CN115698286A

CN115698286A - 外泌体衍生的piwi-相互作用rna及使用其的方法

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Publication number: CN115698286A
Application number: CN202180040396.0A
Authority: CN
Inventors: 爱德华多·马尔万; 亚历山德拉·丘洛; 艾哈迈德·G·易卜拉欣
Original assignee: Cedars Sinai Medical Center
Current assignee: Cedars Sinai Medical Center
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2021-05-17
Publication date: 2023-02-03
Also published as: WO2021237238A1; JP2023527766A; AU2021275327A1; US20230203487A1; EP4153743A1

Abstract

本文提供的是衍生自治疗性外泌体的PIWI‑相互作用RNA(piRNA)，以及使用其治疗需要组织修复和/或再生的病症的方法。通过外泌体衍生的piRNA和/或携带piRNA的外泌体治疗的病症在一些实施方案中包括缺血性损伤和/或组织纤维化。还提供了包含外泌体衍生的piRNA和药学上可接受的赋形剂的治疗组合物。

Description

外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA及使用其的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月19日提交的美国临时申请No.63/027191的优先权，该申请的全部内容通过引用并入本文。

关于联邦资助研发的声明

本发明是在国家卫生研究院授予Eduardo Marbán博士的授权号为R01 HL124074的政府支持下完成的。政府对本发明拥有一定权利。

序列表的引用

本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2021年5月16日创建的命名为SEQLIST_CSMC014WO.txt的文件提供，该文件大小为3.85KB。序列表的电子格式的信息通过引用全部并入本文。

技术领域

本公开内容一般而言涉及衍生自外泌体的PIWI-相互作用RNA(piRNA)及其治疗需要组织修复和/或再生的病症的用途。

背景技术

piRNA是一组与PIWI蛋白相关的小型非编码RNA，并且已知其在生殖系细胞中的基因沉默反转录转座子和其他遗传元件中发挥作用。细胞质PIWI蛋白是引导转座子目标的内切核苷酸的小型RNA引导核酸酶(剪切器(slicer))，而核PIWI蛋白在目标基因座上组装沉默复合物以介导转录沉默。

心球衍生细胞(Cardiosphere-derived cells，CDC)是一种心脏源性祖细胞群，其在临床前和临床环境中具有经证明的治疗效果。CDC通过分泌细胞外囊泡(EV)(即充满生物活性分子的脂质双层纳米颗粒)而发挥作用。保留了治疗潜力的永生化CDC(imCDC)可以被生成，并通过其分泌的EV提供增强的CDC功能。

发明内容

本文提供一种治疗缺血性心肌损伤的无外泌体和任选地无细胞方法，包括：识别具有缺血性心肌损伤或需要治疗缺血性心肌损伤的受试者；向该种受试者施用有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)。在几个实施方案中，有效(或治疗有效)量包括约80ng至约5mg的piRNA，以由此治疗缺血性心肌损伤。任选地，外泌体衍生的piRNA包括CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。任选地，缺血性心肌损伤包括缺血/再灌注损伤。在一些实施方案中，缺血性心肌损伤包括心肌纤维化。在一些实施方案中，受试者患有心肌梗塞。在一些实施方案中，在缺血性心肌损伤后约10分钟至约2小时施用有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的piRNA。

还提供一种治疗缺血性心肌损伤的无外泌体和任选地无细胞方法，包括：识别需要治疗缺血性心肌损伤的受试者；以及向该种受试者施用有效(或治疗有效)量的包含hsa_piR_016659的核苷酸序列的piRNA，以由此治疗缺血性心肌损伤。此外，本文提供一种治疗肌肉损伤(例如心肌损伤)的无外泌体方法，包括向受试者施用有效(或治疗有效)量的piRNA(诸如hsa_piR_016659)，以由此治疗肌肉损伤。任选地，该piRNA由hsa_piR_016659的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，缺血性心肌损伤包括缺血/再灌注损伤。在一些实施方案中，缺血性心肌损伤包括心肌纤维化。在一些实施方案中，受试者患有心肌梗塞。在一些实施方案中，在缺血性心肌损伤后约10分钟至约2小时施用治疗有效量的piRNA。在一些实施方案中，治疗有效量包括约80ng至约5mg的piRNA。在一些实施方案中，该piRNA包括一种或多种化学修饰的核苷酸。

本文还提供一种治疗需要组织修复和/或再生的病症的无外泌体方法，包括：识别具有需要组织修复和/或再生的病症的受试者；以及向受试者施用有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，其中，有效(或治疗有效)量包括约80ng至约5mg的piRNA，以由此治疗需要组织修复和/或再生的病症。任选地，需要组织修复和/或再生的病症包括肌肉或肺组织的损伤。任选地，该肌肉组织包括骨骼肌或心肌。在一些实施方案中，该病症包括或为导致组织纤维化的病症。在一些实施方案中，该病症包括缺血性心肌损伤或肺纤维化。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA包括成纤维细胞衍生的外泌体piRNA或CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。

在治疗缺血性心肌损伤或治疗需要组织修复和/或再生的病症的方法的几个实施方案中，外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：hsa_piR_016659(SEQ ID NO:1)、hsa_piR_016658(SEQ ID NO:2)、hsa_piR_001040(SEQ ID NO:3)、hsa_piR_007424(SEQ IDNO:4)、hsa_piR_008488(SEQ ID NO:5)、hsa_piR_018292(SEQ ID NO:6)、hsa_piR_013624(SEQ ID NO:7)、hsa_piR_019324(SEQ ID NO:8)和hsa_piR_020548(SEQ ID NO:9)。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA是hsa_piR_016659、其变体和/或其片段。

本文还提供一种治疗需要组织修复和/或再生的病症的无细胞方法，包括：识别具有需要组织修复和/或再生的病症的受试者；和向该种受试者施用有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，以由此治疗需要组织修复和/或再生的病症，其中，外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324、hsa_piR_020548、piR-20450、piR-16735、piR-01184、piR-20786、piR-00805、piR-04153、piR-18570、piR-16677和piR-17716。任选地，施用包括施用有效(或治疗有效)量的包含外泌体衍生的piRNA的外泌体、细胞外囊泡或脂质体，其中，外泌体、细胞外囊泡或脂质体富含外泌体衍生的piRNA。在一些实施方案中，有效(或治疗有效)量包括约80ng至约5mg的外泌体衍生的piRNA。根据实施方案，需要组织修复和/或再生的病症包括肌肉和/或肺组织的损伤。在一些实施方案中，该病症包括或为导致组织纤维化的病症。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA包括成纤维细胞衍生的外泌体piRNA或CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。

在一些实施方案中，将piRNA，例如有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的piRNA，静脉内、动脉内、肌肉内、心内、心肌内或气管内地施用。

在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA包括一种或多种化学修饰的核苷酸。

本文还提供一种治疗肺纤维化的无细胞方法，包括：识别患有肺纤维化的受试者；和向该种受试者施用有效(或治疗有效)量的治疗性外泌体、外泌体衍生的miRNA和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，以由此治疗肺纤维化，其中，所述外泌体衍生自工程化成纤维细胞。任选地，将有效(或治疗有效)量的治疗性外泌体、外泌体衍生的miRNA和/或外泌体衍生的piRNA气管内地施用。在一些实施方案中，有效(或治疗有效)量的治疗性外泌体包括约10⁶至约10¹²个颗粒。

本文还提供一种调节组织修复的方法，包括使转分化成纤维细胞群与有效(或治疗有效)量的外泌体、外泌体衍生的miRNA和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)接触，以由此抑制成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，其中，外泌体衍生自工程化成纤维细胞。任选地，有效(或治疗有效)量的外泌体包括约10⁶至约10¹²个颗粒。在一些实施方案中，转分化是TGFβ介导的转分化。在一些实施方案中，接触在体外进行。任选地，piRNA的有效(或治疗有效)量包括约1nM至约200nM。

在一些实施方案中，所述接触包括向受试者施用所述外泌体。在一些实施方案中，成纤维细胞是肺成纤维细胞。任选地，接触包括将外泌体、外泌体衍生的miRNA和/或外泌体衍生的piRNA气管内地施用于受试者。在一些实施方案中，受试者患有肺纤维化。

在一些实施方案中，外泌体衍生的miRNA包括以下中的一种或多种：miR-183-5p(SEQ ID NO:19)、miR-182-5p(SEQ ID NO:20)、miR-19a-3p(SEQ ID NO:21)、miR-92a-3p(SEQ ID NO:22)、miR-17-5p(SEQ ID NO:23)、miR-126-3p(SEQ ID NO:24)和miR-510-3p(SEQ ID NO:25)。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种、其变体和/或片段：piR-20450(SEQ ID NO:10)、piR-20548(SEQ ID NO:9)、piR-16735(SEQ IDNO:11)、piR-01184(SEQ ID NO:12、piR-20786(SEQ ID NO:13)、piR-00805(SEQ ID NO:14)、piR-04153(SEQ ID NO:15)、piR-18570(SEQ ID NO:16)、piR-16677(SEQ ID NO:17)和piR-17716(SEQ ID NO:18)。

在一些实施方案中，该方法包括从治疗性外泌体中分离piRNA，例如，外泌体衍生的piRNA。任选地，治疗性外泌体是CDC衍生的外泌体或成纤维细胞衍生的外泌体。

在一些实施方案中，该方法包括从治疗性细胞群中分离治疗性外泌体。任选地，该方法包括从非治疗性细胞中产生治疗性细胞群。在一些实施方案中，非治疗性细胞包括成纤维细胞或CDC。任选地，CDC是永生化CDC。

在一些实施方案中，治疗性细胞是同种异体的。在几个实施方案中，在施用piRNA之前、同时或之后施用治疗性细胞。

在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA的有效(或治疗有效)量为约80ng至约500μg。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA的有效(或治疗有效)量为约100ng至约10μg(例如，约100ng、约200ng、约300ng、约400ng、约500ng、约600ng、约700ng、约800ng、约900ng、约1μg、约2μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg，以及它们之间的任何量)。在一些实施方案中，piRNA，例如，外泌体衍生的piRNA，的有效(或治疗有效)量是一种具有这样治疗效果的量，该种治疗效果相当于施用约10⁹至约10¹²个永生化CDC衍生的外泌体的治疗效果。

本文还提供一种外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)治疗有此需要的受试者的缺血性心肌损伤的用途。还提供一种外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)用于制备治疗有此需要的受试者的缺血性心肌损伤的药物的用途。本文提供一种治疗性外泌体和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)治疗在有此需要的受试者的肺纤维化的用途。本文还提供治疗性外泌体和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)用于制备治疗有此需要的受试者的肺纤维化的药物的用途。

本文还提供一种用于治疗需要组织修复和/或再生的病症的无外泌体治疗组合物，包括：一种或多种外泌体衍生的piRNA，选自hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548；和药学上可接受的赋形剂。任选地，该组合物基本上由一种或多种外泌体衍生的piRNA和药学上可接受的赋形剂组成。在一些实施方案中，一种或多种外泌体衍生的piRNA是hsa_piR_016659。在一些实施方案中，该病症包括或为导致组织纤维化的病症。在一些实施方案中，该病症包括缺血性心肌损伤或肺纤维化。在一些实施方案中，一种或多种外泌体衍生的piRNA包括成纤维细胞衍生的外泌体piRNA或CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。

附图说明

图1A显示了分离imCDC(永生化心球衍生细胞)-衍生的外泌体(IMEX)的示意性方案。

图1B显示了初级CDC中的IMEX piRNA(PIWI-相互作用RNA)(pCDC)、imCDC和来自pCDC的细胞外囊泡/外泌体(EV)(pCDC-EV)和来自imCDC的细胞外囊泡/外泌体(EV)(imCDC-EV)。

图1C显示经由qPCR的不同浓度下imCDC-EV中的ImEV-piRNA的检测。

图2A显示了体内缺血/再灌注(I/R)模型的示意性方案。

图2B显示了I/R后48小时的心脏的氯化三苯基四氮唑(TTC)染色。

图3A和3B显示了I/R后24小时和48小时的心肌肌钙蛋白I水平(ng/ml)。

图4A和4B阐释了ImEV-piRNA对I/R后外周血中单核细胞百分比的影响。图4A显示了I/R后24小时和48小时的单核细胞的百分比。图4B显示了I/R后24小时至48小时内的单核细胞百分比的变化。

