CN115697324A - 栗木鞣花素或其类似物用于抗癌功效和增加对免疫检查点抑制剂的应答的用途 - Google Patents

Abstract

描述了在癌症患者中增强或恢复抗肿瘤反应的方法和用途，例如由免疫检查点抑制剂介导的抗肿瘤免疫。这些方法基于施用栗木鞣花素或其类似物，并且特别适用于治疗对免疫治疗如免疫检查点抑制剂治疗具有抗性的肿瘤。栗木鞣花素或其类似物可以以任何合适的形式给药，例如在粗植物或水果提取物如疑拟香桃木提取物中，或在药物组合物中。

Description

栗木鞣花素或其类似物用于抗癌功效和增加对免疫检查点抑 制剂的应答的用途

交叉引用

本申请要求2020年2月20日提交的美国临时专利申请No.62/979327的权益，其通过引用并入本文。

技术领域

本发明总体上涉及癌症领域，更具体地涉及与免疫检查点抑制剂组合治疗癌症。

背景技术

癌症在人类和动物群体中的流行及其在死亡率中的作用意味着对肿瘤有效新药的持续需要。消除肿瘤或减小其大小或减少血液或淋巴结系统中循环的癌细胞的数量可通过多种方式发挥益处；减少疼痛或不适，预防转移，促进手术干预，更重要的是延长生命。

人们已经做出了各种尝试来帮助免疫系统对抗肿瘤。19世纪晚期的一种早期方法涉及对免疫系统的一般刺激，例如通过施用细菌(活的或杀死的)来引发也针对肿瘤的一般免疫应答。

旨在帮助免疫系统特异性识别肿瘤特异性抗原(tumor-specific antigen，TSA)(或肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA))的最近的方法涉及给受试者施用肿瘤特异性的抗原，通常与佐剂结合施用。然而，在癌症中经常观察到对TAA缺乏强大的免疫应答。导致对TAA弱反应的因素之一是诱导抑制免疫反应的抑制途径/信号(通常称为“免疫检查点”)。尽管这种抑制信号对于维持自身耐受和保护组织在免疫系统对致病性感染作出反应时免受损害很重要，但它们也可能减少身体对肿瘤发展的有益反应。

一个免疫检查点抑制剂或阻断剂(immune checkpoint inhibitors or blocker，ICB)靶向诸如CTLA-4、PD-L1和PD-1(Marabelle，OncoImmunology 2016)的抑制性T细胞受体的新治疗时代已经成熟。这一新兴领域甚至获得了2018年诺贝尔医学奖。这些免疫治疗剂在包括肺癌(Reck，NEJM 2016)、黑素瘤(Robert，NEJM 2011)、泌尿生殖系统(Motzer，NEJM 2018)以及头颈部肿瘤(Ferris，NEJM 2016)在内的多种晚期癌症中提供了无与伦比的临床结果。然而，非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者的原发性耐药率为35-44％，而继发性耐药率接近100％(Reck，NEJM 2016)。

因此，需要开发新的方法来增强对ICB的反应，尤其是在对ICB治疗有抗性的癌症中。

本说明书涉及多个文件，其内容通过引用全部并入本文。

发明内容

本申请涉及以下项目1至55：

1、一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述癌症对诸如免疫检查点抑制剂治疗的免疫治疗具有抗性，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗量的栗木鞣花素(castalagin)或其类似物。

2、根据项目1所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(Programmed cell death-1，PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(cytotoxic T-lymphocyte–associated antigen，CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(Programmeddeath-ligand 1，PD-L1)抑制剂。

3、根据项目1或2所述的方法，其中所述抑制剂是阻断抗体。

4、根据项目2或3所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

5、根据项目1至4中任一项目所述的方法，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

6、根据项目5所述的方法，其中所述提取物是疑拟香桃木(Myrciaria dubia)(卡姆果(Camu-Camu))提取物。

7、根据项目1至4中任一项目所述的方法，其中所述方法包括施用包含栗木鞣花素或其类似物的药物组合物。

8、根据项目5至7中任一项所述的方法，其中所述提取物或药物组合物被配制成用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

9、根据项目8所述的方法，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

10、根据项目1至9中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌或乳腺癌。

11、根据项目10所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

12、根据项目10所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(triple-negativebreast cancer，TNBC)。

13、根据项目1至12中任一项所述的方法，进一步包括单独施用有效量的免疫检查点抑制剂或栗木鞣花素。

14、一种增强患有癌症的受试者中的抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗量的栗木鞣花素或其类似物。

15、根据项目14所述的方法，其中所述抗肿瘤免疫应答是抗肿瘤T细胞应答。

16、根据项目14或15所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效治疗量的免疫检查点抑制剂。

17、根据项目16所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂。

18、根据项目16或17所述的方法，其中所述抑制剂是阻断抗体。

19、根据项目17或18所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

20、根据项目14至19中任一项所述的方法，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

21、根据项目20所述的方法，其中所述提取物是疑拟香桃木(卡姆果)提取物。

22、根据项目14至21中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用包含栗木鞣花素或其类似物的药物组合物。

23、根据项目20至22中任一项所述的方法，其中所述提取物或药物组合物被配制成用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

24、根据项目23所述的方法，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

25、根据项目14至24中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肺癌或乳腺癌。

26、根据项目25所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

27、根据项目25所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。

28、栗木鞣花素或其类似物用于治疗患有对诸如免疫检查点抑制剂治疗的免疫治疗具有抗性的癌症的受试者的用途。

29、栗木鞣花素或其类似物在制备用于治疗对诸如免疫检查点抑制剂治疗的免疫治疗具有抗性的癌症的受试者的药物中的用途。

30、根据项目28或29所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂。

31、根据项目28至30中任一项所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是阻断抗体。

32、根据项目28至31中任一项所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

33、根据第28项目至第32项目中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

34、根据项目33的用途，其中所述提取物是疑拟香桃木提取物。

35、根据项目28至32中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于药物组合物中。

36、根据项目33至35中任一项所述的用途，其中所述提取物或药物组合物被配制成用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

37、根据项目36所述的用途，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

38、根据项目28至37中任一项所述的用途，其中所述癌症是肺癌或乳腺癌。

39、根据项目38所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

40、根据项目38所述的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。

41、栗木鞣花素或其类似物用于增强受试者的抗肿瘤免疫应答的用途。

42、栗木鞣花素或其类似物在制备增强受试者抗肿瘤免疫应答的药物中的用途。

43、根据项目41或42所述的用途，其中所述抗肿瘤免疫应答是抗肿瘤T细胞应答。

44、根据项目41至43中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物与免疫检查点抑制剂组合使用。

45、根据项目44所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂。

46、根据项目44或45所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是阻断抗体。

47、根据项目44至46中任一项所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

48、根据项目41至47中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

49、根据项目48所述的用途，其中所述提取物是疑拟香桃木提取物。

50、根据项目41至47中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于药物组合物中。

51、根据项目48至50中任一项所述的用途，其中所述提取物或药物组合物被配制成用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

52、根据项目51所述的用途，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

53、根据项目41至52中任一项所述的用途，其中所述受试者患有皮肤癌(例如黑色素瘤、鳞状细胞皮肤癌)、肺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、肝癌、胃癌或骨髓瘤，优选肺癌或乳腺癌。

54、根据项目53所述的用途，其中所述受试者患有肺癌，优选非小细胞肺癌(NSCLC)。

55、根据项目53所述的用途，其中所述受试者患有乳腺癌，优选三阴性乳腺癌(TNBC)。

本发明的其他目的、优点和特征将在阅读以下仅参考附图作为示例给出的对本发明具体实施例的非限制性描述后变得更加明显。

附图说明

在附图中：

图1A是用于在对抗PD-1治疗敏感的小鼠肿瘤模型中研究单独的卡姆果提取物(CC)的作用以及当与抗PD-2治疗结合时的加性作用的方案示意图。将同系C57BL/6小鼠皮下植入0.8×10⁶MCA-205肉瘤，并在肿瘤大小达到20至35mm²时用抗PD-1单克隆抗体(250μg/小鼠；克隆RMP1-14)或同型对照(克隆2A3)进行腹腔内治疗(i.p.)，每日口服或不口服200mg/kg CC(来自SunFood的卡姆果粉)。

图1B是示出了植入了MCA-205肿瘤的小鼠中肿瘤大小随时间变化的曲线图，小鼠用抗PD-1单克隆抗体(mAb)或同型对照治疗，用或不用CC每日口服灌胃。

图1C是示出了植入了MCA-205肿瘤的小鼠在处死时肿瘤大小的图，小鼠用抗PD-1单克隆抗体或同型对照治疗，用或不用CC每日口服灌胃。

图2A是用于在抗PD-1治疗的小鼠肿瘤模型中研究单独的卡姆果提取物(CC)的作用以及当与抗PD-2治疗结合时的加性作用的方案的示意图。将同系C57BL/6小鼠皮下植入0.5×10⁶E0771乳腺癌肿瘤模型，并在肿瘤大小达到20至35mm²时，用抗PD-1单克隆抗体(250μg/小鼠；克隆RMP1-14)或同型对照(克隆2A3)进行腹腔内(i.p.)治疗，每日灌胃或不灌胃200mg/kg CC(SunFood)。

图2B是示出了在连续注射抗PD-1单克隆抗体(αPD-1)或同型对照(IsoPD-1)，并每日用水或CC口服灌胃后，植入E0771肿瘤的小鼠中肿瘤大小随时间变化的图。

图2C是示出了植入了E0771肿瘤的小鼠在处死时的肿瘤大小的图，小鼠用抗PD-1单克隆抗体或同型对照治疗，用或不用CC每日口服灌胃。

图3A是用于研究小鼠MCA-205肿瘤模型中广谱抗生素(ATB)对CC反应的影响的方案示意图。小鼠在肿瘤植入前2周接受ATB治疗，并继续使用抗生素直到实验结束。将氨苄西林(1mg/ml)、链霉素(5mg/ml)和粘菌素(1mg/ml)(Sigma-Aldrich)的混合物加到无菌饮用水中。溶液和瓶子每周更换3次。通过在处死(扩张(dilatation))时盲肠水平观察到的宏观变化以及在有氧或厌氧条件37℃下在血琼脂平板上培养重悬于无菌NaCl的粪便颗粒48h来确认抗生素活性。如图1A所示进行MCA-205接种和CC处理。

图3B-C是示出了植入MCA-205肿瘤的小鼠中的肿瘤大小随时间的变化的曲线图，小鼠有或没有每日口服灌胃CC、水(对照，图3B)或ATB(图3C)(5只小鼠/组)。

图4A是用于研究CC处理小鼠的粪便微生物群移植(FMT)对小鼠MCA-205肿瘤模型中抗PD-1应答的影响的方案示意图。用CC处理的小鼠粪便在-80℃下冷冻在

试管中。MCA-205皮下植入，当肿瘤大小达到20至35mm²时，用抗PD-1单克隆抗体(250μg/小鼠；克隆RMP1-14)或同型对照(克隆2A3)进行腹腔内(i.p.)治疗，每日口服或不口服NaCl稀释粪便。将100μg粪便重悬在1mL无菌NaCl中。

图4B是示出了植入MCA-205肿瘤的小鼠中在处死时的肿瘤大小的图，小鼠用抗PD-1单克隆抗体或同型对照治疗，其中用或不用NaCl中的稀释粪便每日口服灌胃。

图5A是avatar小鼠实验的实验设计示意图。在SPF C57Bl6小鼠中进行ATB 3天后，分别对来自非小细胞肺癌(NSCLC)患者的无应答者(NR)和应答者(R)的粪便样品进行FMT。两周后，接种MCA-205肉瘤细胞，每日灌胃水或CC，同时连续注射αPD-1或IsoPD-1单克隆抗体。

图5B是示出了每个CC和水组的2个NR和2个R组在FMT后处死(D+17)时的合并平均肿瘤±SEM图。

图5C是示出了基线时(CC灌胃前和植入携带MCA-205的SPF饲养小鼠(n＝10)中14天后)R和NRα多样性的观测属(observed genus)数量的图，这些小鼠用ATB治疗，然后接受来自4名NSCLC患者(n＝2NR，n＝2R)的FMT。示出了平均数±SEM。

图5D是NR和R FMT在植入2周后在属水平上对16s RNA进行测序的β多样性的布雷柯蒂斯(Bray-curtis)图。*p<0.05，***p<0.001。

图5E是在第0天接受NR或R FMT 14天后对小鼠粪便进行16s测序分析后的差异丰度分析结果的火山图图像。

图5F是示出了D+11NR和R FMT组中观测属所表示的α多样性的图。示出了平均数±SEM。*p<0.05，**p<0.01.

