CN115671528A - 一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片及其制备方法与应用，属于医药技术领域。本发明甲基丙烯酸酐MA与壳聚糖乙酸溶液反应制备得到甲基丙烯酰化壳聚糖CSMA水凝胶前体；将CSMA溶解于光引发剂溶液中，制备得到CSMA微针基质；将微针基质加载在微针模具上，填充模具微腔、模具背衬层，经干燥、紫外光照射后，将微针贴片从微针模具中分离出来，即得所述水凝胶微针贴片。本发明水凝胶微针贴片配方组成合理，制备过程简单、成本低、传输效率高、生物相容性好、机械性能良好、具有可调交联性能及药物缓释性能。

Description

一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片及其制备方法与 应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片及其制备方法与应用。

背景技术

药物递送问题一直以来都是科学研究重点，药物的治疗效果与药物递送方式有着紧密的联系。药物经皮递送能够避免口服药物的首过效应和胃肠道反应，减轻患者的疼痛与恐惧心理，避免产生大量的医疗废物，因而被人们广泛应用于临床。但由于人体皮肤角质层的阻碍，传统药物的经皮递送效率低。因此，开发一种高效的、可穿透皮肤角质层的经皮递药系统具有重要意义。

微针技术是近年来新兴的一种递药系统。微针可以通过穿透角质层，产生微通道，从而可以将其负载的药物递送到皮肤内部。一般微针的高度为25～1000μm，该高度设计可以穿透角质层，但又巧妙地避免接触真皮层下的血管以及神经纤维，因此可以达到微创、无痛、无血的应用效果。

现有的微针种类有固体微针、空心微针、涂层微针、可溶解微针以及近几年发展起来的水凝胶微针。固体微针预处理形成的药物微通道因皮肤愈合导致药效降低，且固体微针存在针体断裂滞留人体带来的安全问题。空心微针需要使用数字化控制微机电系统制备，制作工艺复杂、成本高且存在使用时易堵塞针体等问题。涂层微针通过浸润等方式在针体外载药，存在载药量低以及针尖变钝、摩擦力大，而降低有效药物剂量等问题。可溶解微针由于针体可溶解，在使用过程中存在药物的生物利用度低、背衬层吸附药物等问题。作为一种近几年发展起来的新型微针，水凝胶微针避免了微针制备及应用过程中存在的多种问题，如制作工艺复杂、成本高、针体断裂滞留人体、药物释放过快及药物的生物利用度低等。

作为一种高效的经皮递药系统，水凝胶微针需同时具有高生物相容性、足够的机械强度及较高的药物装载量等多种特性。然而，现存的多数水凝胶材料不能满足上述基本要求。因此，开发一种适合制备水凝胶微针的基质具有重要意义。

水凝胶可分为天然水凝胶与合成水凝胶两大类。天然水凝胶如明胶等具有良好的生物相容性，但利用其制备出的水凝胶微针机械强度弱，不足以穿透人体表皮。此外，部分天然水凝胶水溶性差，需有机溶剂溶解后方可作为微针制备基质，降低了微针的生物相容性。合成水凝胶如甲基丙烯酸类聚合物、PVA-PVP交联物等大多为天然水凝胶改性的产物，这类水凝胶既保留了天然水凝胶良好的生物相容性，同时也被赋予了较强的机械性能以及可调的降解性能。然而部分合成水凝胶微针需要高温等过程的制备，不利于药物的保存。

目前已有团队报道甲基丙烯酸类聚合物具有良好的生物相容性及可调的交联性能，可作为水凝胶微针的基质，如甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化透明质酸。然而，在制备微针的过程中，他们使用的微针基质浓度较高(JournalofControlledRelease,2021,336:537-548)，含水率低，传输效率低。同时，部分基质在制备微针的过程中需要保持较高温度以维持基质流变性(ACSNano,2020,14:5901-5908)，使得微针制备过程复杂化。因此，开发一种制备过程简单、传输效率高、生物相容性好、机械性能良好、具有可调交联性能且可达到较高的载药量的水凝胶微针基质至关重要。

近年来，甲基丙烯酰化材料已在生物医学领域得到了广泛应用，如可注射水凝胶、微球材料、3D细胞打印基质、载药水凝胶等。然而，至今仍没有将甲基丙烯酰化壳聚糖材料应用于水凝胶微针制备及药物递送应用的相关报道。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片及其制备方法与应用。本发明水凝胶微针贴片配方组成合理，制备过程简单、成本低、传输效率高、生物相容性好、机械性能良好、具有可调交联性能及药物缓释性能。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片，所述微针贴片是由甲基丙烯酸酐MA、密度≥0.4g/ml的高密度壳聚糖CS和光引发剂制得的微针基质，加载在微针模具上，经紫外光固化得到的。