图5A和5B显示了I/R后24小时和48小时的外周血中单核细胞的百分比。

图6A至6C阐释了幼稚

(M0)BMDM(骨髓衍生的巨噬细胞)的增殖活性的体外评估。图6A显示了如图所示处理24小时的BMDM-衍生的M0的图像。图6B显示了检测在8小时和24小时的细胞的代谢活性的CCK-8分析(FC(倍数变化)vs载体)。图6C显示了24小时的BrDu阳性细胞(FC vs载体)。

图7A和7B阐释了在过夜处理后BMDM-衍生的M0的迁移的体外评估。图7A显示了在指定条件下过夜处理后，在聚碳酸酯嵌件中用结晶紫染色的BMDM-衍生的M0的图像。图7B显示了BMDM-衍生的M0的迁移计算。

图8A至8D阐明ASTEX(来自活化-特化组织效应细胞(ASTEC)的细胞外囊泡/外泌体)的测序揭示了几种抗纤维化介质。图8A和8B示出了与未修饰的正常人真皮皮肤成纤维细胞中的EV相比，ASTEX中的miRs有差异化基因表达。图8C示出了明显的抗纤维化的miRs的QPCR验证。图8D示出了与成纤维细胞EV相比，ASTEX中Piwi RNA(piRNA)种类的富集度和丰度。

图9A至9C阐释了ASTEX气管内施用的剂量耐受研究。图9A显示了剂量耐受研究的研究方案。如动物体重的保持(图9B)和水肿的缺乏(肺部重量与体重之比)(图9C)所表明的，ASTEX在健康动物的肺部有很好的耐受性。

图10A至10D显示了如没有纤维化(羟脯氨酸，图10A)、Ashcroft评分(图10B)、显示浸润的白细胞缺乏的H&E染色(图10C)和肺泡组织的Masson三色染色(图10D)所表明的，ASTEX在健康动物的肺部具有良好的耐受性。

图11A至11C阐释了气管内灌注ASTEX提高小鼠博莱霉素模型的存活率并减弱肺纤维化。图11A显示了动物研究的研究方案。图11B示出了Kaplan-Meir图，该图表明与载体处理的损伤动物相比，灌注ASTEX的动物生存率提高。图11C显示了如肺组织中羟脯氨酸减低所表明的肺中的纤维化减少。

图12A至12D阐释了ASTEX可以减少体外的肺成纤维细胞转分化。图12A显示了该体外研究的研究方案。通过流式细胞术(图12B)和蛋白印迹(图12C和12D)观察到ASTEX处理的、TGFb(损伤)暴露的人肺成纤维细胞中的α平滑肌表达水平减弱。

图13显示了根据本公开的实施方案的一种治疗缺血性心肌损伤的方法的非限制性实例的流程图。

图14显示了根据本公开的实施方案的一种治疗需要组织修复和/或再生的病症的方法的非限制性实例的流程图。

图15显示了根据本公开的实施方案的一种治疗肺纤维化的方法的非限制性实例的流程图。

图16显示了人piRNA序列的核苷酸序列hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324、hsa_piR_020548、piR-20450、piR-16735、piR-01184、piR-20786、piR-00805、piR-04153、piR-18570、piR-16677和piR-17716。

图17A和17B是一组显示imCDC-EV piRNA在初级巨噬细胞的细胞质和细胞核之间往返(shuttle)的图表。

图18A和图18B是一组显示imCDC-EV piRNA处理增加初级巨噬细胞中整体(global)甲基化的图表。

图19是汇总imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA的体内和体外效果的示意图。

具体实施方式

如本文所公开的，由CDC产生的外泌体和细胞外囊泡(EV)的治疗效果可归因于外泌体或EV的一种或多种生物活性有效载荷分子。例如，与初级CDC相比，imCDC可以显示出不同的RNA含量(miRNA、mRNA、rRNA、tRNA和piRNA)。特别地，Piwi RNA(piRNA)，即由Piwi蛋白结合的小型RNA，是表观基因组和转录子组的重要调节子。ImCDC-EV(imEV-Pi)可以高度富集piRNA。

本文提供了通过向有此需要的受试者施用外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)来治疗需要组织修复和/或再生的病症的方法。如本文所公开的，由治疗性细胞(例如永生化心球衍生细胞(imCDC)和工程化成纤维细胞)产生的外泌体/EV可以包含生物活性生物分子，例如piRNA和miRNA，它们可以介导外泌体和/或细胞的治疗效果。在一些实施方案中，向患有如缺血性损伤、纤维化等的病症的受试者施用外泌体衍生的piRNA可以治疗该病症。在一些实施方案中，将含有piRNA的治疗性外泌体施用于患有如缺血性损伤、纤维化等的病症的受试者可以治疗该病症。

如本文所使用的，“外泌体”具有本领域普通技术人员所理解的和考虑到本公开内容的普通含义。外泌体也可包括微囊泡、表皮细胞体(epididimosome)、精囊体(argosomes)、外泌体样囊泡、微粒子、promininosomes、前列腺小体(prostasomes)、dexosomes、texosomes、dex、tex、archeosomes和oncosomes。除非另有说明，外泌体和细胞外囊泡(EV)在本文可互换使用。除非本文另有说明，上述每个术语也应理解为包括每种类型的膜结合囊泡的工程化高效力变体。

“PIWI-相互作用RNA”和“piRNA”在本文可互换使用，指约24至约32个核苷酸，例如约26至约32个核苷酸长度的小型非编码RNA。内源性piRNA可与PIWI蛋白(例如Piwi、Argonaute(诸如Ago3)和Aubergine)关联。内源性piRNA可以与宿主转座元件互补。

Wnt信号传导通路是一组信号转导通路，它以通过细胞表面受体将信号传入细胞的蛋白质开始。经典和非经典的Wnt信号传导通路是已知的。经典和非经典的Wnt信号传导通路都是通过Wnt蛋白配体与Frizzled家族受体的结合而激活的，从而将生物信号传递到细胞内的Dishevelled蛋白。经典的Wnt通路导致基因转录的调节，而非经典通路则调节例如细胞骨架和细胞内钙。经典的Wnt信号传导通路涉及β-连环蛋白。相比之下，非经典的Wnt信号传导独立于β-连环蛋白运作。

本文所用的“受试者”是指任何脊椎动物，包括哺乳动物和非哺乳动物。受试者可以包括灵长类动物(包括人类)以及非灵长类哺乳动物，诸如啮齿动物、家畜或狩猎动物。非灵长类哺乳动物可以包括小鼠、大鼠、仓鼠、兔子、狗、狐狸、狼、猫、马、牛、猪、绵羊、山羊、骆驼、鹿、水牛、野牛等。非哺乳动物可以包括鸟类(例如鸡、鸵鸟、鸸鹋、鸽子)、爬行动物(例如蛇、蜥蜴、乌龟)、两栖动物(例如青蛙、蝾螈)、鱼类(例如鲑鱼、鳕鱼、河豚、金枪鱼)等。术语“个体”、“患者”和“受试者”在本文可互换使用。

如本文所使用的，“治疗”和“处理”包括治愈、改善、缓解疾病、病症和/或其症状，减轻疾病、病症和/或其症状的严重性，预防疾病、病症和/或其症状，减缓疾病、病症和/或其症状的发展和/或推迟疾病、病症和/或其症状的出现。

如果在根据本文所述的方法进行治疗后，本文所述病症的一种或多种体征或症状以有益的方式改变了，其他临床接受的症状改善了，或甚至缓解了，或所需的应答被诱导了，例如至少2％、3％、4％、5％、10％或更多，则可以认为该治疗是本文所用的“有效的”或“治疗有效”。疗效可以例如通过测量根据本文所述方法治疗的病症的标志物、指标、症状和/或发生率或任何其他适当的可测量参数，例如心电活动来评估。还可以通过如住院评估的个体病情恶化的失败，或是否需要医疗干预(例如，疾病的进展被阻止)来测量疗效。治疗包括对个体或动物(一些非限制性的实例包括人或动物)的疾病的任何治疗，并包括：(1)抑制疾病，例如防止症状(例如疼痛或炎症)的恶化；或(2)缓解疾病的严重程度，例如引起症状的消退。疾病治疗的有效量是指当将其施用于有此需要的受试者时，足以导致对该疾病治疗有效(如本文对该术语所定义的)的量。可以通过评估病症的物理指标或所需应答(例如心脏活动)来确定药剂的疗效。本领域的技术人员可以通过测量此类参数中的任何一个，或这些参数的任意组合来监测施用和/或治疗的疗效。

本文所用的术语“有效量”或“治疗有效量”是指缓解疾病或障碍的至少一种或多种症状所需的组合物或药剂的量，并涉及提供所需效果的足够量的治疗组合物。“有效量”或“治疗有效量”可指在施用于典型受试者时足以提供特定修复和/或再生效果的组合物或治疗剂的量。本文所用的治疗有效量，在各种情况下，可以包括足以推迟疾病症状的发展、改变疾病症状的进程(例如但不限于减缓疾病症状的进展)或逆转疾病症状的量。治疗有效量可以治疗剂的一个或多个剂量施用。治疗有效量可以一次性施用，或在一段时间内以多个剂量施用。

本文所用的“施用”可包括施用本文所公开的治疗剂或组合物的任何合适的途径。合适的施用途径包括但不限于口服、肠胃外、静脉注射、肌肉注射、皮下、经皮、气道(气溶胶)、肺部、皮肤、注射或局部施用。施用可以是局部或系统性的。

如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与药学上可接受的载体(例如制药业中常用的载体)的组合。本文使用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症，与合理的益处/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

如本文所使用的术语“核酸”是指多个核苷酸(即包括与磷酸基团和可交换的有机碱相连的糖(例如核糖或脱氧核糖)的分子，该可交换的有机碱为取代的嘧啶(例如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代的嘌呤(例如腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G))。该术语还包括多核苷(即减去磷酸的多核苷酸)和任何其他含有机碱基的聚合物。嘌呤和嘧啶包括但不限于腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、次黄嘌呤以及其他天然和非天然存在的核酸碱基、取代和未取代的芳香族部分。任何合适的修饰都是可以考虑的。因此，术语核酸也包括诸如在碱基和/或糖中具有取代或修饰的核酸。

除非上下文明确指出，单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。同样地，除非上下文明确指出，词“或”旨在包括“和”。尽管与本文描述的方法和材料相似或相当的方法和材料可用于本公开内容的实践或测试，但合适的方法和材料将在下文描述。缩写“e.g.”在本文用来表示非限制性的实例。因此，缩写“e.g.”与术语“例如”是同义的。

细胞生物学和分子生物学中常见术语的定义可以在以下中找到：默克研究实验室(Merck Research Laboratories)出版的《默克诊断与治疗手册》(“The Merck Manual ofDiagnosis and Therapy”)，第19版，2006(ISBN 0-91 1910-19-0)；Robert S.Porter等人(编)的《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular Biology)，布莱克威尔科学有限公司(Blackwell Science Ltd.)出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；BenjaminLewin，《基因X》(Genes X)，Jones&Bartlett Publishing出版，2009(ISBN-10:0763766321)；Kendrew等人(编)，《分子生物学和生物技术：综合参考书目》(MolecularBiology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference)，VCH Publishers,Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8)；和《2009年蛋白质科学最新协议》(Current Protocolsin Protein Sciences 2009)，Wiley Intersciences，Coligan等人编。

方法

本文提供通过将外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)施用于有此需要的受试者来治疗病症(例如需要组织修复和/或再生的病症)的方法。通过本文的方法可以治疗各种病症。病症包括但不限于缺血性损伤(例如肌肉的缺血性损伤)、缺血/再灌注后组织(例如肌肉组织)的损伤和组织纤维化。在一些实施方案中，病症是例如如果不加以治疗将引起组织纤维化的病症。

本文在一些实施方案中提供治疗缺血性心肌损伤的无细胞和/或无外泌体方法。参考图13，描述了一种治疗缺血性心肌损伤的方法的实施方案的一个非限制性实例。该方法1300包括识别1310具有或需要治疗缺血性心肌损伤的受试者，和向该受试者施用1320有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，例如CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。所施用的有效(或治疗有效)量的piRNA可以在约80ng至约5mg的范围内，例如约80ng至约500μg的范围内。

