CN115698056A

CN115698056A - 双特异性蛋白

Info

Publication number: CN115698056A
Application number: CN202180042315.0A
Authority: CN
Inventors: 索菲娅·霍伯; 萨拉·林博; 埃玛·冯·维廷
Original assignee: Hober Biotechnology
Current assignee: Hober Biotechnology
Priority date: 2020-04-29
Filing date: 2021-04-29
Publication date: 2023-02-03
Also published as: WO2021219818A1; EP3904378A1; US20230250160A1; EP4143223A1

Abstract

本公开提供了一种双特异性蛋白，其能够使白蛋白和所需靶两者同时与ADAPT(ABD衍生亲和蛋白)分子结合。本公开提供了一种ADAPT分子，其中所需靶的提议结合表面位于所述ADAPT分子的螺旋1和螺旋2上。

Description

双特异性蛋白

技术领域

本公开涉及工程化改造的双特异性蛋白领域。

背景技术

由于其非凡的亲和性和靶特异性，抗体在制药行业中已取得巨大成功。事实上，目前市场上最畅销的十种药物中有六种是抗体[1]，并且在2017年底，它们的合并销售额接近1000亿美元[2]。尽管它们取得了成功，但抗体并非没有局限性。它们巨大且复杂的结构导致高生产成本和在许多临床应用中的次优药代动力学。鉴于这些局限性，并且多亏近几十年来蛋白质工程技术的开发和完善，其他替代品已经出现。其中包括小亲和蛋白结构域，其被统称为替代支架。这些支架具有作为治疗剂的几种潜在益处，并且可以被工程化改造成具有高亲和性和靶选择性。此外，它们的体积小，这意味着商品成本低并且能够穿透原本无法到达的组织，使它们成为抗体的一种有吸引力的替代品。

除了影响生产过程和生物分布之外，小体积的另一个潜在益处是可以使用可选的给药途径。对于大分子如抗体来说，选项仅限于静脉内和皮下注射，两者对于患者来说均非常不方便，并给医疗系统带来很大负担[3]。对于小得多的替代支架来说，鼻或肺递送可以非常好地作为非侵入性替代方法，可能改善患者的便利性和依从性。以前的研究显示，蛋白质的分子量和大小是影响通过黏膜给药的药物生物利用度的最关键因素，因此将体积保持在最小值变得特别重要[3,4]。

小体积还导致从循环快速清除，这个特点既可以是优点也可以是限制，这取决于应用。快速血液清除和高组织渗透一起对于在分子成像应用中实现高对比度是必需的。事实上，许多替代支架(例如亲合体、DARPin和ADAPT)已被证明是非常有前途的成像探针，表现出与周围健康组织的非凡对比度[5–7]。另一方面，在大多数治疗应用中，快速清除是不利的，因为需要长的停留时间以保持低剂量和较低频率。快速清除通常也在肾脏中产生不希望的积累。为了克服这种与体积相关的限制，已开发了几种延长半衰期的策略[8]。这些策略之一是基于与链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域(ABD)的融合。利用与患者自身的血清白蛋白的非共价结合，通过这种策略开发的支架融合蛋白的半衰期显著增加并且在肾脏积累减少[9–11]。循环半衰期的增加不仅归因于复合物大小的增加以及因此避免滤过肾小球屏障的能力，而且归因于下述事实，即白蛋白通过与新生儿Fc受体FcRn结合而被挽救以免于溶酶体降解[12]。尽管经常使用，但目前存在的大多数延长半衰期的策略的一个障碍是它们抵消了与小体积相关的一些益处。

为了开发在不改变分子大小的情况下延长半衰期的新策略，包括本发明人在内的一组研究人员过去已对ABD本身进行了工程化改造。在这项以前的工作中，除了它与白蛋白的天然结合之外，将新的结合表面引入到ABD中。通过将ABD的第一和第三螺旋中的残基随机化，产生了针对Z₂结构域[13]、TNFα[14]、HER2[15]和HER3[16]的双特异性ADAPT(ABD衍生亲和蛋白)。

发明内容

本发明人在以前的工作中观察到将白蛋白和所需靶两者同时结合到ADAPT分子是不可行的，可能是由于空间位阻。由于血清中的白蛋白浓度高(～600μM)[17]，因此即使对它的亲和性低也会非常肯定地在体内阻止这些分子的靶结合。

因此，本公开的目的是提供一种双特异性蛋白，其能够同时结合白蛋白和ADAPT分子上的所需靶两者。所述目的通过设计一种ADAPT分子，使得其中所需靶的提议结合表面已从所述ADAPT分子的螺旋1和螺旋3移动到螺旋1和螺旋2来实现。

为了至少满足上述目的，根据第一方面，提供了一种能够结合人血清白蛋白(HSA)和另一个靶的双特异性蛋白，所述双特异性蛋白包含氨基酸序列LAEAKVLANRX11LDKX15GX17SX19X20YKX23LIX26X27AKTVEX33VX35X36LX38X39X40ILX43X44X45X46(SEQ ID No.1)，其中

X11、X15、X17、X19、X27、X33、X35、X36、X38和X39彼此独立地是任何氨基酸；

X43、X44、X45和X46彼此独立地不存在或者是任何氨基酸；

X20是Y或F；X23是N、D或R；

X26是N或D；并且X40是E或H；

前提是第22、23和26位中的至少一者和第2、3、6、7、9、10、13和14位中的至少一者已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

根据一个实施方式，第22、23和26位中的至少两者已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

根据一个实施方式，第22、23和26位全都被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

根据一个实施方式，第2、9和13位中的至少一者已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

根据一个实施方式，第9位已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

根据一个实施方式，第X27位是N、K或D；和/或第X33位是G、E、S或D。

根据一个实施方式，X36是D、A、S、E或K。

根据一个实施方式，第1-15、19-26和/或31-44位中的任一氨基酸均不是C。

根据一个实施方式，第1-15和/或19-26位中的任一氨基酸均不是G。

根据一个实施方式，第1-15、19-26和/或31-44位中的任一氨基酸均不是P。

根据一个实施方式，第1、4、5、8、12、16、25、31、34和42位各自且独立地是保守的或者被保守替换。

根据第二方面，提供了一种多核苷酸，其编码根据第一方面的任一实施方式所述的双特异性蛋白。

根据第三方面，提供了一种表达盒，其包含根据第二方面所述的多核苷酸。

根据第四方面，提供了一种载体，其包含根据第二方面所述的多核苷酸或根据第三方面所述的表达盒。

根据第五方面，提供了一种药物组合物，其包含根据第一方面的任一实施方式所述的双特异性蛋白。

根据所述第五方面的一个实施方式，所述药物组合物还包含与所述双特异性蛋白相关、结合或偶联的靶分子。

根据一个实施方式，所述靶分子选自由肿瘤坏死因子α(TNFα)、前列腺特异性抗原(PSA)、C反应蛋白(CRP)、肾素(REN)、血管生成素(ANG)、髓源性生长因子(MYDGF)和胰岛素组成的组。

根据所述第五方面的一个实施方式，所述药物组合物还包含可药用载体、赋形剂、稳定剂、添加剂、缓冲溶液和/或溶剂。

根据第六方面，提供了一种治疗剂，其包含第一方面的任一实施方式所述的双特异性蛋白和细胞毒性剂例如细胞毒性分子、肽、蛋白质或放射性核素。

根据所述第六方面的一个实施方式，所述细胞毒性剂是烷基化药物、蒽环类药物、抗代谢物、长春花生物碱、依托泊苷、抗肿瘤药物或药剂、外毒素、核糖体失活蛋白或蛋白激酶抑制剂。

