CN115671049A - 一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的s/o/w三重纳米乳液及其制备方法和应用 - Google Patents
一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的s/o/w三重纳米乳液及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液及其制备方法和应用，属于多重乳液技术领域。本发明依据体内消化液中酶、pH等多因素对纳米颗粒界面层的响应，通过构建食品级纳米颗粒界面结构，在消化过程中，胃部的蛋白酶和胃酸主要作用于表面的水相层酪蛋白酸钠，当酪蛋白酸钠被水解后，剩余的S/O乳液会被转运到小肠，小肠中的胆汁盐，脂肪酶和胰酶作用于中层的油相和两性离子表面活性剂，释放里层的酪蛋白‑咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙。由于大肠和直肠的微生物代谢发酵相较于胃和小肠会慢很多，在微生物的作用下发酵纳米颗粒表面的海藻酸钙和咖啡酸苯乙酯‑酪蛋白，靶向的传递咖啡酸苯乙酯到结直肠。
Description
技术领域
本发明涉及多重乳液技术领域，特别涉及一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着人们对红肉(猪肉、牛肉和羊肉)制品食用量的增加，富余蛋白质、脂肪等物质在结直肠环境中经细菌分解，产生亚硝酸盐、吲哚、硫化物等有机小分子化合物，可能会引发结直肠炎症，严重的话还会导致结肠癌，危害人类健康。
研究发现，蜂胶中的主要生物活性成分咖啡酸苯乙酯(CAPE)，具有消炎、清除自由基的生物活性，能显著改善结直肠微环境，对结直肠炎有一定的治疗效果。
为避免在胃中直接分解释放，CAPE常以乳液的方式进行给药。而目前CAPE的乳液体系主要是单层的纳米体系，例如CAPE-PLGA(Poly lactic-co-glycolic acid)纳米体系，CAPE-牛奶纳米体系，CAPE-磁性蛋白纳米体系，CAPE-精油-蛋白纳米体系，CAPE-脂肪酸酯纳米微胶囊体系。然而，以上单层纳米体系会被胃肠道中的蛋白酶、胆汁盐、脂肪酶和胰酶消化分解，在小肠中释放出小分子CAPE，这适用于小肠靶向递送体系的开发，但结直肠位于人体消化道的末端，单层传递体系难以到达。
发明内容
有鉴于此，本发明目的在于提供一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液及其制备方法和应用，本发明提供的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液能够在结直肠靶向释放CAPE小分子物质。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，包括分散相和连续相；所述分散相自内至外依次包括固相层、油相层和水相层，所述固相层包括酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒，所述油相层包括椰子油，所述水相层包括酪蛋白酸钠，所述油相和水相通过两性离子表面活性剂结合；所述连续相为水；
所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒包括内核和壳层，所述内核为酪蛋白负载咖啡酸苯乙酯，壳层为海藻酸钙。
优选的，包括以下质量份数的组分：
优选的，所述两性离子表面活性剂为卵磷脂。
优选的，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒中，酪蛋白钙、咖啡酸苯乙酯与海藻酸钠的质量比为0.1～0.2:9:12.5。
优选的，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的粒径为120～150nm；
所述分散相的粒径为150～200nm。
本发明提供了上述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：
提供酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒；