还提供了一种治疗缺血性心肌损伤的方法，该方法包括识别具有或需要治疗缺血性心肌损伤的受试者，并向该受试者施用治疗有效量的RNA(例如piRNA，诸如hsa_piR_016659)，以由此治疗缺血性心肌损伤。在一些实施方案中，该piRNA包括例如如图16所示的hsa_piR_016659(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列，或其变体或衍生物。在一些实施方案中，所施用的有效(或治疗有效)量的piRNA在约80ng至约5mg的范围内，例如约80ng至约500μg的范围内。

可以通过本文的方法治疗各种缺血性心肌损伤。在一些实施方案中，缺血性心肌损伤包括由于缺血造成的心肌损害。在一些实施方案中，缺血性心肌损伤包括缺血/再灌注损伤，例如缺血后再灌注对心肌的损害。在一些实施方案中，缺血性心肌损伤包括心肌纤维化。在一些实施方案中，受试者患有心肌梗塞。

可在任何合适的时间施用piRNA。在一些实施方案中，在受试者患有缺血性心肌损伤后约10分钟、约20分钟、约30分钟、约45分钟、约60分钟、约90分钟、约2小时、约3小时、约4小时、约6小时、约12小时、约24小时或更长时间，或由前述数值中任何两个定义的范围内的时间间隔施用piRNA。在几个实施方案中，可向比如表现出初步症状或处于缺血事件极高风险的受试者预防性地施用piRNA。

本文提供治疗需要组织修复和/或再生的病症的无外泌体方法。参考图14，描述了一种治疗需要组织修复和/或再生的病症的方法的实施方案的一个非限制性实例。该方法1400包括识别1410具有需要组织修复和/或再生的病症的受试者，并向该受试者施用1420有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)。所施用的有效(或治疗有效)量的piRNA可以在约80ng至约5mg的范围内，例如，约80ng至约500μg的范围内。

通过本文的方法可以治疗各种需要组织修复和/或再生的病症。在一些实施方案中，该病症包括肌肉或肺组织的损伤或损害。在一些实施方案中，该病症包括骨骼肌或心肌的损伤或损害。在一些实施方案中，该病症包括或为引起组织纤维化，例如心肌纤维化或肺纤维化的病症。在一些实施方案中，该病症包括例如如本文所述的缺血性心肌损伤。在一些实施方案中，该病症包括肺纤维化，例如特发性肺纤维化。

可以施用任何合适量的piRNA。在一些实施方案中，有效(或治疗有效)量的piRNA为约80ng、约100ng、约120ng、约140ng、约160ng、约180ng、约200ng、约250ng、约300ng、约350ng、约400ng、约500ng、约600ng、约700ng、约800ng、约900ng、约1μg、约2μg、约5μg、约10μg、约20μg、约50μg、约100μg、约200μg、约500μg、约1mg、约2mg、约5mg或更多，或前述数值中任何两个所定义的范围内的量。在一些实施方案中，以每千克为基准施用piRNA，例如，约100ng/kg至约10mg/kg的体重，如，约1μg/kg至约1mg/kg，包括约1μg/kg至约100μg/kg。在另外的实施方案中，以基于目标组织(例如心脏或肺)的质量的量递送外泌体，例如约1μg/kg至约100mg/kg的目标组织，如约10μg/kg至约100mg/kg、约100μg/kg至约10mg/kg，包括约1mg/kg至约10mg/kg的目标组织。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA的有效(或治疗有效)量是一种具有这样治疗效果的量，该种治疗效果相当于施用约10⁹、约2x10⁹、约5x10⁹、约10¹⁰、约2x10¹⁰、约5x10¹⁰、约10¹¹、约2x10¹¹、约5x10¹²、约10¹²或更多个，或前述数值中任何两个定义的范围内的数量的永生化CDC衍生的外泌体的治疗效果。在一些实施方案中，piRNA是hsa_piR_016659。

可以经由任何合适的施用途径施用外泌体衍生的piRNA。在一些实施方案中，piRNA被系统地施用。在一些实施方案中，piRNA被局部施用。根据待治疗的组织，局部施用在一些实施方案中可以通过直接施用到组织(例如，直接注射，比如心肌内注射)来实现。局部施用也可以通过例如对特定组织灌洗(例如气管内灌洗)来实现。在一些实施方案中，外泌体和/或piRNA被雾化或吸入。在一些实施方案中，piRNA肠胃外地施用。在一些实施方案中，将外泌体衍生的piRNA静脉内、动脉内、肌肉内、心内或气管内地施用。

一般而言，本方法的piRNA衍生自和/或分离自外泌体，例如如本文所述的衍生自治疗性细胞的外泌体。在一些实施方案中，本公开的方法是无外泌体方法。在一些实施方案中，没有大量的外泌体与piRNA一起施用于受试者。在一些实施方案中，基本上无外泌体地施用piRNA。在一些实施方案中，基本上所有施用的piRNA都不与外泌体相关。在一些实施方案中，约5％或更少，约4％或更少，约3％或更少，约2％或更少，约1％或更少，约0.5％或更少，约0.2％或更少，约0.1％或更少，约0.05％或更少，约0.02％或更少，约0.01％或更少，约0.001％或更少，约0.0001％或更少，约0.00001％或更少，或前述数值中任何两个定义的范围内的百分比的所施用的piRNA与外泌体相关。在一些实施方案中，包含piRNA并施用于受试者的组合物基本上不含外泌体。

在一些实施方案中，该方法是治疗需要组织修复和/或再生的病症的无细胞方法。在一些实施方案中，无细胞方法可以包括经由施用含有外泌体衍生的piRNA的外泌体、细胞外囊泡和/或脂质体(例如，合成脂质体)来施用有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的piRNA。在一些实施方案中，外泌体、细胞外囊泡和/或脂质体富含外泌体衍生的piRNA。在一些实施方案中，与衍生自治疗细胞(例如，永生化CDC、工程化成纤维细胞(ASTEC))的外泌体中的外泌体衍生的piRNA的量相比，外泌体衍生的piRNA是富集的。

本文还提供了治疗肺纤维化的无细胞方法。参考图15，描述了治疗肺纤维化的方法的实施方案一个非限制性实例。该方法1500包括识别1510具有肺纤维化的受试者，并向该受试者施用1520有效(或治疗有效)量的治疗性外泌体和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)。所施用的有效(或治疗有效)量的piRNA可以在约80ng至约5mg的范围内，例如，约80ng至约500μg的范围内。所施用的有效(或治疗有效)量的治疗性外泌体可以是约10⁶至约10¹²个颗粒。

可以将任何合适量的治疗性外泌体施用于受试者。在一些实施方案中，本文方法包括施用约10⁶至约2x10⁶个颗粒、约2x10⁶至约5x10⁶个颗粒、约10⁷至约2x10⁷个颗粒、约2x10⁷至约5x10⁷个颗粒、约5x10⁷至约10⁸个颗粒、约10⁸至约2x10⁸个颗粒、约2x10⁸至约5x10⁸个颗粒、约5x10⁸至约10⁹个颗粒、约10⁹至约2x10⁹个颗粒、约2x10⁹至约5x10⁹个颗粒、约5x10⁹至约10¹⁰个颗粒、约10¹⁰至约2x10¹⁰个颗粒、约2x10¹⁰至约5x10¹⁰个颗粒、约5x10¹⁰至约10¹¹个颗粒、约10¹¹至约2x10¹¹个颗粒、约2x10¹¹至约5x10¹¹个颗粒、或约5x10¹¹至约10¹²个颗粒的治疗性外泌体。

在一些实施方案中，以每千克为基准施用外泌体的剂量，例如，约1.0x10⁵外泌体/千克至约1.0x10⁹外泌体/千克。在另外的实施方案中，以目标组织的质量为基础的量施用外泌体，例如约1.0x10⁵外泌体/克目标组织至约1.0x10⁹外泌体/克目标组织。在几个实施方案中，以外泌体数量与特定目标组织中的细胞数量的比率为基础施用外泌体，例如外泌体与目标细胞的比率为约10⁹:1至约1:1，包括约10⁸:1至约10⁷:1、约10⁶:1、约10⁵:1、约10⁴:1、约10³:1、约10²:1、约10:1，以及这些比率之间的比率。在另外的实施方案中，以目标组织中细胞数量的约10倍至约100万倍的量施用，包括约50倍、约100倍、约500倍、约1000倍、约10,000倍、约100,000倍、约500,000倍、约750,000倍以及介于这些量之间的量施用外泌体。如果外泌体要与同时疗法(例如，仍可脱落外泌体的细胞、药物疗法、核酸疗法等)一起施用，则可相应地调整(例如，根据需要达到预期的治疗效果增加或减少)施用外泌体的剂量。

治疗性外泌体和/或外泌体衍生的piRNA可以通过任何合适的施用途径施用。在一些实施方案中，外泌体和/或piRNA被系统地施用。在一些实施方案中，外泌体和/或piRNA被局部施用。在一些实施方案中，外泌体和/或piRNA肠胃外地施用。在一些实施方案中，外泌体和/或piRNA经气管内，例如，通过气管内灌洗施用。在一些实施方案中，外泌体和/或piRNA被雾化或吸入。

在一些实施方案中，piRNA和/或外泌体以单一的、单次剂量递送。然而，在一些实施方案中，可以递送多个剂量的piRNA和/或外泌体。在一些实施方案中，可以在一段时间内以特定的速度输注(或以其他方式递送)piRNA和/或外泌体。在几个实施方案中，当在不良事件(例如损伤或损害事件，或不良生理事件，比如MI)后，在相对较短的时间窗内施用piRNA和/或外泌体时，它们的施用可防止对目标组织损害的产生或发展。例如，如果在不良事件后约20至约30分钟内、约30至约40分钟内、约40至约50分钟内、约50至约60分钟内施用piRNA和/或外泌体，对组织的损害或不良影响就会减少(与在这些早期时间点未处理的组织相比)。在一些实施方案中，施用是在不良事件后尽快进行的。在一些实施方案中，施用是在不良事件后尽可能快地进行(例如，一旦受试者在其他方面稳定下来)。在几个实施方案中，施用在约1至约2小时内、约2至约3小时内、约3至约4小时内、约4至约5小时内、约5至约6小时内、约6至约8小时内、约8至约10小时内、约10至约12小时内，以及其重叠的范围。在一些另外的实施方案中，在不良事件后更长时间的时间点施用可有效防止对组织的损害。如上所述，在几个实施方案中，可预防性地施用piRNA和/或外泌体。

在几个实施方案中，外泌体特异性地靶向于受损或患病组织。在一些这样的实施方案中，将外泌体(例如，基因地或其他方式)修饰以将它们导向到特定的靶点。例如，在一些实施方案中，修饰可以包括诱导外泌体上特定的细胞表面标志物的表达，这导致与所需目标组织上的受体发生特异性相互作用。在一个实施方案中，将外泌体的天然内容物移除并用所需的外源蛋白质或核酸取代。在一个实施方案中，外泌体的天然内容物中补充有所需的外源蛋白质或核酸。然而，在一些实施方案中，不进行外泌体的靶向处理。在几个实施方案中，将外泌体修饰以使其表达特定的核酸或蛋白质，除其他用途外，可用于靶向、纯化、示踪等。然而，在几个实施方案中，没有对外泌体进行修饰。在一些实施方案中，外泌体不包括嵌合分子。

通常，如本文所述，本方法的治疗性外泌体衍生自治疗性细胞，和/或从治疗性细胞中分离出。在一些实施方案中，本公开的方法是无细胞方法。在一些实施方案中，没有大量的细胞与治疗性外泌体和/或piRNA一起施用于受试者。在一些实施方案中，基本上无细胞地施用治疗性外泌体和/或piRNA。在一些实施方案中，基本上所有所施用的治疗性外泌体和/或piRNA都不与细胞相关。在一些实施方案中，约5％或更少、约4％或更少、约3％或更少、约2％或更少、约1％或更少、约0.5％或更少、约0.2％或更少、约0.1％或更少、约0.05％或更少、约0.02％或更少、约0.01％或更少、约0.001％或更少、约0.0001％或更少、约0.00001％或更少，或由前述数值中的任何两个数值定义的范围内的百分比的所施用的治疗性外泌体和/或piRNA与细胞相关。在一些实施方案中，将包含治疗性外泌体和/或piRNA并施用于受试者的组合物基本上不含细胞。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA是使用任何合适的核酸合成产生的合成RNA。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA是化学合成的。在一些实施方案中，合成的外泌体衍生的piRNA包括天然和/或非天然的核苷酸。在一些实施方案中，合成的外泌体衍生的piRNA包括核苷酸类似物和衍生物。在一些实施方案中，外泌体衍生的piRNA是重组产生的。