图6A是示出了来自MCA-205实验(图1A)中四组小鼠16s rRNA粪便样品的图，以及通过每组中的香农指数测量的α多样性图像。

图6B是示出了在MCA-205模型(n＝10只小鼠/组)中使用用于16s检测的特异性引物在水或CC灌胃6天后对从小鼠粪便提取的DNA进行实时PCR测定的结果图。

图6C是示出了通过布雷柯蒂斯指数测量的β多样性图，比较基线(处理前)与CC或合并的水(αPD1和IsoPD-1)组。

图6D是示出了来自MCA-205实验的样品的16s rRNA微生物组分析图(图1A)和比较了治疗6天后的所有四组的通过布雷柯蒂斯指数测量的β多样性图像。

图6E是比较MCA-205肿瘤中合并CC组与水组的差异丰度分析的火山图图像。使用调整后的p值和p值表示各组中富集的细菌**p<0.01。

图6F是MCA-205肿瘤模型中水/IsoPD-1与CC/IsoPD-2组中差异丰度分析的火山图图像。使用调整后的p值和p值表示各组中富集的细菌**p<0.01。

图6G是MCA-205肿瘤模型中水/IsoPD-1与CC/αPD-1组的差异丰度分析的火山图。使用调整后的p值和p值表示各组中富集的细菌**p<0.01。

图6H是比较E0771肿瘤中水/αPD-1与CC/αPD1组的差异丰度分析的火山图。使用调整后的p值和p值(FDR:0.1)表示各组中富集的细菌*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图6I是E0771模型中水/IsoPD-1与CC/IsoPD-2组中差异丰度分析的火山图图像。

图7A-图7C是示出了在用抗PD-1和/或CC处理的小鼠MCA-205(图7A-图7B)或E0771(图7C)肿瘤模型中通过流式细胞术进行免疫细胞谱分析的结果图。肿瘤和脾脏分别在第一次将抗PD-1单克隆抗体注射到携带MCA-205或E0771肿瘤的小鼠中后9天或19天收集。将切除的肿瘤切成小块，在含有25μg/ml的liberase(Roche)和150UI/mL的DNase1(Roche)的RPMI培养基中37℃下消化30分钟，然后使用100和70μm细胞过滤器(Becton&Dickinson)粉碎和过滤两次。将脾脏在RPMI培养基中粉碎，并通过100μm细胞过滤器进行下级过滤。在膜染色(CD45、CD3、CD4、CD8、PD1、PDL1、ICOS、CXCR3、CCR9、CD45RB、CD62L、CD44)之前，将200万肿瘤细胞或脾细胞与纯化的抗小鼠CD16/CD32(克隆93；eBioscience)预孵育30分钟。对于细胞内染色，使用Foxp3染色试剂盒(eBioscience)。使用活/死可固定的水蓝色死细胞染色试剂盒(Life Technologies)排除死细胞。图7A-图7B是示出了在用抗PD-1单克隆抗体或同型对照治疗(有或没有口服灌胃CC)后，携带MCA-205肿瘤的小鼠的TIL中的TCM CD8⁺T细胞(CD45RB^-CD62L⁺CD8⁺T细胞)和CD8⁺B细胞/Foxp3+CD4+T细胞的比率(Treg)的图。图7C是示出了CC+/-αPD-1治疗后E0771肿瘤模型的TIL中肿瘤内CD8⁺T细胞活化(通过流式细胞术用ICOS⁺CD8⁺T细胞的MFI评估)的图。

图7D是示出了在小鼠MCA-205肿瘤模型中阻断CD8⁺T细胞活性对CC抗肿瘤作用的影响的图。将同系C57BL/6小鼠皮下植入0.8×10⁶MCA-205肉瘤，在肿瘤接种后3天，用150μg/小鼠的抗CD8(克隆：53-5.8，BioXCell)或同型对照治疗小鼠。然后，当肿瘤大小达到20至35mm²时，小鼠每天灌胃给药200mg/kg CC或不给药。

图7E是在MCA-205实验中，在CC/isoPD-1与水/isoPD-2组(n＝1)富集的显著不同的细菌与正相关的TIL细胞计数以及匹配的肿瘤大小之间的成对斯皮尔曼秩相关热图。左图为TIL内，右图为脾细胞。

图7F是在CC/αPD-1与水/αPD-1组富集的显著不同的粪便分类群与通过流式细胞术检测的指示细胞类型的频率以及E0771肿瘤模型中匹配肿瘤大小的成对斯皮尔曼秩相关热图。采用非配对t检验*p < 0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图8A示出了CC提取物的分馏工作流程图。

图8B是完整的卡姆果提取的高效液相色谱保留时间的图，然后是极性馏分和馏分P3以及从栎属植物(oak)提取的栗木鞣花素的HPLD保留时间。

图8C是示出了图7A所示的各种馏分(P、NP、M、INS)在存在或不存在抗PD-1的情况下对携带MCA-205的SPF饲养小鼠(n＝5，处死时的平均+/-SEM肿瘤大小)的影响的图。使用与先前所述相同的实验设计(图1A)，给小鼠每日口服灌胃给药40.18mg/kg或100mg/kg剂量的CC。采用非配对t检验*p<0.05，**p<0.01。

图8D是显示在鼠MCA-205肿瘤模型中存在或不存在抗PD-1的情况下，来自图7C的馏分P的不同亚馏分(P1、P2、P3、P4)的效果的图。使用与前面描述的相同的实验设计(图1A)，给小鼠以0.85mg/kg的浓度或100mg/kg的剂量每天口服灌胃给药(P1、P2、P3和P4)。采用非配对t检验*p<0.05，**p<0.01。

图8E是示出了在小鼠MCA-205肿瘤模型中存在抗PD-1的情况下不同剂量的栗木鞣花素的作用的图(在处死小鼠时表示的平均MCA-205肿瘤大小)。使用与先前描述的相同的实验设计(图1A)，小鼠每天灌胃给药或不给药，增加剂量的栗木鞣花素(从0.11mg/kg至2.56mg/kg)或以100mg/kg的剂量给药CC。值得注意的是，CC中的剂量相当于约0.85mg/kg。对于0mg/kg的阴性对照，小鼠接受水。

图8F是示出了在携带E0771的SPF饲养小鼠(n＝5，处死时的肿瘤大小)中，在抗PD-1存在下，栗木鞣花素的作用的图。使用与前面描述的相同的实验设计(图2A)，在不存在抗PD-1的情况下，给小鼠或不给小鼠每日口服栗木鞣花素(每只小鼠0.85mg/kg)。

图9A是显示在无菌条件下以标准浓度(每只小鼠0.85mg/kg)施用栗木鞣花素对小鼠MCA-205肿瘤模型中肿瘤大小的影响的图。

图9B是显示MCA-205模型中栗木鞣花素灌胃后第5天(基线)和第11天的细菌多样性(#观察属)的图。采用非配对t检验*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.

图9C是在携带MCA-205的SPF饲养小鼠(n＝5)中，每日灌胃栗木鞣花素或水的16srRNA微生物群的布雷柯蒂斯β多样性图像。每一行对应一个小鼠组，每个点对应一个动物。采用非配对t检验*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

图9D是在携带MCA-205的SPF饲养小鼠(n＝5)中，水/IsoPD-1与栗木鞣花素/IsoPD-2组16s测序分析后差异丰度分析结果的火山图图像。

图9E-I示出了NR FMT实验中水和栗木鞣花素组之间16s测序分析后的瘤胃球菌(Ruminococcus)、另枝菌属(Alistipes)、克里斯藤森菌科(Christensenellaceae)R7组、帕拉普雷沃氏菌属(Paraprevotella)和Lachnoclostridium的相对丰度分析结果*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.

图9J是示出了栗木鞣花素处理(0mg/kg、1/4X、0.21mg/kg、1X、0.85mg/kg和3X、2.55mg/kg)对粪便中瘤胃球菌数量影响的图。在以0.21mg/kg、0.85mg/kg和2.55mg/kg的水或栗木鞣花素灌胃6天后，对从小鼠粪便中提取的DNA进行实时PCR，使用瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)特异性引物检测携带MCA-205的SPF饲养小鼠(n＝5)，*p<0.05，**p<0.01.

图10A是示出了栗木鞣花素处理对小鼠MCA-205中免疫细胞分布的影响的图。在无菌和SPF实验中，比较了处死时CC与水组CD8⁺T中央记忆(TCM)细胞(CD45RB-CD62L⁺)的MCA-205TIL的流式细胞术分析。

图10B水/ISoPD-1和栗木鞣花素/ISoPD-2组中肿瘤的CD4、CD8和Foxp3免疫荧光染色的代表性图像。

图10C用免疫荧光染色获得的肿瘤中CD8+/Foxp3⁺CD4⁺比率的箱形图(n＝8/组)*p<0.05。

图10D-图10E是示出了栗木鞣花素处理对小鼠E0771中免疫细胞分布的影响的结果的图。肿瘤(图10D)和脾脏(图10E)中记忆CD8⁺T细胞E0771的流式细胞术分析。

图11A是示出了在存在或不存在抗PD-1的情况下，栗木鞣花素(0.85mg/kg)对用来自1名NR NSCLC患者FMT后的ATB-avatar模型(每日灌胃栗木鞣花素或水并组合αPD1单克隆抗体或IsoPD-1)的肿瘤生长动力学影响的图。使用未配对t检验。示出了平均数±SEM。*p<0.05.

图11B是示出了在ATB和无菌条件下使用来自NRNSCLC患者的粪便样品FMT后栗木鞣花素的治疗效果图。在无菌C57BL/6小鼠(n＝3)中进行了来自无应答者(NR)非小细胞肺癌(NSCLC)患者(n＝1NR)粪便样本的粪便微生物群移植(FMT)。两周后，接种MCA-205肉瘤细胞，每天灌胃水或栗木鞣花素。每一行对应一个小鼠组，每个点对应一只动物。采用非配对t检验。示出了平均数±SEM。

图12A是栗木鞣花素水解成鞣花酸和栗木素(castalin)的示意图，以及鞣花酸经肠道微生物群代谢成尿石素的示意图。

图12B是示出了在小鼠MCA-205肿瘤模型中，使用与先前所述相同的实验设计(图1A)，栗木鞣花素、栎木鞣花素(vescalagin)、鞣花酸、栗木素和尿石素A在处死时对肿瘤大小的影响的图。

图12C是描述用荧光素体外标记栗木鞣花素的图。

图12D是在与大肠杆菌(Escherichia Coli)、布氏瘤胃球菌(Ruminococcusbromii)和多形类杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)共培养物中荧光素标记的栗木鞣花素的流式细胞术实验图像。上图表示未染色的条件，下图表示在37℃下用荧光素-栗木鞣花素染色。

图12E是示出了在37℃和0℃下存在荧光素结合的栗木鞣花素和在100倍浓度下存在未结合的栗木鞣花素的情况下，布氏瘤胃球菌和大肠杆菌的竞争性测定结果的图。每个点代表一个实验。

图12F示出了氟栗木鞣花素处理后的布氏瘤胃球菌、大肠杆菌、多形类杆菌的落射荧光倒置显微镜图像。

图12G-H是描述在每日1.5mg CC治疗的两名非癌症HIV患者中多样性(16s)和瘤胃球菌科的qPCR分析结果的图。图描绘了CC施用前和3周后的多样性(16s RNA)(图12G)和瘤胃球菌科DNA的量(图12H)。

图13是描绘了对小鼠粪便中提取的DNA进行qPCR分析的结果的图，在小鼠粪便中，以0.85mg/kg的水或栗木鞣花素口服灌胃6天后，使用特异性引物检测携带MCA-205的SPF饲养小鼠(n＝10)中的瘤胃球菌科。*p<0.05。

图14是示出了CC和/或栗木鞣花素给药后与水相比增加的细菌列表的表格。

具体实施方式

在描述本发明的上下文中(特别是在以下权利要求的上下文中)使用术语“一个(a)”和“一个(an)”以及“所述(the)”及类似参考应解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或上下文明显矛盾。

除非另有说明，否则术语“包括(comprising)”、“有(having)”、“包括(including)”和“包含(containing)”应被解释为开放式术语(即“包括但不限于”)。

除非本文中另有说明，否则本文中对数值范围的叙述仅旨在作为单独引用落入该范围内的每个单独数值的简写方法，并且每个单独数值被并入本说明书中，如同其在本文中单独叙述一样。这些范围内的所有值子集也被合并到本说明书中，如同它们在本文中被单独叙述一样。

本文中描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行，除非本文中另有指示或上下文明显矛盾。

使用本文中提供的任何和所有示例或示例性语言(“例如(e.g.)”、“例如(suchas)”等)仅旨在更好地说明本发明，并且不构成对本发明范围的限制，除非另有要求。

说明书中的任何语言都不应被解释为指示对本发明的实践至关重要的任何未要求保护的元件。

在此，“约(about)”一词具有其普通含义。术语“约”用于表示值包括用于确定该值的设备或方法的固有误差变化，或包括接近所述值的值，例如在所述值(或值范围)的10％以内。

