CN115671281A - 一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，涉及新型材料应用领域。本发明包括以下步骤：将2‑6 v/v%HAuCl4(10 mM)滴加到1‑4 v/v%原花青素(5mM)和ddH2O的混合溶液中，加热下持续搅拌20分钟，得到紫红色的Au种子溶液；采用Au种子、HAuCl4水溶液、AgNO3溶液以及对苯二酚和聚乙烯吡咯烷酮在室温下制备支链AuAg NPs。本发明在光热抗菌的同时去除多余的ROS，改善了传统PTT加重炎症的缺点；抑制巨噬细胞M1极化并将其转化为M2表型，以恢复由细菌引起的免疫功能障碍，增强牙周胶原纤维的再生能力。
Description
技术领域
本发明涉及一种纳米粒子制备方法，具体为一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，属于新型材料应用技术领域。
背景技术
目前牙周炎的治疗主要是通过机械清创技术辅助抗生素治疗清除细菌，治疗后的复发率和延迟愈合仍然很高。由于细菌感染是炎症最初阶段的主要原因，但宿主的免疫炎症反应进一步促进牙周炎的发展。因此，要彻底治疗牙周炎，除了清除病区的生物膜外，调节宿主免疫也是至关重要的。
光热剂有效吸收近红外区域的光，并将其转化为热能，可用于局部抗菌治疗。枝状的金银纳米粒子具有良好的光热性能。然而，产生的热量可以融化纳米颗粒突出的结构，因此，在颗粒表面涂上聚合物外壳可以有效地提高稳定性。金属-多酚网络具有合成简单、与人体组织亲和性好等独特优点，可以作为覆盖其他材料的生物涂层。传统的PTT治疗后往往导致炎症加重，本发明通过金属-多酚网络将抗菌与抗炎相结合，既可以达到PTT抗菌效果，又发挥出良好的抗炎作用，促进组织修复。
现有关于金属-多酚网络在纳米粒子生物医学领域的应用大多处在药物载体层面，对于其自身性质在疾病方面的治疗应用较少。金属-多酚具有抗氧化的研究潜力，对于目前的金属-多酚光热性能不理想的问题，本申请提出一种新的纳米粒子制备方式。
发明内容
（一）解决的技术问题
本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，以解决现有技术中的问题。
（二）技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：1．一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，包括以下步骤：
Step1、将2-6 v/v% HAuCl4 (10 mM)滴加到1-4 v/v% 原花青素(5mM)和ddH2O的混合溶液中，加热下持续搅拌20分钟，得到紫红色的Au种子溶液；采用Au种子、HAuCl4水溶液、AgNO3溶液以及对苯二酚和聚乙烯吡咯烷酮在室温下制备支链AuAg NPs；
Step2、将1 mL AuAg NP分散液与50-150 μL 原花青素溶液(5 mM)旋涡混合10 s，加入15-45 μL FeCl3溶液(25 mM)搅拌10 s；随后，NaOH逐级添加以提高悬浮液的pH值至7.8；得到的mpn涂层的AuAg NPs被离心(6000 rpm, 5分钟)以收集沉淀物；最终的产品被称为AuAg@PC-Fe；
Step3、对材料的表征进行检测；
Step4、采用标准细胞计数Kit-8 (CCK8)法测定细胞活力，通过活/死细胞染色进一步评价AuAg@PC-Fe NPs的治疗效果；
Step5、利用2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)评价AuAg@PC-Fe NPs的抗氧化性能以及近红外对自由基清除效果的影响；
Step6、用808 nm激光照射AuAg和AuAg@PC-Fe 溶液(1 mL) 3分钟,利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、SYTO9/PI活/死菌双染色试剂和菌落计数法检测细菌活力；
采用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测RAW 264.7细胞中M1表型相关因子信使RNA(mRNA)表达水平:IL-6、TNF-α、il -1β和M2表型相关因子Arg-1、IL-10、TNF-β；