优选地，所述高密度壳聚糖密度≥0.6g/ml。

本发明还提供了一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的制备方法，包括以下步骤：

(1)将甲基丙烯酸酐MA与高密度壳聚糖CS乙酸溶液反应，制得甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶前体CSMA；

(2)将步骤(1)的CSMA溶解于光引发剂溶液中，得到CSMA微针基质；

(3)将步骤(2)的CSMA微针基质加载在微针模具上，填充模具微腔、模具背衬层，经干燥、紫外光照射后，将微针贴片从微针模具中分离出来，即得所述水凝胶微针贴片。

优选地，步骤(1)中，所述甲基丙烯酸酐MA与高密度壳聚糖乙酸溶液的加入量为：(0.08～2.8):40v/v，所述高密度壳聚糖乙酸溶液浓度为0.1～5％w/v。

优选地，步骤(2)中，所述光引发剂为光引发剂LAP、光引发剂907、光引发剂IHT-PI659或光引发剂I2959其中至少一种。

进一步优选地，所述光引发剂的浓度为0.1～1％w/v。当光引发剂浓度进一步增大，超过本发明最大值时，虽然可以制备出微针，但是随着光引发剂的浓度增大，微针的细胞毒性越大。

优选地，所述CSMA微针基质浓度为2～5％w/v。当CSMA微针基质浓度低于本发明给出的下限数值2％，或者高于本发明给出的上限数值5％时，无法制备出相应的微针。

优选地，步骤(3)中，所述微针模具为聚二甲基硅氧烷PDMS模具。

进一步优选地，所述聚二甲基硅氧烷PDMS模具具有棱锥形孔状阵列，所述阵列棱锥底部边长为20～1000μm，每个针尖高度为25～1000μm。

本发明一个优选的实施例是，微针针体是四棱锥的形式，底部是300μm×300μm的正方形。

更进一步地，本发明采用抽真空法填充PDMS模具的微腔。

本发明还提供了所述甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片在药物递送方面的应用。

壳聚糖(CS)是一种天然的碱性多糖，具有良好的生物相容性及抗菌性能。未修饰的CS由于存在分子间/分子内氢键，溶解性低，使其在生理环境中的应用受限。当用甲基丙烯酸酐(MA)对CS进行改性时，不仅可以通过破坏其分子间/分子内氢键增加溶解度，而且赋予了CS可紫外交联的特性。

目前，本领域未见直接将CSMA水凝胶作为微针基质制备微针贴片的报道。

中国专利CN201811419778.0“一种高强度甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶的制备方法”中提及：为了解决壳聚糖的水溶性，将壳聚糖乙酸溶液与甲基丙烯酸酐反应，得到可UV光交联的水溶性甲基丙烯酰化壳聚糖；为了提高其交联密度，加入了丙烯酰化F127作为交联剂，制成了甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶，保证了水凝胶结构的稳定性。该发明中指出，由于甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶存在结构不稳定问题，因此需要加入丙烯酰化F127作为交联剂。

中国专利CN201810636701.2“一种可快速溶胀的自粘附微针贴片及其制备方法”提及：将甲基丙烯酸酐修饰壳聚糖，合成出丙烯酸酯化的亲水性聚合物，再将儿茶酚类化合物与其进行二次反应，合成出儿茶酚修饰的丙烯酸酯化的亲水性聚合物，最后将其制备成微针贴片。由于微针贴片在制备过程中需要进行紫外光照射，儿茶酚修饰的丙烯酸酯化的亲水性聚合物制成的微针，不会产生微针破碎的风险，不会遗留在皮肤中。该发明中指出，甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶直接作为微针基质制备成微针贴片存在易碎的问题，因此需要使用儿茶酚进行修饰。

由此可见，考虑到上述问题，本领域技术人员不会选择直接将CSMA水凝胶作为微针基质制备微针贴片。

本发明在CSMA水凝胶微针贴片的制备过程中，也遇到了重重困难，采用普通壳聚糖(粘度100-200mpa·s)制备的产品不能形成良好的针形，并且机械性能差。在机械力试验中，当达到0.2N的力时，微针从620μm高度被压缩了500μm左右，几乎都被压弯。