除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

权利要求的范围不应受到实施例中所述优选实施方案的限制，而是应给出与整个描述一致的最广泛的解释。

本发明包括本文公开的实施方案和特征的任何和所有组合和子组合。

在本文所述的研究中，本发明人已在两种小鼠肿瘤模型中证明，来自疑拟香桃木(卡姆果，CC)浆果的粗提取物能够诱导抗肿瘤反应并增强免疫检查点抑制剂的抗肿瘤反应，但也能够恢复抗药性肿瘤中免疫检查点抑制物的抗肿瘤响应。本发明人还提供了令人信服的证据，证明卡姆果提取物的作用至少部分通过调节肠道微生物群介导，并涉及T细胞介导的免疫应答。对卡姆果提取物的进一步表征鉴定出栗木鞣花素是导致提取物对抗肿瘤反应作用的主要活性成分。

因此在第一方面中本发明提供了一种用于诱导或恢复患有对免疫治疗有抗性癌症(例如免疫检查点抑制剂治疗)的受试者对免疫治疗(例如免疫检查点抑制剂治疗)应答的方法，包括向受试者施用有效治疗量的栗木鞣花素或其类似物。本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物在患有对免疫治疗(例如免疫检查点抑制剂治疗)具有抗性的癌症的受试者中单独诱导抗肿瘤和/或改善或恢复对免疫治疗(如免疫检查点抑制物(ICI)治疗)应答的用途。本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物在制备用于诱导或恢复对患有对免疫治疗(例如，免疫检查点抑制物治疗)有抗性癌症的受试者对免疫治疗(例如免疫检查点抑制剂治疗)应答的药物中的用途。本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物，用于诱导或恢复患有对免疫治疗(例如免疫检查点抑制剂治疗)具有抗性的癌症的受试者对免疫治疗(如免疫检查点抑制物治疗)应答。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗患有对免疫治疗(例如免疫检查点抑制剂治疗)具有抗性癌症的受试者的方法，包括与免疫治疗(如免疫检查点抑制物)组合给予受试者有效治疗量的栗木鞣花素或其类似物。本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物与免疫治疗(例如，免疫检查点抑制剂)组合用于治疗患有对这种免疫治疗(如，免疫检查点抑制剂治疗)具有抗性的癌症的受试者的用途。本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物与免疫治疗(例如，免疫检查点抑制剂)组合用于制备用于治疗对这种免疫治疗(如免疫检查点抑制物治疗)具有抗性的癌症患者的药物的用途。本发明还提供了一种组合治疗，其包括栗木鞣花素或其类似物与免疫治疗(例如，免疫检查点抑制剂)的组合，用于治疗患有对这种免疫治疗(如，免疫检查点抑制剂治疗)具有抗性的癌症的受试者。

在另一方面，本发明提供了一种用于增强有需要的受试者的免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗量的栗木鞣花素或其类似物。本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物用于增强受试者的免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的用途。本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物在制备用于增强受试者的免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的药物中的用途。本发明还提供了用于增强受试者的免疫应答(例如抗肿瘤免疫应答)的栗木鞣花素或其类似物。

在一个实施方案中，上述治疗增加了免疫细胞如肿瘤中T细胞(例如肿瘤浸润淋巴细胞，或TIL)的水平。在一个实施方案中，T细胞是CD4⁺和/或CD8⁺T细胞，例如活化的(ICOS+)和/或记忆性CD4+或CD8+T细胞(中央记忆(T_CM)CD4⁺细胞和/或CD8⁺细胞)。在另一个实施方案中，上述治疗增加了CD8⁺T细胞/Foxp3⁺CD4⁺T细胞(Treg)比率。在另一个实施方案中，上述治疗增加ICOS⁺Foxp3^-CD4⁺T细胞。

在另一个方面，本发明提供了一种用于增加受试者肠道中图14所示的科或属的细菌水平的方法，如产醋菌属(Acetatifactor)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)FCS020组、聚乙酸菌属(Acetitomaculum)、毛螺菌GCA-900066225、阿克曼菌属(Akkermansia)、毛螺菌GCA-900066575、另枝菌属(Alistipes)、毛螺菌UCG-001、厌氧原体属(Anaeroplasma)毛螺菌UCG-004、厌氧孢杆菌属(Anaerosporobacter)、毛螺菌UCG-006、Anaerovorax，乳杆菌属(Lactobacillus)、颤杆菌克属(Oscillibacter)、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、颤螺菌(Oscillospiraceae)UCG-005、双岐杆菌属(Bifidobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)、嗜胆菌属(Bilophila)、副萨特氏菌(Parasutterella)、经黏液真杆菌属(Blautia)、消化球菌科(Peptococcaceae)、丁酸球菌属(Butyricicoccus)、消化链球菌科(Peptostreptococcaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、Candidatus soleaferrea、紫单胞菌科(Porphyromonadaceae)、肉杆菌科(Carnobacteriaceae)、克里斯滕森菌科、罗姆布茨菌属(Romboutsia)、克里斯滕森菌R-7组、罗斯氏菌属(Roseburia)、梭菌目(Clostridiales)vadinBB60组、瘤胃梭菌属(Ruminiclostridium)、狭义梭菌属1(Clostridium sensu stricto 1)、瘤胃梭菌5、粪球菌(Coprococcus)3、瘤胃梭菌9、Eisenbergiella、瘤胃球菌科、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、瘤胃球菌UBA1819、肠球菌科(Enterococcaceae)、瘤胃球菌UCG-005、肠球菌属(Enterococcus)、瘤胃球菌UCG-009、丹毒丝菌科(Erysipelotrichaceae)、瘤胃球菌UCG-014、埃希氏菌属/志贺菌属(Escherichia/Shigella)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)、Family XIII、Sporacetigenium、Family XIII UCG-001、葡萄球菌科(Staphylococcaceae)、黄杆菌属(Flavonifractor)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、Herbinix、坦纳菌科(Tannerellaceae)、Isobaculum、Turicibacter、毛螺菌科、Tyzzerella 3和/或毛螺菌A2，优选Turicibacter、嗜胆菌属、瘤胃球菌科(例如，瘤胃球菌UBA1819)、副萨特氏菌属、狭义梭菌属1、克里斯滕森菌科、另枝菌属、瘤胃球菌属、阿克曼氏菌和/或厌氧原体菌属，包括给受试者施用有效量的栗木鞣花素或其类似物。在另一个方面，本发明提供了栗木鞣花素或其类似物用于增加受试者肠道中的以下科或属的细菌水平的用途，所述科或属为产醋菌属、毛螺菌FCS020组、聚乙酸菌属、毛螺菌GCA-900066225、阿克曼菌属、毛螺菌GCC-900066575、另枝菌属、毛螺菌UCG-001、厌氧原体属、毛螺菌UCG-004、厌氧孢杆菌属，毛螺菌UCG-006、Anaerovorax、乳杆菌属、Angelakisella、Monoglobus、Asaccharospora、颤杆菌克属、双歧杆菌科、颤螺菌UCG-005、双歧杆菌属、帕拉普雷沃氏菌属、嗜胆菌属、副萨特氏菌属、经黏液真杆菌属、消化球菌科、丁酸球菌科、消化链球菌科、Candidatus soleaferrea、紫单胞菌科、肉杆菌科、理研菌科、克里斯滕森菌科、罗姆布茨菌属、克里斯滕森菌R-7组、罗斯氏菌属、梭菌目vadinBB60组、瘤胃梭菌属、狭义梭菌属1、瘤胃梭菌5、粪球菌3、瘤胃梭菌9、Eisenbergiella、瘤胃球菌科、肠杆菌科、瘤胃球菌UBA1819、肠球菌科、瘤胃球菌UCG-005、肠球菌属、瘤胃球菌UCG-009、丹毒丝菌科、瘤胃球菌UCG-014、埃希氏菌属/志贺菌属、瘤胃球菌属、Family XIII、Sporacetigenium、FamilyXIIIUCG-001、葡萄球菌科、黄杆菌属、葡萄球菌属、Herbinix、坦纳菌科、Isobaculum、Turicibacter、毛螺菌科、Tyzzerella3和/或毛螺菌A2，优选Turicibacter、嗜胆菌属、瘤胃球菌科(例如，瘤胃球菌UBA1819)、副萨特氏菌属、狭义梭菌属1、克里斯滕森菌科、另枝菌属、瘤胃球菌属、阿克曼氏菌和/或厌氧原体菌属。在另一个方面，本发明提供了栗木鞣花素或其类似物在制备用于用于增加受试者肠道中的以下科或属的细菌水平的用途，所述科或属为产醋菌属、毛螺菌FCS020组、聚乙酸菌属、毛螺菌GCA-900066225、阿克曼菌属、毛螺菌GCC-900066575、另枝菌属、毛螺菌UCG-001、厌氧原体属、毛螺菌UCG-004、厌氧孢杆菌属，毛螺菌UCG-006、Anaerovorax、乳杆菌属、Angelakisella、Monoglobus、Asaccharospora、颤杆菌克属、双歧杆菌科、颤螺菌UCG-005、双歧杆菌属、帕拉普雷沃氏菌属、嗜胆菌属、副萨特氏菌属、经黏液真杆菌属、消化球菌科、丁酸球菌科、消化链球菌科、Candidatus soleaferrea、紫单胞菌科、肉杆菌科、理研菌科、克里斯滕森菌科、罗姆布茨菌属、克里斯滕森菌R-7组、罗斯氏菌属、梭菌目vadinBB60组、瘤胃梭菌属、狭义梭菌属1、瘤胃梭菌5、粪球菌3、瘤胃梭菌9、Eisenbergiella、瘤胃球菌科、肠杆菌科、瘤胃球菌UBA1819、肠球菌科、瘤胃球菌UCG-005、肠球菌属、瘤胃球菌UCG-009、丹毒丝菌科、瘤胃球菌UCG-014、埃希氏菌属/志贺菌属、瘤胃球菌属、Family XIII、Sporacetigenium、FamilyXIIIUCG-001、葡萄球菌科、黄杆菌属、葡萄球菌属、Herbinix、坦纳菌科、Isobaculum、Turicibacter、毛螺菌科、Tyzzerella3和/或毛螺菌A2，优选Turicibacter、嗜胆菌属、瘤胃球菌科(例如，瘤胃球菌UBA1819)、副萨特氏菌属、狭义梭菌属1、克里斯滕森菌科、另枝菌属、瘤胃球菌属、阿克曼氏菌和/或厌氧原体菌属。

本发明还提供了栗木鞣花素或其类似物，用于增加受试者肠道中的以下科或属的细菌水平，所述科或属为产醋菌属、毛螺菌FCS020组、聚乙酸菌属、毛螺菌GCA-900066225、阿克曼菌属、毛螺菌GCC-900066575、另枝菌属、毛螺菌UCG-001、厌氧原体属、毛螺菌UCG-004、厌氧孢杆菌属，毛螺菌UCG-006、Anaerovorax、乳杆菌属、Angelakisella、Monoglobus、Asaccharospora、颤杆菌克属、双歧杆菌科、颤螺菌UCG-005、双歧杆菌属、帕拉普雷沃氏菌属、嗜胆菌属、副萨特氏菌属、经黏液真杆菌属、消化球菌科、丁酸球菌科、消化链球菌科、Candidatus soleaferrea、紫单胞菌科、肉杆菌科、理研菌科、克里斯滕森菌科、罗姆布茨菌属、克里斯滕森菌R-7组、罗斯氏菌属、梭菌目vadinBB60组、瘤胃梭菌属、狭义梭菌属1、瘤胃梭菌5、粪球菌3、瘤胃梭菌9、Eisenbergiella、瘤胃球菌科、肠杆菌科、瘤胃球菌UBA1819、肠球菌科、瘤胃球菌UCG-005、肠球菌属、瘤胃球菌UCG-009、丹毒丝菌科、瘤胃球菌UCG-014、埃希氏菌属/志贺菌属、瘤胃球菌属、Family XIII、Sporacetigenium、Family XIII UCG-001、葡萄球菌科、黄杆菌属、葡萄球菌属、Herbinix、坦纳菌科、Isobaculum、Turicibacter、毛螺菌科、Tyzzerella 3和/或毛螺菌A2，优选Turicibacter、嗜胆菌属、瘤胃球菌科(例如，瘤胃球菌UBA1819)、副萨特氏菌属、狭义梭菌属1、克里斯滕森菌科、另枝菌属、瘤胃球菌属、阿克曼氏菌和/或厌氧原体菌属。

在一个实施方案中，上述方法或用途增加了Turicibacter科或属的细菌水平。在一个实施方案中，上述方法或用途增加了嗜胆菌科或属细菌的水平。在一个实施方案中，上述方法或用途增加了瘤胃球菌(例如，瘤胃球菌UBA1819)科或属的细菌水平。在一个实施方案中，上述方法或用途增加了副萨特氏菌科或属的细菌水平。在一个实施方案中，上述方法或使用增加了狭义梭杆菌1科或属的细菌水平。在一个实施方案中，上述方法或用途增加了阿克曼氏菌科或属的细菌水平。在一个实施方案中，上述方法或用途增加了厌氧原体菌科或属的细菌水平。在另一个实施方案中，阿克曼菌科或属的细菌是嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermensia muciniphilia)。