使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞分泌的IL-6和IL-10；用流式细胞仪定量检测巨噬细胞标志物CD86和CD206的表达；
Step7、通过NF-κB/P65核移位和Nrf2(p-Nrf2)磷酸化来评估NF-κB和Nrf2信号通路受到的影响；确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制；
Step8、制备动物模型，体内评估AuAg@PC-Fe对牙周病的抗炎作用；
将细菌连续注入下颌骨切牙4天；
除空白对照组外，其余各组均以0.2 mL /只大鼠原位给药3 d；
两组小鼠给药后均给予808nm近红外辐射(2.5 W/cm2)照射3 min；
用热成像仪观察温度变化。
优选地，对材料的表征进行检测的方式包括：
利用透射电镜对AuAg NPs和AuAg@PC-Fe NPs的形态和结构进行分析；
通过动态光散射(DLS)记录尺寸分布，并使用Zetasizer仪器测定zeta电位；
进行x射线能谱(EDS)图谱和紫外-可见吸收光谱分析。
优选地，在激光照射时，使用FLIR热成像仪(FLIRA-E50，美国)采集实时温度和红外图像。
优选地，在确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制时，利用Western blot检测抗氧化蛋白表达水平的方式：在冰中提取，用BCA蛋白测定试剂盒定量测定总蛋白；
经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，在室温下封闭1小时；
将含有蛋白的膜用p-PI3K (1:2000),PI3K (1:2000,p-Akt (1:1000), p-Akt(1:1000), Akt (1:1000)， p-Nrf2 (S40) (1:2000;亲和力),Nrf2 (1:20 00;亲和力)，然后用辣根过氧化物酶偶联二抗体(1:1000;室温下保温1小时；
蛋白经ECL试剂盒(Beyotime)处理后在凝胶成像分析系统中可视化。
优选地，Step8中的实验分为六组，其分别为：
(1)空白对照组；
(2)炎症对照组；
(3)AuAg；
(4)AuAg@PC-Fe；
(5)AuAg+NIR；
(6)AuAg@PC-Fe+NIR (n = 6)。
优选地，在Step8中：需使用苏木精-伊红(H&E)染色和Masson染色后，才可在光镜下观察切片，计数炎症细胞和胶原纤维数量；
利用免疫组化染色检测组织中炎性细胞因子TNF-α和IL-1β，显微镜下观察和捕获图像，随机计数各组蛋白阳性细胞数；
利用real-time PCR检测组织中促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)和抗炎细胞因子(IL10、TNF-β和Arg-1) mRNA的表达。
本发明提供了一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其具备的有益效果如下：
1.本发明在光热抗菌的同时去除多余的ROS，改善了传统PTT加重炎症的缺点；
2.抑制巨噬细胞M1极化并将其转化为M2表型，以恢复由细菌引起的免疫功能障碍，增强牙周胶原纤维的再生能力。
3.将FeⅢ-PC网络包覆在支化AuAg NPs表面，实现光热抗菌和免疫治疗的综合效果，有效降低氧化应激和过度炎症，对于牙周炎起到良好的治疗效果。
附图说明
图1为本发明的合成过程及在治疗牙周炎中的抗菌、抗氧化和抗炎作用示意图。
图2为AuAg NPs纳米颗粒的制备示意图。
图3为本发明AuAg@PC-Fe纳米颗粒的合成原理图。
图4为本发明TEM示意图。
图5 本发明的表征检测结果示意图；其中包含：(A) AuAg@PC-Fe的TEM图像；(B)Au (C) Ag和(D) Fe元素的元素映射图；(E) AuAg@PC-Fe NPs的XRD谱图；(F) AuAg@PC-Fe复合材料的XPS测量谱；(G) Fe2p核能级谱；(H) C1s核能级谱。
图6为本发明的细胞毒性和抗氧化性能。(A)细胞毒性和(B)活细胞(绿色)和死细胞(红色)的共聚焦荧光图像，(C) AuAg@PC-Fe的ROS清除活性，(D) AuAg@PC-Fe和AuAg@PC-Fe+NIR的ABTS+清除能力。