附图说明

图1A图示了所述新的双特异性蛋白的设计，其中随机化的位置用黑色示出。图1B图示了以前发表的双特异性结合物的用黑色示出的结合表面，所述结合物具有空间位阻，阻止了同时结合HSA和其他靶。图1C描述了用黑色示出的与HSA的结合。图1D公开了母体分子ABD035的序列，并且本公开的随机化位置用黑点标记。

图2公开了本公开的双特异性蛋白同时结合HSA和靶的能力。图2A公开了ADAPT_{胰岛素_02}的SPR传感图，显示出它与胰岛素和HSA结合但不与无关靶Her2结合。图2B)公开了相同的分析，但其中将ADAPT_{胰岛素_02}用HSA饱和，显示出它仍可结合胰岛素但不结合HSA。

图3公开了所选的ADAPT变体在热变性之前(黑线)和之后(黑点)的CD光谱。A)ADAPT_CRP_09；B)ADAPT_CRP_23；C)ADAPT_CRP_38；D)ADAPT_CRP_40；E)ADAPT_胰岛素_01；F)ADAPT_胰岛素_02；G)ADAPT_胰岛素_03；H)ADAPT_TNF_05；I)ADAPT_TNF_09；J)ADAPT_PSA_01；K)ADAPT_PSA_05；L)ADAPT_REN_01；M)ADAPT_REN_40；N)ADAPT_ANG_02；O)ADAPT_ANG_06；P)ADAPT_ANG_13；Q)ADAPT_ANG_16；R)ADAPT_MYDGF_07；S)ADAPT_MYDGF_08。

图4公开了通过SEC色谱图进行的寡聚体状态的评估，示出了所选的ADAPT变体(黑线)与校准物(黑点)的叠加。A)ADAPT_CRP_09；B)ADAPT_CRP_23；C)ADAPT_CRP_38；D)ADAPT_CRP_40；E)ADAPT_胰岛素_01；F)ADAPT_胰岛素_02；G)ADAPT_胰岛素_03；H)ADAPT_TNF_05；I)ADAPT_TNF_09；J)ADAPT_PSA_01；K)ADAPT_PSA_05；L)ADAPT_REN_01；M)ADAPT_REN_40；N)ADAPT_ANG_02；O)ADAPT_ANG_06；P)ADAPT_ANG_13；Q)ADAPT_ANG_16；R)ADAPT_MYDGF_07；S)ADAPT_MYDGF_08。

图5公开了通过SPR捕获测定法进行的同时结合的评估。在捕获到固定有HSA的表面上之后，ADAPT变体的SPR传感图通过演示注入的靶的结合曲率，表明了HSA和靶的同时结合。A)ADAPT_胰岛素_01；B)ADAPT_胰岛素_02；C)ADAPT_胰岛素03；D)ADAPT_TNFa_05；E)ADAPT_TNFa_09；F)ADAPT_PSA_01；G)ADAPT_PSA_05；H)ADAPT_MYDGF_07；I)ADAPT_MYDGF_08；J)ADAPT_ANG_02；K)ADAPT_ANG_06；L)ADAPT_ANG_13；M)ADAPT_ANG_16。

图6以ADAPT_胰岛素_02为例公开了三元复合物的形成。SEC色谱图含有HSA、ADAPT_Ins02和胰岛素的单独注入以及含有胰岛素和ADAPT_Ins02的样品、含有HSA和ADAPT_Ins02的样品和含有所有三种结合配偶体的样品的叠加信号。

图7是已知白蛋白结合序列的比对。

定义

“ABD”表示白蛋白结合结构域。

“HSA”表示人血清白蛋白。

本公开中的双特异性蛋白在本文中也使用术语“ADAPT”(ABD衍生亲和蛋白的缩略语)或术语“结合物”来公开。

当在本文中使用时，“靶”是指将与双特异性蛋白结合的靶分子，并且所述分子在与所述靶和HSA结合的双特异性蛋白的复合物中是效应分子。

对于氨基酸来说，使用下述缩略语：丙氨酸–A；精氨酸-R；天冬酰胺–N；天冬氨酸–D；半胱氨酸–C；谷氨酸–E；谷氨酰胺–Q；甘氨酸–G；组氨酸–H；异亮氨酸–I；亮氨酸–L；赖氨酸–K；甲硫氨酸–M；苯丙氨酸–F；脯氨酸–P；丝氨酸–S；苏氨酸–T；色氨酸–W；酪氨酸–Y；缬氨酸–V。

详细描述

小体积是治疗性蛋白的有吸引力的特点，因为它允许高的组织渗透和非侵入性给药途径以及容易且成本效益高的生产。然而，优点往往伴随着代价。这些小蛋白通常具有有限的体内半衰期，导致大量的肾脏摄取以及较低的治疗功效。克服这些限制的一个公知的策略是利用人血清白蛋白的长半衰期，通过直接融合到白蛋白本身或融合到不同的白蛋白结合组成部分。以前的研究显示，将治疗性分子融合到源自于链球菌蛋白G的ABD导致肾脏摄取的显著降低和明显更长的半衰期[10,23]。

在构成本公开的基础的研究中，已经利用了ABD的白蛋白结合特性，但不是将它融合到另一个结合物，而是在所述分子本身中引入额外的结合部位。因此，获得了具有改进的药代动力学特性的小的单域双特异性结合物。为此，设计了一个新的组合噬菌体展示文库，并将其用于选择目的是同时结合HSA和其他临床相关靶两者的分子。

以前已证实，在这个支架中引入双重结合特异性是可能的[13–16]。然而，在这些研究中，配偶体之一的结合以某种方式阻止了另一者的同时结合。本发明人假设这可能是由于空间位阻，因此将本文公开的文库设计成在所述分子的另一侧上具有新的结合表面(参见图1)。这被证明是一个成功的策略，因为它导致几种双特异性分子表现出同时结合。

因此，本发明人设计了一种新的组合文库，其中所述提议的结合表面已被移动到ABD的螺旋1和2。假设新的文库设计将提高产生能够同时结合白蛋白和其他靶的最小蛋白的可能性，从而将小治疗分子和大治疗分子的优点组合在单一格式中。为了证明这种新的组合文库的质量和适用性，对一组不同大小的临床相关靶(TNFα、PSA、CRP、REN、ANG、MYDGF和胰岛素)进行了噬菌体展示选择。此外，设计了包括下一代测序和基于PCR的基因回收方法在内的标准化工作流程，以允许高成本效益地回收结合靶的克隆。本研究的结果显示，所述新的结合表面适合于靶相互作用并且也能同时与血清白蛋白结合。

因此，提供了一种能够同时结合人血清白蛋白(HSA)和另一个靶的双特异性蛋白。所述双特异性蛋白包含氨基酸序列LAEAKVLANR X11LDKX15GX17SX19X20YKX23LIX26X27AKTVEX33VX35X36LX38X39X40ILX43X44X45X46(SEQ ID No.1)。在所述序列中，X11、X15、X17、X19、X27、X33、X35、X36、X38和X39彼此独立地是任何氨基酸。X43、X44、X45和X46彼此独立地不存在或者是任何氨基酸。X20是Y或F。X23是N、D或R。X26是N或D。X40是E或H。上述氨基酸序列中第22、23和26位中的至少一者和第2、3、6、7、9、10、13和14位中的至少一者已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