在另一个方面，本发明提供了一种用于降低受试者肠道中乳酸杆菌和/或假黄体杆菌(Pseudoflavonifractor)科或属细菌水平的方法，包括向受试者施用有效量的栗木鞣花素或其类似物。在另一方面，本发明提供了栗木鞣花素或其类似物用于降低受试者肠道中乳酸杆菌和/或假黄体杆菌科或属细菌水平的用途。在另一方面，本发明提供了栗木鞣花素或其类似物在制备用于降低受试者肠道中乳酸杆菌和/或假黄体杆菌科或属细菌水平的药物中的用途。本发明还提供了用于降低受试者肠道中乳酸杆菌和/或假黄体杆菌科或属细菌水平的栗木鞣花素或其类似物。

本发明还提供了一种包括栗木鞣花素或其类似物的联合治疗和免疫治疗，如免疫检查点抑制剂。本发明还提供了包含栗木鞣花素或其类似物的联合治疗和免疫治疗(即免疫治疗剂)，例如免疫检查点抑制剂，用于治疗患有癌症(例如，对免疫治疗如免疫检查点抑制物单一治疗具有抗药性的癌症)的受试者的用途。本发明还提供了包括栗木鞣花素或其类似物的组合治疗和免疫治疗(如免疫检查点抑制剂)在制备用于治疗患有癌症(例如，对免疫治疗(例如免疫检查点抑制物单治疗)具有抗药性的癌症)的受试者的药物中的用途。本发明还提供了一种治疗患有癌症(例如，对免疫治疗如免疫检查点抑制剂单药治疗具有抗性的癌症)的受试者的方法，该方法包括向受试者施用有效量的包含栗木鞣花素或其类似物的组合治疗和免疫治疗，如免疫学检查点抑制剂。

栗木鞣花素(分子量934.63，CAS号24312-00-3)具有以下结构：

它是栎木鞣花素(分子量934.63，CAS号36001-47-5)的(33β)异构体，具有以下结构：

栗木鞣花素和栎木鞣花素属于由一系列高水溶性C-葡萄糖苷变体组成的一组特殊的鞣花素。

因此，栗木鞣花素的类似物包括栗木鞣花素糖苷，如grandinin(lyxose)和roburin E(木糖)、木麻黄鞣宁(casuarinin)和栗木素。如WO2014/071438中所述，栗木鞣花素类似物也可以是乙氧基化的栗木鞣花素。栗木鞣花素类似物保留或共享栗木鞣花素的生物活性，更具体地，具有改善免疫应答(抗肿瘤免疫应答)和恢复受试者对免疫治疗如免疫检查点抑制剂治疗的应答的能力。在一个实施方案中，栗木鞣花素类似物是栗木鞣花素盐，优选为药学上可接受的盐。本文使用的术语“盐”表示与无机酸和/或有机酸形成的酸性盐，以及与无机碱和/或无机碱形成的碱性盐。用于药物组合物的盐将是药学上可接受的盐。如本文所用，术语“药学上可接受的盐”指的是保持栗木鞣花素生物活性且在生物学上或其他方面不期望的栗木鞣花素盐。

例如，栗木鞣花素的盐可以是酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、磷酸、乙酸、三氟乙酸、乳酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、戊二酸、富马酸、酒石酸、马来酸、柠檬酸、抗坏血酸、甲磺酸或乙磺酸或樟脑酸。它也可以是碱加成盐，如氢氧化钠或氢氧化钾、三乙胺或叔丁胺。本领域技术人员可以使用标准技术非常容易地形成这种盐。事实上，将药物化合物(即栗木鞣花素)化学改性成盐是药物化学家熟知的技术(例如，见H.Ansel等人，PharmaceuticalDosage Forms and Drug Delivery Systems(6th Ed.1995)at pp.196and 1456–1457；P.Stahl等人,Camille G.(eds.)Handbook of Pharmaceutical Salts.Properties,Selection and Use.(2002)Zurich:Wiley-VCH；S.Berge等人,Journal ofPharmaceuticalSciences(1977)66(1)1–19；P.Gould,International J.of Pharmaceutics(1986)33201–217；Anderson等人,The Practice ofMedicinal Chemistry(1996),Academic Press,NewYork；以及在其网站上的橙皮书The Orange Book中(Food&Drug Administration,华盛顿特区(Washington,D.C.))。例如，可以通过使栗木鞣花素与一定量的酸或碱(例如等量)在介质(例如盐沉淀的介质)中或在水性介质中反应，然后冷冻干燥来形成栗木鞣花素的盐。

栗木鞣花素可以从多种来源中找到或分离，包括水果和/或植物提取物，例如来自疑拟香桃木(卡姆果)浆果的提取物、千屈菜(lythrum salicaria)提取物(参见例如WO/2016/102874)、栎属植物提取物(栎属(Quercus sp.))、栗树提取物(栗属(Castaneasp.))、来自光滑果榆绿木(Anogeissus leiocarpus)和Terminalia avicennoides的茎皮提取物(Shuaibu MN等人,Parasitology Research.103(6):1333-8)、洋蒲桃(Syzygiumsamarangense(Blume))叶提取物(Kamada et al.,Fitoterapia,Volume 129,September2018,Pages 94-101)。分离栗木鞣花素和/或其他C-葡萄糖苷类鞣花素的方法在本领域是公知的，并且在一些上述参考文献以及Araujo等人，Rsc Advances,2015,5,96151-96157and Stine et al.,Methods in Molecular Biology(Clifton,N.J.),2011,670,13-32)中进行了显著描述。

对于本文所述的方法、用途和治疗，可以以提取物(水果和/或植物提取物)的形式使用栗木鞣花素或其类似物，所述提取物包含合适量的栗木鞣花素或其类似物，包括粗提取物或富含栗木鞣花素或其类似物的部分纯化提取物，或者可以是纯化形式(从天然来源分离或合成)。因此，在一个实施方案中，使用或施用包含栗木鞣花素或其类似物的提取物。在另一个实施方案中，使用或施用纯化的或分离的栗木鞣花素或其类似物。在一个实施方案中，使用或施用纯化或分离的栗木鞣花素或其类似物。

本领域技术人员将理解，提取物或纯化的栗木鞣花素或其类似物可与一种或多种载体和/或赋形剂(药学上可接受的载体和/或者赋形剂)混合以获得适合给药给受试者的组合物。

本文使用的“赋形剂”在本领域中具有其正常含义，并且是不是活性成分(药物)本身的任何成分。赋形剂包括例如缓冲剂、粘合剂、润滑剂、稀释剂、填料、增稠剂、崩解剂、增塑剂、包衣、阻隔层制剂、稳定剂、缓释剂和其他组分。本文中使用的“药学上可接受的赋形剂”是指不干扰活性成分生物活性有效性且对受试者无毒的任何赋形剂，即，是一种赋形剂和/或以对受试物无毒的量使用。赋形剂是本领域公知的，并且本发明组合物在这些方面不受限制。载体/赋形剂可适用于例如静脉内、肠外、皮下、肌肉内、颅内、眼眶内、眼内、脑室内、囊内、椎管内、鞘内、硬膜外、脑内、腹腔内、鼻内或肺(例如，气雾剂)给药。通过将具有期望纯度的活性成分与一种或多种任选的药学上可接受的载体赋形剂和/或稳定剂混合(见Remington:The Science and Practice ofPharmacy,by Loyd VAllen,Jr,2012,22^ndedition,Pharmaceutical Press；Handbook of Pharmaceutical Excipients,by Rowe etal.,2012,7^th edition,Pharmaceutical Press)。

在一个实施方案中，制备用于口服给药的栗木鞣花素或其类似物。适于口服给药的制剂可包括(a)液体溶液，如悬浮在稀释剂(如水、盐水或PEG 400)中的有效量的活性剂/组合物；(b)胶囊、小袋或片剂，每个含有预定量的活性成分，如液体、固体、颗粒或明胶；(c)在适当液体中的悬浮液；和(d)合适的乳液。片剂形式可包括乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸酯和其他赋形剂、着色剂、填料、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、增湿剂、防腐剂、调味剂、色素、崩解剂、防腐剂和/或其混合物中的一种或多种，和药物相容载体。锭剂形式可将活性成分包含于香料(例如蔗糖)，以及诸如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶(acacia)乳液、凝胶等包含除活性成分外本领域已知载体的惰性基质中。

在一个实施方案中，将栗木鞣花素或其类似物配制用于肠外给药(例如注射)。例如肠外给药制剂可以包含赋形剂、无菌水或盐水、聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物源油或氢化萘。生物相容性、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧化丙烯共聚物可用于控制化合物的释放。其他潜在有用的栗木鞣花素或其类似物的肠外递送系统包括乙烯-醋酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可植入输注系统和脂质体。吸入制剂可以含有赋形剂(例如乳糖)，或者可以是含有例如聚氧乙烯-9-月桂基醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或者可以是以滴鼻剂或凝胶形式给药的油性溶液。

在一个实施方案中，将栗木鞣花素或其类似物配制用于肠内递送，即递送到肠内。这可以通过本领域公知的方法实现。例如，可以用肠溶剂或材料涂覆或包封栗木鞣花素或其类似物。例如肠溶剂允许在某些pH下或在降解酶或细菌的存在下释放，所述降解酶或微生物特征性地存在于需要释放的胃肠道的特定位置(例如小肠、大肠或其特定区域)。在一个实施方案中，肠道材料是pH敏感的，并且受胃肠道内遇到的pH变化的影响(pH敏感释放)。肠道材料通常在胃pH下保持不溶性，然后允许活性成分在下游胃肠道(例如，通常是十二指肠，有时是结肠)的较高pH环境中释放。在另一个实施方案中，肠道材料包括可酶降解的聚合物，其被存在于下胃肠道，特别是结肠中的细菌酶(例如，碳水化合物加工酶，如糖苷酶、多糖裂解酶和碳水化合物酯酶)降解。这种肠溶材料包括例如纤维素聚合物，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素醋酸酯琥珀酸酯、羟丙甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、乙基纤维素、醋酸纤维素、醋酸纤维酯邻苯二酸酯、醋酸纤维素偏苯三甲酸酯和羧甲基纤维素钠；丙烯酸聚合物和共聚物，优选由丙烯酸、甲基丙烯酸、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸甲酯和/或甲基丙烯酸乙酯和其他甲基丙烯酸树脂形成，其商品名为丙烯酸

(Colorcon，USA)、

(RohmPharma；Westerstadt，Germany)，包括

L30D-55和L100-55(在pH 5.5及以上时可溶)、

L-IOO(在pH 6.0及以上时可溶)、

S(由于较高的酯化程度，在pH7.0及更高时可溶)，以及

NE、RL和RS(具有不同渗透性和膨胀性的水不溶性聚合物)；乙烯基聚合物和共聚物，如聚乙烯吡咯烷酮、乙酸乙烯酯、乙酸乙烯基酯-邻苯二甲酸乙烯酯、醋酸乙烯酯-巴豆酸共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；酶降解聚合物，如偶氮聚合物、果胶、壳聚糖、直链淀粉和瓜尔胶；玉米醇溶蛋白和虫胶。也可以使用不同肠道材料的组合。结肠靶向药物递送的方法在本领域是众所周知的(例如，参见Philip等人，OmanMedJ.2010Apr；25(2):79–87；Lee等人,Pharmaceutics.2020Jan；12(1):68)，并且包括pH依赖性系统(例如，使用pH依赖性聚合物)、受体介导系统、磁驱动系统、延迟或时间依赖性系统、微生物触发的药物递送系统(例如，压力控制结肠递送胶囊(由结肠中遇到的较高压力诱导的药物释放)、渗透控制药物递送以及这些方法的任何组合(例如，使用pH依赖性和微生物触发药物递送的组合方法的结肠靶向递送系统(CODESTM))。

在一个实施方案中，将栗木鞣花素或其类似物配制在由肠溶材料制成的胶囊(肠溶胶囊)中。

可以向受试者施用任何合适量的栗木鞣花素或其类似物。剂量取决于许多因素，包括给药方式。通常，单剂量中所含的栗木鞣花素或其类似物的量将是有效预防、延迟或治疗癌症而不诱导显著毒性的量。

为了预防、治疗或降低给定疾病或病症(癌症)的严重性，栗木鞣花素或其类似物的适当剂量将取决于待治疗的疾病或病症的类型、疾病或病症严重性和病程、是否出于预防或治疗目的施用栗木鞣花素或其模拟物、先前的治疗、患者的临床病史和对栗木鞣花素或其类似物的反应，以及主治医师的判断。栗木鞣花素或其类似物在一次或一系列治疗中适当地给予患者。优选地，期望在体外测定剂量-反应曲线，然后在人类试验之前在有用的动物模型中测定。本发明提供了栗木鞣花素或其类似物的剂量以及包含其的组合物。例如，根据疾病的类型和严重程度，每天体重约为1μg/kg至1000mg/kg(mg/kg)。此外，有效剂量可以是0.5mg/kg、1mg/kg，5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg、55mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、75mg/kg、80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg并且可以以25mg/kg的增量增加至1000mg/kg或可以在上述任意两个值之间。根据上述因素，典型的日剂量可能在1μg/kg至100mg/kg或更大范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，持续治疗直到出现期望的疾病症状抑制(例如，肿瘤体积或肿瘤细胞数量减少)。然而，其他剂量方案可能是有用的。这种治疗的进展很容易通过常规技术和分析进行监测。在一个实施方案中，给予人类受试者的剂量对应于小鼠中至少0.8mg栗木鞣花素每kg的剂量。