如本文所述，可将各种piRNA，例如外泌体衍生的piRNA，用于本方法。在一些实施方案中，如本文所述，外泌体衍生的piRNA是成纤维细胞衍生的外泌体piRNA，例如，从来自工程化成纤维细胞或ASTEX的治疗性外泌体衍生的piRNA。在一些实施方案中，该方法包括通过施用成纤维细胞衍生的外泌体piRNA来治疗肺纤维化。在一些实施方案中，piRNA包括例如如图16所示的piR-20450、piR-20548、piR-16735、piR-01184、piR-20786、piR-00805、piR-04153、piR-18570、piR-16677和piR-17716中的一种或多种。

在一些实施方案中，piRNA，例如外泌体衍生的piRNA，是CDC衍生的外泌体piRNA，例如自如本文所述的永生化CDC(imCDC)的治疗性外泌体衍生的piRNA或富集于该治疗性外泌体的piRNA。在一些实施方案中，piRNA包括例如如图16所示的hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548中的一种或多种。在一些实施方案中，piRNA包括与例如如图16所示的hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548中的一种或多种具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或更多相同的序列。在一些实施方案中，piRNA包括与hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548中的一种或多种相差不超过1、2、3、4或5个核苷酸的序列。在一些实施方案中，piRNA是例如如图16所示的hsa_piR_016659。在一些实施方案中，piRNA包括与例如如图16中所示的hsa_piR_016659具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或更多相同的序列。在一些实施方案中，piRNA包括与例如如图16中所示的hsa_piR_016659相差不超过1、2、3、4或5个核苷酸的序列。

在一些实施方案中，该方法包括从治疗性外泌体中分离外泌体衍生的piRNA。在一些实施方案中，该方法包括从治疗性细胞群，例如工程化成纤维细胞或永生化CDC(imCDC)中分离治疗性外泌体。在一些实施方案中，该方法包括从非治疗性细胞，例如来自正常人真皮成纤维细胞的工程化成纤维细胞，或来自低效力imCDC的增强效力的imCDC中生成治疗性细胞群。可以使用任何合适的方案从非治疗性细胞产生治疗性细胞群。在一些实施方案中，通过激活非治疗性细胞，例如低治疗效力的imCDC中的Wnt/β连环蛋白信号传导来产生治疗性细胞群，从而产生增强治疗效力的imCDC。如本文所使用的，除非另有说明，否则“永生化CDC”和“imCDC”可以互换使用，指增强治疗效力的imCDC。在一些实施方案中，通过激活Wnt/β连环蛋白信号并过表达成纤维细胞(例如正常人真皮成纤维细胞)中的gata4，以由此产生工程化成纤维细胞来产生治疗性细胞群。如本文所用，“ASTEX”指衍生自工程化成纤维细胞的细胞外囊泡/外泌体。用于从非治疗性细胞生成治疗性细胞群的合适方案描述于例如国际申请号PCT/US20/31808和Ibrahim等人，Nat Biomed Eng.2019Sep；3(9):695-705，这些公开内容通过引用以其整体并入本文。

在几个实施方案中，可以例如通过使用例如CRISPR-Cas、锌指核酸酶和/或TALEN的基因编辑来操纵外泌体(例如工程化为高效力的外泌体)，以减少其潜在的免疫原性。有利的是，根据实施方案，外泌体可以衍生自从相对于该外泌体的最终接受者来说是同种异体、自体、异种或同基因来源获得的细胞。此外，可以生成并长期储存特征在于其表达一些piRNA、miRNA和/或蛋白质的外泌体主库，以便随后在“现成的”基础上用于定义的受试者。然而，在几个实施方案中，外泌体被分离，然后在没有长期或短期储存的情况下使用(例如，它们在生成后在可行的情况下被尽快使用)。

在一些实施方案中，将外泌体如本文所述进行收获，并经受用于释放和收集其核酸内容物(例如piRNA)的方法。在几个实施方案中，使用离液(chaotropic)破坏外泌体并随后分离核酸来分离核酸。除了离液破坏或替代离液破坏，也可以使用其他已建立的核酸分离方法。被分离的核酸可以包括但不限于DNA、DNA片段和DNA质粒、总RNA、mRNA、tRNA、snRNA、saRNA、miRNA、piRNA、rRNA、调控RNA、非编码和编码RNA等。在分离RNA的几个实施方案中，RNA可被用作基于RT-PCR(或其他扩增)方法的模板，以产生大拷贝数(以DNA形式)的目标RNA。在这种情况下，如果对特定的RNA或片段特别感兴趣，可以选择通过体外合成和所需序列的联合施用来补充RNA的外泌体分离和制备。

在几个实施方案中，将piRNA和/或外泌体与一种或多种另外的药剂联合施用。例如，在几个实施方案中，piRNA和/或外泌体与衍生自外泌体的一种或多种蛋白质或核酸联合施用(例如，以补充外泌体内容物)。在几个实施方案中，将分离出piRNA和/或外泌体的细胞与外泌体一起施用。

在几个实施方案中，piRNA和/或外泌体与更传统的疗法，例如手术疗法或药物疗法一起递送。在几个实施方案中，这些方法的组合导致目标组织的生存力和/或功能的协同改善。在一些实施方案中，外泌体可以与一种或多种基因治疗载体、核酸(例如用作siRNA或完成RNA干扰的核酸)和/或衍生自其他细胞类型的外泌体的组合一起递送。

因此，在一些实施方案中，piRNA和/或外泌体(单独或与诸如核酸的辅助剂组合)的递送提供用于促进组织的修复、功能的改善、生存力的增加或其组合的某些效应(例如旁分泌效应)。在一些实施方案中，所递送的外泌体的piRNA内容物负责至少部分靶标组织的修复或再生。在几个实施方案中，通过外泌体递送的miRNA全部或部分负责受损组织的修复和/或再生。如上所述，miRNA递送可以用于抑制一些信使RNA(例如，那些参与程序性细胞死亡的信使RNA)的翻译，或可以导致信使RNA的裂解。在任何一种情况下，以及在一些实施方案中，组合起来，这些效应会改变目标组织中的细胞信号传导通路，并且如本文所公开的数据所示，可以导致细胞生存力的提高、细胞复制的增加、有益的解剖学效应和/或细胞功能的改善，其中，每一种效应又有助于受损或患病组织整体的修复、再生和/或功能改善。

piRNA和/或外泌体(或其内容物)的有益效果不需要只作用于直接受损或受伤的细胞。例如，在一些实施方案中，受所公开方法影响的受损组织的细胞是健康细胞。然而，在几个实施方案中，受所公开方法影响的受损组织的细胞是受损细胞。

在几个实施方案中，再生包括改善组织的功能。例如，在心脏组织受损的一些实施方案中，功能改善可以包括增加心输出量、收缩性、心室功能和/或减少心律失常(以及其他功能改善)。对于其他组织，也可以实现功能的改善，比如响应于神经损伤治疗的认知增强，响应于肺部损伤治疗的血氧传输改善，响应于受损的免疫相关组织治疗的免疫功能改善。

在几个实施方案中，再生性piRNA和/或外泌体是哺乳动物来源的。在几个实施方案中，再生性piRNA和/或外泌体是人类来源的。在一些实施方案中，piRNA和/或外泌体衍生自非胚胎性的人再生细胞和/或外泌体。在几个实施方案中，再生性外泌体相对于个体是自体的，而在几个其他实施方案中，再生性外泌体相对于个体是同种异体的。在一些其他的实施方案中，使用异种或同基因来源的外泌体。

本文还提供调节组织修复的方法，包括用有效(或治疗有效)量的外泌体、外泌体衍生的miRNA和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)接触转分化的成纤维细胞群，从而抑制成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，其中，外泌体衍生自工程化成纤维细胞。在一些实施方案中，转分化是TGFβ介导的转分化，例如由TGFβ信号传导诱导的转分化。在一些实施方案中，TGFβ信号传导由组织损伤或损害激活。在一些实施方案中，成纤维细胞是肺成纤维细胞。

在一些实施方案中，接触包括将外泌体、外泌体衍生的miRNA和/或外泌体衍生的piRNA施用于受试者。在一些实施方案中，受试者具有肺纤维化，例如特发性肺纤维化。在一些实施方案中，接触包括将外泌体、外泌体衍生的miRNA和/或外泌体衍生的piRNA(例如通过气管内灌洗、吸入或雾化)气管内地施用于受试者。如本文所述，任何适当量的外泌体都可以与转分化成纤维细胞接触或施用于受试者。在一些实施方案中，有效(或治疗有效)量的外泌体包括约10⁶至约10¹²个颗粒。

治疗性细胞、其衍生的外泌体和PIWI-相互作用RNA

用于本方法的PIWI-相互作用RNA(piRNA)通常衍生自细胞外囊泡(EV)，例如衍生自治疗细胞的外泌体。可以衍生出piRNA的合适的EV或外泌体包括衍生自CDC(例如永生化CDC)的外泌体以及衍生自工程化成纤维细胞(例如ASTEX)的外泌体。

一些类型的核酸与膜结合颗粒相关。这种膜结合颗粒从大多数细胞类型中脱落，由质膜碎片组成，并含有DNA、RNA、mRNA、microRNA、piRNA和蛋白质。这些颗粒往往反映了脱落出它们的细胞的组成。外泌体是这种膜结合颗粒的一种类型，直径范围通常为约15nm至约95nm，包括约15nm至约20nm、20nm至约30nm、约30nm至约40nm、约40nm至约50nm、约50nm至约60nm、约60nm至约70nm、约70nm至约80nm、约80nm至约90nm、约90nm至约95nm，以及其重叠范围。在几个实施方案中，外泌体更大(范围为约140nm至约210nm的那些，包括约140nm至约150nm、150nm至约160nm、160nm至约170nm、170nm至约180nm、180nm至约190nm、190nm至约200nm、200nm至约210nm，及其重叠范围)。在一些实施方案中，从原始细胞体生成的外泌体在至少一个维度(例如直径)上比原始细胞体小100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、5000、10,000倍。

也经常用替代术语来指代外泌体。因此，本文使用的术语“外泌体”应被赋予其普通含义，并且也可以包括包含微囊泡、表皮细胞体、精囊体、外泌体样囊泡、微粒子、promininosomes、前列腺小体、dexosomes、texosomes、dex、tex、archeosomes和oncosomes的术语。除非本文另有说明，上述每个术语也应理解为包括每种类型的外泌体的工程化高效力变体。外泌体由广泛的哺乳动物细胞分泌，且在正常和病理条件下都会分泌。在一些实施方案中，外泌体凭借携带mRNA、miRNA、piRNA或其他内容物从第一个细胞到另一个细胞(或多个细胞)而发挥细胞内信使的功能。

在几个实施方案中，通过包括过滤、离心、基于抗原的捕获等中的一种或多种的方法从细胞制剂中分离出外泌体。例如，在几个实施方案中，收集并汇集在培养物中生长的细胞群。在几个实施方案中，使用单层细胞，在这种情况下，在汇集之前任选地地处理细胞，以提高细胞收率(例如，刮削培养皿和/或用诸如胰蛋白酶的酶处理以释放细胞)。在一些实施方案中，在血清饥饿状态下培养细胞约10天或更长时间，约12天或更长时间，或约15天或更长时间，并从条件培养基中收集外泌体。在一些实施方案中，将在标准细胞培养条件下培养的细胞在低氧条件下暴露在无血清培养基中过夜，并收集含有外泌体的条件培养基。在一些实施方案中，低氧条件包括约15％、约12％、约10％、约9％、约8％、约7％、约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％O₂或更少，或在前述数值中任何两个定义的范围内的百分比的O₂。在一些实施方案中，低氧条件包括在37℃下的2％O₂/5％CO₂。在一些实施方案中，将暴露于低氧条件下的细胞在37℃的标准氧下的完全血清中恢复约24、约36、约48、约60、约72小时或更长时间，或前述数值中任何两个定义的范围内的时间间隔，然后重新暴露于低氧条件下，生成条件培养基。标准氧包括约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％或更多的O₂，在前述数值中任何两个定义的范围内的百分比的O₂。在一些实施方案中，细胞在低氧和标准氧介质之间循环1、2、3、4、5、6或更多次。在一些实施方案中，使用在悬浮液中生长的细胞。然后将汇集的细胞群进行一轮或多轮离心(在一些实施方案中采用超速离心和/或密度离心)，以便将外泌体部分与细胞群中的细胞内容物和碎片的剩余物中分离。在一些实施方案中，不需要进行离心来收获外泌体。在一些实施方案中，将细胞的预处理用来提高外泌体的捕获效率。例如，在几个实施方案中，将增加细胞分泌外泌体的速度的药剂用于提高外泌体的总收率。在一些实施方案中，不进行外泌体分泌的增强。在一些实施方案中，将尺寸排阻过滤与离心结合使用或取代离心使用，以收集特定尺寸(例如直径)的外泌体。在一些实施方案中，使用分子量为1000KDa的截止过滤器进行离心超滤来纯化外泌体。在几个实施方案中，不需要使用过滤。在另外的实施方案中，通过选择性地识别外泌体上或其中，的独特标志物(例如，跨膜蛋白)来捕获外泌体(或外泌体的亚群)。在这样的实施方案中，独特标志物可用于选择性地富集特定的外泌体群。在一些实施方案中，不进行基于外泌体的特定标志物或特征的富集、选择或过滤。