一般来说，通常粉状的普通壳聚糖的堆积密度为0.15～0.30g/ml，发明人尝试将普通壳聚糖更换为密度≥0.4g/ml的高密度壳聚糖后，意外地发现，不仅能够成功制备出CSMA水凝胶微针贴片，并且制备的微针贴片稳定性、机械性能均良好，克服了本领域长期存在的问题。

本发明通过CSMA微针贴片的机械强度实验，证明该微针具有良好的机械性能；通过小鼠皮肤刺入实验，证明该微针可以很好的刺入皮肤；通过溶胀性能测定，证明该微针具有良好的溶胀性能；通过载药微针的体外透皮扩散实验，证明该微针传输效率高，具有可调交联性能及药物缓释性能；通过溶血率测试、细胞毒性试验，证明CSMA具有良好的生物相容性。因此，本发明的CSMA微针贴片能够应用于药物或大分子蛋白的递送治疗疾病、提取组织间液用于疾病或有毒物质的检测方面。

有益效果：

(1)本发明采用密度≥0.4g/ml的高密度壳聚糖，与甲基丙烯酸酐和光引发剂制得了甲基丙烯酰化壳聚糖微针基质，进而制备得到了甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片，该产品具有良好的形貌特征，可看出排列整齐的棱锥形微针贴片，稳定性、机械性能均良好。

(2)本发明制备方法中甲基丙烯酰化壳聚糖作为微针基质时，使用浓度仅为2～5％，微针制备过程简便，不需要受到特定条件的限制，成本低。

(3)本发明通过拉力仪检测出CSMA水凝胶微针贴片机械性能强，刺入皮肤后，显示出高效的药物透皮扩散效率，在24小时内将药物通过皮肤缓慢递送进入人体，并在药物递送完全后可完整拔出，生物安全性良好。同时，本产品生物相容性好，具有可调交联性能以及溶胀性能，并可达到较高药物释放效率。

附图说明

图1为实施例1中CSMA水凝胶前体红外表征图；

图2为实施例1中CSMA水凝胶前体核磁氢谱表征图；

图3为实施例1中CSMA水凝胶在不同紫外照射时间下的扫描电子显微镜(SEM)图；

图4为实施例1中CSMA水凝胶微针的光学显微镜图；

图5为对比例1中CSMA水凝胶微针的光学显微镜图；

图6为实施例6中载药CSMA水凝胶微针光学显微镜图；

图7为实施例1的CSMA空白水凝胶微针与实施例6的载药水凝胶微针的机械力测试对比图；

图8为实施例1中CSMA水凝胶微针放置50天后的光学显微镜图；

图9为实施例1中CSMA水凝胶微针放置50天前后的机械力测试对比图；

图10为实施例1中CSMA水凝胶微针的皮肤插入图；

图11为实施例1中CSMA水凝胶微针溶胀结果图；

图12为实施例6中载药CSMA水凝胶微针的药物累积释放结果图；

图13为实施例1中CSMA溶血率测试结果图；

图14为实施例1中CSMA细胞相容性测试结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的制备

材料：高密度壳聚糖CAS：9012-76-4，脱乙酰度85％，密度≥0.6g/ml，品牌麦克林Macklin；

甲基丙烯酸酐CAS：760-93-0，品牌麦克林Macklin；

仪器：红外光谱仪(ShimadzuCorp,Japan)、核磁氢谱仪(300Ultrashied,Bruker公司)

(1)甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)水凝胶前体的制备

将高密度壳聚糖(CS)溶解在1％(v/v)的乙酸溶液得到1％(w/v)的CS溶液。将0.7ml甲基丙烯酸酐(MA)缓慢滴加至40ml1％(w/v)CS溶液中，在60℃下搅拌6h得到CSMA溶液。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液，调节pH至中性，终止反应，把制备好的溶液装入透析袋，透析4-6天，放入冻干机冻干得白色海绵状产物，待用。

CSMA红外表征：分别取10mgCS和CSMA溶于1ml水中，使其溶解，在溴化钾固体中逐滴加入上述溶液，45℃烘干。再加少量溴化钾研细混匀，压片，用红外光谱仪测量。如图1所示，为CS和CSMA的红外图谱表征对比图。在图中可看出CSMA在1654cm^-1、1536cm^-1以及1315cm^-1波长处存在峰形，而CS不存在峰，此三处峰为酰胺键的特征峰。因此，可以从红外图谱中得知CSMA中形成了新的酰胺键。