本文使用的术语免疫治疗是指增强或强化针对肿瘤细胞的免疫应答的抗肿瘤治疗。免疫治疗包括基于细胞的免疫治疗，例如施用能够识别肿瘤细胞的免疫细胞(如嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞和NK细胞)，或具有肿瘤抗原特异性TCR的T细胞，或能够在其表面表达肿瘤抗原的抗原呈递细胞(APC，如树突状细胞)。免疫治疗还包括施用识别肿瘤细胞表达的抗原并靶向它们以供免疫系统破坏的特异性抗体，或施用刺激免疫应答的细胞因子(干扰素、白细胞介素)。另一种类型的免疫治疗包括施用免疫检查点抑制剂。可以使用不同类型的免疫治疗的组合，例如免疫细胞(CAR T或NK细胞)与免疫检查点抑制剂的联合施用。

本文中使用的术语“免疫检查点抑制剂”(ICI)或“免疫检查点阻断剂”(ICB)指的是阻断或抑制免疫应答的负调节器的活性的试剂。免疫应答(即免疫检查点)的这种负调节物的实例包括腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、B和T淋巴细胞衰减因子(BTLA或CD272)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4、CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、免疫抑制因子(CTLA)和免疫抑制因子、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NADPH氧化酶亚型2(NOX2)、程序性死亡1(PD-1)受体、PD-L1、PD-L2、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、T细胞活化V结构域Ig抑制剂(VISTA)和唾液酸结合免疫球蛋白型凝集素7(SIGLEC7或CD328)和SIGLEC9(CD329)。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4、PD-1或PD-L1的抑制剂。在一个方案中，免疫检测点抑制剂是PD-1的抑制剂，例如抗PD-1抗体。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是PD-L1的抑制剂，例如抗PD-L1抗体。在一个实施方案中，免疫检查点抑制剂是CTLA-4的抑制剂，例如抗CTLA-3抗体。

癌症可以是任何类型的癌症，包括原发性(primary)(或原发(original))癌症、复发性癌症或转移性癌症。癌症的实例包括心脏肉瘤、肺癌、小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌、支气管癌(鳞状细胞癌、未分化小细胞癌、无分化大细胞癌、腺癌)、肺泡(细支气管)癌、支气管腺瘤、肉瘤(如尤因肉瘤、卡波西肉瘤)、淋巴瘤、软骨瘤性错构瘤、间皮瘤；胃肠系统的癌症，例如食管(鳞状细胞癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃腹部(stomach)(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胃(gastric)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌肿瘤、血管活性肠肽瘤(vipoma)，小肠(腺癌、淋巴瘤、类癌、卡波西肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(腺癌，管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌癌)；泌尿生殖道癌症，例如，肾癌(腺癌、肾母细胞瘤、淋巴瘤、白血病)、膀胱和/或尿道癌(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、前列腺癌(腺腺癌、肉瘤)，睾丸癌(精原细胞瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸胎癌、绒毛膜癌、肉瘤、间质细胞癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样肿瘤、脂肪瘤)；肝癌，例如，肝癌(肝细胞癌，HCC)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤、胰腺内分泌肿瘤(如嗜铬细胞瘤、胰岛素瘤、血红素肠肽瘤、胰岛细胞瘤和胰高血糖素瘤)；骨癌，例如，骨肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨外生骨瘤)、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨黏液纤维瘤、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经系统癌症，例如，中枢神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、颅骨癌(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、变形性骨炎)、脑膜瘤(脑膜瘤、脑膜肉瘤、胶质瘤病)，脑癌(星形细胞瘤、髓母细胞瘤、神经胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体]、多形性胶质母细胞瘤，少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤和先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、胶质瘤、肉瘤)；生殖系统癌症，例如妇科癌症、子宫癌(子宫内膜癌)、宫颈癌(宫颈癌、癌前宫颈发育不良)、卵巢癌(卵巢癌[浆液性囊腺癌、粘液性囊腺腺癌、未分类癌]、颗粒膜细胞瘤、睾丸间质细胞瘤、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)，外阴癌(鳞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、阴道癌(透明细胞癌、鳞癌、葡萄状肉瘤(胚胎横纹肌肉瘤)、输卵管癌(癌)；胎盘癌、阴茎癌、前列腺癌、睾丸癌；血液系统癌症，例如，血癌(急性髓细胞白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]；口腔癌，例如唇癌、舌癌、牙龈癌、腭癌、口咽癌、鼻咽癌、窦癌；皮肤癌，例如，恶性黑素瘤、皮肤黑色素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波西肉瘤、痣发育异常痣(moles dysplastic nevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤和瘢痕疙瘩；肾上腺癌：神经母细胞瘤；以及其他组织的癌症，包括结缔组织和软组织、腹膜后和腹膜、眼癌、眼内黑色素瘤和附件、乳腺癌(例如导管乳腺癌)、头颈癌(头颈鳞状细胞癌)、肛门癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌；淋巴结继发性和非特异性恶性肿瘤、呼吸和消化系统继发性恶性肿瘤以及其他部位继发性恶性瘤。

免疫检查点抑制剂已被批准或目前正在对包括肺癌(例如非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌、鳞状细胞肺癌)在内的几种癌症进行III期和IV期临床试验，头颈癌(如头颈鳞状细胞癌、肾细胞癌、胃腺癌、鼻咽肿瘤、尿路上皮癌、结直肠癌、间皮瘤(如胸膜间皮瘤)、乳腺癌(如三阴性乳腺癌、TNBC)、食管癌、多发性骨髓瘤、胃和胃食管交界癌、胃癌、，黑色素瘤、默克尔细胞癌(MCC)、淋巴瘤(例如霍奇金和非霍奇金淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤)、肝癌(如肝细胞癌)、黑色素瘤、卵巢癌、输卵管癌、腹膜肿瘤、膀胱癌、移行细胞癌、前列腺肿瘤和胆道肿瘤(参见，例如，Darvin等人，Experimental&MolecularMedicine volume 50,Article number:165(2018))。因此，在一个实施方案中，癌症是上述癌症之一，免疫检查点抑制剂已被批准或目前正在III期和IV期临床试验中测试。

目前已批准的免疫检查点抑制剂包括抗CTLA-4伊匹单抗(Ipilimumab)(黑色素瘤和肺癌)、抗PD-1纳武单抗(Nivolumab)(黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、结肠癌和肝癌)派姆单抗(Pembrolizumab)(黑色瘤、肺癌、头颈癌、霍奇金淋巴癌、肾细胞瘤和胃癌)，和西米普利单抗(Cemiplimab)(鳞状细胞皮肤癌、骨髓瘤和肺癌)，以及抗PD-L1阿特珠单抗(Atezolizumab)(NSCLC、小细胞肺癌、TNBC)、阿维鲁单抗(Avelumab)(非小细胞肺癌，MCC)和德瓦鲁单抗(Durvalumab)(尿路上皮癌、肺癌)。因此，在一个实施方案中，所述癌症是已经批准免疫检查点抑制剂的上述癌症之一。在另一个实施方案中，癌症对基于PD-1抑制剂的治疗(抗PD-1治疗)具有抗性，并且是黑素瘤、肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈癌、结肠癌、肝癌、胃癌、鳞状细胞皮肤癌或骨髓瘤。

在一个实施方案中，上述治疗包括与免疫检查点抑制剂(即组合治疗)组合使用/施用一种以上(即组合)活性/治疗剂、栗木鞣花素或其类似物。药剂的组合可以以任何常规剂型施用或共同施用(例如，连续、同时、在不同时间)。在本发明的上下文中，共同施用是指在协调治疗过程中施用一种以上的治疗剂以实现改善的临床结果。这种共同施用也可以是共同延伸的，即在重叠的时间段期间发生。例如，可以在施用第二活性剂之前、同时、之前和之后或之后向患者施用第一活性剂。在一个实施方案中，所述药剂可以在单一组合物中组合/配制，并因此同时施用。或者，它们可以以单独的组合物配制，并因此单独施用(同时或不同时间)。

在一个实施方案中，在本发明的方法、用途、组合物、联合治疗中使用/施用的栗木鞣花素或其类似物和/或免疫检查点抑制剂的剂量是次优剂量。本文中使用的“次优剂量”是指本文所述的组合的化合物(栗木鞣花素或其类似物和/或免疫检查点抑制剂)之一的剂量，当在不存在组合的其他化合物的情况下使用时，其产生50％或更少的生物效应，在一个实施方案中为40％或更少，在另一个实施方案中为30％或更少，在另一个实施方案中为20％或更少，在另一实施方案中是10％或更少。因此，使用本文所述化合物的组合，其中组合中的一种或多种化合物以次优剂量使用，相对于在不存在其他化合物的情况下以可比次优剂量的情况下使用该化合物，可实现提高的功效/生物效应。

如本文所用，当组合化合物的效果大于在不存在另一种试剂的情况下每种试剂的效果的理论总和时，实现协同效应。具有协同效应的联合治疗的一个潜在优点是，可以使用较低剂量(例如，次优剂量)的一种或两种药物或治疗，以实现具有低毒性的高治疗活性。在一个实施方案中，联合治疗(栗木鞣花素或其类似物和免疫检查点抑制剂)导致相对于所述药剂的预测理论加性效应的效应增加至少5％。在另一个实施方案中，联合治疗导致相对于药剂的预测理论加性效应的效应增加至少10％。在另一个实施方案中，联合治疗导致相对于药剂的预测理论加性效应的效应增加至少20％。在另一个实施方案中，联合治疗导致相对于药剂的预测理论加性效应的效应增加至少30％。在另一个实施方案中，联合治疗导致相对于药剂的预测理论加性效应的效应增加至少50％。联合使用这些药物的另一个优点是，在其中任何一种药物单独都不会产生效果的情况下，例如对于对免疫检查点抑制剂具有抗性的癌症或肿瘤，可以实现疗效。耐药性意味着单独施用免疫检查点抑制剂不会导致显著的治疗效果，例如肿瘤体积或肿瘤细胞数量的显著减少。已经在患者和/或动物模型中报告了对免疫检查点抑制剂的抗性的癌症的实例包括肺癌(例如NSCLC)、胰腺癌、前列腺癌、黑色素瘤、卵巢癌、尿路上皮癌、肾细胞癌(参见，例如，Fares等人，American Societyof Clinical Oncology Educational Book 39,147-164,2019；Pandey等人，Cancer DrugResist 2019；2:178-188)。

栗木鞣花素或其类似物和/或免疫检查点抑制剂可与一种或多种额外的活性剂或治疗(化疗、放疗、手术、疫苗、免疫治疗等)联合施用/使用，用于治疗靶向疾病/病症(癌症)或用于治疗靶向疾病/病症的一种或多种症状(如止痛药、抗恶心剂等)。在一个实施方案中，栗木鞣花素或其类似物和/或免疫检查点抑制剂与一种或多种化疗剂、免疫治疗(例如，使用CART细胞或CARNK细胞)、抗体、基于细胞的治疗等组合使用。适合与栗木鞣花素或其类似物和/或免疫检查点抑制剂组合使用的化疗剂的实例包括但不限于长春花碱、破坏微管形成的药物(如秋水仙素及其衍生物)、抗血管生成剂、治疗性抗体、EGFR靶向剂、酪氨酸激酶靶向剂(如酪氨酸激酶抑制剂)、过渡金属络合物、蛋白酶体抑制剂、抗代谢剂(如核苷类似物)、烷化剂、基于铂的制剂、蒽环类抗生素、拓扑异构酶抑制剂、大环内酯类、类维甲酸(如全反式维甲酸或其衍生物)；格尔达霉素或其衍生物(如17-AAG)和本领域公认的其他癌症治疗剂。在一些实施方案中，与栗木鞣花素或其类似物和/或免疫检查点抑制剂组合使用的化疗剂包括阿霉素(adriamycin)、秋水仙碱、环磷酰胺、放线菌素、博莱霉素、正定霉素(duanorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、丝裂霉素、甲氨蝶呤、米托蒽醌、氟尿嘧啶、卡铂、卡莫司汀(BCNU)、甲基CCNU、顺铂、依托泊苷、干扰素、喜树碱及其衍生物、胆甾醇苯乙酸氮芥、紫杉烷类药物及其衍生物(例如，紫杉醇(taxol)、紫杉醇(paclitaxel)及其衍生物、紫衫醚(taxotere)及其衍生物等)、托普替康(topetecan)、长春碱、长春新碱、他莫昔芬、皮波苏芬、nab-5404、nab-5800、nab-5801、伊立替康、HKP、沃塔紫杉醇(Ortataxel)、吉西他滨、奥沙利铂、