此外，提供促进外泌体，尤其是工程化为高效力的外泌体的产生的方法。在几个这样的实施方案中，将水解酶用于促进外泌体从细胞中的释放(例如，分泌)。在一些实施方案中，使用能裂解酯键、糖类(例如DNA)、醚键、肽键、碳氮键、酸酐、碳-碳键、卤化物键、磷-氮键、硫-氮键、碳-磷键、硫-硫键和/或碳-硫键中的一种或多种的水解酶。在一些实施方案中，水解酶是DNA酶(例如，裂解糖类)。一些实施方案采用特异性的水解酶，诸如例如，溶酶体酸性鞘磷脂酶、分泌的锌依赖性酸性鞘磷脂酶、中性鞘磷脂酶和碱性鞘磷脂酶中的一种或多种。

在几个实施方案中，将外泌体施用于受试者以便启动细胞或组织的修复或再生。在几个实施方案中，外泌体衍生自干细胞。在几个实施方案中，干细胞为非胚胎干细胞。在一些实施方案中，非胚胎干细胞是成人干细胞。然而，在一些实施方案中，任选地将胚胎干细胞用作外泌体的来源。在一些实施方案中，将体细胞(非限制性实例为成纤维细胞)用作外泌体的来源。在另外的实施方案中，将生殖细胞用作外泌体的来源。

在一些实施方案中，如本文所述，生成具有高治疗效力的细胞。在一些实施方案中，细胞被工程化成产生高治疗效力的外泌体。任何细胞类型都可用于产生具有高治疗效力的细胞和/或产生高治疗效力的外泌体。例如，可以使用心球衍生细胞(CDC)或成纤维细胞。

在采用干细胞作为外泌体来源的几个实施方案中，来自干细胞的外泌体的核酸和/或蛋白质内容物特别适合于引起受损或患病细胞的修复或再生。在几个实施方案中，外泌体从衍生自待治疗组织的干细胞中分离。例如，在一些要修复心脏组织的实施方案中，外泌体衍生自心脏干细胞。在几个实施方案中，心脏干细胞获自心脏的各个区域，包括但不限于心房、隔膜、心室、auricola及其组合(例如，在一些实施方案中，可使用部分或整个心脏来获得心脏干细胞)。在几个实施方案中，外泌体衍生自于包括心脏干细胞的细胞(或细胞群)，或可在培养中操作以产生心脏干细胞(例如，心球和/或心球衍生细胞(CDC))。有关心球分离的进一步信息可在2012年9月18日发布的美国专利No.8,268,619中找到，该专利通过引用整体并入本文。在几个实施方案中，心脏干细胞是心球衍生细胞(CDC)。有关分离CDC的方法的进一步信息可在2008年4月21日提交的美国专利申请No.11/666,685和2012年3月5日提交的No.13/412,051中找到，这两份申请都通过引用整体并入本文。根据实施方案，也可以使用其他各种干细胞，包括但不限于骨髓干细胞、脂肪组织衍生的干细胞、间充质干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞和神经元干细胞。

在几个实施方案中，外泌体例如通过抑制翻译和/或裂解mRNA来诱导基因表达的改变。在一些实施方案中，基因表达的改变导致抑制不需要的蛋白质或其他分子，比如参与细胞死亡通路，或诱发对周围细胞的进一步损害(例如自由基)的那些。在几个实施方案中，基因表达的改变直接或间接地导致所需蛋白质或分子(例如，那些具有有益作用的蛋白质或分子)的产生。蛋白质或分子本身无需是理想的(例如，在组织受损的情况下，蛋白质或分子可能有整体的有益效果，但在其他情况下不会产生有益效果)。在一些实施方案中，基因表达的改变导致不希望的蛋白质、分子或通路的抑制(例如，有害的通路的抑制)。在几个实施方案中，基因表达的改变减少一种或多种炎性药剂的表达和/或对这种药剂的敏感性。有利地，在几个实施方案中，外泌体、miRNA或piRNA的施用导致一些炎性分子和/或参与炎性通路的分子的下调。因此，在几个实施方案中，与外泌体、miRNA或piRNA接触的细胞享有增强的生存力，即使在损伤后的炎症或因疾病引起的炎症的情况下也是如此。

在几个实施方案中，外泌体与受损组织的一个或多个接受细胞融合。在几个实施方案中，外泌体将microRNA和/或piRNA释放到受损组织的一个或多个接受细胞中，从而改变受损组织的一个或多个细胞中的至少一个通路。在一些实施方案中，外泌体通过改变受损组织细胞周围的环境来对受损组织的细胞施加影响。在一些实施方案中，由外泌体的内容物或特征产生的信号或作为外泌体的内容物或特征的结果的信号，导致一些细胞通路的增加或减少。例如，外泌体(或其内容物/特征)可以通过改变蛋白质和/或脂质水平来改变细胞环境，这反过来可以导致细胞在该环境中的行为改变。此外，在几个实施方案中，外泌体的miRNA和/或piRNA可以改变接受细胞中的基因表达，这改变该基因参与的通路，然后进一步改变细胞环境。在几个实施方案中，外泌体的影响直接或间接地刺激血管生成。在几个实施方案中，外泌体的影响直接或间接地影响细胞的复制。在几个实施方案中，外泌体的影响直接或间接地抑制细胞凋亡。同样，在几个实施方案中，衍生自外泌体的piRNA诱导这些和/或其他效果。

治疗组合物

在几个实施方案中，提供了组合物，例如治疗组合物，包括一种或多种piRNA(例如外泌体衍生的piRNA)，和药学上可接受的赋形剂。发现本组合物在需要组织修复和/或再生的病症的治疗，例如缺血性损伤和/或组织纤维化的治疗中的用途。在一些实施方案中，这些组合物是无细胞和/或无外泌体的组合物。在一些实施方案中，无外泌体组合物为实质上或基本上不含外泌体或细胞外囊泡。在一些实施方案中，无外泌体组合物不包括任何外泌体或细胞外囊泡，或包括这样量的外泌体或细胞外囊泡，该种量不足以提供可检测的功能效果(例如，当将该组合物施用于本文提供的受试者时)。在一些实施方案中，无细胞组合物实质上或基本上不含细胞。在一些实施方案中，无细胞组合物不包括任何细胞，或包括这样量的细胞，该种量不足以提供可检测的功能效果(例如，当将该组合物施用于本文提供的受试者时)。在几个实施方案中，该组合物包括一种或多种外泌体衍生的RNA(例如piRNA和/或miRNA)和药学上可接受的赋形剂，由或基本上由所述一种或多种外泌体衍生的RNA(例如piRNA和/或miRNA)和药学上可接受的赋形剂组成。在一些实施方案中，该组合物包括核酸、蛋白质或其组合。在一些实施方案中，RNA包括信使RNA、snRNA、saRNA、miRNA、piRNA中的一种或多种和其组合。在一些实施方案中，外泌体衍生的RNA包括成纤维细胞衍生的外泌体piRNA，例如，来自工程化成纤维细胞的外泌体衍生的piRNA。在一些实施方案中，外泌体衍生的RNA包括CDC衍生的外泌体piRNA，例如来自永生化CDC的外泌体衍生的piRNA。在几个实施方案中，piRNA包括例如如图16所示的hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548中的一种或多种。在一些实施方案中，piRNA是hsa_piR_016659。在几个实施方案中，piRNA包括piR-20450、piR-20548、piR-16735、piR-01184、piR-20786、piR-00805、piR-04153、piR-18570、piR-16677和piR-17716中的一种或多种。在几个实施方案中，该组合物包括合成piRNA和药学上可接受的载体，由或基本上由所述合成piRNA和药学上可接受的载体组成。在一些这样的实施方案中，合成piRNA包括例如如图16所示的hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548的一种或多种。在一些这样的实施方案中，合成piRNA是hsa_piR_016659。在几个实施方案中，该组合物包括合成piRNA和药学上可接受的载体，由或基本上由所述合成piRNA和药学上可接受的载体组成。在几个实施方案中，miRNA包括例如如下表1所示的miR-183-5p、miR-182-5p、miR-19a-3p、miR-92a-3p、miR-17-5p、miR-126-3p和miR-510-3p中的一种或多种。在几个实施方案中，miRNA包括miR-92a、miR-182、miR-183、miR-19a、miR-26a、miR27-a、let-7e、mir-19b、miR-125b、mir-27b、let-7a、let-7c、miR-140-3p、miR-125a-5p、miR-150、miR-155、mir-210、let-7b、miR-24、miR-423-5p、miR-22、let-7f、miR-146a中的一种或多种及其组合。

表1

miRNA	序列	SEQ ID NO:
			miR-183-5p	UAUGGCACUGGUAGAAUUCACU	19
miR-182-5p	UUUGGCAAUGGUAGAACUCACACU	20
			miR-19a-3p	UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA	21
miR-92a-3p	UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU	22
			miR-17-5p	CAAAGUGCUUACAGUGCAGGUAG	23
miR-126-3p	UCGUACCGUGAGUAAUAAUGCG	24
			miR-510-3p	AUUGAAACCUCUAAGAGUGGA	25

在几个实施方案中，该组合物包括衍生自各种细胞类型的多种piRNA(例如，从衍生自第一类和第二类“母细胞”的外泌体群中分离的piRNA)。如上所述，在几个实施方案中，本文公开的组合物可以单独使用，或与一种或多种辅助治疗方式(例如药物、细胞疗法、基因疗法、蛋白质疗法、手术等)一起使用。

可以对本公开的RNA(例如piRNA、miRNA)在沿核酸的一个或多个位置进行化学修饰。在一些实施方案中，piRNA在一个或多个位置被化学修饰。在一些实施方案中，miRNA在一个或多个位置被化学修饰。在一些实施方案中，RNA包括一个或多个经化学修饰的核苷酸。一个核苷酸可以有任何合适的化学修饰。在一些实施方案中，RNA(例如piRNA、miRNA)的化学修饰增加了RNA的体外和/或体内的稳定性。在一些实施方案中，RNA(例如piRNA、miRNA)的化学修饰增加了RNA的体内活性。

在一些实施方案中，RNA，例如piRNA或miRNA，含有约1％至约100％的修饰核苷酸(无论是相对于整体核苷酸含量，还是相对于一种或多种类型的核苷酸，即A、G、U或C中的任何一种或多种)或任何中间的百分比(例如，1％至20％，1％至25％，1％至50％，1％至60％，1％至70％，1％至80％，1％至90％，1％至95％，10％至20％，10％至25％，10％至50％，10％至60％，10％至70％，10％至80％，10％至90％，10％至95％，10％至100％，20％至25％，20％至50％，20％至60％，20％至70％，20％至80％，20％至90％，20％至95％，20％至100％，50％至60％，50％至70％，50％至80％，50％至90％，50％至95％，50％至100％，70％至80％，70％至90％，70％至95％，70％至100％，80％至90％，80％至95％，80％至100％，90％至95％，90％至100％和95％至100％)。可以理解的是，任何剩余的百分比都是由存在的未修饰的A、G、U或C所占。