将所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒与椰子油超声混合，得到S/O脂质体；
将酪蛋白酸钠、两性离子表面活性剂与水混合，得到水相；
将所述S/O脂质体与水相均质混合，得到靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液。
优选的，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将酪蛋白与缓冲溶液混合，得到酪蛋白溶液；
将所述酪蛋白溶液、咖啡酸苯乙酯的醇溶液、海藻酸钠溶液、可溶性钙盐依次混合，冻干，得到酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒。
优选的，所述超声混合的功率为500～800W，时间为4～6min。
优选的，所述均质混合的速率为20000～25000psi，时间为4～6min。
本发明提供了上述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液在制备结直肠抗炎药物中的应用。
本发明提供了一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，包括分散相和连续相；所述分散相自内至外依次包括固相层(S)、油相层(O)和水相层(W)，所述固相层包括酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙，所述油相层包括椰子油，所述水相层包括酪蛋白酸钠，所述油相和水相通过两性离子表面活性剂结合；所述连续相为水；所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒包括内核和壳层，所述内核为酪蛋白负载咖啡酸苯乙酯，壳层为海藻酸钙。在本发明中，所述咖啡酸苯乙酯(CAPE)具有抗结直肠炎症活性；酪蛋白作为载体蛋白，能够作为水溶性的药物载体传递疏水性的咖啡酸苯乙酯；海藻酸钙作为咖啡酸苯乙酯的包裹壳层，能够避免咖啡酸苯乙酯的过早分解。本发明依据体内消化液中酶、pH等多因素对纳米颗粒界面层的响应，通过构建食品级纳米颗粒界面结构，在消化过程中，胃部的蛋白酶和胃酸主要作用于表面的水相层酪蛋白酸钠，胃中蛋白酶难以消化油脂，因此当酪蛋白酸钠被水解后，剩余的S/O乳液会被转运到小肠，小肠中的胆汁盐、脂肪酶和胰酶作用于中层的油相和两性离子表面活性剂，油相和两性离子表面活性剂被乳化降解后释放出里层的酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙，这种释放可能在小肠中也可能在大肠中发生。然而，即使在小肠中释放，纳米颗粒表面的海藻酸钙外壳也会先降解，而将咖啡酸苯乙酯-酪蛋白复合物传达到大肠中去。由于大肠和直肠的微生物代谢发酵相较于胃和小肠会慢很多，在微生物的作用下发酵纳米颗粒表面的海藻酸钙和咖啡酸苯乙酯-酪蛋白，靶向的传递咖啡酸苯乙酯到结直肠。本发明提供的S/O/W三重纳米乳液水油界面层具有非常低的表明张力，纳米体系非常稳定。
本发明提供了上述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液的制备方法，此法操作简单，成本低廉，适用于工业化批量生产。
附图说明
图1为S/O/W三重纳米乳液的油水界面张力图；
图2为S/O/W三重纳米乳液粒径图；
图3为S/O/W纳米乳液的扫描电镜图；
图4为S/O/W纳米乳液的透射电镜图；
图5为S/O/W三重纳米乳液的傅里叶红外变换图；
图6为S/O/W三重纳米乳液的pH稳定性测试结果；
图7为不同牛磺胆酸钠浓度下S/O/W三重纳米乳液的实物图；
图8为S/O/W三重纳米乳液在不同温度下贮存15天图像；
图9为S/O/W三重纳米乳液在不同温度下贮存15天的共聚焦图像；
图10为小鼠胃、小肠、大肠和结肠内容物的共聚焦激光显微镜图像；
图11为消化道内容物冻干后在扫描电子显微镜图像；
图12为S/O/W乳液乳剂在体内消化的示意图。
具体实施方式
本发明提供了一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，包括分散相和连续相；所述分散相自内至外依次包括固相层、油相层和水相层，所述固相层包括酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒，所述油相层包括椰子油，所述水相层包括酪蛋白酸钠，所述油相和水相通过两性离子表面活性剂结合；所述连续相为水；