本文讨论的双特异性蛋白的氨基酸位置相对于SEQ ID No.1来指称。例如，在讨论第2位中的氨基酸的突变时，它涉及SEQ ID No.1中第2位中的氨基酸；在讨论第3位中的氨基酸的突变时，它涉及SEQ ID No.1中第3位中的氨基酸；在讨论第22位中的氨基酸的突变时，它涉及SEQ ID No.1中第22位中的氨基酸；以此类推。SEQ ID No.1的蛋白质可以被并入到较大的复合物中，在SEQ ID No.1的C-端或N-端带有额外的氨基酸。然而，本文讨论的氨基酸的位置总是如上所阐明的相对于SEQ ID No.1来指称。SEQ ID No.1是基于图7中示出的已知白蛋白结合物的比对以及本发明人对各种不同位置的氨基酸对结合和稳定性的影响的理解。

如上所述的双特异性蛋白在结构上包含三个螺旋，其中第1-15位氨基酸形成螺旋1，第19-26位氨基酸形成螺旋2，并且第31-44位氨基酸形成螺旋3。因此，在第22、23和26位中的至少一者中的任何突变位于螺旋2中，并且在第2、3、6、7、9、10、13和14位中的至少一者中的任何突变位于螺旋1中。第2、3、6、7、9、10、13和14位构成了螺旋1的靶结合表面，并且第22、23和26位构成了螺旋2的靶结合表面。

通过对螺旋1和2中的指定氨基酸位置应用随机突变并随后对上述靶进行选择，本发明人鉴定了对突变特别重要的特定氨基酸位置，以便获得对所选靶的亲和性，同时仍维持蛋白质的稳定性，并确保与靶的结合可以和与HSA的结合同时发生。所述特定氨基酸位置使得靶的结合部位不在空间上阻碍HSA的结合。参见图1，其清楚地图示了所述进行突变的特定氨基酸位置相对于HSA结合部位指向所述蛋白的相反侧。

此外，所述特定氨基酸位置使得它们不干扰或扰乱所述蛋白质的稳定性。

根据一个优选实施方式，第22、23和26位中的至少两者已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。例如，第22和26位或第22和23位或第23和26位可能已被突变。根据又一个优选实施方式，第22、23和26位全都已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

根据一个优选实施方式，第2、9和13位中的至少一者已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。根据又一个优选实施方式，第9位已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

根据一个实施方式，第X27位是N、K或D。根据一个实施方式，X33是G、E、S或D。根据又一个实施方式，X36是D、A、S、E或K。

根据一个优选实施方式，第1-15、19-26和/或31-44位中的任一氨基酸均不是C。C是形成二硫化物的氨基酸，因此是不适合的，因为不需要的二硫键将会对这种小蛋白的总体结构产生负面影响。

根据一个优选实施方式，第1-15和/或19-26位中的任一氨基酸均不是G。G是非常柔性的氨基酸。提高的柔性可能对螺旋结构产生负面影响。

根据一个优选实施方式，第1-15、19-26和/或31-44位中的任一氨基酸均不是P。P具有非常刚性的结构，具有破坏螺旋的特性，因此不利于蛋白质的部分形成螺旋结构。

根据一个优选实施方式，第1-15、19-26和/或31-44位中的任一氨基酸均不是C、G或P中的任一者。

根据一个实施方式，第1、4、5、8、12、16、25、31、34和42位中的氨基酸各自且独立地是保守的或者被保守替换。优选地，第1、4、5、8、12、16、25、31、34和42位中的氨基酸是保守的。这些位置对蛋白质的稳定性重要，因此不应被突变或者只包含保守突变，以便维持并且不扰乱所述蛋白质的结构和稳定性。

保守替换是将给定氨基酸改变成具有相似物理-生物化学性质的不同氨基酸的氨基酸替换。通常，V可以用A或F保守替换；I可以用F或C保守替换；L可以用F或V保守替换；M可以用F或V保守替换；F可以用L或M保守替换；C可以用V或M保守替换；W可以用F或L保守替换。

在本公开中，本发明人更详细地研究了如上所述的双特异性蛋白，将其突变以获得针对选自肿瘤坏死因子α(TNFα)、前列腺特异性抗原(PSA)、C反应蛋白(CRP)、肾素(REN)、血管生成素(ANG)、髓源性生长因子(MYDGF)和胰岛素的靶的更高亲和性。在研究被突变以便与上述靶结合的双特异性蛋白变体时，在下面的表1中指示的位置中发现了下述氨基酸。

表1.新的结合物中突变位置的比对

因此，显然本文中具体鉴定到的位置中的氨基酸突变随着靶而不同。此外，显然针对同一靶的突变具有很大相似性，并且对于特定位置中的氨基酸类型来说具有许多共同特点，或者甚至下特定位置中具有相同氨基酸。这清楚地支持了在本公开的双特异性蛋白中指定的被突变以提高对靶的亲和性的氨基酸位置确实是重要的。在本公开的双特异性蛋白中指定的被突变的氨基酸位置是用于本公开目的的突变“热点”。上述鉴定的突变体的表征公开在下文结果章节下的表3中。

在本公开中还提供了一种多核苷酸，其编码根据所述第一方面的任何实施方式的双特异性蛋白。所述多核苷酸的序列可以被密码子优化以在适合的生物体或表达系统中表达。

本公开还提供了一种表达盒，其包含如上所述的多核苷酸。所述表达盒包含在开放阅读框(ORF)中的如上所述的多核苷酸、启动子和3’非翻译区，所述非翻译区任选为多腺苷酸化位点。所述启动子被选择成能够在适合的生物体或表达系统中表达。所述表达盒可以包含额外的调控序列。

此外，提供了一种载体，其包含如上所述的多核苷酸或如上所述的表达盒。所述载体可以额外包含适合的启动子、标签、可检测标志物和/或控制所述载体在适合的生物体或表达系统中的复制和/或表达的其他调控序列。

在本公开中还提供了一种药物组合物，其包含根据上述任何实施方式所述的双特异性蛋白。

根据一个实施方式，所述药物组合物还包含可药用载体、赋形剂、稳定剂、添加剂、缓冲溶液和/或溶剂。

所述药物组合物优选地适合于鼻部或肺部给药。正如上文在背景章节中讨论的，分子或蛋白质的大小对其给药来说是重要的，其中与较大体积相比，较小体积能够使用其他给药途径。本文公开的双特异性蛋白体积小，约为6kDa，因此适合于通过鼻或肺给药途径给药。通过鼻部给药，本公开的双特异性蛋白可以快速跨过鼻腔黏膜中的单一上皮细胞层转移并直接进入全身血液循环。这能够使给药的药剂快速起效。此外一般来说，鼻部给药容易，非侵入性，并且令待治疗或给药所述药物组合物的受试者感觉舒适。因此，所述药物组合物优选地可以配制成溶液、悬液或粉剂，用于喷洒或滴入到鼻和鼻腔中。除了上面提到的用于药物组合物的组分之外，此类药物制剂通常可以包含增溶剂、缓冲组分、抗氧化剂、保湿剂、胶凝剂/增黏剂和口味和/或调味掩蔽剂。

本公开还提供了一种治疗剂，其包含任何上述实施方式的双特异性蛋白和细胞毒性剂例如细胞毒性分子、肽、蛋白质或放射性核素。

根据一个实施方式，所述细胞毒性剂是烷基化药物、蒽环类或其他细胞毒性抗生素、抗代谢物、长春花生物碱、依托泊苷、抗肿瘤药物或药剂、外毒素、核糖体失活蛋白或蛋白激酶抑制剂。