图7为本发明的抗菌性能展示图；其中包含：AuAg和AuAg@PC-Fe NPs对细菌生物膜的抗菌性能(A)细菌菌落形成图像；(B)P. gingivalis生物膜CFU计数;(C) F. nucleatum生物膜CFU计数；(D,E) MTT法测定P. gingivalis和F. nucleatum的代谢活性；(F) 4天细菌生物膜的三维活/死图像；(G,H)P. gingivalis和F. nucleatum的死菌/活菌比。
图8为本发明通过驱动巨噬细胞极化抑制炎症作用的展示图；其中：(A)Real-timePCR分析促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)和抗炎细胞因子(IL-10、TGF-β和Arg-1)的基因表达；(B) IL-6和(C) IL-10浓度的ELISA分析；(D)流式细胞术检测m1标记CD86和m2标记CD206；(E) CD86阳性细胞的定量和(F) CD206阳性细胞的定量。
图9为不同处理对动物模型的抗炎作用；其中：(A)包括模型构建在内的整个体内实验示意图，纳米药物治疗后808 nm近红外光照射到最终治疗；(B)治疗4天后动物模型的口腔内照片；(C) PBS、AuAg和AuAg@PC-Fe在不同时间(2.5 W/cm 2)近红外照射下的大鼠牙龈红外热像。
具体实施方式
本发明实施例提供一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法。
请参阅图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9，包括以下步骤：
Step1、将2-6 v/v% HAuCl4 (10 mM)滴加到1-4 v/v% 原花青素(5mM)和ddH2O的混合溶液中，加热下持续搅拌20分钟，得到紫红色的Au种子溶液；采用Au种子、HAuCl4水溶液、AgNO3溶液以及对苯二酚和聚乙烯吡咯烷酮在室温下制备支链AuAg NPs；
Step2、将1 mL AuAg NP分散液与50-150 μL 原花青素溶液(5 mM)旋涡混合10 s，加入15-45 μL FeCl3溶液(25 mM)搅拌10 s；随后，NaOH逐级添加以提高悬浮液的pH值至7.8；得到的mpn涂层的AuAg NPs被离心(6000 rpm, 5分钟)以收集沉淀物；最终的产品被称为AuAg@PC-Fe；
Step3、对材料的表征进行检测；
Step4、采用标准细胞计数Kit-8 (CCK8)法测定细胞活力，通过活/死细胞染色进一步评价AuAg@PC-Fe NPs的治疗效果；
Step5、利用2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)评价AuAg@PC-Fe NPs的抗氧化性能以及近红外对自由基清除效果的影响；
Step6、用808 nm激光照射AuAg和AuAg@PC-Fe 溶液(1 mL) 3分钟,利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、SYTO9/PI活/死菌双染色试剂和菌落计数法检测细菌活力；
采用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测RAW 264.7细胞中M1表型相关因子信使RNA(mRNA)表达水平:IL-6、TNF-α、il -1β和M2表型相关因子Arg-1、IL-10、TNF-β；
使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞分泌的IL-6和IL-10；用流式细胞仪定量检测巨噬细胞标志物CD86和CD206的表达；
Step7、通过NF-κB/P65核移位和Nrf2(p-Nrf2)磷酸化来评估NF-κB和Nrf2信号通路受到的影响；确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制；
Step8、制备动物模型，体内评估AuAg@PC-Fe对牙周病的抗炎作用；将细菌连续注入下颌骨切牙4天；
除空白对照组外，其余各组均以0.2 mL /只大鼠原位给药3 d；
两组小鼠给药后均给予808nm近红外辐射(2.5 W/cm2)照射3 min；
用热成像仪观察温度变化。
对材料的表征进行检测的方式包括：