所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒包括内核和壳层，所述内核为酪蛋白负载咖啡酸苯乙酯，壳层为海藻酸钙。
在本发明中，以质量份数计，所述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液包括：
以质量分数计，本发明提供的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液包括3～5份酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒，优选为4份。在本发明中，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒包括内核和壳层，所述内核为酪蛋白负载咖啡酸苯乙酯，壳层为海藻酸钙。在本发明中，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒中，酪蛋白钙、咖啡酸苯乙酯与海藻酸钠的质量比优选为0.1～0.2:9:12.5。在本发明中，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的粒径优选为120～150nm，更优选为130～140nm。
在本发明中，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的制备方法，优选包括以下步骤：
将酪蛋白与缓冲溶液混合，得到酪蛋白溶液；
将所述酪蛋白溶液、咖啡酸苯乙酯的醇溶液、海藻酸钠溶液、可溶性钙盐混合，冻干，得到酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒。
本发明优选将酪蛋白与缓冲溶液混合，得到酪蛋白溶液。在本发明中，所述缓冲溶液优选为PBS缓冲溶液，所述PBS缓冲溶液的浓度优选为0.05mol/L，pH值优选为7.0。
本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中，所述酪蛋白溶液的浓度优选为1～2wt％，更优选为1.5wt％。
本发明优选将所述酪蛋白溶液、咖啡酸苯乙酯的醇溶液、海藻酸钠溶液、可溶性钙盐依次混合，冻干，得到酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙。在本发明中，所述咖啡酸苯乙酯的醇溶液优选为咖啡酸苯乙酯的乙醇溶液。在本发明中，所述咖啡酸苯乙酯的醇溶液的浓度优选为1.2～1.8mg/mL，更优选为1.4～1.6mg/mL。在本发明中，所述咖啡酸苯乙酯(CAPE)化学式为C17H16O4，其化学名为3-(3’,4’-二羟基苯基)-2-丙烯酸苯乙醇酯，是天然蜂胶中的一种多酚类化合物，分子中有两个邻位酚羟基具有生物活性，能抗氧化，抗炎，抑制肿瘤等功效。
在本发明中，所述海藻酸钠溶液为海藻酸钠的水溶液；所述海藻酸钠溶液的浓度优选为0.9～1.25mg/mL，更优选为1～1.1mg/mL。在本发明中，海藻酸钠是一种纤维素，可以和Ca2+物理交联形成复合物耐受胃蛋酶的消化和降解。
本发明优选先将酪蛋白溶液、咖啡酸苯乙酯的醇溶液、海藻酸钠溶液加热混合，再加入可溶性钙盐。在本发明中，所述加热混合的温度优选为75～80℃，时间优选为40～50min。在本发明中，所述加热混合优选在搅拌的条件下进行。
在本发明中，所述可溶性钙盐优选为CaCl2。本发明优选以水溶液的形式加入所述可溶性钙盐。
在本发明中，所述酪蛋白溶液、咖啡酸苯乙酯的醇溶液、海藻酸钠溶液、可溶性钙盐水溶液的体积比优选为10mL:5mL:10mL:20μL。
在本发明中，所述混合的方式优选为均质混合。在本发明中，所述均质混合的速率优选为15000～20000rpm，更优选为18000rpm；时间优选为8～10min。
在本发明中，所述均质混合后，本发明优选进行二次均质混合。在本发明中，所述二次均质混合的速率优选为18000～2000psi，时间优选为5～10min，更优选为6～8min。