烷基化药物的实例是苯达莫司汀、白消安、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、洛莫司汀、美法兰、噻替哌和曲奥舒凡。

蒽环类和其他细胞毒性抗生素的实例是博来霉素、卡利奇霉素、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、丝裂霉素和米托蒽醌。

抗代谢物的实例是阿扎胞苷、卡培他滨、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、氟达拉滨、氟尿嘧啶、吉西他滨、巯基嘌呤、甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞和硫鸟嘌呤。

长春花生物碱的实例是长春碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。

抗肿瘤药物或药剂的实例是α-鹅膏蕈碱、安吖啶、蓓萨罗丁、硼替佐米、卡铂、西妥昔单抗、顺铂、菊天冬酰胺酶(crisantaspase)、隐藻菌素(cryptophycin)、达卡巴嗪、多西他赛、羟基脲(hydroxyurea)、依立替康、美登素(emtansine)、单甲基奥瑞他汀E、单甲基奥瑞他汀F、奥沙利铂、紫杉醇、喷司他丁、甲基苄肼、ravtansine(索拉夫坦辛/soravtansine)、根瘤菌素、替莫唑胺、拓扑替康、微管溶素(tubulysin)、曲妥珠单抗和维甲酸。

外毒素的实例是白喉毒素、假单胞菌外毒素A和霍乱毒素。

核糖体失活蛋白的实例是相思豆毒素、beetin、bouganin、白树毒素、蓖麻毒素、皂草素、志贺毒素、螺原体蛋白、sportin和天花粉蛋白。

蛋白激酶抑制剂的实例是达沙替尼、厄洛替尼、依维莫司、伊马替尼、尼罗替尼和舒尼替尼。

根据一个实施方式，所述细胞毒性放射性核素选自由¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、¹⁶⁶Ho、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁴Cu、¹⁴⁹Tb、¹⁶¹Tb、⁴⁷Sc、²²⁵Ac、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹²Bi、²²⁷Th、²²³Ra、^58mCo、¹³¹I、⁷⁶As、⁷⁷As和²¹¹At组成的组。

在一个实施方式中，所述放射性核素是放射性金属，并且所述双特异性蛋白通过共价结合到所述双特异性蛋白、优选为所述双特异性蛋白的C残基的螯合剂偶联到所述放射性金属。因此，所述双特异性蛋白的一个实施方式进一步包含末端半胱氨酸C残基，优选为C-端C残基。所述末端C残基优选为所述双特异性蛋白的唯一C残基。所述末端C残基优选地位于SEQ ID No.1的C-端，因此不包括在SEQ ID No.1中。

所述螯合剂可以选自由十二烷四乙酸(DOTA)及其衍生物(例如DOTA的马来酰亚胺基衍生物)、交叉桥接的大环螯合剂和空间限制的非环螯合剂组成的组。

对于¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁶⁶Ho、¹⁵³Sm、¹⁴⁹Tb、¹⁶¹Tb、⁴⁷Sc、²²⁵Ac、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹²Bi、^227Th和^58mCo来说，特别适合的螯合剂是DOTA及其衍生物DOTAGA。

对于⁶⁷Cu和⁶⁴Cu来说，交叉桥接的螯合剂例如CB-TE2A是更好的选择。

对于¹⁸⁸Re和¹⁸⁶Re来说，基于含有半胱氨酸或巯基乙酰基的肽的螯合剂是优选的。

¹³¹I、⁷⁶As、⁷⁷As和²¹¹At是非金属放射性核素，其可以利用共价偶联结合到所述双特异性蛋白。

放射性碘化可以使用((4-羟基苯基)乙基)马来酰亚胺(HPEM)来实现，其可以结合到所述双特异性蛋白的C残基。采取As(III)形式的⁷⁶As和⁷⁷As(和⁷⁴As)可以直接偶联到所述双特异性蛋白的C残基的(新)还原的硫醇基。

对于²¹¹At的偶联来说，可以使用N-[4-(三-正-丁基甲锡烷基)苯乙基]-马来酰亚胺作为连接物。在这种情况下，首先通过砹代去锡烷化将²¹¹At偶联到所述连接物，形成4-砹-苯乙基-马来酰亚胺(AtPEM)，其进而可以被偶联到融合蛋白的半胱氨酸(C)残基。

实施例–材料和方法

噬菌体展示文库的构建

在噬菌粒pAffi1的基础上构建噬菌粒载体(pSE)[18]。在pSE中，编码pAffi1中存在的蛋白Z的螺旋3的基因片段被移除，并代之以重新放置编码ABDwt的基因片段以编码全长蛋白Z。噬菌粒pSE从Thermo Fisher Scientific GENEART GmbH(Regensburg,Germany)订购。位于Zwt上游的XhoI和NheI的限制性酶识别位点被用于随后插入文库基因表达盒。

第一个ADAPT文库基因从三个独立的寡核苷酸组装：fwdABDlib_h1(SEQ IDNo.2)，其覆盖螺旋1并含有8个多样化的位置，允许除了Pro、Cys和Gly之外的所有氨基酸(Ella Biotech,Martinsried,Germany)；revABDlib_h2(SEQ ID No.3)，其覆盖螺旋2并含有三个通过NNK简并多样化的位置(TAG Copenhagen,Copenhagen,Denmark)；和revABDlib_h3(SEQ ID No.4)，其覆盖螺旋3并且没有任何多样化的位置(TAG Copenhagen,Copenhagen,Denmark)。所述文库的第二个版本通过将revABDlib_h2(SEQ ID No.3)更换为revABDlib_h2_v2(SEQ ID No.5)(Ella Biotech,Martinsried,Germany)来组装，后者具有相同的位置但代之以被多样化以允许除了Pro、Cys和Gly之外的所有氨基酸，就像螺旋1一样。完整的寡核苷酸序列可以在表2中找到。将800pmol的每种寡核苷酸以等比例混合，通过10个循环的PCR组装并使用外部引物扩增另外10个循环。这些引物也引入了限制性位点XhoI和NheI，用于连接到噬菌粒载体pSE中。使用QIAquick凝胶纯化试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从2％琼脂糖凝胶提取并纯化所述连接的噬菌粒。将产物通过电穿孔转化到XL1 blue大肠杆菌(Lucigen,Middleton,WI,USA)中，得到5x10⁹个成员。

表2.用于ADAPT文库的文库构建的寡核苷酸。用于组装文库的四个寡核苷酸的序列。fwdABDlib_h1和revABDlib_h2_v2中的NNN对应于允许除了Pro、Cy和Gly之外的所有氨基酸的平等分配的密码子。revABDlib_h2中的MNN对应于NNK简并密码子但顺序相反。

靶抗原的产生和生物素化

除了胰岛素之外的所有靶抗原在如前所述的人类分泌组计划(Human SecretomeProject)(Stockholm,Sweden)中产生[19]。人类重组胰岛素从Thermo Scientific(Waltham,MA,USA)订购。对于靶抗原的生物素化来说，将EZ-连接的Sulfo-NHS-LC-生物素(Thermo Scientific,Waltham,MA,USA)在水中溶解到终浓度为10mM，并以12倍摩尔过量添加到靶抗原溶液。将所述反应在室温(RT)温育30min。通过NAP5脱盐柱(GE Healthcare,Stockholm,Sweden)从样品中除去未反应的生物素试剂。

