CN111228214A - 红细胞膜基水凝胶接触镜及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了红细胞膜基水凝胶接触镜及其制备方法和应用，以含羧基的水溶性高分子为交联剂，通过细胞膜蛋白中的氨基与交联剂的羧基之间的酰胺反应，在低温下使用接触镜模具制备具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜。本发明所涉及的水凝胶接触镜具有内部大孔结构（孔径约为40μm~100μm）和高孔隙率(大于80%)，因此具备高含水量和高透氧性。水凝胶接触镜以细胞膜为主要基质，具有低免疫原性和抗炎效果。由于细胞膜的两亲性磷脂组分，水凝胶接触镜可以负载亲水性药物和疏水性药物，并实现可控缓慢释放，因此在眼部疾病的药物治疗中具有重要的应用前景。

Description

红细胞膜基水凝胶接触镜及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及红细胞膜基水凝胶接触镜及其制备方法和应用。
背景技术
角膜碱烧伤在临床上是一种常见的眼外伤疾病,也是临床上复杂而难以治愈的眼病之一,还是致盲的重要原因之一；可导致角膜溶解、新生血管形成及溃疡穿孔等严重病理改变 ,其临床经过和病理变化与其他烧伤相比更严重和复杂。文献(Estrella-Mendoza,M.F., et al , Nutrients, 2019. 11(5).)报道，严重的碱烧伤,愈后特别影响患者的视力。如何能促进角膜碱烧伤既快又好地治愈,是许多学者一直研究的课题。
为了解决这一问题，眼部有效的药物治疗成为了研究的热点。目前临床最常见的药物治疗是经常使用滴眼液治疗，但是滴眼液的生物利用度较差(1-5%)。原因主要是角膜前停留时间较短，眼内存在生理和解剖障碍，接触镜可能是维持眼科药物释放的理想医疗设备。水凝胶因其内部为三维微孔结构,不仅具有高含水量，有利于接触镜材料的制备，还具有高孔隙率便于药物持续递送等，参见文献（Maulvi, F.A., et al, ActaBiomater,2019. 86: p. 350-362.），因而在生物医学领域包括接触镜的制备、药物缓释等方面具有广泛的应用前景。
临床上用于眼部药物缓释的药物分为亲水性药物和疏水性药物，单一的亲水性隐形眼镜材料或单一的疏水性隐形眼镜材料只能负载其中一种药物，治疗效果有限。
发明内容
为解决现有技术存在的问题和不足，本发明的目的是提供具有药物缓释功能的水凝胶接触镜。本发明还提供具有药物缓释功能的水凝胶接触镜的制备方法。
本发明还提供一种基于具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜作为眼部治疗的药物载体的应用，该药物载体用于负载亲水性药物和疏水性药物，并实现可控缓慢释放。
具有药物缓释功能的水凝胶接触镜，主要组分为红细胞膜、交联剂、水凝胶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，其中红细胞膜的质量百分比超过70%，孔隙率大于80%，水凝胶的内部孔径40 µm~100 µm。
进一步地，以含羧基的水溶性高分子为交联剂。
进一步地，红细胞膜包括脂类、蛋白质和糖类，蛋白质为红细胞膜蛋白，细胞膜蛋白与交联剂的质量比例为(50~5):1。
进一步地，交联剂为海藻酸钠、透明质酸或聚赖氨酸。
具有药物缓释功能的水凝胶接触镜的制备方法，包括以下步骤：以细胞膜蛋白、交联剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和 N-羟基琥珀酰亚胺为原料，通过酰胺反应，在接触镜模具为反应容器，交联剂为含羧基的水溶性高分子，反应制备形成接触镜形状的红细胞膜基水凝胶接触镜。
进一步地，细胞膜蛋白为红细胞膜蛋白，其制备方法是：
a1. 将采集的血液在300 g/min的条件下离心20 min，弃上清液；按照下层红细胞与磷酸缓冲盐溶液（1xPBS）体积比为1：10的比例混匀，500 g/min，离心5 min，反复操作3 次；再按照采集全血与磷酸缓冲盐溶液比为1：4定容血液，收集处理血液；