长春瑞滨、

卡培他滨、

拉帕替尼、索拉非尼、埃洛替尼、埃尔比妥及其衍生物等中的一种或多种。

受试者可以是任何动物，尤其是哺乳动物，如小鼠、大鼠、狗和人。在一个实施方案中，受试者是人。

实施本发明的模式

本发明通过以下非限制性示例更详细地说明。

材料和方法

小鼠研究。所有动物研究均由机构动物护理委员会(CIPA)批准，并按照加拿大动物护理委员会指南进行。使用来自加拿大查尔斯河(Charles River)的7周龄雌性C57BL/6小鼠进行小鼠实验。无菌雌性C57BL/6小鼠购自国际微生物中心无菌设施(加拿大卡尔加里大学)，并在CR-CHUM无菌设施进行维护。

细胞培养、试剂和肿瘤细胞系。本研究使用MCA-205纤维肉瘤细胞和E0771乳腺癌细胞，C57BL/6小鼠的I类MHC H-2^b同系细胞系。MCA-205细胞在37℃下，在5％CO₂存在下，在Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640(Gibco Invitrogen)中培养，其中含有10％胎牛血清(FBS)(Wisent)、2mM L-谷氨酰胺(Wisent)，100IU/ml青霉素/链霉素(Wisent)、1mM丙酮酸钠(Wisent)和MEM非必需氨基酸(Gibco Invitrogen)。E0771细胞在37℃下，在含有10％FBS(Wisent)、2mM L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素/链霉素(Wisent)和1mM丙酮酸钠(WISEST)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium，DMEM)(Gibco Invitrogen)中，在5％CO₂存在下培养。

MCA-205肉瘤和E0771乳腺癌的皮下模型。同系C57BL/6小鼠皮下植入0.8×10⁶个MCA-205或0.5×10⁶个E0771。当肿瘤大小达到20至35mm²时，每三天用抗PD-1单克隆抗体(mAb)(250μg/小鼠；克隆RMP1-14，BioXcell)或同型对照(克隆2A3，BioXcell)腹腔内(i.p.)治疗小鼠四次(或两次流式细胞仪分析，见下文章节)。在治疗开始后，小鼠每天接受以下产品的口服灌胃：疑拟香桃木卡姆果(CC)粗提取物(Sunfood)(每只小鼠200mg/kg)、第1轮提取的组分(P、INT、NP、Insol)(每只鼠40.18mg/kg)、来自第2轮提取的部分(P1、P2、P3和P4)(相当于每只小鼠40.18mg/kg的组分P剂量)，栎木鞣花素(从CC中提取，见下面的分离过程)(每只小鼠0.85mg/kg)、鞣花酸(每只小鼠为0.85mg/kg)(Sigma-Aldrich)、尿石素A(每只鼠为0.85mg/kg)(SigmaAldrich)，栗木素(每只老鼠为0.5mg/kg)(

Sigma-Aldrich)和栗木鞣花素的不同浓度：标准浓度的1/8、1/6、1/4、1/2，标准浓度(每只小鼠0.85mg/kg)、1.5倍(每只小鼠1.25毫克/千克)和3倍增加浓度(每只鼠2.55mg/kg)(

Sigma-Aldrich或从食品级栎属植物中分离，见以下分离过程)。在对照组中，小鼠每天口服灌胃水(100μL)，通过卡尺每三天常规监测肿瘤面积。在耗竭实验中，我们使用抗CD8单克隆抗体(150μg/小鼠；克隆53-6.7，BioXcell)或同型对照(克隆2A3，BioXcell)。

抗生素治疗。对于抗生素(ATB)实验，如前所述(Routy等人，Science，2018年1月5日；359(6371)：91-97.Epub 2017年11月2日)，将含有氨苄西林(1mg/ml)、链霉素(5mg/ml)和粘菌素(1mg/ml)的ATB溶液添加到小鼠的无菌饮用水中，对小鼠进行治疗。通过在COS(含5％羊血的哥伦比亚琼脂)平板上在37℃有氧和无氧条件下每周培养48小时，在脑心输注(BHI)培养基+15％甘油(0.1g/ml)中再悬浮的粪便颗粒来确认抗生素活性。对于SPF饲养小鼠的粪便微生物群移植(FMT)实验，小鼠在FMT前接受3天相同的ATB组合。

粪便微生物群移植(FMT)实验。如之前发表的Routy等人所述，通过在Centre derecherche du Centre hospitalier de l’Universitéde Montréal(CRCHUM)获得适当的伦理批准后，解冻5种不同的非小细胞肺癌(NSCLC)患者的粪便材料，进行FMT。回顾性分析患者记录，以确定其反应状态。FMT后两周，皮下注射肿瘤细胞，用抗PD-1单克隆抗体或同型对照+/-CC、栗木鞣花素或水治疗小鼠，如上所述。

流式细胞术分析。在第一次将抗PD-1单克隆抗体注射到携带MCA-205肿瘤的小鼠中后9天和在第一次向携带E0771肿瘤的小鼠注射抗PD-1mAb后11天收获肿瘤和脾脏。将切除的肿瘤切成小块，在含有25μg/mL的Liberase^TM(Roche)和150UI/mL的DNase I(Roche))的RPMI培养基中37℃下消化30分钟，然后用100和70μm细胞过滤器压碎和过滤两次(FisherScientific)。脾在RPMI培养基中粉碎，随后通过100μm细胞过滤器过滤。用对CD3(145-2C11)、CD4(GK1.5)、CD8(53-6.7)、CD44(IM7)、CD45(30-F11)、CD45RB(C363-16A)、CD62L(MEL-14)、Foxp3(FJK-16s)、CXCR3(CXCR3-173)、CCR9(CW-1.2)、PD-1(29F.1A12)、PD-L1(MIH5)、ICO(7E.17G9)(BD、BioLegend、R&Dand eBioscience)抗小鼠抗体膜染色前，用200万肿瘤细胞或脾细胞在4℃下与纯化的抗小鼠CD16/CD32(克隆93；eBioscience)预孵育30分钟。对于细胞内染色，使用Foxp3染色试剂盒(eBioscience)。使用活/死可固定aqua死细胞染色试剂盒(Life Technologies)排除死细胞。在BD Fortessa16色细胞仪(BD)上采集样本，并使用FlowJo软件(BD)进行分析。

免疫荧光染色。在最佳切割温度(OCT)化合物中保存的小鼠肿瘤被切割成5μm厚切片)并粘附在显微镜载玻片上，并在-80℃下储存。在实验开始时，将载玻片风干并用冷丙酮洗涤。为了防止与生物素的非特异性结合，使用内源性抗生物素-生物素阻断试剂盒(ThermoFisher)。此外，用10％的驴血清孵育组织，以减少背景染色。使用的一级抗体是抗CD4、抗CD8、抗Foxp3。将与AF-488结合的驴抗山羊和驴抗大鼠用作二级抗体，并将载玻片与Cy3链亲和素孵育以检测生物素化抗体。通过用DAPI(ThermoFisher)复染显示细胞核。使用全玻片扫描仪Olympus BX61VS(20x 0.75NA物镜，分辨率为0.3225mm)生成图像。使用Visiomorph软件(Visiopharm)分析图像。

HPLC和LC-MS系统。连接到Agilent Technologies的6120四极LC/MS质谱仪的1260Infinity LC系统分别用于反相色谱(C18)和质谱(MS)。X-Select SCH和HSS柱(Waters)用于HPLC。对于色谱，MilliQ^TM的双组分溶剂系统使用水(溶剂A)和乙腈(ACN)(溶剂B)，各自用0.1％甲酸(FA)酸化。仅报告了负电离数据，因为该极性对于酸化溶液中的多酚是最佳的。

卡姆果(CC)提取。CC中的多酚类物质是根据Fracassetti等人(Food Chem201315；139(1-4):578-88)的程序提取的，并进行了轻微修改。冷冻干燥的CC粗提取物(SunFood)用50％甲醇水溶液(MeOH)以1:15(g:mL)的比例(分析实验)或1:8的比例(制备实验)提取。对悬浮液进行涡流、超声处理，并在室温下孵育60分钟。离心悬浮液，回收上清液。使用90％甲醇水溶液对沉降进行第二次提取。两种提取物的上清液在分析前合并并过滤。

卡姆果(CC)提取物分析和LC-MS峰鉴定。从CC中提取多酚后，将合并提取物注入LC-MS系统进行分析。用于分解样品中组分的溶剂梯度修改自Fracassetti等人，2013。将LC-MS分析的254nm相对保留时间和负离子质谱与Fracasetti等人，2013的CC多酚表征结果进行了比较。根据当前数据与Fracassetti等人，2013报告的数据之间的一致性，初步确定了峰值的身份。

从卡姆果(CC)中分离的活性馏分P(分馏循环1)的鉴定。为了评估CC的哪些组分负责其活性，通过反相色谱和顺序提取产生了四个馏分：极性(P)、中间极性(M)、非极性(NP)和不溶性(INS)。从CC中提取多酚并浓缩至干，然后再溶解在40％ACN:10％MeOH的水混合物中，以溶解大多数多酚。过滤分离不溶性物质并丢弃。用于CC峰鉴定的相同溶剂梯度(上文)用于制备HPLC。每10分钟手动收集一次馏分，共60分钟。然后将馏分冷冻至-80℃并冻干。将30-60分钟的三个馏分合并以产生馏分NP。使用0-10分钟的HPLC柱穿透作为产生馏分P的起始点。简单地说，平行设置四个Strata C18-E固相萃取(SPE)柱(Phenomenex)，并用甲醇进行调节。将冻干的0-10分钟HPLC穿透溶解在MilliQ水中，浓度为10mg/mL。向每个柱中加入5ml样品(10mg/mL)，并收集流动。然后，将9ml 5％ACN加入柱中并收集流动。将从每个柱收集的流量合并并冻干以产生馏分P。通过连续提取CC粗提取物在水中，以去除高极性化合物、50％MeOH和90％MeOH，产生馏分M和INS。馏分M由50％甲醇提取物组成，将其蒸发，然后冷冻干燥。INS馏分由所有提取步骤完成后的干燥沉降组成。

活性馏分P3(分馏循环2)的鉴定。为了评估馏分P的哪些组分负责其活性，生产了4个馏分(P1、P2、P3和P4)。开发了一种新的溶剂梯度，以关注馏分P中所含的极性多酚。梯度方法如下：0分钟时为0％B，30分钟时为16％B，35分钟时为95％B，36-46分钟时为100％B。对于馏分P的生产，溶解在MilliQ水中的0-10分钟的HPLC流穿(分馏循环1)被用作分馏循环2的起点。每分钟手动收集馏分30分钟。通过LC-MS分析每次运行的馏分，然后冻干并组合以产生馏分P1、P2、P3和P4，如下所示：将0-5分钟组合以产生馏分P1，将5-17分钟组合以形成馏分P2，将18-19分钟组合以制备馏分P3，将20-30分钟组合以制成馏分P4。

馏分P3的表征。通过254nm分析LC-MS色谱图的峰积分确定馏分P3中的栗木鞣花素峰的纯度。溶解在MilliQ水中的栗木鞣花素分析标准品用于比较254nm处的保留时间和负离子质谱。将馏分P3和栗木鞣花素分析标准品溶解在D₂O中，用于NMR分析。¹H、¹H-¹H相关谱(COSY)和1H-13C异核单量子相干(HSQC)NMR谱在BrukerAviiiiHD 500MHz NMR谱仪上记录。Matsuo等人在2015年将峰值与栗木鞣花素结构重新分配进行了比较(Org Lett 2015年1月2日；17(1)：46-9.Epub 2014年12月12日)。

卡姆果(CC)和食品级栎属植物中栗木鞣花素和栎木鞣花素的分离。如上所述提取20克冻干CC粉末。使用Strata C18-E SPE柱对粗提取物进行预分馏。简言之，将3ml重新溶解的粗提取物加载到SPE柱上，并加入2ml MilliQ水以除去抗坏血酸。然后，向每个柱中加入9ml 5％ACN，并以3ml批次收集流动。随后通过HPLC从流量中纯化栗木鞣花素和栎木鞣花素。通过LC-MS分析分离物并评估其纯度。

荧光栗木鞣花素的合成、纯化和表征。通过与5/6-羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(荧光素NHS)的酯交换反应，用荧光素单官能化栗木鞣花素。简而言之，将栗木鞣花素溶解于DMF中，然后在三乙胺(2当量)和4-二甲基亚氨基吡啶存在下与荧光素NHS(2当量))反应。用DOWEX50WX8树脂处理后，通过LC-MS分析粗混合物。通过HPLC分离对应于单官能化的荧光栗木鞣花素的峰。布氏瘤胃球菌、大肠杆菌和多形类杆菌细菌在37℃和0℃的荧光素结合的栗木鞣花素存在下以及在100倍浓度的未结合栗木鞣花素存在下染色。