噬菌体展示选择

使用溶液中的生物素化的重组靶抗原(bTNFα、bCRP、bPSA、bREN、bANG、bMYDGF、b胰岛素)进行了四轮(对于胰岛素选择来说两轮)筛选，然后捕获在链霉亲和素包被的磁珠上。为了除去非特异性结合的噬菌体，将在选择期间使用的所有试管和磁珠用含有0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲盐水(PBS-T)清洗，并用补充有0.5％明胶的PBS-T阻断。此外，在所有筛选轮之前，与0.5mg所述清洗过且阻断的链霉亲和素包被的磁珠在RT和150rpm下温育30min。然后将得到的上清液用作筛选轮中的输入物。在筛选期间，对于第1-4轮来说，将噬菌体上清液分别与150、100、50和25nM靶抗原温育。允许所述温育在旋转下进行2小时，然后捕获在链霉亲和素包被的磁珠上。将所述磁珠用PBS-T在第1轮中清洗两次，在第2轮中清洗四次，在第3轮中清洗八次，并在第4轮中清洗12次。将结合的噬菌体用50mM pH 2.0甘氨酸在RT洗脱10min，然后用等体积的pH 8.0PBS中的10％1M Tris-HCl中和。然后将所述中和的洗脱液用于感染与洗脱的噬菌体相比至少100x过量的XL1 blue大肠杆菌。在允许感染进行30分钟后，向细胞添加等量的补充有200μg/ml氨苄青霉素和10μg/ml四环素的胰酶大豆肉汤和酵母提取物(TSB+YE)培养基。30分钟后，添加与感染时使用的细胞数相比10x过量的M13K07辅助噬菌体。在另外90min后，将细胞离心沉积并重悬浮在100ml补充有100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml卡那霉素和0.1mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的TSB+YE中，最后在30℃温育过夜。通过聚乙二醇(PEG)沉淀收集扩增的噬菌体，并在下一个筛选轮次中用作输入物。

下一代测序

使用QIAprep Miniprep试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从用来自于不同筛选轮的噬菌体洗脱液或原始噬菌体文库感染的XL1 blue大肠杆菌提取噬菌粒DNA。使用50ng纯化的噬菌粒作为模板，并使用5pmol含有正向接头序列的寡核苷酸和5pmol含有反向接头序列以及样品特异性指标序列的寡核苷酸进行PCR。为了降低偏差和错误的风险，将PCR反应限制到15个循环。使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Hilden,Germany)从2％琼脂糖凝胶提取并纯化得到的PCR产物。最后将所有样品以等量合并，达到10nM的总浓度。测序在Illumina MiSeq v2仪器的一个流动池中进行，并在国家基因组研究所(NationalGenomics Infrastructure)(Stockholm,Sweden)进行。

测序数据分析

FASTQ文件使用内部软件来分析。首先拣选出正确序列：如果存在可变区上游9个碱基和下游9个碱基的两个识别位点，则认为序列是正确的。此外，这两个位点之间的距离必须具有正确的长度，并且所有碱基需要具有≥30的Phred质量评分。随后，为每个测序样品计算正确序列中每个遇到的基因变体的数目。

前导ADAPT的亚克隆、生产和纯化

基于下一代测序结果，为每种抗原选择了十二个不同富集的基因变体用于进一步评估。选择的基因仅在该特定抗原的轨迹中以高频率出现，并分布在几个不同的序列簇上。用于针对TNFα、CRP、PSA、REN和胰岛素进行选择的基因变体由Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA USA)合成，并使用含有限制性位点的带有侧翼区域的引物进行扩增，用于亚克隆到T7诱导型表达载体中。来自于针对ANG和MYDGF的选择的变体如下一节中所述进行分离。最终产物由Microsynth Seqlab(

Germany)使用Sanger测序进行序列验证。将所有变体在大肠杆菌BL21*(DE3)细胞中表达，并通过超声处理进行提取。使用与人血清白蛋白(HSA)偶联的树脂(内部制造)，通过亲和层析对得到的裂解液进行纯化。

挽救单个克隆的基于PCR的策略的开发

尽管来自于所述七个选择中的五个的基因最初如上所述合成，但也开发了基于标准的PCR方案的成本效益更高的策略，并用于从针对ANG和MYDGF的选择中挽救克隆。分别使用一个覆盖螺旋1中的随机化位置的独特的寡核苷酸和另一个覆盖螺旋2中的随机化位置的寡核苷酸作为正向和反向引物，以扩增所述独特的序列并引入限制性位点，用于克隆到表达载体中。将与上述相同的T7诱导型表达载体装备第三个非随机化的螺旋，在所述螺旋中本发明人也引入了HindIII限制性位点，用于组装独特ADAPT变体的全长序列。

圆二色谱

在Chirascan圆二色性光谱仪(Applied Photophysics,Surrey,UK)中评估二级结构含量、解链温度和变性后重新折叠的能力。将样品在PBS中稀释到浓度为0.2mg/ml，并且所有分析在光径长度为1mm的比色皿中进行。二级结构含量通过在20℃下测量从260至195nm的椭圆率来评估。解链温度通过在将温度以每分钟5℃的速率从20℃提高到100℃的同时监测221nm处的信号来确定。重新折叠能力通过在对样品进行热处理后重复二级结构评估来评价。

通过尺寸排阻色谱法评估寡聚体状态

通过尺寸排阻色谱法(SEC)评估ADAPT变体的聚集倾向性。所述实验在装备有Superdex 755/150柱的

纯化系统(GE Healthcare,Stockholm,Sweden)上进行。将所述柱用PBS平衡，并通过以0.45ml/min的流速注入25ul纯化的蛋白质(浓度在0.5-1mg/ml之间的范围内)来获得洗脱曲线。将四种不同蛋白质的校准物(伴白蛋白75kDa、碳酸酐酶29kDa，核糖核酸酶A13.7kDa和载脂蛋白7.5kDa)用于比较。

靶结合分析

使用Biacore T200系统(GE Healthcare,Stockholm,Sweden)进行基于传感器的结合分析。所有分析均使用包被有靶抗原、另一种无关抗原和HSA的CM-5传感器芯片来进行。留下一个表面作为参比。结合分析在25℃下在PBS-T中进行。将ADAPT变体在PBS-T中稀释到500nM、250nM、125nM、62.5nM和31.25nM。将样品以30ul/min的流速进样120s，然后将PBS-T进样240s以监测解离。将表面用10mM HCl再生。使用Biacore Insight评估软件确定动力学参数，假设1:1结合。

ADAPT与白蛋白和靶抗原的同时结合通过预温育试验或捕获试验来评估。预温育试验通过以与直接结合分析相同的参数将与10x摩尔过量的HSA预温育的ADAPT变体进样到传感器芯片上来进行。对于捕获试验来说，首先将500nM ADAPT变体以10μl/min的流速在HSA表面上捕获50秒，然后进样200或500nM的靶抗原。将所述靶抗原以30ul/min的流速进样120s，然后将PBS-T进样240s以监测解离。将表面用10mM HCl再生。

通过尺寸排阻色谱法评估三元复合物形成

在SPR中证实了白蛋白和靶抗原的同时结合后，进行最后的表征步骤以确认溶液中三元复合物的形成。将HSA、ADAPT和靶抗原以1:1:1的摩尔比混合在一起，总浓度为50μM，并在RT温育1小时，然后进样到SEC柱上。也将相同量的每种结合配偶体独立进样。所述实验在装备有Superdex 755/150柱的