所述混合后，本发明优选对所得混合液进行冷冻干燥，得到酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒。
以所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的质量分数为基准，本发明提供的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液包括70～80份的椰子油，更优选为75份。在本发明中，椰子油主要成分是中链脂肪酸(月桂酸占有50％以上)，在胆汁盐和脂肪酶的作用下分解利用较慢。
以所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的质量分数为基准，本发明提供的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液包括10～15份的酪蛋白酸钠，更优选为13份。在本发明中，所述酪蛋白酸钠分子内部具有大量的疏水基团，在分子的自由热运动过程中，疏水基团会因为疏水作用与椰子油发生吸附来降低界面张力。
以所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的质量分数为基准，本发明提供的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液包括20～30份的两性离子表面活性剂，更优选为25份。在本发明中，所述两性离子表面活性剂优选为卵磷脂。
以所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的质量分数为基准，本发明提供的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液包括870～897份的水，优选为874份。
在本发明中，所述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液中，所述分散相的粒径优选为150～200nm。
本发明提供了上述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：
提供酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒；
将所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙与椰子油超声混合，得到S/O脂质体；
将酪蛋白酸钠、两性离子表面活性剂与水混合，得到水相；
将所述S/O脂质体与水相均质混合，得到靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液。
在本发明中，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的制备方法与上文相同，在此不再赘述。
本发明将所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙与椰子油超声混合，得到S/O脂质体。
在本发明中，所述超声混合的功率优选为500～800W，更优选为600～700W，时间优选为4～6min，更优选为5min。所述超声混合后，本发明优选将所得S/O脂质体置于4℃条件下冷藏。
本发明将所述S/O脂质体与水相均质混合，得到靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液。
在本发明中，所述均质混合的速率优选为20000～25000psi，更优选为22000～24000psi；时间优选为4～6min，更优选为5min。本发明优选使用纳米微射流均质机进行所述均质。在本发明中，所述均质前，本发明优选进行预均质，所述预均质的速率优选为18000～20000rpm，时间优选为2～3min。