在一些实施方案中，RNA，例如piRNA或miRNA，含有最少1％和最多100％的修饰核苷酸，或任何中间百分比的修饰核苷酸，比如至少5％的修饰核苷酸，至少10％的修饰核苷酸，至少25％的修饰核苷酸，至少50％的修饰核苷酸，至少80％的修饰核苷酸，或至少90％的修饰核苷酸。例如，RNA可以包含一个修饰的嘧啶，比如修饰的尿嘧啶或胞嘧啶。在一些实施方案中，多核苷酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的尿嘧啶被修饰的尿嘧啶(例如，5-取代的尿嘧啶)所取代。在一些实施方案中，核酸中至少5％、至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％或100％的胞嘧啶被修饰的胞嘧啶(例如5-取代的胞嘧啶)所取代。

药学上可接受的赋形剂包括但不限于盐水、水性缓冲溶液、溶剂和/或分散介质。可以作为药学上可接受的赋形剂的材料的一些非限制性实例包括：(1)糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；(4)粉末状的黄芪胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，诸如硬脂酸镁、月桂基硫酸钠和滑石粉；(8)可可脂和栓剂蜡；(9)油类，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇，诸如丙二醇；(11)多元醇，诸如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇(PEG)；(12)酯类，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)pH缓冲溶液；(21)聚酯、聚碳酸酯和/或聚酸酐；(22)膨松剂，诸如多肽和氨基酸；(23)血清成分，诸如血清白蛋白、HDL和LDL；(22)C2-C12醇，如乙醇；以及(23)药物制剂中使用的其他无毒兼容物质。在一些实施方案中，赋形剂抑制活性药剂(例如piRNA)的降解。

在一些实施方案中，该组合物为肠胃外剂型。在一些实施方案中，肠胃外剂型是无菌的或在施用于患者前能够被灭菌的。肠胃外剂型的实例包括但不限于用于注射的溶液、可溶解或悬浮在药学上可接受的注射载体中的干品、可用于注射的悬浮液和乳剂。此外，还可以制备控释肠胃外剂型，以施用于受试者。可用于提供外泌体衍生的piRNA的肠胃外剂型的合适赋形剂包括但不限于：无菌水；USP注射用水；生理盐水；葡萄糖溶液；水性载体，诸如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、葡萄糖注射液、葡萄糖和氯化钠注射液，以及乳酸林格氏注射液；水可混溶性载体，诸如但不限于乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及非水性载体，诸如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。

在几个实施方案中，将外泌体配制成适合施用于受试者，例如，气管内地施用于受试者的剂型。在一些实施方案中，如本文所述，将外泌体与药学上可接受的赋形剂一起配制。在一些实施方案中，使用任何合适的方案将外泌体配制用于吸入或雾化。在一些实施方案中，将外泌体气溶胶化。

有利地，在几个实施方案中，外泌体包括合成的膜结合颗粒(例如，外泌体替代物)，根据实施方案，其被配置为特定的直径范围。在这样的实施方案中，外泌体替代物的直径是为特定的应用(例如，靶点或施用途径)而定制的。在另外的实施方案中，外泌体替代物被标记或修饰以增强施用后向特定部位或区域的转运。

在几个实施方案中，通过对再生细胞进行离心获得外泌体。在几个实施方案中，使用超速离心法。然而，在几个实施方案中，不使用超速离心法。在几个实施方案中，经由再生细胞的尺寸排阻过滤获得外泌体。如上所述，在一些实施方案中，生成可通过与上述类似的机制分离的合成外泌体。

如本文所述，本文还提供用于治疗需要组织修复和/或再生的病症(例如，心肌缺血性损伤、肺纤维化)的试剂盒，其中，该试剂盒包括一种或多种外泌体衍生的piRNA种类，或本公开的组合物。如本文所述，在一些实施方案中，该试剂盒包括药学上可接受的赋形剂。该试剂盒可以包括一个或多个用于容纳试剂盒的一个或多个成分的容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶子)。该试剂盒可以进一步包括使用该试剂盒治疗需要组织修复和/或再生的病症(例如，心肌缺血性损伤、肺纤维化)的说明。该信息和说明可以是文字、图片或两者结合的形式等。

前述实施方案中的任一个的特定元素可以与其他实施方案中的元素组合或被其他实施方案中的元素替换。此外，虽然与本公开的一些实施方案相关的优点已经在这些实施方案的上下文进行了描述，但其他实施方案也可以表现出这样的优点，并且并非所有实施方案都需要必须表现出这样的优点才落入本公开的范围。

本文描述的技术由以下实施例进一步说明，这些实施例绝不应被解释为进一步限制。

实施例

实施例1

该非限制性实施例阐释了来自永生化CDC(imCDC)和imCDC衍生的细胞外囊泡(EV)/外泌体的PIWI相互作用的RNA(piRNA)的检测和分离。

使用以前使用的低氧循环方法从CDC收获细胞外囊泡(EV)，如图1A中所描述。简言之，使细胞在37℃下20％O₂/5％CO₂条件下生长至汇合，然后在37℃下2％O₂/5％CO₂条件下，将细胞无血清培养约24小时。收集条件培养基并通过0.45μm的过滤器过滤，以去除凋亡体和细胞碎片，并在-80℃冷冻备用。细胞在2％O₂/5％CO₂条件下循环三次，在20％O₂/5％CO₂中恢复，两次暴露于低氧条件之间全血清培养48小时。使用具有1000KDa分子量截止过滤器的离心超滤纯化EV。分析各级分的颗粒大小、数量、浓度和piRNA含量。

使用小型RNA序列分析来分析初代CDC(pCDC)、imCDC、pCDC-EV和imCDC-EV的piRNA含量。图1B显示，与衍生出它们的细胞相比，EV富含piRNA。此外，与非永生化CDC及其衍生的EV相比，永生化的CDC及自其中，分离的EV富含piRNA。因此，与初代CDC相比，imCDC显示出不同的piRNA组成。ImEV-Pi(hsa_piR_016659)被确定为最高表达的非编码RNA之一(与CDC-EV相比，在imCDC-EV中的读数高出35倍)(图1B)。如图1C所示，piRNA的数量与EV的数量相关。

这些结果表明imCDC与初代CDC相比富含piRNA。在一些实施方案中，EV富含piRNA。在一些实施方案中，与pCDC-EV相比，imCDC-EV富含piRNA。

实施例2

该非限制性实施例阐释了衍生自imCDC-EV的piRNA在心肌缺血/再灌注(I/R)损伤中的体内心脏保护作用。

为了研究衍生自imCDC-EV的piRNA的作用，使用了心肌缺血/再灌注的大鼠模型。图2A示出了实验方案的示意图。在第0天，通过手术诱导8至10周龄的Wistar-Kyoto雌性大鼠的心肌梗塞，持续45分钟，之后进行再灌注。再灌注20分钟后，用阻断(cross-clamping)注射法心心肌内地施用载体、imCDC-EV(10¹⁰个颗粒)、imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659；400ng)或乱序(scramble)RNA。缺血/再灌注24小时后，收集尾静脉血进行血细胞计数和心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平的测量。48小时后，将动物处死(sacrifice)进行血细胞计数、cTnI测量和氯化三苯基四氮唑(TTC)染色以测量疤痕大小。

根据TTC染色，与载体相比，施用imCDC-EV的动物显示疤痕大小(梗塞面积)减少(图2B)。与载体相比，imCDC-EV piRNA的施用也显示出梗塞尺寸减少。与用imCDC-EV piRNA处理的动物相比，imCDC-EV处理的动物的梗塞面积更小。相比之下，与载体处理的动物相比，施用乱序RNA的动物的梗塞面积没有变化，而与施用乱序RNA的动物相比，施用imCDC-EVpiRNA的动物的梗塞面积有减小的趋势。

外周血中的心肌肌钙蛋白I(cTnI)用于测量心肌缺血/再灌注后imCDC-EV piRNA的治疗效果。在24小时时，所有处理组的cTnI水平都很低(图3A)。在48小时时，用载体处理的动物以及用乱序RNA处理的动物的cTnI水平上升(图3B)。与载体处理的动物相比，施用imCDC-EV piRNA的动物显示出较低的cTnI水平。imCDC-EV piRNA处理的动物的cTnI水平与施用imCDC-EV的动物的水平相似。与乱序RNA处理的动物相比，imCDC-EV piRNA处理的动物的cTnI水平呈现较低的趋势。

这些结果表明imCDC-EV piRNA再现了心肌缺血/再灌注损伤后imCDC-EV的治疗效果。在一些实施方案中，施用imCDC-EV piRNA(例如，hsa_piR_016659)有效减少心脏损伤后的心肌梗塞面积。在一些实施方案中，施用imCDC-EV piRNA(例如，hsa_piR_016659)可降低心脏损伤后的血液cTnI水平。

实施例3

该非限制性实施例阐释了imCDC-EV和imCDC-EV piRNA改变心肌缺血/再灌注损伤后外周单核细胞群动力学。

研究了在心肌缺血/再灌注损伤后施用imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)对动物外周血中单核细胞比例变化的影响。在心肌缺血/再灌注24小时后，与假手术动物相比，载体处理和乱序RNA处理的动物显示单核细胞增加(图5A)。相比之下，与载体处理和乱序RNA处理的动物相比，用imCDC-EV处理的动物的单核细胞的百分比较低。与载体处理和乱序RNA处理的动物相比，imCDC-EV piRNA处理的动物表现出类似的单核细胞百分比较低的趋势。

在接下来的24小时内，外周血中单核细胞的百分比发生变化。在用载体或乱序RNA处理的动物中，从心肌缺血/再灌注后24小时到48小时单核细胞的百分比下降(图4A、4B)。相比之下，在imCDC-EV处理和imCDC-EV piRNA处理的动物中，单核细胞的百分比增加。

在心肌缺血/再灌注后48小时，imCDC-EV piRNA处理的动物的单核细胞百分比高于载体处理和乱序RNA处理的动物(图5B)。与载体处理和乱序RNA处理的动物相比，ImCDC-EV处理的动物显示出更高的单核细胞百分比的趋势。相比之下，imCDC-EV piRNA对血液中的中性粒细胞计数情况的影响很小。

这些结果表明imCDC-EV和imCDC-EV piRNA的施用可以改变心肌缺血/再灌注损伤后外周血中单核细胞的动力学。单核细胞可以是imCDC-EV和imCDC-EV piRNA的一个靶标。在一些实施方案中，imCDC-EV和imCDC-EV piRNA(例如hsa_piR_016659)改变外周血中的单核细胞组成。在一些实施方案中，心肌缺血/再灌注损伤后24小时，imCDC-EV piRNA(例如hsa_piR_016659)的施用抑制外周血中单核细胞的增加。在一些实施方案中，在心肌缺血/再灌注损伤后24至48小时期间，imCDC-EV piRNA(例如hsa_piR_016659)的施用延迟外周血中单核细胞的增加。

实施例4

这个非限制性的实施例表明，在imCDC-EV和imCDC-EV piRNA存在下培养的初代巨噬细胞的体外生存、增殖和迁移增加。

在体外研究了imCDC-EV和imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)对单核细胞的影响。将衍生自骨髓巨噬细胞(BMDM)的幼稚(M0)巨噬细胞在imCDC-EV、imCDC-EV piRNA或乱序RNA的存在下培养24小时，并测试细胞生存力和增殖。图6A显示了24小时培养后BMDM-衍生的M0巨噬细胞的图像。与载体对照组相比，ImCDC-EV处理的细胞在培养8和24小时后显示出超过2倍的细胞生存力增加(图6B)，并在24小时后表现出超过3倍的增殖增加(图6C)。在24小时时，与载体对照组相比，用imCDC-EV piRNA培养的细胞也显示出增强的生存力和增殖。相比之下，用乱序RNA培养的细胞显示出与载体对照组相当的细胞增殖。在24小时时，与载体相比，乱序RNA处理的细胞确实显示出增强的生存力，但其水平低于imCDC-EV或imCDC-EVpiRNA处理的细胞。

对用imCDC-EV、imCDC-EV piRNA或乱序RNA处理的巨噬细胞的迁移进行体外测试。图7A显示了在聚碳酸酯嵌件中用结晶紫染色的BMDM衍生的M0巨噬细胞的图像。用imCDC-EV或imCDC-EV piRNA生长的巨噬细胞与载体和乱序RNA处理的细胞相比显示出更高的迁移(图7B)。

这些结果表明imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA可以直接作用于单核细胞以促进细胞的存活、增殖和迁移。