CSMA核磁氢谱表征：分别取CS、CSMA放入含2％氘代盐酸的氘代水溶液中溶解，用核磁氢谱仪测定。如图2所示，为CS和CSMA的核磁氢谱表征对比图。在图中可看出在5-6ppm处CSMA出现了双峰，而CS不存在峰，该峰为MA中烯烃的氢。

结合图1、图2，可以证明成功合成了CSMA。

(2)CSMA微针基质的制备

在室温下避光称取光引发剂I2959，溶于去离子水，50℃搅拌得到0.5％(w/v)的I2959溶液。再称取30mgCSMA，溶于1mlI2959溶液中，室温充分搅拌均匀。得到3％(w/v)CSMA微针基质。

(3)CSMA水凝胶微针贴片的制备

利用棱锥形孔状阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具制备微针贴片。所有的阵列包含10×10个针头，棱锥底部边长为300μm，每个针尖高度为620μm，每个针头间距为600μm。微针针体是四棱锥的形式，底部是300μm×300μm的正方形。

吸取200μL制备好的CSMA微针基质滴加在PDMS模具上，在0.9Mpa下抽真空10min，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液及气泡。再吸取1mL制备好的CSMA微针基质滴加在PDMS模具上填充模具背衬层，干燥24h。干燥完成后，使用紫外光照射60s，将微针贴片从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。

图3为CSMA水凝胶在不同紫外照射时间下的SEM图。从图中可以看出：紫外照射时间不同，CSMA水凝胶孔隙率不同，并随着紫外照射时间的增加，孔隙率越来越小，交联度越来越强。这表明MA对CS的改性，赋予了CS的可紫外交联性。

图4为CSMA水凝胶微针的光学显微镜图。从图中可以看出：该微针贴片是排列整齐的棱锥形微针贴片，具有良好的形貌特征。

实施例2甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的制备

材料、仪器：同实施例1。

(1)甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)水凝胶前体的制备

将高密度壳聚糖(CS)溶解在1％(v/v)的乙酸溶液得到1％(w/v)的CS溶液。将0.35ml甲基丙烯酸酐(MA)缓慢滴加至40ml1％(w/v)CS溶液中，在60℃下搅拌6h得到CSMA溶液。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液，调节pH至中性，终止反应，把制备好的溶液装入透析袋，透析4-6天，放入冻干机冻干得白色海绵状产物，待用。

经红外、核磁氢谱检测证明成功合成了CSMA。

(2)CSMA微针基质的制备

在室温下避光称取光引发剂LAP，溶于去离子水，50℃搅拌得到0.1％(w/v)的LAP溶液。再称取20mgCSMA，溶于1mlLAP溶液中，室温充分搅拌均匀。得到2％(w/v)CSMA微针基质。

(3)CSMA水凝胶微针贴片的制备

利用棱锥形孔状阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具制备微针贴片。所有的阵列包含10×10个针头，棱锥底部边长为200μm，每个针尖高度为25μm，每个针头间距为600μm。

吸取200μL制备好的CSMA微针基质滴加在PDMS模具上，在0.9Mpa下抽真空10min，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液及气泡。再吸取1mL制备好的CSMA微针基质滴加在PDMS模具上填充模具背衬层，干燥24h。干燥完成后，使用紫外光照射60s，将微针贴片从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。

实施例3甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的制备

材料、仪器：同实施例1。

(1)甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)水凝胶前体的制备

将高密度壳聚糖(CS)溶解在1％(v/v)的乙酸溶液得到1％(w/v)的CS溶液。将1.4ml甲基丙烯酸酐(MA)缓慢滴加至40ml1％(w/v)CS溶液中，在60℃下搅拌6h得到CSMA溶液。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液，调节pH至中性，终止反应，把制备好的溶液装入透析袋，透析4-6天，放入冻干机冻干得白色海绵状产物，待用。

经红外、核磁氢谱检测证明成功合成了CSMA。

(2)CSMA微针基质的制备

在室温下避光称取光引发剂907，溶于去离子水，50℃搅拌得到1％(w/v)的907溶液。再称取50mgCSMA，溶于1ml907溶液中，室温充分搅拌均匀。得到5％(w/v)CSMA微针基质。

(3)CSMA水凝胶微针贴片的制备

利用棱锥形孔状阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具制备微针贴片。所有的阵列包含10×10个针头，棱锥底部边长为500μm，每个针尖高度为800μm，每个针头间距为600μm。

吸取200μL制备好的空白微针基质滴加在PDMS模具上，在0.9Mpa下抽真空10min，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液及气泡。再吸取1mL制备好的空白微针基质和载药微针基质分别滴加在PDMS模具上填充模具背衬层，干燥24h。干燥完成后，使用紫外光照射60s，将微针贴片从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。