本发明提供了上述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液在制备结直肠抗炎药物中的应用。本发明依据体内消化液中酶、pH等多因素对纳米颗粒界面层的响应，通过构建食品级纳米颗粒界面结构，在消化过程中，胃部的蛋白酶和胃酸主要作用于表面的水相层酪蛋白酸钠，胃中蛋白酶难以消化油脂，因此当酪蛋白酸钠被水解后，剩余的S/O乳液会被转运到小肠，小肠中的胆汁盐，脂肪酶和胰酶作用于中层的油相和两性离子表面活性剂，油相和两性离子表面活性剂被乳化降解后释放出里层的酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙，这种释放可能在小肠中也可能在大肠中发生。然而，即使在小肠中释放，纳米颗粒表面的海藻酸钙[请老师核实是海藻酸钠还是海藻酸钙]外壳也会先降解，而将咖啡酸苯乙酯-酪蛋白复合物传达到大肠中去。由于大肠和直肠的微生物代谢发酵相较于胃和小肠会慢很多，在微生物的作用下发酵纳米颗粒表面的海藻酸钙和咖啡酸苯乙酯-酪蛋白，靶向的传递咖啡酸苯乙酯到结直肠。本发明提供的S/O/W三重纳米乳液水油界面层具有非常低的表明张力，纳米体系非常稳定。
下面结合实施例对本发明提供的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液的制备
材料来源：CAPE(纯度>99％)购置于阿拉丁(CAS:104594-70-9，中国，上海)，酪蛋白(Casein)来源于牛奶(购置于加拿大)；海藻酸钠购置于阿拉丁(中国，上海)，氯化钙购置于科隆(中国，成都)。大豆卵磷脂(CAS:8002-43-5，纯度≥98％)、酪蛋白酸钠(CAS:9005-46-3，来自牛奶)、椰子油(CAS:8001-31-8，来自椰子)购自阿拉丁(中国上海)。
(1)制备酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒(Ca-Casein-CAPE-NaAlg，以下简称纳米颗粒)
将酪蛋白(casein)溶解在0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.0)中，生成2％(w/v)的酪蛋白溶液。将5mL CAPE溶液(溶于100％乙醇中形成1.8mg/mL)加入10mL酪蛋白溶液中并搅拌4h。然后，将10mL海藻酸钠溶液(NaAlg，浓度为1.25mg/mL)添加到混合物中，在80℃下加热40min并搅拌。将20μL CaCl2溶液(1mol/L)溶解在上述混合物中并用TRA-TURRAXT25均质器(IKA，Staufen，Germany)在20，000rpm下处理10min，随即在纳米微射流均质机(NoozleTechnology，上海，中国)上以20,000psi均质5min，Ca-casein-CAPE-NaAlg纳米颗粒通过在4℃下离心(10,000×g)40min进行分离，重复3次以清除过量的海藻酸钠，收集沉淀并重新悬浮在30mL PBS缓冲盐水(pH＝7.0)，将制备的纳米颗粒悬浮液冷冻干燥以收集颗粒。
(2)制备靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液(以下简称S/O/W乳液)
将0.03mg冷冻干燥的纳米颗粒重新分散到0.8g椰子油中，并超声(Scientz-IID，宁波SCIENTZ，中国)5min。然后在4℃下冷藏10min，以确保纳米颗粒的外表面完全形成涂有椰子油的S/O脂质体。将0.13g酪蛋白酸钠与8.74g超纯水混合，添加0.3g卵磷脂制备成卵磷脂和酪蛋白酸钠混合液，最后与S/O脂质体混合形成共重10g的S/O/W混合物，用
T18(IKA，德国)以20,000rpm的恒定速度旋转2min进行均质化，接下来在纳米微射流均质机(Noozle Technology，上海，中国)上以25,000psi均质5min，以获得S/O/W乳液。
测试例1结构表征与性能测试
(1)O/W界面层评价
为了制备稳定的S/O/W三重纳米乳液，对油相和水相之间的界面层的稳定性进行评价。由于水油界面层之间存在张力，张力越小，两相间越稳。因此，可以通过比较超纯水、卵磷脂溶液、酪蛋白酸钠溶液和酪蛋白-卵磷脂混合溶液与椰子油之间的界面张力，来评价乳液O/W界面层的稳定性。具体方法如下：
使用悬滴法测量椰子油和纯水，卵磷脂溶液，酪蛋白酸钠溶液以及酪蛋白酸钠和卵磷脂混合溶液之间的界面张力。首先用三甲基氨基甲烷盐酸盐溶液浸泡光学石英比色皿48h，然后用超纯水清洗并干燥。将超纯水、酪蛋白酸钠溶液、卵磷脂溶液、酪蛋白酸钠和卵磷脂混合溶液分别放入装有不锈钢针(内径为1.65mm)的注射器中，然后轻轻挤压注射器，在椰子油中形成滴状(30μL)，光学接触角测量仪(OCA20，德国)记录了W/O界面的变化，并用Young-Laplace方程计算界面张力，每个样品的测量时间为5min。
