAd衍生的载体能够复制和衣壳化，与对于CELrd型载体描述的下游缺失松散互补的CELO基因组区段必须在引入CELrd基因组后存在于包装细胞或宿主细胞中。所述互补的CELO基因组区段必须提供遗传信息，从而提供由开放阅读框1、15和2编码的蛋白质。所述互补的CELO基因组区段必须至少以提供由开放阅读框1、15和2编码的蛋白质的表达的形式涵盖核苷酸794到2829的CELO基因组。这些蛋白质的表达可以通过CELO基因组片段来实现，诸如但不限于核苷酸1到3100或250到3100的CELO基因组片段(图3A)。这些蛋白质的表达可以通过使用一个异源启动子和一个异源多腺苷酸化位点，或多个异源启动子和多个异源多腺苷酸化位点的表达载体来实现，以促进开放阅读框架1、15和2的表达(图3B)。

实施例4

能够复制和衣壳化完全缺失的“有肠”CELO AAd衍生的基因转移载体基因组的包装表达载体的构建

为了能够复制和衣壳化CELO AAd衍生的基因转移载体，所述载体携带CELO基因组的较大缺失或为完全缺失的“有肠”CELO载体，诸如实施例2中所描述的CELfd载体，包装表达载体必须与CELO载体基因组一起提供给包装细胞或宿主细胞。

所述包装表达载体缺失包装信号ψ，所述信号在CELO基因组区域中核苷酸70到200或350附近发现(图4)。包装表达质粒也可以对应于阅读框8、10和11的部分或完全缺失而缺失CELO基因组的反向末端重复和区段中的一个或两个(图4)。

实施例5

构建CELO基因组片段以增强包装或宿主细胞的功能。

包装细胞或宿主细胞的活性将被表达构建体增强以表达CELO基因，诸如由开放阅读框22和8(pAdCELO)编码的基因。对应于用于包装携带腺病毒E1A和E1B的基因的人类腺病毒载体的表达载体，所述表达构建体将被设计为表达阅读框22和8的基因(图5A)。图5B中给出了这种表达载体的实例。所述表达载体将携带启动子(异源或腺病毒启动子)、可能通过内部核糖体进入位点连接的开放阅读框22和8，然后是多腺苷酸化位点(异源或腺病毒位点)。这种表达构建体可以稳定地整合至包装或宿主细胞的基因组中，或在CELO AAd衍生载体复制和衣壳化期间共转染至包装或宿主细胞中。

实施例6

复制缺陷型CELO AAd衍生的基因转移载体的复制和衣壳化(图6)。

如此处对于完全缺失的“有肠”CELO AAd衍生的基因转移载体所例示，CELO AAd衍生的载体的基因组(此处是CELfd基因组)将通过限制酶酶切而从其克隆载体中释放(图6A)。与包装表达构建体一起(图6B)，它将被共转染至包装或宿主细胞(图6C)中，例如LMH细胞，这些细胞可能已通过携带pAdCELO表达构建体而被修饰。孵育几天后，释放衣壳化的CELfd载体。

CELrd型的部分缺失的CELO AAd衍生的基因转移载体将以下列方式产生。其基因组将通过限制酶酶切而释放。与实施例3中所描述的互补基因构建体一起，它将被共转染至包装或宿主细胞中，例如LMH细胞，这些细胞可能已通过携带pAdCELO表达构建体而被修饰。孵育几天后，释放衣壳化的CELfd载体。将实施例3的互补基因构建体稳定整合至包装或宿主细胞中是可能的。然后可以通过用CELrd基因组转染包装或宿主细胞或通过用衣壳化的CELrd载体转导包装或宿主细胞来复制和包装CELrd。

实施例7

针对禽流感的复制缺陷型CELO AAd载体疫苗的工程改造。

CELfd构建体的CELrd装载有由巨细胞病毒启动子，随后是血凝素基因、内部核糖体进入位点、神经氨酸酶基因和多腺苷酸化位点构成的转基因构建体，其中血凝素和神经氨酸酶基因来源于H5N1或H7N9血清型的流感病毒。鸟和其他物种的动物可以用这种以肌肉内、静脉内、皮下、鼻内或肠内疫苗递送的构建体来进行疫苗接种。在鸟类的情况下，可以通过注射受精蛋来接种疫苗。