纯化系统(GE Healthcare,Stockholm,Sweden)上进行。将柱用PBS平衡，并通过以0.45ml/min的流速进样25ul样品来获得洗脱曲线。

实施例–结果

为了选择针对HSA和其他靶抗原的有功能的单域双特异性结合物，建立了标准的工作流程。在噬菌体展示选择和下一代测序分析后，通过合成或通过使用覆盖随机化位置的独特寡核苷酸的基于PCR的方法来回收单克隆。为了确保所有最终候选物在将来的应用中有功能，首先在结构和稳定性方面对所有蛋白质变体进行评估，然后最终测试它们与不同靶抗原以及HSA的结合。那些被产生、纯化并通过工作流程的所有质量检查的突变体在下文描述并概述在表3中。

表3.来自于结合靶的ADAPT变体的表征的结果，描述了解链温度、重新折叠的能力、同时与HSA结合的能力和确定的动力学参数。N.D意味着所述值不可确定。

噬菌体展示文库的构建

为了允许同时结合天然配体HSA和其他临床相关靶两者，设计并创建了一个新的组合文库。ABD以前已被工程化改造用于此目的，产生了在图1B中示出的文库，其中随机化位置散布在第一和第三螺旋上。

第一个文库被成功地用于开发针对几种靶的双特异性结合物。然而，尽管它们都分别结合它们的靶和HSA，但在所有情况下HSA的结合阻碍了与靶抗原的同时结合[13,15]。本发明人假设相当大且笨重的HSA分子可能在螺旋1和3的结合表面周围造成空间位阻，并且相信将随机化结合表面迁移到螺旋1和2可以带来新的可能性(图1A)。由于本发明人顾虑螺旋2中接近HSA结合部位的突变位置可能影响结合，因此所述文库是基于被称为ABD035的亲和成熟的ABD[20]。

为了构建新文库，覆盖螺旋1的正向寡核苷酸在根据图1A和1C的位置中包括等量分布的除了Pro、Cys和Gly之外的所有天然氨基酸的变异，而覆盖螺旋2的反向寡核苷酸是基于在第22、23和26位中引入NNK的简并密码子。最终的覆盖第三螺旋的反向寡核苷酸仅含恒定位置。

螺旋1和2中的随机化位置基于它们的侧链位置来选择，所述侧链位置被表明位于距HSA结合表面足够距离处，正如在Lejon等人描述的晶体结构中所示[21]。此外，文库设计还基于关于不直接参与HSA结合的残基以及以前已被成功替换的位置的现有知识[22]。在同源结构域之间的序列比对中高度保守并因此被认为是重要的残基被避开。在以对应于10¹⁴个个体的量组装编码ADAPT变体的完整基因后，将所述文库以5x10⁹的总多样性转化到XL1 blue细胞中。将最终的原始

文库用Illumina MiSeq测序，产生超过500000个读出序列，并显示出与设计参数相一致的变异和氨基酸分布(数据未示出)。

噬菌体展示选择和序列评估

针对五种生物素化的靶抗原中的四种进行了四轮筛选：bTNFα(19.5kDa)，bCRP(25.7kDa)，bPSA(29.5kDa)和bREN(44.9kDa)。针对胰岛素(5.8kDa)的选择在两轮筛选后已经测序。使用带条形码的接头序列的下一代测序整个评估在整个选择中的序列富集。前四个选择证实了特定序列的富集以及第四轮筛选后的强烈共有序列，并且在胰岛素选择的第二轮筛选后也出现富集，尽管正如预期那样没有那么明显(数据未示出)。以对TNFα的选择(数据未示出)为例，研究了在不同筛选轮中100个最富集的序列的氨基酸分布。在这个实例中，可以观察到在筛选期间，原始

文库中氨基酸的均匀分布朝向某些优选氨基酸变化。在同一实例中，也可以看到脯氨酸这种氨基酸在螺旋2的第23和26位中相当凸显。以其刚性结构和螺旋中断特性著称的脯氨酸与柔性的甘氨酸和形成二硫化物的半胱氨酸一起，均被排除在螺旋1的设计之外。本发明人假设这些氨基酸在螺旋2中不会有那么大问题，但是比较不同选择的结果，他们发现对所有选择来说这三种氨基酸中的一者或多者的出人意料的富集。在这些结果的基础上设计了一个新的文库，其中剩余的17种氨基酸在螺旋1和2两者中均匀分布。为了评估这个新版本的文库，使用靶抗原血管生成素(ANG)(16.8kDa)和髓源性生长因子(MYDGF)(18.9kDa)进行了两个额外的选择。正如从文库设计所预期的，这些选择导致不含Cys、Pro或Gly的相关序列的富集。

通过比较不同选择的每个位置中的氨基酸富集(数据未示出)，似乎对于不同靶抗原来说结合表面的位置略有不同。这并不非常令人吃惊，因为靶抗原在分子性质方面不同，并且人们可以假定不同氨基酸位置可能对不同靶抗原具有各不相同的可接近性。

源自于测序数据的另一个有趣发现是在不论何种靶的所有选择中，第6位对疏水性氨基酸(A、I、L、V和W)显示出强烈偏好性，并且来自于TNFα、PSA、CRP和ANG选择的大部分序列甚至含有存在于母体ABD035中的缬氨酸。这些结果表明可以改进和重新设计文库以使其甚至更加集中。

根据测序数据选择了某些有前途的ADAPT变体用于进一步表征。合成了来自于针对TNFα、CRP、PSA、REN、ANG和MYDGF的每个选择的12个变体，并将它们克隆到表达载体中用于生产和纯化。所述变体的选择是基于它们的相对频率以及它们在几个序列簇上的分布。对于胰岛素选择来说使用了可选策略，其中变体在两轮筛选后已经选出，这是因为以前的实例(数据未示出)暗示在这个早期阶段富集已经足够这一事实。表4示出了来自于在对胰岛素的选择中源自于第二轮筛选的MiSeq数据的排名靠前的克隆。这些变体中的四个显示出高的序列相似性，因此被选择用于进一步表征。

表4.在针对胰岛素的两轮选择后排名靠前的克隆。被选择用于进一步表征的克隆用粗体标记。

几个其他排名靠前的克隆在针对其他靶的其他选择中也可以发现并因此被忽略。这可能是测序错误、选择期间靶非特异性富集或污染的结果。不论原因如何，对来自于针对不同靶的几个选择的结果进行比较已被证明是排除非靶特异性序列的有用策略。

前导ADAPT变体的结构和稳定性的表征

通过圆二色谱法评估了所有以合理的产率产生的ADAPT变体的热稳定性和二级结构含量。选择表现出预期的α螺旋含量并在222nm和208nm附近具有两个特征性下沉的候选物(图3)用于进一步表征。所述变体的热稳定性可变，解链温度(Tm)在34℃至67℃的范围内(表3)，这意味着与报告Tm为58℃的母体分子ABD035[20]相比，某些选择的变体具有提高的稳定性，而其他变体具有降低的稳定性。几种变体也具有在热变性后重新折叠的能力(表3，图3)。那些表现出高α螺旋含量的变体被进一步评估它们形成不必要的寡聚体的倾向性。这通过在尺寸排阻色谱法柱上分析来进行。具有单峰(在与标准品相比正确的洗脱时间处)的样品被认为是处于单体状态(图4)。具有对应于较大复合体或降解产物的峰的变体从后续的表征中忽略。