所得油水界面张力图如图1所示。图1中，自上而下依次为：油和水的界面张力、油和卵磷脂溶液的界面张力、油和酪蛋白酸钠溶液的界面张力以及油和卵磷脂与酪蛋白酸钠缓和溶液的界面张力。
由图1可以看出，当椰子油在超纯水中时界面张力为6.58mN/m，随着时间的增加，界面张力逐渐下降到6.35mN/m。椰子油在卵磷脂溶液中时界面张力可下降到4.46mN/m。这是由于卵磷脂是双亲性化合物，其脂肪酸一端会伸入油相中保持稳定，从而降低界面张力。而酪蛋白酸钠溶液与椰子油间的界面张力为3.18mN/m，这是由于酪蛋白酸钠分子内部具有大量的疏水基团，在分子的自由热运动过程中，疏水基团会因为疏水作用与椰子油发生吸附来降低界面张力。不过当椰子油在卵磷脂-酪蛋白酸钠混合溶液中时，界面张力降低到0.8mN/m，这可能由于酪蛋白酸钠和卵磷脂两者均具有双亲性，当与油相混合时，可共同吸附在油相表面，形成稳定的界面层。已有研究也表明这种油相和水相间的稳定的界面层可能是通过氢键或疏水作用降低了界面张力。因此，酪蛋白钠-卵磷脂的混合物作为表层能够显著降低与椰子油之间的界面张力，从而提高S/O/W乳液的稳定性。
(2)平均粒径，PDI和ζ电位测量
用超纯水稀释100倍的乳液稀释液，使用Zetasizer(Zetasizer Nano ZS，Malvern，Worcestershire，UK)来测量新鲜样品的平均粒径、PDI和ζ电位值，实验在25±0.1℃下进行三次测量，溶液的粘度为0.8872cP，折射率为1.330。S/O/W三重纳米乳液粒径图如图2所示。
由图2可以看出，成功制备的S/O/W三重纳米乳液粒径为155.5±0.72nm，PDI为0.24±0.01，体系具有良好的纳米粒径和分散度。酪蛋白酸钠吸附在椰子油表面形成三维空间位阻，防止油相团聚，形成纳米级的小乳液颗粒，三维空间位阻的形成会阻碍油相的运动，促进油相在乳液体系中的分散，存在良好的PDI。酪蛋白酸钠广泛用作乳化剂，能通过静电和空间排斥作用稳定乳状液，这是由于酪蛋白酸钠中COO-离子会引起的乳液体系的ζ电势降低。测定出乳液ζ电势为-48.1±3.23mV，就ζ电势理论而言，电位绝对值高于30mV则具有稳定的体系，较低ζ电势说明纳米乳具有优异的稳定性。
(3)形貌表征
使用超纯水将新制备的乳液样品稀释10倍，并将一滴稀释的溶液置于200目碳包覆铜网格上，用HT7700透射电子显微镜(日本，东京，日立)在80kV的工作电压下以25000倍的放大率拍摄乳液的表面形状。使用双面胶带将S/O/W纳米乳液的冷冻干燥粉末固定在铝短截线上，涂上金/钯薄膜(10nm)，然后在10kV的加速电压下检查。用扫描电子显微镜在20，0000倍放大下记录纳米乳液的外观形貌。
S/O/W纳米乳液的扫描电镜图像如图3所示，透射电镜图像如图4所示。
从SEM图(图3)可以看出，多个纳米颗粒堆叠在一起，有聚集现象，表面出现凹凸不平的皱褶，是由于冻干过程中小液滴之间由于表面水分的蒸发，原来水分子存在的位置就可能被里层的表面活性剂所占据，表面活性剂与其他液滴表面的酪蛋白酸钠发生了吸附。在Chavoshpour Natanzi的研究中，也描述了这种因干燥过程造成的纳米颗粒聚集。而在透射电镜图(图4)中，可以看到纳米乳粒中心为白色圆形颗粒，外表被一层灰黑色的物质包裹，粒径约为150～200nm，与SEM的数据相似。
(4)傅里叶变换红外光谱(FT-IR)
傅里叶变换红外光谱是用于确定物质结构，通过不同的官能团来识别物质的不同成分以及键键结合方式。分析使用带有衰减全反射(ATR)探针的傅里叶红外变换FT-IR(Spectrum Two，PerkinElmer，Waltham，USA)记录样品的FT-IR光谱。用超纯水清洗ATR探针，并在室温下扫描背景。称取100mg的重量制备纳米颗粒、椰子油、S/O脂质体、卵磷脂和酪蛋白酸钠结合物、S/O/W乳液粉末的冻干粉末，并在70Pa的压力下测量。在4000～650cm-1的波数下，以4cm-1的分辨率分析所有光谱，并进行16次扫描。所得傅里叶变换红外光谱如图5所示，图5中，曲线自上而下依次为CAPE、Ca-casein-CAPE-NaAlg纳米颗粒、椰子油、S/O脂质体、卵磷脂和酪蛋白酸钠、卵磷脂和酪蛋白酸钠混合物、S/O/W乳液。