利用透射电镜对AuAg NPs和AuAg@PC-Fe NPs的形态和结构进行分析；
通过动态光散射(DLS)记录尺寸分布，并使用Zetasizer仪器测定zeta电位；
进行x射线能谱(EDS)图谱和紫外-可见吸收光谱分析。
在激光照射时，使用FLIR热成像仪(FLIRA-E50，美国)采集实时温度和红外图像。
在确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制时，利用Western blot检测抗氧化蛋白表达水平的方式：在冰中提取，用BCA蛋白测定试剂盒定量测定总蛋白；
经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，在室温下封闭1小时；
将含有蛋白的膜用p-PI3K (1:2000),PI3K (1:2000,p-Akt (1:1000), p-Akt(1:1000), Akt (1:1000)， p-Nrf2 (S40) (1:2000;亲和力),Nrf2 (1:20 00;亲和力)，然后用辣根过氧化物酶偶联二抗体(1:1000;室温下保温1小时；
蛋白经ECL试剂盒(Beyotime)处理后在凝胶成像分析系统中可视化。
Step8中的实验分为六组，其分别为：
(1)空白对照组；
(2)炎症对照组；
(3)AuAg；
(4)AuAg@PC-Fe；
(5)AuAg+NIR；
(6)AuAg@PC-Fe+NIR (n = 6)。
在Step8中：需使用苏木精-伊红(H&E)染色和Masson染色后，才可在光镜下观察切片，计数炎症细胞和胶原纤维数量；
利用免疫组化染色检测组织中炎性细胞因子TNF-α和IL-1β，显微镜下观察和捕获图像，随机计数各组蛋白阳性细胞数；
利用real-time PCR检测组织中促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)和抗炎细胞因子(IL10、TNF-β和Arg-1) mRNA的表达。
具体的，铁离子与原花青素的络合作用在纳米粒子表面形成包裹，且经过1、2、3次涂层循环后，壳体的厚度会增加，导致粒子直径增大。HAADF-STEM-EDS元素映射图像揭示了纳米复合材料由Au, Ag和Fe元素组成。表征检测证实，形成了稳定的AuAg@PC-Fe NPs。
另外说明的，将NPs溶液(100 μg/mL)在808 nm (2.5W/cm2)激光照射至稳态温度。实时光热图像直接显示了它们的光热效应。与AuAg NPs相比，AuAg@PC-Fe NPs的温度增量更高。壳层越厚，升温越高，说明PC-Fe壳层有助于提高AuAg NPs的光热性能。在808 nm的近红外条件下，经过3 min的辐照，AuAg@PC-Fe可达到50°C左右；
因为PTT的局部光热效应可导致细胞内ROS过量产生，导致炎症的发展，针对这一特性，检测近红外照射对纳米材料自由基清除能力的影响是PTT治疗炎症的关键；
还可采用ABTS法对材料进行了测试，结果也证实了AuAg@PC-Fe具有良好的自由基清除能力。与AuAg和AuAg+NIR相比，AuAg@PC-Fe+NIR清除细胞内自由基的能力更强，因此，AuAg@PC-Fe经过PTT处理后仍然是一种很好的抗氧化剂；
还可通过对琼脂平板上不同稀释倍数的菌落计数来评价NPs的抑菌性能，AuAgNPs和AuAg@PC-Fe NPs结合了Ag+固有的抗菌活性和优异的光热性能。在没有近红外照射的情况下，AuAg@PC-Fe的抗菌能力强于AuAg，证明MPN涂层具有一定的抗菌性能。同样，细菌代谢活性为AuAg@PC-Fe+NIR< AuAg+NIR < AuAg@PC-Fe < AuAg <对照组。
在研究AuAg@PC-Fe NPs对巨噬细胞极化和炎症反应的免疫调节作用时，可采用real-time PCR、ELISA和流式细胞仪检测巨噬细胞表型。LPS刺激后，巨噬细胞中TNF-α、IL-1β、IL-6三因子水平急剧升高，而AuAg@PC-Fe处理后显著抑制促炎细胞因子表达水平，同时提高了细胞中抗炎因子IL10、Arg-1和TGF- β的表达；
流式细胞术检测M1标记CD86 +和M2标记CD206 +的比值。
结果表明，与LPS刺激的阴性组(95.9%)相比，AuAg@PC-Fe抑制LPS上调的CD86表达(50.9%)。同时，与AuAg组(39.3%)相比，AuAg@PC显著促进巨噬细胞中CD206的表达(67.3%)。