靶结合、亲和性和与HSA的同时结合的评估

进一步分析具有足够的α螺旋结构以及在SEC柱上的单体洗脱曲线的变体与它们的靶蛋白以及HSA的结合。与选择中使用的靶抗原的结合使用SPR通过多循环分析来测量，显示出几种结合物具有μM-pM范围内的亲和性。ADAPT变体只有在它们专门对靶分子而不对其他无关靶蛋白表现出结合的情况下才被认为是结合物。分析揭示出19个ADAPT变体以特异性方式结合它们的靶蛋白(所述变体和它们的特征概述在表3中)。在靶结合已被确定后，还评估了所述变体同时与HSA结合的能力。这通过SPR捕获测定法或其中将ADAPT与HSA的饱和条件预温育然后再分析与靶的结合的实验来进行。图2A示出了ADAPT胰岛素_02在单独进样时与胰岛素和HSA两者的结合的代表性实验。此外，所述图还示出了ADAPT胰岛素_02在与HSA的饱和浓度温育后仍可结合胰岛素，这由它不再可以结合HSA这一事实进一步确认(图2B)。来自于针对TNFα、PSA、ANG、MYDGF和胰岛素的选择的总共13个被表征的结合物可以同时结合HSA和它的靶抗原两者。图5含有所述13个变体在捕获测定法中的传感图。

通过尺寸排阻色谱法评估三元复合物的形成

作为最后的表征，评估了在溶液中形成由ADAPT变体与白蛋白以及靶抗原一起组成的三元复合物的能力。在图6中以ADAPT胰岛素_02与其靶一起作为这种情况的实例。在这个色谱图中，与进样二元复合物以及单独的结合配偶体两种情况相比，在允许三元复合物形成时可以看到洗脱曲线的少量迁移。信号重叠被归因于SEC柱的有限分辨率。进一步强化复合物形成这一主张的是，在作为复合体进样时不能检测到游离ADAPT胰岛素_02并且只能检测到少量游离胰岛素。这些数据证实了本发明人可以在SPR结果中看到的情况，即ADAPTs不仅是双特异性的，而且它们也可以同时结合白蛋白和它们的靶两者。

讨论

因此，本发明人设计了一种新的组合文库，其目的是开发除了血清白蛋白之外还针对各种不同新靶的双特异性ADAPT。通过使用噬菌体展示和下游的测序，他们鉴定并评估了针对七种不同靶的双特异性结合物，并证实了其中五种与白蛋白的同时结合。这些单域双特异性结合物为将小分子的优点例如良好的组织渗透和非侵入性给药途径与大得多的分子具有明显更长的体内半衰期的优点相组合提供了机会。

来自于本研究的结果确认，6kDa的小结构域确实可以容纳两个独立的结合表面，并因此与白蛋白结合而不影响它的大小或与其所打算的靶的结合。此外，本发明人还开发了一种将噬菌体展示与下一代测序相结合的高效工作流程，以允许将来针对许多其他靶以时间和成本高效的方式选择这些结合物。

通过使用噬菌体展示和Illumina高通量测序的组合鉴定了所述结合物或双特异性蛋白，以获得关于富集过程的更广泛的视野。噬菌体展示技术带来了令人难以置信的发现，并导致了抗体开发领域中的巨大范式转变，但它并非没有限制。进行重复的筛选轮，每一轮后在细菌细胞中进行扩增步骤，不可避免地引入偏差。此外，一个或几个序列的高富集导致序列多样性的丧失以及因此一些仅仅是不像其他变体繁殖那样快的相关变体的丧失。因此，下一代测序特别适合于噬菌体展示的ADAPT的应用，因为Illumina MiSeq的一个150bp的读出序列覆盖了所述随机化序列的全长。此外，通过将许多单独条形码标记的样品一起合并在单一分析中，本发明人以低成本从许多不同的选择和筛选轮中的每一者获得了数十万个序列。下一代测序的另一个优点当然是数据的深度。查看所选结合物在它们的相应噬菌体合并物中出现的频率(表5)，可以看出在使用传统的Sanger测序方法时，不是所有的这些序列都具有被发现的公平机会。此外，通过在较早的筛选轮进行测序，本发明人可以看出在第2轮后已发现结合变体被充分富集(数据未示出)。为了在真实环境中测试这一点，本发明人对胰岛素进行了选择，并挑选了四个在两轮筛选后已经出现的测序克隆，这事实上得到了三个同时结合物。这证实了以前报告的发现，即在不需繁琐的重复筛选轮的情况下就已鉴定到阳性克隆[24,25]。具体来说，这种策略在没有下一代测序的情况下是不可能的，因为与胰岛素结合的变体仅存在于总噬菌体合并物的不到0.1％中。

尽管下一代测序具有优点，但这种工作流程的主要限制是在鉴定后从噬菌体合并物中回收单个克隆。在这个项目中，本发明人主要使用合成的基因片段工作，如果人们想要筛选许多变体，这不是一种非常成本高效的备选方案。为了克服这一点，本发明人后来也开发了一种基于PCR的策略，其中使用独特但较短的寡核苷酸来挽救单个克隆。综上所述，阳性克隆可以在两轮筛选后已被发现以及可以使用直接的基于PCR的方法回收这一事实，导致在噬菌体展示过程中时间和成本的显著节约。它还消除了与以多重和高通量方式进行许多并行选择有关的一些障碍。

在富集变体的表征后，可以注意到在所有七个不同选择中鉴定到几种双特异性结合物。测量到的亲和性在pM-μM的范围内，血管生成素是唯一的例外，它们是相对快的结合速率以及快的解离速率的结果(表5)。对于具有重要治疗价值的其余分子来说，需要亲和成熟以便最重要的是提高解离速率。本发明人相信，更严格的选择条件可能是提高解离速率并因此提高亲和性的一种方式。本发明人还认为，对每个位置中的氨基酸偏好获得的见解将有助于指导构建新的且甚至更加集中的亲和成熟文库。此外，由于选择这些ADAPT变体背后的理由是它们出现在不同的序列簇中，因此另一种策略可以是更深入地研究鉴定到结合变体的簇。

有趣的是，尽管不论使用何种靶抗原在所有选择中均鉴定到双特异性结合物，但不是所有选择都产生可以同时结合它们的两个靶的结合物。TNFα、PSA、ANG、MYDGF和胰岛素同时被为结合物，但CRP和REN没有。观察这些靶的大小，分子量将影响同时结合的能力这一点并不明显，尽管较大的靶抗原具有引起空间位阻的较高风险这一点似乎有理。然而，似乎同时结合物的保留的序列区更朝向螺旋1迁移，而非同时结合物也在螺旋2中具有更多一致性。由于HSA结合表面主要位于螺旋2附近，因此这可能解释了为什么某些结合物同时结合而其他结合物不能。随着从这些和将来的选择中获得的知识的越来越多，本发明人相信将有可能产生一种更集中的文库，它将在选择众多不仅双特异性而且同时的结合物方面甚至更加成功。

正如本发明人预期的，与母体ABD035相比所有变体均更弱地结合HSA。然而，亲和性仍在低纳摩尔范围内，并且考虑到血清中非常高的HSA浓度，这些亲和性远高于有效的半衰期延长所需的水平。事实上，以前的研究表明，半衰期延长仅微弱地受到亲和性影响，即使是μM范围内的亲和性[26]。