实施例4甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的制备

材料：高密度壳聚糖CAS：9012-76-4，脱乙酰度85％，密度≥0.4g/ml，浙江金壳生物化学有限公司；

仪器：同实施例1。

(1)甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)水凝胶前体的制备

将高密度壳聚糖(CS)溶解在1％(v/v)的乙酸溶液得到0.1％(w/v)的CS溶液。将0.08ml甲基丙烯酸酐(MA)缓慢滴加至40ml0.1％(w/v)CS溶液中，在60℃下搅拌6h得到CSMA溶液。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液，调节pH至中性，终止反应，把制备好的溶液装入透析袋，透析4-6天，放入冻干机冻干得白色海绵状产物，待用。

经红外、核磁氢谱检测证明成功合成了CSMA。

(2)CSMA微针基质的制备

在室温下避光称取光引发剂907，溶于去离子水，50℃搅拌得到0.5％(w/v)的907溶液。再称取40mgCSMA，溶于1ml907溶液中，室温充分搅拌均匀。得到4％(w/v)CSMA微针基质。

(3)CSMA水凝胶微针贴片的制备

利用棱锥形孔状阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具制备微针贴片。所有的阵列包含10×10个针头，棱锥底部边长为20μm，每个针尖高度为80μm，每个针头间距为600μm。

吸取200μL制备好的空白微针基质滴加在PDMS模具上，在0.9Mpa下抽真空10min，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液及气泡。再吸取1mL制备好的空白微针基质和载药微针基质分别滴加在PDMS模具上填充模具背衬层，干燥24h。干燥完成后，使用紫外光照射60s，将微针贴片从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。

实施例5甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的制备

材料：高密度壳聚糖CAS：9012-76-4，脱乙酰度85％，密度≥0.8g/ml，品牌麦克林Macklin；

甲基丙烯酸酐CAS：760-93-0，品牌麦克林Macklin

仪器：同实施例1。

(1)甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)水凝胶前体的制备

将高密度壳聚糖(CS)溶解在1％(v/v)的乙酸溶液得到5％(w/v)的CS溶液。将2.8ml甲基丙烯酸酐(MA)缓慢滴加至40ml1％(w/v)CS溶液中，在60℃下搅拌6h得到CSMA溶液。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液，调节pH至中性，终止反应，把制备好的溶液装入透析袋，透析4-6天，放入冻干机冻干得白色海绵状产物，待用。

经红外、核磁氢谱检测证明成功合成了CSMA。

(2)CSMA微针基质的制备

在室温下避光称取光引发剂907，溶于去离子水，50℃搅拌得到1％(w/v)的907溶液。再称取50mgCSMA，溶于1ml907溶液中，室温充分搅拌均匀。得到5％(w/v)CSMA微针基质。

(3)CSMA水凝胶微针贴片的制备

利用棱锥形孔状阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具制备微针贴片。所有的阵列包含10×10个针头，棱锥底部边长为1000μm，每个针尖高度为1000μm，每个针头间距为600μm。

吸取200μL制备好的空白微针基质滴加在PDMS模具上，在0.9Mpa下抽真空10min，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液及气泡。再吸取1mL制备好的空白微针基质和载药微针基质分别滴加在PDMS模具上填充模具背衬层，干燥24h。干燥完成后，使用紫外光照射60s，将微针贴片从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。

对比例1普通壳聚糖制备的CSMA水凝胶微针贴片

材料：普通壳聚糖CAS：9012-76-4，脱乙酰度≥95％，粘度100-200mpa·s，品牌麦克林Macklin；

甲基丙烯酸酐CAS：760-93-0，品牌麦克林Macklin；

制备方法同实施例1。

实验结果：采用普通壳聚糖制备的CSMA水凝胶微针贴片形貌差，不能形成良好的针形，其光学显微镜图见图5。经机械力试验发现，当达到0.2N的力时，微针高度从620μm被压缩了500μm左右，几乎都被压弯。

由实施例1-5与对比例1可以知道，发明人将普通壳聚糖更换为密度≥0.4g/ml的高密度壳聚糖后，意外地发现，成功制备出了形貌良好的CSMA水凝胶微针贴片。此外，发明人发现微针的制备与最终干燥后能留存下来的微针基质有关，采用密度越高的壳聚糖，其制备的微针基质的留存率越大。