a2. 在 2 ml 离心管中滴加 500 µl a1 步骤中的处理血液，再加入0.2 mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，混匀，18000 rcf/min，温度为 4 ℃，离心 6 min；
a3. 弃上清，向2 ml 离心管中加入1 ml 0.2 mmol/L 的EDTA，混匀，再滴加100 µl10xPBS 混匀，18000 rcf/min，温度为4 ℃，离心6 min；
a4. 重复 a3 步骤2 次，弃上清，向其中一个2 ml 离心管加入 1 ml 1xPBS，吹打均匀，将其转移到第二个离心管，直到转移到最后一个离心管，使红细胞膜浓缩，在 18000rcf/min，温度为4 ℃的条件下离心6 min，弃上清，收集下层沉淀即为红细胞膜蛋白。
进一步地，交联剂为含羧基的天然多糖或水溶性合成聚合物。
进一步地，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与交联剂的摩尔比例为 1:(1~1.2):(3~4)。
进一步地，细胞膜蛋白与交联剂的质量比例为(50~5):1，反应温度为-10 ℃~-30℃，反应时间为 16~24 h。
一种基于具有药物缓释功能的水凝胶接触镜作为眼部治疗的药物载体的应用，该药物载体用于负载亲水性药物和疏水性 药物，并实现可控缓慢释放。
以上描述的红细胞膜基水凝胶接触镜的性能表征如下：
采用扫描电子显微镜观察所制备的红细胞膜基水凝胶接触镜在干燥状态下内部孔径大小，称重法计算大孔水凝胶的溶胀率和孔隙率，流变仪测试水凝胶的储存模量。
本发明的有益之处在于：
1.本发明制备的红细胞膜基水凝胶接触镜具有高含水量、高透氧量、高孔隙率、力学强度适中、生物相容性好，符合水凝胶接触镜的要求。
2.本发明制备的红细胞膜基水凝胶接触镜以细胞膜为主要基质，隐形眼镜材料来源于主题，具有低免疫原性和抗炎效果。
3.本发明制备的红细胞膜基水凝胶接触镜中由于细胞膜具有两亲性磷脂组分，接触镜可以负载亲水性药物和疏水性药物，并实现可控缓慢释放，在眼部疾病的药物治疗中具有重要的应用前景。
4.本发明制备的红细胞膜基水凝胶接触镜使用接触镜模具制备，具有眼部生理弧度，有利于增加佩戴过程中的舒适性。
附图说明
图1为实施例 1 制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为交联剂）的光学照片；
图2为实施例 1 制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为交联剂）的扫描电子显微镜照片；
图3为实施例 1 制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为化学交联剂）的孔隙率（左）与溶胀率（右）；
图4为实施例 1 制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为交联剂）的模量表征。
图5为实施例 1 制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为交联剂）的细胞毒性实验。
图6为实施例 1 制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为交联剂）的药物释放量。
图7为实施例 1 制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为交联剂）的药物疗效实验。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
药物的功能试验采用荧光测定细胞内活性氧（ROS）试剂盒验证三金属酶（Trim）具有的过氧化物酶的作用，细胞在过氧化氢（H２Ｏ２）的刺激下会产生大量的活性氧ROS，荧光测定细胞内活性氧试剂盒会根据ROS含量发出荧光，ROS越多，荧光越强，结果用相对荧光强度（RFU）表示。由于三金属酶具有过氧化物酶的作用，可以分解过氧化氢，阻止细胞内ROS产生，使相对荧光强度减低。从图７中可以看出随着三金属酶浓度的增加，荧光强度的减低，当三金属酶浓度达到200 µg/ml时，荧光强度已经与对照组相近。