表5.结合靶的ADAPT变体的补充数据。测序数据中的频率源自于TNFα、CRP、PSA、REN、ANG、MYDGF和第4轮和胰岛素的第2轮

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序列表

<110> 霍伯生物技术公司

<120> 双特异性蛋白

<130> P222615CN1-P

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 46

<212> PRT

<213> 智人（Homo Sapiens）

<220>

<221> 杂项特点

<222> (11)..(11)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸，优选地不是Cys、Gly或Pro

<220>

<221> 杂项特点

<222> (15)..(15)

<220>

<221> 杂项特点

<222> (17)..(17)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸

<220>

<221> 杂项特点

<222> (19)..(19)

<220>

<221> 杂项特点

<222> (20)..(20)

<223> Xaa选自Tyr或Phe

<220>

<221> 杂项特点

<222> (23)..(23)

<223> Xaa选自Asn、Asp或Arg

<220>

<221> 杂项特点

<222> (26)..(26)

<223> Xaa选自Asn或Asp

<220>

<221> 杂项特点

<222> (27)..(27)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸，优选地可以选自Asn、Lys或Asp

<220>

<221> 杂项特点

<222> (33)..(33)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸，优选地可以选自Gly、Glu、Ser或Asp

<220>

<221> 杂项特点

<222> (35)..(35)

<220>

<221> 杂项特点

<222> (36)..(36)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸，优选地可以选自Asp、Ala、Ser、Glu或Lys

<220>

<221> 杂项特点

<222> (38)..(38)

<220>

<221> 杂项特点

<222> (39)..(39)

<220>

<221> 杂项特点

<222> (40)..(40)

<223> Xaa选自Glu或His

<220>

<221> 杂项特点

<222> (43)..(43)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸，优选地不是Cys、Gly或Pro，或者可以不存在

<220>

<221> 杂项特点

<222> (44)..(44)

<220>

<221> 杂项特点

<222> (45)..(46)

<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸或者不存在

<400> 1

Leu Ala Glu Ala Lys Val Leu Ala Asn Arg Xaa Leu Asp Lys Xaa Gly

1 5 10 15

Xaa Ser Xaa Xaa Tyr Lys Xaa Leu Ile Xaa Xaa Ala Lys Thr Val Glu

20 25 30

Xaa Val Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Ile Leu Xaa Xaa Xaa Xaa

35 40 45

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 杂项特点

<222> (28)..(33)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> 杂项特点

<222> (40)..(45)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> 杂项特点

<222> (49)..(54)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> 杂项特点

<222> (61)..(66)

<223> n是a、c、g或t

<400> 2

gatgaagccg tcgacgccaa ttcactgnnn nnngcgaaan nnnnngcgnn nnnngaactg 60

nnnnnntatg gcgtgagcga t 81

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 杂项特点

<222> (20)..(21)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> 杂项特点

<222> (29)..(30)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> 杂项特点

<222> (32)..(33)

<223> n是a、c、g或t

<400> 3

ttccacggtt ttcgctttmn naatcagmnn mnnataaaaa tcgctcacgc cata 54

<210> 4

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工构建的寡核苷酸

<400> 4

cggcagcgcc gccagaatat gcagtttcag cgcttccacg ccttccacgg ttttcgc 57

<210> 5

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 杂项特点

<222> (19)..(21)

<223> n是a、c、g或t

<220>

<221> 杂项特点

<222> (28)..(33)

<223> n是a、c、g或t

<400> 5

ttccacggtt ttcgctttnn naatcagnnn nnnataaaaa tcgctcacgc cata 54

Claims

1.一种能够结合人血清白蛋白(HSA)和另一个靶的双特异性蛋白，所述双特异性蛋白包含氨基酸序列LAEAKVLANRX₁₁LDKX₁₅GX₁₇SX₁₉X₂₀YKX₂₃LIX₂₆X₂₇AKTVEX₃₃VX₃₅X₃₆LX₃₈X₃₉X₄₀ILX₄ ₃X₄₄X₄₅X₄₆(SEQ IDNo.1)，其中：

X₁₁、X₁₅、X₁₇、X₁₉、X₂₇、X₃₃、X₃₅、X₃₆、X₃₈和X₃₉彼此独立地是任何氨基酸；

X₄₃、X₄₄、X₄₅和X₄₆彼此独立地不存在或者是任何氨基酸；

X₂₀是Y或F；

X₂₃是N、D或R；

X₂₆是N或D；并且

X₄₀是E或H，

前提是第22、23和26位中的至少一者和第2、3、6、7、9、10、13和14位中的至少一者相对于SEQ ID No.1已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

2.根据权利要求1所述的双特异性蛋白，其中第22、23和26位中的至少两者相对于SEQID No.1已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

3.根据权利要求1或2所述的双特异性蛋白，其中第22、23和26位全部相对于SEQ IDNo.1已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

4.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第2、9和13位中的至少一者相对于SEQ ID No.1已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

5.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第9位相对于SEQ ID No.1已被突变，以获得对所述另一个靶的亲和性。

6.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中：

X₂₇是N、K或D；和/或

X₃₃是G、E、S或D。

7.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中X₃₆是D、A、S、E或K。

8.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第1-15位中的任一氨基酸均不是C。

9.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第19-26位中的任一氨基酸均不是C。

10.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第31-44位中的任一氨基酸均不是C。

11.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第1-15位中的任一氨基酸均不是G。

12.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第19-26位中的任一氨基酸均不是G。

13.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第1-15位中的任一氨基酸均不是P。

14.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第19-26位中的任一氨基酸均不是P。

15.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第31-44位中的任一氨基酸均不是P。

16.根据前述权利要求中的任一项所述的双特异性蛋白，其中第1、4、5、8、12、16、25、31、34和42位各自且独立地是保守的或者被保守替换。

17.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-16中的任一项所述的双特异性蛋白。

18.一种表达盒，其包含根据权利要求17所述的多核苷酸。

19.一种载体，其包含根据权利要求16所述的多核苷酸或根据权利要求17所述的表达盒。

20.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-16中的任一项所述的双特异性蛋白。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述靶分子选自由肿瘤坏死因子α(TNFα)、前列腺特异性抗原(PSA)、C反应蛋白(CRP),肾素(REN)、血管生成素(ANG)、髓源性生长因子(MYDGF)和胰岛素组成的组。

22.根据权利要求20或21中的任一项所述的药物组合物，其还包含可药用载体、赋形剂、稳定剂、添加剂、缓冲溶液和/或溶剂。

23.一种治疗剂，其包含权利要求1-16中的任一项所述的双特异性蛋白和细胞毒性剂，例如细胞毒性分子、肽、蛋白质或放射性核素。

24.根据权利要求23所述的治疗剂，其中所述细胞毒性剂是烷基化药物、蒽环类药物、抗代谢物、长春花生物碱、依托泊苷、抗肿瘤药物或药剂、外毒素、核糖体失活蛋白或蛋白激酶抑制剂。

25.根据权利要求23所述的治疗剂，其中所述细胞毒性放射性核素选自由¹⁷⁷Lu、⁹⁰Y、¹⁸⁸Re、¹⁸⁶Re、¹⁶⁶Ho、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁴Cu、¹⁴⁹Tb、¹⁶¹Tb、⁴⁷Sc、²²⁵Ac、²¹²Pb、²¹³Bi、²¹²Bi、²²⁷Th、²²³Ra、^58mCo、¹³¹I、⁷⁶As、⁷⁷As和²¹¹At组成的组。