实施例6载药甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的制备

材料、仪器同实施例1。

(1)甲基丙烯酰化壳聚糖(CSMA)水凝胶前体的制备

将高密度壳聚糖(CS)溶解在1％(v/v)的乙酸溶液得到1％(w/v)的CS溶液。将1.4ml甲基丙烯酸酐(MA)缓慢滴加至40ml1％(w/v)CS溶液中，在60℃下搅拌6h得到CSMA溶液。反应结束后，加入饱和碳酸氢钠溶液，调节pH至中性，终止反应，把制备好的溶液装入透析袋，透析4-6天，放入冻干机冻干得白色海绵状产物，待用。

经红外、核磁氢谱检测证明成功合成了CSMA。

(2)载药微针基质的制备

在室温下避光称取光引发剂I2959，溶于去离子水，50℃搅拌得到0.5％(w/v)的I2959溶液。加入4mg甲氨蝶呤、10mg烟酰胺，室温搅拌均匀后，称取30mgCSMA，溶于1mlI2959溶液中，室温充分搅拌均匀。得到载药CSMA微针基质1mL。

(3)载药水凝胶微针贴片的制备

利用棱锥形孔状阵列的聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具制备微针贴片。所有的阵列包含10×10个针头，棱锥底部边长为300μm，每个针尖高度为620μm，每个针头间距为600μm。微针针体是四棱锥的形式，底部是300μm×300μm的正方形。

吸取200μL制备好的载药CSMA微针基质滴加在PDMS模具上，在0.9Mpa下抽真空10min，以填充PDMS模具的微腔，去除模具表面残留的多余溶液及气泡。再吸取1mL制备好的载药微针基质滴加在PDMS模具上填充模具背衬层，干燥24h。干燥完成后，使用紫外光照射60s，将微针贴片从PDMS模具中分离出来，储存在干燥器中。

图6为载药CSMA水凝胶微针光学显微镜图。从图中可以看出：该微针贴片是排列整齐的黄色棱锥形微针贴片，黄色为药物的颜色。

实施例7甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的机械强度试验

本实施例性能测试对象为实施例1制备得到的空白甲基丙烯酰化壳聚糖CSMA水凝胶微针贴片与实施例6制备得到的载药甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片。

将微针贴片的针尖朝上放在拉力试验仪(TH-82033，苏州拓博)的检测平台上。感应器探头以0.1mm/s的速度向垂直微针针尖的方向移动。力和位移的测量从传感器第一次接触到微针尖端开始，一直持续到力达到70N停止。

图7为CSMA空白水凝胶微针与载药水凝胶微针的机械力测试对比图。如图所示，空白CSMA水凝胶微针与载药微针针尖在受到0.7N的压力下也没有出现断裂点，这表明本发明制备的微针贴片具有良好的机械强度，远远超过微针刺入皮肤所需机械力0.2N(Designandevaluationofdissolvingmicroneedlesforenhanceddermaldeliveryof propranololhydrochloride.Pharmaceutics.2021,13,579)。

实施例8甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片的稳定性测试

本实施例通过产品放置50天前后的形貌与机械力对比情况，证明产品的稳定性。本实施例性能测试对象为实施例1制备得到的甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片。

发明人将实施例1制备出的微针贴片放置50天后，拍摄了其光学显微镜图，见图8。从图中可以看出，该微针贴片形貌良好，与刚制备的微针贴片形貌相似。

发明人将实施例1制备出的微针贴片放置50天后，测试了其机械力，通过与刚制备的微针贴片的机械力测试比较(见图9)。试验结果表明，经过50天，该微针仍有良好的机械性能。

由此可见，本发明制备的甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片具有良好的稳定性。

实施例9甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片皮肤刺入实验

本实施例性能测试对象为实施例1制备得到的甲基丙烯酰化壳聚糖CSMA水凝胶微针贴片。

为了验证本发明微针的真实皮肤插入能力，实验中使用了小鼠皮肤(小鼠购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司)模拟人体皮肤，用手将待测的微针贴片压在小鼠皮肤上并保持2分钟。拔出微针贴片，使用手机拍摄小鼠皮肤的针孔进行观察记录。图10为CSMA水凝胶微针的皮肤插入图。从图中可以看出，小鼠皮肤上存在完整的微针针孔阵列，表明本发明制备的微针贴片具有良好的皮肤穿刺效果。

实施例10甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片不同紫外照射时间微针溶胀性能测定本实施例性能测试对象为实施例1制备得到的甲基丙烯酰化壳聚糖CSMA水凝胶微针贴片。