实施例1 制备具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（海藻酸钠为交联剂，明胶为物理交联剂）。
a) 红细胞膜的提取：采集血液 1 ml，在300 g/min的转速下离心 20 min，弃上清液；用 1xPBS 洗下层红细胞，500 g/min，离心5 min，反复操作3 次；再按照采集全血与磷酸缓冲盐溶液比为1：4 定容血液，收集处理血液, 在2 ml 离心管中滴加500 µl处理血液，再加入 1 ml 0.2 mmol/L 的EDTA, 混匀，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min；弃上清，向2ml 离心管中加入1 ml 0.2 mmol/L 的EDTA，混匀，再滴加100 µl 10xPBS 混匀，18000rcf/min，4 ℃，离心6 min；重复上述步骤2 次，弃上清，向其中一个2 ml 离心管加入1 ml1xPBS ，吹打均匀，将其转移到第二个离心管，直到转移到最后一个离心管，使红细胞膜浓缩，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min，弃上清，收集下层沉淀即为红细胞膜；获得的红细胞膜为反应物1，在-80 ℃冰箱中保存。
b) 海藻酸钠的活化：将2 g海藻酸钠（粘均分子量≥2000 cps）溶解于100 ml磷酸缓冲盐溶液（PBS, pH 7.2）中制备2%的海藻酸钠溶液。在240 µl海藻酸钠溶液中加入15mgEDC，并充分震荡混匀。在摇床上反应30 min后，再加入9 mgNHS充分混匀。
c) 制备红细胞膜基大孔凝胶：在一个200 µl离心管中依次加入90 µl红细胞膜溶液，30 µl按照步骤b活化的海藻酸钠溶液和30 µl明胶，最后加入亲水性药物三金属酶和疏水性药物阿西替尼16 µg，混匀后迅速转入直径14 mm，深度6 mm的接触镜模具中，在-20 ℃冰箱中反应24 h。反应结束后采用扫描电子显微镜观察水凝胶在干燥状态下的内部孔径大小。
本实施例得到的产物为具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（红细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为化学交联剂），如图 1 所示。扫描电子显微镜显示水凝胶内部为无规大孔，孔径大小为 40 µm~100 µm，（如图 2 所示）。
实施例2 制备药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（透明质酸为交联剂）。
a) 红细胞膜的提取：采集血液1 ml，在300 g/min的转速下离心 20 min，弃上清液；用 1xPBS 洗下层红细胞，500 g/min，离心5 min，反复操作3 次；再按照采集全血与磷酸缓冲盐溶液比为1：4定容血液，收集处理血液, 在2 ml 离心管中滴加500 µl处理血液，再加入1 ml 0.2 mmol/L 的EDTA, 混匀，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min；弃上清，向2 ml离心管中加入1 ml 0.2 mmol/L 的EDTA，混匀，再滴加100 µl 10xPBS 混匀，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min；重复上述步骤2 次，弃上清，向其中一个2 ml 离心管加入1 ml1xPBS ，吹打均匀，将其转移到第二个离心管，直到转移到最后一个离心管，使红细胞膜浓缩，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min，弃上清，收集下层沉淀即为红细胞膜；获得的红细胞膜为反应物1，在-80 ℃冰箱中保存。
b) 透明质酸的活化：将1 g透明质酸（数均分子量 100000 ~200000）溶解于100ml磷酸缓冲盐溶液（PBS, pH 7.2）中制备 1%的透明质酸溶液。在250 µl透明质酸溶液中加入5 mg EDC，并充分震荡混匀。在摇床上反应30 min后，再加入4 mg NHS 充分混匀。