实施例5

该非限制性实施例显示了巨噬细胞转录组诱导的imCDC-EV piRNA的变化。

如实施例4，在体外，将骨髓衍生的巨噬细胞(BMDM)暴露于imCDC-EV、imCDC-EVpiRNA(hsa_piR_016659)和对照。然后评估转录组水平和激活的通路。与对照组相比，ImCDC-EV piRNA条件化(conditioned)的BMDM表现出不同的转录组水平，伴随参与炎症反应、细胞死亡和细胞间信号传导的通路上调。

这些结果表明巨噬细胞可能是imCDC-EV和imCDC-EV piRNA的靶标。在一些实施方案中，imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA(例如，hsa_piR_016659)改变巨噬细胞的mRNA表达谱。

实施例6

该非限制性实施例阐释了ASTEX(来自活化-特化组织效应细胞(ASTEC)的细胞外囊泡/外泌体)中抗纤维化介质的识别。

从ASTEC产生的细胞外囊泡(EV)中分离出RNA，ASTEC使用15天的血清饥饿法进行培养。分离的RNA的测序发现与来自未修饰的正常人真皮成纤维细胞的EV相比，miRNA和piRNA种类(包括那些牵涉到抗纤维化的介质)的表达被富集(图8A、8D)。特别地，miRNA的miR-183家族和miR-17-92家族被富集，已知它们靶向和抑制特发性肺纤维化(IPF)的病理驱动因素。qPCR证实了miR-182、miR-183和miR-92a的富集(图8C)。与此相比，与来自未修饰的正常人真皮成纤维细胞的EV相比，ASTEX的一组miRNA和piRNA被耗尽(图8B)。

这些结果表明ASTEX可以富集抗纤维化介质，包括靶向IPF病理驱动因素的miRNA种类。在一些实施方案中，ASTEX富集miR-182、miR-183和miR-92a。在一些实施方案中，ASTEX富集piR-20450。

实施例7

该非限制性实施例阐释了ASTEX对特发性肺纤维化的治疗效果。

将特发性肺纤维化的小鼠模型用于测试ASTEX的治疗效果。首先，进行了ASTEX的剂量耐受性研究，如图9A示意性地示出。在研究开始时，50μL的生理盐水(HBSS)与100μL的空气一起鞘内施用。7天后，以10⁷、10⁸和10⁹个颗粒的剂量鞘内施用ASTEX。在施用ASTEX21天后，测量身体质量、肺部质量和肺部羟脯氨酸水平(HyP)，并对肺泡组织进行组织学染色。以各剂量施用ASTEX的动物均保持了体重，并且相对于载体对照没有出现肺部水肿(图9B)，这表明ASTEX的耐受性良好。所有剂量下的肺羟脯氨酸水平均与载体对照相当(图10A)，这表明施用ASTEX的动物没有出现纤维化。肺泡组织的组织学特征也显示在施用10⁹ASTEX的动物中没有纤维化。施用ASTEX的动物的肺泡组织的Ashcroft评分与载体对照相当(图10B)。H&E染色显示在施用ASTEX的动物的肺泡组织中没有浸润的白细胞(图10C)，根据Masson的毛细血管染色也没有纤维化的证据(图10D)。

在确认ASTEX能被健康动物很好地耐受后，将EV施用于由博来霉素诱导的肺纤维化的动物(图11A)。在对动物施用博来霉素5天后，将1x10⁸个颗粒的ASTEX(1000kDa)在鞘内施用(图11A)。

与经载体处理动物相比，施用了ASTEX的博来霉素处理动物显示改善的生存率(图11B)。此外，与载体处理的动物相比，ASTEX的施用降低了肺羟脯氨酸水平(图11C)。

这些结果表明ASTEX对治疗特发性肺纤维化(IPF)有治疗作用。在一些实施方案中，ASTEX减少或延缓IPF的死亡率。在一些实施方案中，ASTEX减少或延缓IPF的肺纤维化。

实施例8

该非限制性实施例阐释了ASTEX对体外肺纤维细胞转分化的作用。

为了了解ASTEX对IPF的治疗作用的机制，在体外研究了ASTEX对初代人肺成纤维细胞的作用。将细胞用TGFβ处理，以模拟促进肺成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞的损伤(图12A)。将细胞同时用ASTEX或载体溶液处理。与载体处理的细胞相比，ASTEX处理减弱了TGFβ诱导的α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的上调(图12B-12D)。

这些结果表明ASTEX可以减少损伤诱导的肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转分化。在一些实施方案中，ASTEX减弱了肺成纤维细胞中由TGFβ诱导的α-SMA的上调。

实施例9

该非限制性实施例阐释了通过施用ASTEX的piRNA治疗特发性肺纤维化的方法。

从ASTEX中分离piRNA。将动物气管内暴露于博莱霉素以诱导肺纤维化。在博来霉素暴露5天后，将ASTEX衍生的piRNA气管内施用于动物。观察动物的存活情况，并在施用piRNA后21天内测量体重。测量肺组织中的羟脯氨酸水平以估计肺纤维化的程度。

实施例10

该非限制性实施例阐释了imCDC-EV piRNA在细胞质和细胞核之间的往返。

BMDM衍生的M0巨噬细胞在imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)或载体对照的存在下生长，并在不同的时间点以相对于对照水平的倍数变化测量piRNA的亚细胞定位(见实施例4)。从培养开始后5分钟开始，piRNA最初在细胞质中比在细胞核中更丰富，并且在45分钟时主要在细胞质内(图17A)。在18小时时，piRNA出现在细胞质和核区，到24小时时，piRNA主要在细胞核中，而在细胞质中的含量很少(图17A)。到48小时时，在细胞质和细胞核中都没有发现任何显著水平的piRNA(图17A)。相比之下，在5'、18小时和24小时时，乱序RNA存在于细胞质和细胞核中，到48小时时，两个区室中的乱序RNA大部分被消除(图17B)。该结果表明，imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)优先在细胞核中积累，在那里它可以调节基因表达。

实施例11

该非限制性实施例阐释了用imCDC-EV piRNA处理的初代巨噬细胞中整体甲基化的增加。

使BMDM衍生的M0巨噬细胞在imCDC-EV、imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)、乱序RNA或载体对照的存在下生长，并在24和48小时测量整体甲基化水平(见实施例4)。在24小时时，与载体对照或乱序RNA相比，用imCDC-EV和imCDC-EV piRNA处理的细胞显示整体甲基化增加(图18A)。在48小时时，用imCDC-EV处理的细胞的甲基化水平与载体对照相当(图18B)。相比之下，与载体对照或乱序RNA相比，用imCDC-EV piRNA处理的初代巨噬细胞保持升高水平的整体甲基化(图18B)。

该结果表明，imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)可以增加DNA甲基化，这可能有助于基因表达的调节。

在一些实施方案中，使初代巨噬细胞与imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA(例如，hsa_piR_016659)接触会增加初代巨噬细胞中的整体甲基化。在一些实施方案中，通过使初代巨噬细胞与imCDC-EV piRNA(例如hsa_piR_016659)接触诱导的整体甲基化水平的变化比由imCDC-EV诱导的整体甲基化变化更持久。

实施例11

该非限制性实施例显示了汇总imCDC-EV piRNA(例如hsa_piR_016659)对初代巨噬细胞作用的示意图，如实施例1至5、10和11中所示。

实施例1至5、10和11中公开的数据支持imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)通过其对BMDM衍生的M0巨噬细胞的作用在心肌缺血/再灌注(I/R)损伤中的心脏保护模型(图19，上部小图)。用imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)培养的BMDM表现出转录谱的改变，表明参与炎症反应、细胞死亡和细胞间信号传导的通路的上调(实施例5；图19，左下小图)。imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)被优先运送到细胞核，并增加了整体DNA甲基化(实施例10；图19，右下小图)。当施用于心肌缺血/再灌注损伤模型的动物时，imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)减少了梗塞面积和外周的cTnI水平(实施例2；图19，中下小图)。心肌缺血/再灌注损伤后的外周单核细胞群动力学也被imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA的施用所改变(实施例3；图19，中下小图)。在体外，imCDC-EV和/或imCDC-EV piRNA(hsa_piR_016659)增加了初代巨噬细胞的存活、增殖和迁移(实施例4；图19，中下小图)。

尽管为了清楚和理解的目的，上文已经通过说明和实施例的方式进行了一些详细描述，但本领域的技术人员将理解，在不背离本公开内容的精神的情况下可以进行修改。因此，应该理解的是，本文公开的形式只是说明性的，并不是为了限制本公开的范围，而是还涵盖了与本公开的实施方案的真正范围和精神一致的所有的修改和替代。

考虑可以对上述公开的实施方案的具体特征和方面进行各种组合或子组合。此外，本文公开的与一个实施方案相关的任何特定特征、方面、方法、性质、特性、质量、属性、元素等可用于本文阐述的所有其他实施方案。相应地，应该理解的是，所公开的实施方案的各种特征和方面可以相互结合或替换，以形成所公开主题的不同模式。因此，目的是本公开的范围不应受到上述特定公开实施方案的限制。此外，在附图中举例显示并在本文中详细描述了本公开主题的具体实施例，但是本公开主题是很容易采取各种修改和替换形式的。然而，应该理解的是，本公开的内容并不局限于所公开的特定形式或方法，而是涵盖属于所描述的各种实施方案和所附权利要求的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。本文公开的任何方法都不需要按照所述的顺序执行。本文公开的方法包括从业者采取的某些行动；然而，它们也可以包括任何第三方对这些行动的指示，无论是明确的还是暗示的。例如，诸如“施用有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)”的行动包括“指示有效(或治疗有效)量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)的施用”。此外，在以马库什组的方式描述本公开内容的特征或方面时，本领域的技术人员将认识到，本公开内容也因此以马库什组的任何单个成员或亚组成员的方式描述。

本文公开的范围还包括任何和所有重叠、子范围及其组合。诸如“至多”、“至少”、“大于”、“小于”、“之间”等语言包括所叙述的数字。诸如“约”或“大约”的术语前面的数字包括所叙述的数字。例如，“约90％”包括“90％”。在一些实施方案中，至少95％的同源性包括与参考序列有96％、97％、98％、99％和100％的同源性。此外，当一个序列被公开为“包括”一个核苷酸或氨基酸序列时，除非另有说明，这种提及也应包括“包含”所述的序列、“由”或“基本上由”所述的序列组成的序列。

本申请中使用的术语和短语及其变形，特别是所附权利要求中的术语和短语及其变形，除非另有明确说明，应被理解为开放性的，而不是限制性的。作为前述的例子，术语“包括”应理解为意指“包括，但无限制”、“包括但不限于”等。

不定冠词“一个”或“一种”并不排除多个。本文所用的用于例如限定分子量的值和范围的术语“约”是指所指示的值和/或范围限制可以在±20％内，例如在±10％内，包括在±5％内变化。在一个数字前使用“约”包括该数字本身。例如，“约5”提供对“5”的明确支持。以范围提供的数字包括重叠的范围和中间的整数；例如，1-4至5-7的范围包括例如1-7、1-6、1-5、2-5、2-7、4-7、1、2、3、4、5、6和7。

序列表

<110> 西达-赛奈医疗中心

<120> 外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA及使用其的方法

<130> FP224753US

<150> US 63/027191

<151> 2020-05-19

<160> 25

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 26

<212> RNA

<213> 智人

<400> 1

ccccccacug cuaaauuuga cugguu 26

<210> 2

<211> 27

<212> RNA

<213> 智人

<400> 2

ccccccacug cuaaauuuga cuggcua 27

<210> 3

<211> 27

<212> RNA

<213> 智人

<400> 3

aggggcccgu gccuuggaaa gcgucgc 27

<210> 4

<211> 29

<212> RNA

<213> 智人

<400> 4

ugagaacuag cuaaacaggg ucgggcaga 29

<210> 5

<211> 29

<212> RNA

<213> 智人

<400> 5

ugaucaguag ugggaucgcg ccugugaau 29

<210> 6

<211> 31

<212> RNA

<213> 智人

<400> 6

uugcugugau gacuaucuua ggacaccuuu g 31

<210> 7

<211> 27

<212> RNA

<213> 智人

<400> 7

ugggaaugca gcccaaagcg gguggua 27

<210> 8

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<212> RNA

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<400> 8

gagaggggcc cgugccuugg aaagcgucgc g 31

<210> 9

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<212> RNA

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<400> 9

ggucagucgg uccugagaga ugggcgagc 29

<210> 10

<211> 30

<212> RNA

<213> 智人

<400> 10

gggagaugaa gaggacagug acugagagac 30

<210> 11

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<212> RNA

<213> 智人

<400> 11

ccgccuggga auaccgggug cuguaggcuu a 31

<210> 12

<211> 29

<212> RNA

<213> 智人

<400> 12

aucagacccc agaaaaggug uugguugau 29

<210> 13

<211> 27

<212> RNA

<213> 智人

<400> 13

gugguggcgg cggcggcgga ggcggac 27

<210> 14

<211> 32

<212> RNA

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<400> 14

agccugagca acauagcgag accccgucuc ua 32

<210> 15

<211> 32

<212> RNA

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<400> 15

ucccuggugg ucuagugguu aggauucggc ac 32

<210> 16

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<212> RNA

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<400> 16

uuggugguuc agugguagaa uucucgccug cc 32

<210> 17

<211> 30

<212> RNA

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<400> 17

ccccuggugg ucuagugguu aggauucggc 30

<210> 18

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<212> RNA

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uucccuggug gucuaguggu uaggauucgg c 31