以上结果提示，AuAg@PC-Fe NPs能有效诱导M1巨噬细胞向M2巨噬细胞转化，调节免疫应答
在研究AuAg@PC-Fe的抗炎机制以及PTT是否会影响材料的抗炎和抗氧化应激作用时，可进行Western blotting和免疫荧光染色。
免疫荧光结果显示，AuAg@PC-Fe处理的炎症巨噬细胞内p-Nrf2荧光强度增强，AuAg@PC-Fe-NIR组的荧光强度明显高于AuAg-NIR组，说明AuAg@PC-Fe在经过近红外处理后仍然可以激活p-NrF2去除多余ROS，在抗氧化应激中发挥很好的作用。
Western blotting结果显示，AuAg@PC-Fe显著上调p-Akt和p-PI3K的表达。AuAg@PC-Fe-NIR组的蛋白表达量显著高于AuAg和AuAg-NIR组，提示AuAg@PC-Fe在NIR处理后可调节PI3K/Akt信号通路，进一步激活Nrf2。p-NrF2的Western blotting结果与免疫荧光的结果一致。
LPS刺激后细胞核中P65的高荧光表达表明，LPS激活的NF-κB信号通路导致P65的核易位，而AuAg@PC-Fe和AuAg@PC-Fe+NIR可显著抑制NF-κB信号通路，发挥显著的抗炎作用。
因此，AuAg@PC-Fe通过激活PI3K/Akt信号通路促进Nrf2磷酸化，消除ROS，抑制NF-κB信号通路中P65的核易位。
在体内牙周病模型中，检测其抗炎特性的实际疗效：
将AuAg和AuAg@PC-Fe纳米复合材料注射到感染部位，每天用808 nm光照射，观察其体内抗炎作用。4天后，炎症对照组牙龈P. gingivalis治疗后，牙龈肿胀明亮；
AuAg组和AuAg@PC-Fe组红肿逐渐消退，AuAg+NIR组炎症部位仍有轻微肿胀，AuAg@PC-Fe+NIR组炎症部位颜色和特征与正常牙龈组织相似；
照射3 min后，AuAg@PC-Fe-treated创面温度升高至~50℃，而PBS组仅升高约1.5℃。与其他实验组和炎症对照组相比，AuAg@PC-Fe+NIR组的炎症细胞数量最少，胶原纤维密度与健康牙龈相似，胶原纤维含量明显增加。
说明AuAg@PC-Fe调节免疫反应，促进M2极化，提高牙周修复能力，有利于组织再生。结合PTT的有效杀菌，炎症得到较好的治疗。IHC检测牙周组织中促炎M1生物标志物IL-1β和TNFα的表达。炎症对照组在炎症状态下可见大量棕色细胞，AuAg@PC-Fe+NIR组阳性细胞数量最少。
还可采用real-time PCR检测龈组织炎症相关因子的表达水平。AuAg@PC-Fe+NIR处理后，M1巨噬细胞特异性生物标志物的基因表达减少，而M2巨噬细胞特异性生物标志物的基因表达明显增加。AuAg@PC-Fe被证实可以促进巨噬细胞从M1向M2表型的极化，增强牙周胶原纤维的再生能力。经验证，PTT与近红外照射后的免疫治疗相结合，具有良好的抗炎作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1.一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
Step1、将2-6 v/v% HAuCl4 (10 mM)滴加到1-4 v/v% 原花青素(5mM)和ddH2O的混合溶液中，加热下持续搅拌20分钟，得到紫红色的Au种子溶液；采用Au种子、HAuCl4水溶液、AgNO3溶液以及对苯二酚和聚乙烯吡咯烷酮在室温下制备支链AuAg NPs；
Step2、将1 mL AuAg NP分散液与50-150 μL 原花青素溶液(5 mM)旋涡混合10 s，加入15-45 μL FeCl3溶液(25 mM)搅拌10 s；随后，NaOH逐级添加以提高悬浮液的pH值至7.8；得到的mpn涂层的AuAg NPs被离心(6000 rpm, 5分钟)以收集沉淀物；最终的产品被称为AuAg@PC-Fe；
Step3、对材料的表征进行检测；
Step4、用808 nm激光照射AuAg和AuAg@PC-Fe 溶液(1 mL) 10分钟；
Step4、采用标准细胞计数Kit-8 (CCK8)法测定细胞活力，通过活/死细胞染色进一步评价AuAg@PC-Fe NPs的治疗效果；
Step5、利用2,2'-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)评价AuAg@PC-FeNPs的抗氧化性能以及近红外对自由基清除效果的影响；