将制备好的CSMA水凝胶微针贴片直接进行称量，记录其干重为W0，在37℃磷酸盐缓冲液(PBS)(pH＝7.4)中吸水溶胀，在不同时间点(0，10，60，180，360min)拿出，用滤纸吸干水渍，在不同时间点称重Wt。Ws＝Wt/W0×100％，s为Swellingrate，溶胀率的缩写。Ws是通过微针吸取水分称量的重量来衡量的溶胀率。Ws越大，表明微针吸收水分越多，溶胀率越大。

图11为CSMA水凝胶微针贴片溶胀结果图。由图可知，该微针的溶胀性能随着紫外照射时间的增加而降低，这表明紫外照射时间越长，CSMA交联度越强，微针贴片的溶胀性能越小。根据图11可看出60s、90s紫外照射的微针的溶胀率为200％，30s紫外照射的微针的溶胀率为400％，0s紫外照射的微针为1600％，这表明该微针具有较好的溶胀性能。

实施例11载药微针的体外透皮扩散实验

本实施例性能测试对象为实施例6制备得到的载药甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片。

采用Franz扩散池(TK-24，上海楷凯)进行载药微针的体外透皮扩散实验。

将微针针尖刺入家兔的离体皮肤(家兔购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司)，用手指按压1分钟。将贴好微针贴片的兔皮转移至带有搅拌器的接收池中，角质层面向供应池并固定。其中，接收池含有3毫升PBS(pH＝7.4)溶液。随后，将透皮扩散池放在透皮扩散仪(TK-24，上海楷凯)上，温度设定为37.0℃，速度设定为200rpm/min，在预定的时间间隔(2h，4h，6h，8h，10h和24h)取出300μl接收液作为待测样品液，并立即补充300μl的PBS(pH＝7.4)溶液。每组三个平行。用0.22μm滤膜过滤样品溶液用于测试。

用HPLC-UV检测烟酰胺(NIC)和甲氨蝶呤(MTX)含量。

NIC色谱条件：反相C18色谱柱，流动相比例为乙腈：纯水＝7:3，柱温为37℃，检测波长：260nm，注射样品量为20μL，流动相流速为1mL/min。

MTX色谱条件：反相C18色谱柱，流动相比例为7％磷酸二氢钠：2％柠檬酸：乙腈＝8：1：1，三乙胺调pH至6，柱温为37℃，检测波长：302nm，注射样品量为20μL，流动相流速为1mL/min。

在不同时间点取样，测出样品的峰面积，通过对比标准曲线计算得出药品浓度；使用标准曲线法，得到药物释放曲线。图12为CSMA载药水凝胶微针贴片的药物累积释放结果图。从图中可以看出，本发明微针贴片显示出高效的药物透皮扩散效率。在24小时内的扩散率高达80％，这表明微针贴片能够成功将装载的不同药物(MTX、NIC)通过皮肤缓慢递送进人体内。

实施例12溶血率测试

本实施例性能测试对象为实施例1制备得到的甲基丙烯酰化壳聚糖CSMA水凝胶微针贴片。

活鼠(购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司)眼球取血，对得到的新鲜鼠血进行溶血试验。取约500μL新鲜鼠血，置于抗凝管中，3000rpm离心10min，收集红细胞；用PBS(pH7.4)溶液洗涤3次，0.9％生理盐水稀释红细胞(先用生理盐水：红细胞溶液体积比8：2稀释，摇匀之后，再用生理盐水：红细胞溶液体积比9：1稀释)，得到红细胞悬液。将红细胞悬液分别与不同浓度的CSMA(31.25、62.5、125、250、500、1000μg/ml)混合均匀后，在37℃下于孵育箱中孵育6h。阳性对照组和阴性对照组分别为纯水组和生理盐水组。在540nm下对所有样品进行吸光度测定。若发生溶血，540nm处的溶血率会增加。

图13为CSMA溶血率测试结果图。如图13所示，当CSMA的浓度高达1mg/ml时，材料的溶血率小于5％，证明了CSMA的生物安全性(溶血率小于5％，即证明生物安全性，参见大豆溶血磷脂的制备及其生物安全性分析)。

实施例13细胞毒性测试

本实施例性能测试对象为实施例1制备得到的甲基丙烯酰化壳聚糖CSMA水凝胶微针贴片。

采用MTT实验检测CSMA对293T细胞生长的影响。MTT实验采用方法来源：广州中医药大学硕士论文，蛋黄油对LPS诱导HaCaT细胞增殖的寻常型银屑病模型及Bcl--2表达的影响初探。