倒置落射荧光显微镜。使用倒置光学显微镜(Ti2，Nikon，Inc.)配置用于落射荧光，并配备高灵敏度CCD摄像机(C14440-20UP，Hamamatsu，Inc.)来获取荧光栗木鞣花素染色的图像。

小鼠粪便中提取基因组DNA。使用Zymobomics DNA Miniprep试剂盒(Zymo研究公司)从粪便颗粒中提取总基因组DNA，并立即在-80℃下储存。该方案包括一个打珠(beadbeating)步骤，以确保细菌DNA的完全回收。使用Nanodrop ND-1000(ThermoFisher)测定DNA浓度和质量。

定量实时PCR(qRT-PCR)。进行定量实时PCR以评估总细菌DNA的相对水平，并使用引物组891F(5’-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGA-3’，SEQ ID NO:1)和1033R(5’-TGCGGGACTTAACCCAACA-3’，SEQ ID NO:2)扩增16S rRNA基因的V6区(Anhê等人，Diabetologia.2018Apr；61(4):919-931)，并使用特异性引物F(5’-TGCGGGACTTAACCCAACA-3’、SEQ ID NO:3)和R(5’-CCTTTACACCCAGTAAWTCCGGA-3’、SEQ ID NO:4)具体评估瘤胃球菌科DNA的相对水平(Garcia Mazcorro JF等FEMS Microbiol Ecol 2012；80(3):624-36)。将提取的DNA(400ng/孔)与500nM的上述引物混合物和1X qPCRBIO-SyGreen-blue-mix-Hi-ROX(PCRBIOSystems)组合。在Applied Biosystems StepOnePlus实时PCR系统(ThermoFisher Scientific)上，在95℃下进行3分钟的qPCR反应，以变性DNA，在95℃5秒、60℃30秒，40个循环的扩增，并在熔融曲线阶段完成。将原始阈值循环(Ct)值与大肠杆菌DNA产生的细菌标准曲线进行比较，用于16s分析，并与瘤胃球菌科的Ruminoccocusbicirculans进行比较，以粗略估计细菌载荷。

16SrRNA基因序列处理和小鼠粪便样品分析。使用16S核糖体RNA(rRNA)基因序列分析分离的DNA，以调查粪便样品中的微生物组成。16S rDNA基因的V3-V4区通过PCR扩增，引物Bakt_341F(5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′，SEQ ID NO:5)和Bakt_805R(5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′，SEQ ID NO:6)适于结合基于转座子的IlluminaNextera接头(adapter)(Illumina)和允许多重双端测序的样本条形码序列。PCR混合物包含1×Q5缓冲液(NEB)、1×Q4增强子(NEB)，200μM dNTP(VWR International)、0.2μM正向和反向引物((Integrated DNATechnologies)、1单位Q5(NEB)和1μl模板DNA，在50μl反应中。PCR循环条件包括在98℃下30秒的初始变性，然后是第一组15次循环(98℃10秒，55℃30秒，72℃30秒钟)，然后是15次循环的第二步(98℃10秒，65℃30秒内，72℃30秒)，最后在72℃下延长2分钟，然后无限期冷却至4℃。每50μl PCR反应使用35μl磁珠(AxyPrep Mag PCR清洁试剂盒；Axygen Biosciences)纯化PCR产物。使用DNA 7500芯片(Agilent Technologies)在生物分析仪2100上控制扩增。以等摩尔比合并样品；如前所述对合并样品进行重新纯化，并使用DNA高灵敏度芯片在Bioanalyzer 2100上检查质量。使用picogreen(Life Technologies)对合并样品进行量化，并将其加载到MiSeq系统(Illumina)。高通量测序在IBIS(Institutde Biologie Intégrative et des Systèmes-UniversitéLaval))进行。

使用R v4.0.0进行基因序列处理和分析。使用DADA2 R软件包v1.16.0(Callahan等人，Nat Methods.2016Jul；13(7)：581-3)从原始扩增子序列生成每个样本的精确扩增子序列变体(ASV)。对Illumina扩增子序列错误的序列进行校正、去重、去除嵌合体，并将双端读长与260个碱基的正向读长和190个碱基(反向读长)合并。根据SILVA参考数据库v138进行分类分配(Quast等人，Nucleic Acids Res.2013Jan；41(Database issue):D590-6)。去除了古细菌和真核生物的残余序列。下游分析通过phyloseq R软件包v1.32.0在属水平上进行(McMurdie等人，2013Apr 22；8(4):e61217)。用香农多样性指数和逆辛普森指数估计α多样性。使用Mann-Whitney检验比较各组之间的这些指标。

统计分析。使用R v4.0.0进行统计分析。使用Mann–Whitney U检验，使用α多样性确定不同组之间的显著差异，该差异显示了每个样本测量的多样性。DESeq2(Love等人，Genome Biol.2014；15(12)：550)用于在属水平上进行差异丰度分析。使用Graphpad获得斯皮尔曼秩相关测试。Prism 8用于比较流式细胞术分析参数之间的连续变量，并与通过差异丰度分析在水中鉴定的重要细菌进行比较水与CC、水/αPD-1与CC/αPD-1、水/αPD-1与栗木鞣花素/αPD-1、水/IsoPD-1与栗木鞣花素/αPD-1组的比较。除非另有说明，当问题涉及两个以上的实验条件时，所有p值均在邦费罗尼校正(Bonferroni correction)后报告。p值为双侧，置信区间为95％，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001.

实施例1：施用卡姆果(CC)提取物增强或恢复小鼠肿瘤模型中的抗PD-1抗肿瘤活性。

为了寻找增强或恢复ICB(例如抗PD-1抗体)抗肿瘤活性的方法，将来自具有独特植物化学特征的亚马逊水果卡姆果(疑拟香桃木)的粗提取物，根据图1A所示的方案，在植入MCA-205肉瘤细胞(抗PD-1敏感)的同系C57BL/6小鼠中与抗PD-2联合施用。本文所述实验中使用的卡姆果提取物是Sunfood公司商业化的卡姆过原料粉末，其从南美雨林的卡姆果浆果中获得，在低温下干燥并研磨成细粉末。

图1B-1C的结果显示，每天单独用CC提取物灌胃显示出抗癌活性(类似于抗PD-1单药治疗)，并增强抗PD-2抗体的抗癌活性，如肿瘤大小的减少所证明的。

接下来根据图2A所示的方案在植入抗PD-1抗性肿瘤(E0771乳腺癌)的小鼠中测试CC的抗肿瘤作用。如预期的，在该模型中，单独施用抗PD-1并未导致肿瘤大小的显著减小，证实了E0771乳腺癌细胞对抗PD-2单一治疗的抗性(图2B-图2C)。类似地，单独施用CC提取物未能显著降低E0771肿瘤大小。然而，在施用抗PD-1和CC提取物后，获得了E0771肿瘤大小的显著减少(图2B-C)，提供了CC提取物具有恢复抗PD-2抗肿瘤反应的能力的证据。

实施例2:卡姆果提取物通过调节肠道微生物群发挥作用

根据图3A所示的方案进行实验，以便更好地理解CC提取物发挥其抗肿瘤作用的机制。首先，图3B-图3C显示，在小鼠MCA-205肿瘤模型中，影响肠道微生物群的广谱抗生素(ATB)的施用完全消除CC提取物的抗肿瘤作用。其次，在无特定病原体(SPF)小鼠中进行粪便微生物群转移(FMT)实验。更具体地，将先前用CC提取物处理的小鼠的粪便转移到植入MCA-205肿瘤的小鼠中，并测定对肿瘤大小的影响(图4A)。如图4B所示，来自先前用CC提取物治疗的小鼠的微生物转移足以在单药治疗或与抗PD-1联合治疗中恢复CC活性。为了探索CC的治疗潜力，通过对两名非小细胞肺癌(NSCLC)应答者(R)患者和两名非应答者(NR)患者进行FMT，对ATB治疗的小鼠进行再克隆。将MCA-205肿瘤接种到这些“替身(avatar)”小鼠模型中，并用CC或水处理小鼠，并添加或不添加αPD-1(图5A)。来自NR患者的FMT赋予了对αPD-1的抗性，而来自R患者的FMT恢复了αPD-2抗肿瘤作用(图5A和5B)。FMT植入后(CC+/-αPD-1之前)，对接受FMT的小鼠的基线微生物群进行了表征。来自R的FMT与更大的α多样性相关(图5C)。分析与NR组相比的β多样性R时，还发现了两个目标聚类(图5D)。有趣的是，在接受来自R的FMT并具有对水/αPD-1敏感的肿瘤的小鼠中，嗜胆菌和瘤胃球菌科UBA1819过度表达(图5E)。

在FMTNR avatar小鼠中，口服补充CC/isoPD-1恢复了CC的抗肿瘤作用(图4B)。此外，CC/αPD-1的组合恢复了用水/αPD-2处理的FMT NR小鼠中受损的αPD1功效。相反，在FMTR avatar小鼠中，CC单独或与抗PD-1组合与水相比，没有显示出任何抗肿瘤反应的进一步增强。在微生物组水平上，CC/isoPD-1增加了FMT NR avatar中的α多样性，但不影响水/isoPD-2中FMT R avatar小鼠的多样性(图5F)。在属水平上，将CC/isoPD-1添加到FMT NR与瘤胃球菌科相对丰度的增加相关(p＝0.055)。

接下来，利用16s rRNA测序对来自图1A中描述的实验的粪便样品进行微生物群分析。16S rDNA基因的V3-V4区通过PCR扩增，使用引物Bakt_341F和Bakt-805R，它们已被适配为结合基于转座子的Illumina Nextera接头(Illumina)。高通量测序在Institut debiologie intégrative et des système(IBIS)进行。数据集过滤(从低-高读长)后，用USEARCH 61(版本6.1.544)将成功通过预处理步骤且有≥97％核苷酸序列同一性的rRNA序列合并到操作分类单元(OTU)。这些实验表明，与水/isoPD-1相比，CC处理与α多样性增加相关，独立于αPD-1治疗(图6A)。使用基于16S rRNA基因的特异性引物的定量实时(qRT PCR)PCR证实，与水相比，CC组中的细菌丰度增加(图6B)。

布雷柯蒂斯测量的β多样性显示，与补充CC前相比，口服CC导致单独的细菌群的形成(p < 0.001)(图6C)，而水/αPD-1的口服灌胃法显示微生物群没有分成不同的类群(p＝0.16)(图6C-图6D)。

差异丰度分析表明，与水组相比，CC组在属水平上的特定细菌特别富集。瘤胃球菌属(经调整的p<0.05)是差异最丰富的细菌，其次是Turicibacter和颤螺菌UCG 005(未经调整的p<0.01)(图6E)。此外，与相应的水组相比，瘤胃球菌是CC/isoPD1和CC/αPD-1组中唯一持续增加的细菌(图6F-G)。

在αPD-1抗性E0771肿瘤模型中使用16s rRNA测序对肠道微生物群进行分析表明，与水/αPD-2相比，CC/αPD-3治疗的小鼠中，Turicibacter、嗜胆菌属、瘤胃球菌科UBA1819、副萨特氏菌、狭义梭菌1、瘤胃球菌属、阿克曼菌属、厌氧原体菌(调整后p<0.05)的过表达(图6H)。有趣的是，在用CC/isoPD-1处理的小鼠中，与水/ISO-1相比，阿克曼菌属和瘤胃球菌也过表达(图6I)。总之，这些结果揭示了细菌种类与CC抗癌效果之间的特定关联。

这些结果提供了令人信服的证据，证明CC提取物的抗肿瘤活性至少部分依赖于肠道微生物群。

实施例3：CC给药对免疫细胞的影响

在小鼠肿瘤模型中进行免疫替代分析，以评估治疗对免疫细胞的影响。单独或与抗PD-1联合施用CC提取物、在MCA-205肿瘤模型中导致中枢记忆(T_CM)CD8⁺的显著上调(图7A)，以及具有抗肿瘤功效的三组中CD8⁺/Foxp3⁺CD4⁺T(Treg)的比率显著增加(图7B)，即CC/isoPD-1、CC/αPD-1或水/αPD-1相对于水/isoPD-1增加。此外，在单独或与抗PD-1联合施用CC提取物的E0771肿瘤模型中也观察到CD8⁺T细胞上ICOS表达的显著增加(图7C)。

为了验证与CC相关的抗肿瘤活性是由CD8⁺T细胞介导的，携带MCA-205的小鼠接受CC和抗CD8⁺单克隆抗体以耗尽CD8⁺亚群，并显示与CC/isoCD8(对照)相比肿瘤生长增加，表明CC的抗肿瘤作用是CD8⁺T细胞依赖性的(图7D)。