Step6、用808 nm激光照射AuAg和AuAg@PC-Fe 溶液(1 mL) 3分钟,利用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、SYTO9/PI活/死菌双染色试剂和菌落计数法检测细菌活力；
采用定量聚合酶链式反应(qPCR)检测RAW 264.7细胞中M1表型相关因子信使RNA(mRNA)表达水平:IL-6、TNF-α、il -1β和M2表型相关因子Arg-1、IL-10、TNF-β；
使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞分泌的IL-6和IL-10；用流式细胞仪定量检测巨噬细胞标志物CD86和CD206的表达；
Step7、通过NF-κB/P65核移位和Nrf2(p-Nrf2)磷酸化来评估NF-κB和Nrf2信号通路受到的影响；确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制；
Step8、制备动物模型，体内评估AuAg@PC-Fe对牙周病的抗炎作用；
将细菌连续注入下颌骨切牙4天；
除空白对照组外，其余各组均以0.2 mL /只大鼠原位给药3 d；
两组小鼠给药后均给予808nm近红外辐射(2.5 W/cm2)照射3 min；
用热成像仪观察温度变化。
2.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于，对材料的表征进行检测的方式包括：
利用透射电镜对AuAg NPs和AuAg@PC-Fe NPs的形态和结构进行分析；
通过动态光散射(DLS)记录尺寸分布，并使用Zetasizer仪器测定zeta电位；
进行x射线能谱(EDS)图谱和紫外-可见吸收光谱分析。
3.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于：在激光照射时，使用FLIR热成像仪(FLIRA-E50，美国)采集实时温度和红外图像。
4.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于：在确定AuAg@PC-Fe的抗炎机制时，利用Western blot检测抗氧化蛋白表达水平的方式：在冰中提取，用BCA蛋白测定试剂盒定量测定总蛋白；
经过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到聚偏氟乙烯膜上，在室温下封闭1小时；
将含有蛋白的膜用p-PI3K (1:2000),PI3K (1:2000,p-Akt (1:1000), p-Akt (1:1000), Akt (1:1000)， p-Nrf2 (S40) (1:2000;亲和力),Nrf2 (1:20 00;亲和力)，然后用辣根过氧化物酶偶联二抗体(1:1000;室温下保温1小时；
蛋白经ECL试剂盒(Beyotime)处理后在凝胶成像分析系统中可视化。
5.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于：Step8中的实验分为六组，其分别为：
(1)空白对照组；
(2)炎症对照组；
(3)AuAg；
(4)AuAg@PC-Fe；
(5)AuAg+NIR；
AuAg@PC-Fe+NIR (n = 6)。
6.根据权利要求1所述的一种金属多酚改性的金银纳米粒子制备方法，其特征在于：在Step8中：需使用苏木精-伊红(H&E)染色和Masson染色后，才可在光镜下观察切片，计数炎症细胞和胶原纤维数量；
利用免疫组化染色检测组织中炎性细胞因子TNF-α和IL-1β，显微镜下观察和捕获图像，随机计数各组蛋白阳性细胞数；
利用real-time PCR检测组织中促炎细胞因子(IL-1β、TNF-α和IL-6)和抗炎细胞因子(IL10、TNF-β和Arg-1) mRNA的表达。
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- 2022-10-26 CN CN202211315939.8A patent/CN115671281A/zh active Pending
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