<210> 19

<211> 22

<212> RNA

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uauggcacug guagaauuca cu 22

<210> 20

<211> 24

<212> RNA

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<400> 20

uuuggcaaug guagaacuca cacu 24

<210> 21

<211> 23

<212> RNA

<213> 智人

<400> 21

ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23

<210> 22

<211> 22

<212> RNA

<213> 智人

<400> 22

uauugcacuu gucccggccu gu 22

<210> 23

<211> 23

<212> RNA

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caaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 24

<211> 22

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ucguaccgug aguaauaaug cg 22

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<211> 21

<212> RNA

<213> 智人

<400> 25

auugaaaccu cuaagagugg a 21

Claims

1.一种治疗缺血性心肌损伤的无外泌体方法，包括：

识别需要治疗缺血性心肌损伤的受试者；和

向所述受试者施用治疗有效量的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，以由此治疗所述缺血性心肌损伤，所述piRNA包括hsa_piR_016659(SEQ ID NO:1)的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述piRNA由所述hsa_piR_016659的核苷酸序列组成。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缺血性心肌损伤包括缺血/再灌注损伤。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缺血性心肌损伤包括心肌纤维化。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述受试者患有心肌梗塞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述缺血性心肌损伤后约10分钟至约2小时施用所述治疗有效量的piRNA。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述治疗有效量包括约80ng至约5mg的piRNA。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述piRNA包括一种或多种化学修饰的核苷酸。

9.一种治疗缺血性心肌损伤的无外泌体方法，包括：

识别需要治疗缺血性心肌损伤的受试者；和

向所述受试者施用治疗有效量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，以由此治疗所述缺血性心肌损伤，其中所述治疗有效量包括约80ng至约5mg的piRNA。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA包括CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。

11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：hsa_piR_016659(SEQ ID NO:1)、hsa_piR_016658(SEQ ID NO:2)、hsa_piR_001040(SEQ ID NO:3)、hsa_piR_007424(SEQ ID NO:4)、hsa_piR_008488(SEQ ID NO:5)、hsa_piR_018292(SEQ ID NO:6)、hsa_piR_013624(SEQ ID NO:7)、hsa_piR_019324(SEQ ID NO:8)和hsa_piR_020548(SEQ ID NO:9)。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA是hsa_piR_016659。

13.根据权利要求10所述的方法，其中，所述缺血性心肌损伤包括缺血/再灌注损伤。

14.根据权利要求10所述的方法，其中，所述缺血性心肌损伤包括心肌纤维化。

15.根据权利要求10所述的方法，其中，所述受试者患有心肌梗塞。

16.根据权利要求10所述的方法，其中，在所述缺血性心肌损伤后约10分钟至约2小时施用所述治疗有效量的外泌体衍生的piRNA。

17.一种治疗需要组织修复和/或再生的病症的无外泌体方法，包括：

识别具有需要组织修复和/或再生的病症的受试者；和

向所述受试者施用治疗有效量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，以由此治疗所述需要组织修复和/或再生的病症，其中所述治疗有效量包括约80ng至约5mg的piRNA。

18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述需要组织修复和/或再生的病症包括肌肉组织或肺组织的损伤。

19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述肌肉组织包括心肌或骨骼肌。

20.根据权利要求18所述的方法，其中，所述病症是导致组织纤维化的病症。

21.根据权利要求18所述的方法，其中，所述病症包括缺血性心肌损伤或肺纤维化。

22.根据权利要求18所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA包括CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA或成纤维细胞衍生的外泌体piRNA。

23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA是hsa_piR_016659。

25.一种治疗需要组织修复和/或再生的病症的无细胞方法，包括：

识别具有需要组织修复和/或再生的病症的受试者；和

向所述受试者施用治疗有效量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)，以由此治疗所述需要组织修复和/或再生的病症，

其中，所述外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：hsa_piR_016659(SEQ IDNO:1)、hsa_piR_016658(SEQ ID NO:2)、hsa_piR_001040(SEQ ID NO:3)、hsa_piR_007424(SEQ ID NO:4)、hsa_piR_008488(SEQ ID NO:5)、hsa_piR_018292(SEQ ID NO:6)、hsa_piR_013624(SEQ ID NO:7)、hsa_piR_019324(SEQ ID NO:8)、hsa_piR_020548(SEQ ID NO:9)、piR-20450(SEQ ID NO:10)、piR-16735(SEQ ID NO:11)、piR-01184(SEQ ID NO:12)、piR-20786(SEQ ID NO:13)、piR-00805(SEQ IDNO:14)、piR-04153(SEQ ID NO:15)、piR-18570(SEQ ID NO:16)、piR-16677(SEQ ID NO:17)和piR-17716(SEQ ID NO:18)。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，施用包括施用治疗有效量的包含所述外泌体衍生的piRNA的外泌体、细胞外囊泡或脂质体，其中所述外泌体、细胞外囊泡或脂质体富含所述外泌体衍生的piRNA。

27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述治疗有效量包括约80ng至约5mg的所述外泌体衍生的piRNA。

28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述需要组织修复和/或再生的病症包括肌肉组织或肺组织的损伤。

29.根据权利要求28所述的方法，其中，所述病症是导致组织纤维化的病症。

30.根据权利要求25至29中任一项所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA包括成纤维细胞衍生的外泌体piRNA或CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。

31.根据权利要求9至30中任一项所述的方法，其中，所述外泌体衍生的piRNA包括一种或多种化学修饰的核苷酸。

32.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，静脉内、动脉内、肌肉内、心内、心肌内或气管内地施用所述piRNA。

33.一种治疗肺纤维化的无细胞方法，包括：

识别患有肺纤维化的受试者；和

向所述受试者施用治疗有效量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)、治疗性外泌体和/或外泌体衍生的miRNA，以由此治疗所述肺纤维化，其中所述外泌体衍生自工程化成纤维细胞。

34.根据权利要求33所述的方法，其中，气管内施用所述治疗有效量的外泌体衍生的piRNA、治疗性外泌体和/或外泌体衍生的miRNA。

35.根据权利要求33所述的方法，其中，所述治疗性有效量的治疗性外泌体包括约10⁶至约10¹²个颗粒。

36.一种调节组织修复的方法，包括使转分化的成纤维细胞群与治疗有效量的外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)、外泌体和/或外泌体衍生的miRNA接触，以由此抑制成纤维细胞转分化为肌成纤维细胞，其中所述外泌体衍生自工程化成纤维细胞。

37.根据权利要求36所述的方法，其中，所述治疗有效量的外泌体包括约10⁶至约10¹²个颗粒。

38.根据权利要求36所述的方法，其中，所述转分化是TGFβ-介导的转分化。

39.根据权利要求36所述的方法，其中，所述接触在体外进行。

40.根据权利要求39所述的方法，其中，所述治疗有效量的piRNA包括约1nM至约200nM。

41.根据权利要求36所述的方法，其中，所述接触包括向受试者施用所述外泌体。

42.根据权利要求36所述的方法，其中，所述转分化成纤维细胞是肺成纤维细胞。

43.根据权利要求42所述的方法，其中，接触包括将所述外泌体衍生的piRNA、外泌体和/或外泌体衍生的miRNA气管内地施用于受试者。

44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述受试者患有肺纤维化。

45.根据权利要求36所述的方法，其中，所述接触包括使所述转分化成纤维细胞群与治疗有效量的外泌体衍生的miRNA接触，其中所述外泌体衍生的miRNA包括以下中的一种或多种：miR-183-5p(SEQ ID NO:19)、miR-182-5p(SEQ ID NO:20)、miR-19a-3p(SEQ ID NO:21)、miR-92a-3p(SEQ ID NO:22)、miR-17-5p(SEQ ID NO:23)、miR-126-3p(SEQ ID NO:24)和miR-510-3p(SEQ ID NO:25)。

46.根据权利要求36所述的方法，其中，所述接触包括使所述转分化成纤维细胞群与治疗有效量的外泌体衍生的piRNA接触，其中所述外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：piR-20450(SEQ ID NO:10)、piR-20548(SEQ ID NO:9)、piR-16735(SEQ ID NO:11)、piR-01184(SEQ ID NO:12)、piR-20786(SEQ ID NO:13)、piR-00805(SEQ ID NO:14)、piR-04153(SEQ ID NO:15)、piR-18570(SEQ ID NO:16)、piR-16677(SEQ ID NO:17)和piR-17716(SEQ ID NO:18)。

47.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括从治疗性外泌体中分离piRNA。

48.根据权利要求47所述的方法，其中，所述治疗性外泌体是CDC衍生的外泌体或成纤维细胞衍生的外泌体。

49.根据权利要求33至48中任一项所述的方法，包括从治疗性细胞群中分离所述治疗性外泌体。

50.根据权利要求49所述的方法，包括从非治疗性细胞中产生所述治疗性细胞群。

51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述非治疗性细胞包括成纤维细胞或CDC。

52.根据权利要求51所述的方法，其中，所述CDC是永生化CDC。

53.根据权利要求49至52中任一项所述的方法，其中，所述治疗性细胞是同种异体的。

54.根据权利要求33至53中任一项所述的方法，其中，所述治疗有效量的外泌体衍生的piRNA为约80ng至约500μg。

55.根据权利要求54所述的方法，其中，所述治疗有效量的外泌体衍生的piRNA为约100ng至约10μg。

56.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述治疗有效量的piRNA是具有相当于施用约10⁹至约10¹²个永生化CDC衍生的外泌体的治疗效果的量。

57.外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)治疗有此需要的受试者的缺血性心脏损伤的用途。

58.外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)用于制备治疗有此需要的受试者的缺血性心脏损伤的药物的用途。

59.根据权利要求57和58所述的外泌体衍生的piRNA的用途，其中，所述外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548。

60.治疗性外泌体和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)治疗有此需要的受试者的肺纤维化的用途。

61.治疗性外泌体和/或外泌体衍生的PIWI-相互作用RNA(piRNA)用于制备治疗有此需要的受试者的肺纤维化的药物的用途。

62.根据权利要求60或61所述的治疗性外泌体和/或外泌体衍生的piRNA的用途，其中，所述治疗性外泌体和/或外泌体衍生的piRNA包括以下中的一种或多种：piR-20450、piR-20548、piR-16735、piR-01184、piR-20786、piR-00805、piR-04153、piR-18570、piR-16677和piR-17716。

63.一种用于治疗需要组织修复和/或再生的病症的无外泌体治疗组合物，包括：

一种或多种外泌体衍生的piRNA，选自：hsa_piR_016659、hsa_piR_016658、hsa_piR_001040、hsa_piR_007424、hsa_piR_008488、hsa_piR_018292、hsa_piR_013624、hsa_piR_019324和hsa_piR_020548；和

药学上可接受的赋形剂。

64.根据权利要求63所述的组合物，其基本上由一种或多种外泌体衍生的piRNA和药学上可接受的赋形剂组成。

65.根据权利要求63所述的组合物，其中，所述一种或多种外泌体衍生的piRNA是hsa_piR_016659。

66.根据权利要求63所述的组合物，其中，所述病症是导致组织纤维化的病症。

67.根据权利要求63所述的组合物，其中，所述病症包括缺血性心肌损伤或肺纤维化。

68.根据权利要求63至67中任一项所述的组合物，其中，所述一种或多种外泌体衍生的piRNA包括成纤维细胞衍生的外泌体piRNA或CDC(心球衍生细胞)衍生的外泌体piRNA。