或者，CELfd构建体装载有超过一种具有上述设计的转基因表达构建体，使得可以用单一构建体实现针对不同血清型流感的疫苗接种。

或者，CELfd构建体装载有源自不同传染病的转基因以用作组合疫苗。

当介绍本公开或其一个或多个优选实施方案的要素时，冠词“一个/种(a/an)”、“所述(the)”和“所述(said)”旨在表示存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”意图是包括性的，并且意指除了所列要素之外，可能存在其他要素。

鉴于以上，将明白的是：实现了本公开的若干目标，并且获得其他有利结果。

因为在不背离本公开的范围的情况下，可在上述产物和方法中做出各种改变，所以以上说明书中含有的所有内容均应理解为是说明性的并且不具有限制意义。

Claims (22)

1.一种包含缺失的禽腺病毒基因组的禽腺病毒基因转移载体，其中所述禽腺病毒载体是复制缺陷型的并且具有其基因组的部分缺失。

2.根据权利要求1所述的禽腺病毒基因转移载体，其中所述禽腺病毒载体来源于鉴定为禽腺病毒的不同物种和血清型中的一种。

3.根据权利要求1所述的禽腺病毒基因转移载体，其中所述禽腺病毒载体来源于鸡禽腺病毒A、鹘禽腺病毒A、鹌鹑支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、出血性肠炎病毒、大理石脾病病毒和包涵体肝炎病毒。

4.根据权利要求3所述的禽腺病毒基因转移载体，其中所述禽腺病毒基因组在功能上缺失了对应于E1A和E1B区域的开放阅读框。

5.根据权利要求1所述的禽腺病毒基因转移载体，其中所述禽腺病毒载体来源于鸡胚胎致死性孤儿(CELO)病毒。

6.根据权利要求5所述的禽腺病毒基因转移载体，其中所述禽腺病毒基因组的开放阅读框1、15和2部分缺失。

7.根据权利要求5所述的禽腺病毒基因转移载体，其中所述开放阅读框1、15和2被异源转基因部分替代。

8.一种禽腺病毒互补基因组构建体，其中表达了CELO基因组的开放阅读框1、15和2。

9.根据权利要求9所述的禽腺病毒互补基因组构建体，其中所述开放阅读框1、15和2携带CELO基因组片段。

10.根据权利要求9所述的禽腺病毒互补基因组构建体，其中所述开放阅读框1、15和2由表达载体表达。

11.一种用于禽腺病毒载体的包装和宿主细胞，其包含禽细胞。

12.根据权利要求11所述的包装和宿主细胞，其中所述细胞已经用表达对应于腺病毒E1A和E1B区的基因的构建体转染。

13.根据权利要求11所述的包装和宿主细胞，其中所述细胞已经用涵盖CELO开放阅读框22和8的构建体转染。

14.一种复制缺陷型禽腺病毒载体的复制和衣壳化方案，其包括：

(1)复制缺陷型禽腺病毒载体；

(2)互补的禽腺病毒构建体；

(3)禽类包装或宿主细胞；和

(4)将复制缺陷型禽腺病毒载体和互补的禽腺病毒构建体共转染至禽类包装或宿主细胞中。

15.一种禽腺病毒包装表达载体，其包含缺失包装信号ψ的CELO禽腺病毒衍生的基因组。

16.根据权利要求15所述的禽腺病毒包装表达载体，其中其基因组缺失至少一个其ITR。

17.根据权利要求15所述的禽腺病毒包装表达载体，其中其基因组在功能上缺失开放阅读框9、10和11。

18.一种完全缺失的“有肠”禽腺病毒载体的复制和衣壳化方案，其包括：

(1)完全缺失的“有肠”禽腺病毒载体；

(2)禽腺病毒包装表达载体构建体；

(3)禽类包装或宿主细胞；和

(4)将完全缺失的“有肠”禽腺病毒载体和禽腺病毒包装表达载体构建体共转染至禽类包装或宿主细胞中。

19.一种根据权利要求14所述的衣壳化的复制缺陷型禽腺病毒载体，其中所述载体用作基因转移载体。

20.一种根据权利要求14所述的衣壳化的复制缺陷型禽腺病毒载体，其中所述载体用于疫苗接种。

21.一种根据权利要求18所述的衣壳化的复制缺陷型禽腺病毒载体，其中所述载体用作基因转移载体。

22.一种根据权利要求18所述的衣壳化的复制缺陷型禽腺病毒载体，其中所述载体用于疫苗接种。

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