将293T细胞(中国科学院细胞库)种植于96孔板中，于37℃，含5％CO₂细胞培养箱中使用含5％胎牛血清(gibco)的DMEM培养基培养24h之后，加入相同体积不同浓度(使用生理盐水将CSMA配置成20mg/ml，然后使用细胞培养液进行稀释，最终得到不同终浓度的CSMA)的CSMA(31.25、62.5、125、250、500、1000μg/ml)和新鲜的细胞培养液(5％胎牛血清(gibco)-95％DMEM培养基(森贝伽)，(CSMA：细胞培养液质量比1：10，更有利于细胞生长)培养12h后，弃去培养基，加入含MTT(凯基生物)的培养基，4h之后可以看到蓝紫色结晶，加入100μl二甲基亚砜，震荡5min，使用酶标仪(SpectraMaxM5multimodemicroplatereader，MolecularDevices,Ltd.)在波长490nm处进行检测。

活细胞线粒体中含琥珀酸脱氢酶可使MTT噻唑蓝还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜，甲臜可溶于DMSO中，可在酶标仪490nm检测波长。而死细胞无琥珀酸脱氢酶，不能生成甲臜。

细胞存活率＝(实验组OD-空白组OD)/(CSMA组OD-空白组OD)*100％

细胞死亡率小于20％，即为低毒性。

图14为CSMA细胞相容性测试结果图。如图14所示，当CSMA的浓度高达1mg/ml时，细胞的存活率为90％左右，证明了CSMA具有较低的细胞毒性，生物安全性好。

本发明对实施例1-5制备得到的甲基丙烯酰化壳聚糖CSMA水凝胶微针贴片进行了性能测定，通过拉力仪检测出CSMA水凝胶微针贴片机械性能强，刺入皮肤后，显示出高效的药物透皮扩散效率，在24小时内将药物通过皮肤缓慢递送进入人体，并在药物递送完全后可完整拔出，生物安全性良好。同时，通过实施例与对比例的比较可知，本发明不仅成功制备出了CSMA水凝胶微针贴片，并且制备的微针贴片稳定性、机械性能均良好，克服了本领域长期存在的问题。

本发明甲基丙烯酰化壳聚糖生物安全性较高，具有可紫外交联的特性，作为微针基质时使用浓度仅为2～5％即可，相较于现有的甲基丙烯酰基明胶、甲基丙烯酰基透明质酸，该基质制备的微针机械性能良好，使用的基质浓度低，微针制备过程简便，不需要受到特定条件的限制。

综上所述，本发明水凝胶微针贴片配方组成合理，制备过程简单、成本低、传输效率高、生物相容性、稳定性、机械性能均良好、具有可调交联性能及药物缓释性能。本发明的CSMA微针贴片可以应用于药物或大分子蛋白的递送治疗疾病、提取组织间液用于疾病或有毒物质的检测方面。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (10)

1.一种甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片，其特征在于，所述微针贴片是由甲基丙烯酸酐MA、密度≥0.4g/ml的高密度壳聚糖CS和光引发剂制得的微针基质，加载在微针模具上，经紫外光固化形成的。

2.根据权利要求1所述的水凝胶微针贴片，其特征在于，所述高密度壳聚糖密度≥0.6g/ml。

3.根据权利要求1或2所述的水凝胶微针贴片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将甲基丙烯酸酐MA与高密度壳聚糖CS乙酸溶液反应，制得甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶前体CSMA；

(2)将步骤(1)的CSMA溶解于光引发剂溶液中，得到CSMA微针基质；

(3)将步骤(2)的CSMA微针基质加载在微针模具上，填充模具微腔、模具背衬层，经干燥、紫外光照射后，将微针贴片从微针模具中分离出来，即得所述水凝胶微针贴片。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述甲基丙烯酸酐MA与高密度壳聚糖乙酸溶液的加入量为：(0.08～2.8):40v/v，所述高密度壳聚糖乙酸溶液浓度为0.1～5％w/v。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述光引发剂为光引发剂LAP、光引发剂907、光引发剂IHT-PI659或光引发剂I2959中至少一种。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述光引发剂的浓度为0.1～1％w/v。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述CSMA微针基质浓度为2～5％w/v。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述微针模具为聚二甲基硅氧烷PDMS模具。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述聚二甲基硅氧烷PDMS模具具有棱锥形孔状阵列，所述阵列棱锥底部边长为20～1000μm，每个针尖高度为25～1000μm。

10.一种根据权利要求1所述的甲基丙烯酰化壳聚糖水凝胶微针贴片在药物递送方面的应用。

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