c) 制备红细胞膜基大孔凝胶：在一个200 µl离心管中依次加入 90 µl红细胞膜溶液，30 µl按照步骤b活化的透明质酸溶液，最后加入亲水性药物和疏水性药物，混匀后迅速转入直径14 mm，深度6 mm的接触镜模具中，在-20 ℃冰箱中反应24 h。反应结束后采用扫描电子显微镜观察水凝胶在干燥状态下的内部孔径大小。
本实施例得到的产物为具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（红细胞膜提供蛋白的氨基成分，透明质酸为化学交联剂），其中凝胶孔径大小为40 µm ~100 µm。
实施例3 制备药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（聚赖氨酸为交联剂） a)红细胞膜的提取：采集血液1 ml，在300 g/min的转速下离心20 min，弃上清液；用 1xPBS洗下层红细胞，500 g/min，离心 5 min，反复操作3 次；再按照采集全血与磷酸缓冲盐溶液比为 1：4定容血液，收集处理血液, 在2 ml 离心管中滴加500 µl处理血液，再加入1 ml0.2mmol/L 的 EDTA, 混匀，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min；弃上清，向2 ml 离心管中加入 1 ml 0.2 mmol/L的EDTA，混匀，再滴加100 µl 10xPBS 混匀，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min；重复上述步骤 2 次，弃上清，向其中一个2 ml 离心管加入1 ml 1xPBS ，吹打均匀，将其转移到第二个离心管，直到转移到最后一个离心管，使红细胞膜浓缩，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min，弃上清，收集下层沉淀即为红细胞膜；获得的红细胞膜为反应物1，在-80 ℃冰箱中保存。
b) 聚丙烯酸的活化：将3 g聚丙烯酸（数均分子量 100000）溶解于100 ml磷酸缓冲盐溶液（PBS, pH 7.2）中制备3%的聚赖氨酸溶液。在250 µl聚丙烯酸溶液中加入5 mgEDC，并充分震荡混匀。在摇床上反应30 min后，再加入4 mg NHS 充分混匀。
c) 制备红细胞膜基大孔凝胶：在一个200 µl离心管中依次加入 90 µl，红细胞膜溶液，30 µl按照步骤b活化的聚丙烯酸溶液，最后加入亲水性药物和疏水性药物，混匀后迅速转入直径 14 mm，深度 6 mm的接触镜模具中，在-20 ℃冰箱中反应24 h。反应结束后采用扫描电子显微镜观察水凝胶在干燥状态下的内部孔径大小。
本实施例得到的产物为具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（红细胞膜提供蛋白的氨基成分，聚丙烯酸为化学交联剂），其中凝胶孔径大小为40 µm~100 µm。
实施例4制备具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（海藻酸钠为化学交联剂，明胶为物理交联剂）。
a) 红细胞膜的提取：采集血液1 ml，在300 g/min的转速下离心 20 min，弃上清液；用 1xPBS 洗下层红细胞，500 g/min，离心5 min，反复操作3 次；再按照采集全血与磷酸缓冲盐溶液比为1：4定容血液，收集处理血液, 在2 ml 离心管中滴加500 µl处理血液，再加入1 ml 0.2 mmol/L 的EDTA，混匀，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min；弃上清，向2 ml离心管中加入1 ml 0.2 mmol/L 的EDTA，混匀，再滴加100 µl 10xPBS 混匀，18000 rcf/min，4 ℃，离心6 min；重复上述步骤2 次，弃上清，向其中一个2 ml 离心管加入1 ml1xPBS ，吹打均匀，将其转移到第二个离心管，直到转移到最后一个离心管，使红细胞膜浓缩，18000 rcf/min，4 ℃，离心 6 min，弃上清，收集下层沉淀即为红细胞膜；获得的红细胞膜为反应物1，在-80 ℃冰箱中保存。