接下来研究CC对MCA-205小鼠模型中肿瘤和脾脏的肠道微生物群、肿瘤大小和免疫谱的影响。利用肿瘤内细胞计数免疫标记物和肿瘤大小进行了利用非参数斯皮尔曼相关性在富含CC/isoPD-1的细菌与水/isoPD-2组之间进行的成对比较。MCA-205中CD3⁺T细胞浸润比例、CD8⁺T细胞PD-L1表达、CD8⁺TCM细胞和CD8⁺/Treg比例的增加与CC富集的细菌(如瘤胃球菌属和下调的乳杆菌和假黄体杆菌)(图7E)相关。类似地，在CC/isoPD-1组中，相对于水/isoPD-2，脾细胞中的CD8⁺细胞和CD8+/Treg比率与瘤胃球菌属和颤螺菌UCG 005相关。

同时，在CC+/-αPD-1后对E0771肿瘤中的TIL进行分析。CC与αPD-1组合诱导肿瘤内CD8⁺T细胞活化，与水/αPD-1相比，ICOS⁺CD8⁺T细胞的MFI增加(图7C)。随后对水/αPD-1和CC/αPD-1中上调细菌、免疫标志物和肿瘤大小之间进行了斯皮尔曼等级相关性分析，进一步证明了CD8/Treg比率与ICOS+Foxp3-CD4⁺T细胞浸润的上调之间的正相关，其中瘤胃球菌、嗜胆菌和阿克曼菌的丰度导致肿瘤大小减小(图7F)。

实施例4：作为CC抗肿瘤活性的生物活性化合物的栗木鞣花素多酚提取物的分离

为了鉴定CC提取物中赋予小鼠肿瘤模型中观察到的抗肿瘤活性的特定化合物，根据图8A所示的分馏工作流程图进行CC提取物的HPLC分离。图8B中描绘了完整的卡姆果提取的HPLC保留时间的代表图，随后是极性馏分和馏分P3以及从栎属植物中提取的栗木鞣花素中的HPLC保留时间。使用该技术，CC提取物首先分离为4个馏分(P极性、M-中间/中极性、NP非极性、INS-不溶性)，并在MCA-205肿瘤模型中测试每个组分。图8C所示的结果表明，只有极性部分(P)能够模拟在本实验中以200mg/kg的剂量平行测试的CC提取物的效果。

然后根据保留时间(P1-P4)将活性极性馏分P进一步分离为不同的子馏分，并进行HPLC分析。P1馏分主要由抗坏血酸组成，P2由多酚栎木鞣花素和没食子酸组成，P3由多酚栗木鞣花素组成，P4由不同杂质组成。在MCA-205模型中测试这四个子馏分，发现主要由栗木鞣花素组成的P3是与类似于CC的抗肿瘤作用相关的唯一馏分(图8D)。

为了确认子馏分D中的活性成分确实是栗木鞣花素，使用从商业来源(MilliporeSigma的

参考物质)获得的纯化栗木鞣花素以及使从CC和栎属植物中提取的栗木鞣花素用HPLC进行了额外的测试。不同来源的栗木鞣花素的HPLC证实保留时间与从CC提取的P3馏分相似。使用来自

或来自栎属植物的栗木鞣花素，以CC中存在类似浓度(每只小鼠0.85mg/kg)，在MCA-205以及与αPD-1组合在E0711获得了类似的肿瘤抑制(图8E-图8F)。为了确定栗木鞣花素是否具有剂量依赖性，在小鼠中使用6种不同浓度(标准剂量的1/8至3倍)进行栗木鞣花素口服灌胃。在1/2剂量(0.42mg/kg)下观察到一些抗癌活性，并且仅在标准剂量(0.85mg/kg，图8E)下抗癌活性变得显著。另一方面，3倍增加浓度(每只小鼠2.55mg/kg)不会达到标准剂量。总之，结果表明，栗木鞣花素是CC的生物活性化合物，具有剂量依赖性效应，具有潜在的平台。

实施例5：补充栗木鞣花素可增加肠道微生物群的细菌多样性，并增强T细胞介导的ICI反应

进行了原理证明实验，以确定在无菌条件下栗木鞣花素的微生物群依赖效应。如图9A所示，在无菌条件下进行实验消除了栗木鞣花素抗肿瘤作用。下一步评估用栗木鞣花素/isoPD-1处理的SPF小鼠中栗木鞣花素的微生物组的影响。16S微生物组分析显示，栗木鞣花素后α多样性增加(图9B)以及β多样性观察到的显著类群形成(图9C)。在分类水平上，栗木鞣花素导致阿克曼氏菌属、瘤胃球菌UBA1819、瘤胃球菌属、葡萄球菌属、埃希菌/志贺菌、经黏液真杆菌属和另枝菌属的富集，而来自水组的粪便则富含毛螺菌UCG-001(图9D)。此外，在NR FMT实验中，在对栗木鞣花素组中的瘤胃球菌属、另枝菌属、克里斯滕森菌R7组、帕拉普雷沃氏菌属进行16s测序分析后，观察到相对于水组的相对丰度增加，而在NR FMT实验中的水和栗木鞣花素组之间没有观察到Lachnoclostridium的差异(图9E-图9I)。在剂量依赖性栗木鞣花素实验中，使用瘤胃球菌科特异性引物对粪便进行qRT-PCR(图9J)。相对于水对照，1/4浓度剂量的栗木鞣花素(没有抗肿瘤作用)不会使瘤胃球菌科增加，而补充标准栗木鞣花素剂量或三倍标准栗木鞣花素剂量(具有抗肿瘤作用)，瘤胃球菌类丰度显著增加(图9J)。

为了确定栗木鞣花素对系统免疫应答的影响是否与CC相同，使用了两种技术。首先，MCA-205实验中的流式细胞术分析再次揭示了T_CM CD8⁺T细胞的上调，而在无菌条件下未观察到CC的影响(图10A)。第二，免疫荧光(IF)染色进一步证明了栗木鞣花素/IsoPD-1组中CD8⁺/Foxp3⁺CD4⁺的比率相对于水/IsoPD-1的增加(图10B-图10C)。在E0771细胞中，比较αPD-1同时用或不用CC时，栗木鞣花素与肿瘤微环境和脾细胞中记忆性CD8⁺T细胞(CD44^HighCD62L^-CD8⁺T细胞)的频率增加相关(图10D和10E)。

如先前使用替身小鼠进行的，我们测试了在ATB和GF条件下使用NRNSCLC患者FMT后栗木鞣花素的治疗效果。单独添加栗木鞣花素能够恢复抗肿瘤活性，当与αPD-1组合时具有加性效应(图11A-图11B)。

为了阐明栗木鞣花素改变肠道微生物群组成和改变微生物群的机制，分析了栗木鞣花素及其异构体栎木鞣花素的代谢产物。栗木鞣花素水解成鞣花酸和栗木素，鞣花酸经肠道微生物群进一步转化为尿石素(图12A-图12B)。因此，对其中一些代谢物(鞣花酸和尿石素A)以及栎木鞣花素的潜在抗肿瘤作用进行了单独测试。与栗木鞣花素相反，下游代谢物或异构体没有观察到抗肿瘤作用(图12B)。

使用荧光素结合的栗木鞣花素(图12C)，接下来评估了栗木鞣花素是否能够与瘤胃球菌科相互作用。图12D和12E所示的结果显示，荧光标记的栗木鞣花素与布氏瘤胃球菌的共培养导致大部分(～80％)细菌被标记，而在相同条件下共培养后，大肠杆菌和多行类杆菌的标记率分别为10％和34％。在过量(100x)未标记的栗木鞣花素存在下孵育降低了荧光素标记的布氏瘤胃球菌的比例(图12E)。

图12G和12H表明，在两名非癌症人类患者中，每天给药1.5mg的卡姆果3周，导致多样性(16s)和粪便样品中瘤胃球菌科的出现增加，这与在小鼠中获得的结果一致。

图13示出了在栗木鞣花素实验中对粪便进行的利用瘤胃球菌科特异性引物的重复qRT-PCR实验的结果，证实了栗木鞣花素处理组中瘤胃菌科的增加(图13)。

尽管上文已经通过本发明的具体实施例描述了本发明，但是在不脱离所附权利要求中定义的本发明的精神和性质的情况下，可以对本发明进行修改。在权利要求书中，“包括”一词被用作开放式术语，基本上等同于短语“包括但不限于”。单数形式“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(The)”包括相应的复数，除非上下文另有明确规定。

序列表

<110> 蒙特利尔大学医疗中心

皇家学术促进会/麦吉尔大学

<120> 栗木鞣花素或其类似物用于抗癌功效和增加对免疫检查点抑制剂的应答的用途

<130> G17004-00008

<150> US 62/979,327

<151> 2020-02-20

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 1

tggagcatgt ggtttaattc ga 22

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 2

tgcgggactt aacccaaca 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 3

actgagaggt tgaacggcca 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 4

cctttacacc cagtaawtcc gga 23

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

cctacgggng gcwgcag 17

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成寡核苷酸

<400> 6

gactachvgg gtatctaatc c 21

Claims (57)

1.一种治疗患有对免疫治疗具有抗性的癌症的受试者的方法，包括向所述受试者施用有效治疗量的栗木鞣花素或其类似物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫治疗包括免疫检查点抑制剂治疗。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述抑制剂是阻断抗体。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述提取物是疑拟香桃木(卡姆果)提取物。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用包含栗木鞣花素或其类似物的药物组合物，优选栗木鞣花素。

9.根据权利要求6至8中任一项所述的方法，其中所述提取物或药物组合物被配制用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述癌症是肺癌或乳腺癌。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，进一步包括单独施用有效量的免疫检查点抑制剂或栗木鞣花素。

15.一种用于增强患有癌症的受试者中的抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗量的栗木鞣花素或其类似物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗肿瘤免疫应答是抗肿瘤T细胞应答。

17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效治疗量的免疫检查点抑制剂。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂。

19.根据权利要求17或18所述的方法，其中所述抑制剂是阻断抗体。

20.根据权利要求18或19所述的方法，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的方法，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

22.根据权利要求21所述的方法，其中所述提取物是疑拟香桃木(卡姆果)提取物。

23.根据权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述方法包括施用包含栗木鞣花素或其类似物的药物组合物，优选栗木鞣花素。

24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述提取物或药物组合物被配制用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

26.根据权利要求15至25中任一项所述的方法，其中所述受试者患有肺癌或乳腺癌。

27.根据权利要求26所述的方法，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

28.根据权利要求26所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。

29.栗木鞣花素或其类似物用于治疗患有对免疫治疗具有抗性的癌症的受试者的用途。

30.栗木鞣花素或其类似物在制备用于治疗患有对免疫治疗具有抗性的癌症的受试者的药物中的用途。

31.根据权利要求29或30所述的用途，其中所述免疫治疗包括免疫检查点抑制剂治疗。

32.根据权利要求31所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂。

33.根据权利要求31或32所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是阻断抗体。

34.根据权利要求31至33中任一项所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

35.根据权利要求29至34中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

36.根据权利要求35所述的用途，其中所述提取物是疑拟香桃木提取物。

37.根据权利要求29至34中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物，优选栗木鞣花素，存在于药物组合物中。

38.根据权利要求35至37中任一项所述的用途，其中所述提取物或药物组合物被配制成用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

40.根据权利要求29至39中任一项所述的用途，其中所述癌症是肺癌或乳腺癌。

41.根据权利要求40所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

42.根据权利要求40所述的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。

43.栗木鞣花素或其类似物用于增强患有癌症的受试者的抗肿瘤免疫应答的用途。

44.栗木鞣花素或其类似物在制备用于增强患有癌症的受试者的抗肿瘤免疫应答的药物中的用途。

45.根据权利要求43或44所述的用途，其中所述抗肿瘤免疫应答是抗肿瘤T细胞应答。

46.根据权利要求43至45中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物与免疫检查点抑制剂组合使用。

47.根据权利要求46所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是程序性细胞死亡-1(PD-1)抑制剂、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)抑制剂或程序性死亡配体1(PD-L1)抑制剂。

48.根据权利要求46或47所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是阻断抗体。

49.根据权利要求46至48中任一项所述的用途，其中所述免疫检查点抑制剂是PD-1抑制剂。

50.根据权利要求43至49中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于植物或水果提取物中。

51.根据权利要求50所述的用途，其中所述提取物是疑拟香桃木提取物。

52.根据权利要求43至49中任一项所述的用途，其中所述栗木鞣花素或其类似物存在于药物组合物中，优选为栗木鞣花素。

53.根据权利要求50至52中任一项所述的用途，其中所述提取物或药物组合物被配制成用于将所述栗木鞣花素或其类似物递送到肠中。

54.根据权利要求53所述的用途，其中所述提取物或药物组合物配制成胶囊。

55.根据权利要求43至54中任一项所述的用途，其中所述受试者患有肺癌或乳腺癌。

56.根据权利要求55所述的用途，其中所述肺癌是非小细胞肺癌(NSCLC)。

57.根据权利要求55所述的用途，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌(TNBC)。

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