b) 海藻酸钠的活化：将2 g海藻酸钠（粘均分子量≥2000 cps）溶解于100 ml磷酸缓冲盐溶液（PBS, pH 7.2）中制备2%的海藻酸钠溶液。在240 µl海藻酸钠溶液中加入15mgEDC，并充分震荡混匀。在摇床上反应30 min后，再加入9mgNHS充分混匀。
c) 制备红细胞膜基大孔凝胶：在一个200 µl离心管中依次加入90 µl红细胞膜溶液，30 µl按照步骤b活化的海藻酸钠溶液和30 µl明胶，最后加入亲水性药物和疏水性药物，混匀后迅速转入直径14 mm，深度6 mm的接触镜模具中，在-20 ℃冰箱中反应24 h。反应结束后采用扫描电子显微镜观察水凝胶在干燥状态下的内部孔径大小。
本实施例得到的产物为具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜（红细胞膜提供蛋白的氨基成分，海藻酸钠为化学交联剂，明胶为物理交联剂），其中凝胶孔径大小为40µm~100 µm。
测试实施例5 实施例1制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜的性能测试。
将实施例1制备的水凝胶隐形眼镜冷冻干燥后称重为W1，再用去离子水浸泡过夜后称重为W2，然后用滤纸将浸泡过的水凝胶中的水吸干后再称重为W3。
按照公式：溶胀率= W2/W1，孔隙率= (W2-W3)/W2×100%，分别计算水凝胶隐形眼镜的溶胀率及孔隙率，结果如图3所示。实施例1制备的蛋白基双层水凝胶溶胀率约为15.57，孔隙率约为87.35%。
通过流变仪测试实施例1制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶的接触镜储存模量及损耗模量，结果如图4所示。细胞膜基大孔水凝胶的储存模量约为7000 Pa，损耗模量约为580 Pa，说明用此方法制备的红细胞膜基水凝胶接触镜具有不错的力学性能。
测试实施例6 实施例1制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜的细胞毒性检测。
将具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜制备以后冻干称量记录质量，按照1 mg/ml 的比例使用 DMEM（10%FBS，1%青霉素-链霉素双抗）浸泡水凝胶接触镜，共分3组，每组5个样本，3 组样本分别用培养基浸泡24 h、48 h、72 h。取生长良好的 L929 小鼠成纤维细胞，用上述浸泡过水凝胶接触镜的的 DMEM 培养基制备单细胞悬液，以 5x10 4/ml 的密度接种于96 孔板，每孔体积100 µl，置于5%CO2，37 ℃恒温培养箱。培养到24 h后，用CCK-8 检测试剂盒检测细胞毒性。
测试实施例7 实施例1制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜的药物缓释测试。
将实施例 1 中制备水凝胶接触镜用磷酸缓冲盐溶液进行清洗，每次使用1xPBS共10 ml，每次清洗10 min，一共清洗3 次。
清洗后的细胞膜基水凝胶接触镜转移到2 ml离心管中，每个离心管中加入1 ml1xPBS，在100 rpm 转速，37 ℃恒温条件下进行药物缓释。分别在 2 h、4 h、6 h、8 h、24 h、48 h、96 h、120 h、144 h、192 h、240 h、288 h、336 h取1 ml药物缓释液，每次取出旧的缓释液后再添加1 ml新鲜1xPBS。取出的药物缓释液保存在-20 ℃冰箱中，待测。
将缓释液解冻，用高效液相色谱法检测疏水性药物阿西替尼的释放量，并用酶标仪检测亲水性药物三金属酶替代物罗丹明-B的释放量。
测试实施例7 实施例1制备的具有药物缓释功能的红细胞膜基水凝胶接触镜的药物效果检测。
本实验实施例 1 中红细胞膜基水凝胶接触镜所负载的水溶性药物是三金属酶，三金属酶有过氧化物酶和过氧化氢酶作用，可以与活性氧（ROS）反应，ROS 具有促进眼部血管生成的作用，因此，三金属酶可以抑制眼部血管生成。本实验利用三金属酶具有过氧化物酶和过氧化氢酶作用的特点设计实验，用活性氧检测试剂盒检测在不同三金属酶浓度下，细胞内活性氧的水平。实验共分为6 组，分别为一个对照组和5 个不同浓度的三金属酶组：对照组，0 µg/ml组， 25 µg/ml组，50 µg/ml组，100 µg/ml组，200 µg/ml组。在96 孔板中加入角膜上皮细胞，每孔5000 个细胞，孵育24 h。然后每列分别加入不同浓度的三金属酶，孵育24 h后加入检测试剂2'，7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）荧光探针，孵育1 h，使试剂充分进入细胞。最后去除上清液，用0.2 mmol/L的过氧化氢（Ｈ２Ｏ２）溶液诱发氧化应激，孵育2 h后在酶标仪中检测荧光强度。
以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

Claims (10)

1.红细胞膜基水凝胶接触镜，其特征在于：主要组分为红细胞膜、交联剂、水凝胶、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺，其中红细胞膜的质量百分比超过70%，孔隙率大于80%，水凝胶的内部孔径40 µm~100 µm。
2.根据权利要求 1 所述的红细胞膜基水凝胶接触镜，其特征在于：以含羧基的水溶性高分子为交联剂。
3.根据权利要求 1 所述的红细胞膜基水凝胶接触镜，其特征在于：红细胞膜包括脂类、蛋白质和糖类，蛋白质为红细胞膜蛋白，细胞膜蛋白与交联剂的质量比例为(50~5):1。
4.根据权利要求 1 所述的红细胞膜基水凝胶接触镜，其特征在于：交联剂为海藻酸钠、透明质酸或聚赖氨酸。
5.红细胞膜基水凝胶接触镜的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：以细胞膜蛋白、交联剂、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺为原料，通过酰胺反应，在接触镜模具为反应容器，交联剂为含羧基的水溶性高分子，反应制备形成接触镜形状的红细胞膜基水凝胶接触镜。
6.根据权利要求 5 所述的红细胞膜基水凝胶接触镜的制备方法，其特征在于：细胞膜蛋白为红细胞膜蛋白，其制备方法是：
a1. 将采集的血液在300 g/min的条件下离心20 min，弃上清液；按照下层红细胞与磷酸缓冲盐溶液（1xPBS）体积比为1：10的比例混匀，500 g/min，离心5 min，反复操作3 次；再按照采集全血与磷酸缓冲盐溶液比为1：4定容血液，收集处理血液；
a2. 在2 ml 离心管中滴加500 µl a1步骤中的处理血液，再加入 0.2 mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，混匀，18000 rcf/min，温度为4 ℃，离心6 min；
a3. 弃上清，向2 ml 离心管中加入1 ml 0.2mmol/L 的 EDTA，混匀，再滴加100 µl10xPBS混匀，18000 rcf/min，温度为4 ℃，离心6 min；
a4. 重复a3 步骤2 次，弃上清，向其中一个2 ml离心管加入1 ml 1xPBS，吹打均匀，将其转移到第二个离心管，直到转移到最后一个离心管，使红细胞膜浓缩，在18000 rcf/min，温度为4 ℃的条件下离心6 min，弃上清，收集下层沉淀即为红细胞膜蛋白。
7.根据权利要求 5 所述的红细胞膜基水凝胶接触镜的制备方法，其特征在于：交联剂为含羧基的天然多糖或水溶性合成聚合物。
8.根据权利要求 5 所述的红细胞膜基水凝胶接触镜的制备方法，其特征在于：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺与交联剂的摩尔比例为 1:(1~1.2):(3~4)。
9.根据权利要求 5 所述的红细胞膜基水凝胶接触镜的制备方法，其特征在于：细胞膜蛋白与交联剂的质量比例为(50~5):1，反应温度为-10 ℃~-30 ℃，反应时间为16~24 h。
10.一种基于权利要求 1所述的红细胞膜基水凝胶接触镜作为眼部治疗的药物载体的应用，其特征在于：该药物载体用于负载亲水性药物和疏水性药物，并实现可控缓慢释放。
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