在纳米颗粒中，3467cm-1和3278cm-1是CAPE的O-H特征峰，酪蛋白在1633cm-1和1532cm-1处的特征峰是酰胺Ⅰ带(C＝C拉伸振动)和酰胺Ⅱ(N-H对称振动)带，这表明CAPE被纳米粒子成功地包封。在椰子油中，在2955cm-1处为-C-N-(CH3)拉伸峰，在2924cm-1处为-CN-(CH2)不对称拉伸峰，在2852cm-1处为-C-N-(CH2)对称拉伸峰，在1740cm-1处为-C＝O拉伸峰，在1465cm-1处为-C-H(-CH2)弯曲剪切，在1173cm-1处为-C-O拉伸。在S/O纳米脂质体中，椰子油的这些特征峰几乎保持不变，但在1622cm-1处出现了一个特征峰，这是纳米颗粒在1633cm-1附近的特征峰，这表明纳米粒子被成功嵌入。
在卵磷脂-酪蛋白酸钠溶液中，1737cm-1为卵磷脂C＝O伸缩的特征峰，酪蛋白酸钠的酰胺Ⅰ带(C＝C)的特征峰从1633cm-1变成了1644cm-1，表明酪蛋白酸钠和卵磷脂之间发生了结合，并且酰胺Ⅰ带发生了蓝移，说明其疏水性增强，这可能是结合了卵磷脂。酪蛋白酸钠中酰胺Ⅱ带(N-H)的特征峰从1532cm-1转移到了1519cm-1，酰胺Ⅱ带(N-H)发生了红移，说明其亲水性增强，这也是与卵磷脂结合后的效果。在S/O/W纳米乳液中(绿色)发现，酪蛋白酸钠的酰胺Ⅰ带(C＝C)的特征峰仍然是在1644cm-1，这说明加入椰子油后对其影响不显著，但酰胺Ⅱ带峰从1519cm-1移到1535cm-1，表明其疏水性的增强，可以认为以卵磷脂-酪蛋白酸钠溶液为水相可增加与椰子油的亲和力。以上结果表明，成功制备了包含固相纳米颗粒、油相和水相的S/O/W纳米乳液。
(5)稳定性测试
①pH稳定性研究
5mL新鲜乳液样品(pH＝7.38)作为对照，用0.01M盐酸调节pH值至2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00，收集乳液外观。用超纯水将纳米乳液稀释100倍，然后用Zetasizer(Zetasizer Nano ZS，Malvern，Worcestershire，UK)收集乳液的粒径，PDI和ζ电位的变化，同时记录乳液的外观变化。
所得结果如图6所示，图6中，A为S/O/W乳液在不同pH值(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、7.4)下图像，B为S/O/W在不同p H值(2.0、3.0、6.0、7.0、7.4)下的储能模量(G')，C为S/O/W在不同p H值(2.0、3.0、6.0、7.0、7.4)下的损耗模量(G”)。
由图6可以看出，所制备的S/O/W纳米乳液在不同pH值下呈现不同的状态，当pH为6.0～7.4时，乳液呈现流体状态，粒径、PDI和ζ电势(数据见表1)均无显著变化(P＞0.05)。当pH在4.0和5.0时，出现了明显相分离现象，这可能是酪蛋白酸钠经过等电点(pH＝4.5)，导致酪蛋白酸钠聚集，从乳液中分离出来。在pH值为4.00～5.00之间时，粒径和PDI数据的结果表明乳液表面电位发生了显著变化(P<0.05)，乳液液滴表面的电势显著减小，液滴之间的空间位阻难以维持，乳液因此发生聚集和絮凝。而在pH为2.0和3.0时，乳液体系此时表现为一种凝胶状，难以流动，pH 2.0和3.0时乳液的ζ电势由负电变为正电，这是由表面酪蛋白酸钠在酸性条件下带正电引起的，随着pH值逐渐远离等电点(pH＝4.5)，表面的酪蛋白酸钠再次溶解，pH越低，纳米乳液的ζ电势正向增加，聚集液滴之间的静电排斥力增加，纳米乳液液滴的尺寸越小，这与粒径的结果一致。通过流变仪可测定乳液的储能模量G′和损耗模量G″，储能模量G′表示乳液的可逆程度；损耗模量G″代表乳液的不可逆性和变形程度。如图6中C所示，在pH 6.0～7.4时，损耗模量G″均大于储能模量G′，乳液仍能维持流体状态。pH4.0～5.0时，由于乳液已经出现絮凝并发生相分离，因此没有测定pH 4.0-5.0的储能模量G′和耗损模量G″。在pH 2.0和3.0时(图6中B)，纳米乳液的储能模量G'大于损耗模量G”，乳液处于水凝胶状态，这可能是由于pH降低过程中，小粒径纳米乳液重新悬浮于水相中，悬浮在水相中的乳液液滴增多，甚至有可能在液滴与液滴之间形成三维网状结构，纳米乳液体系的内能变大，使整个乳液体系变稠。
表1乳液在不同pH下粒径、多分散性指数和Zeta电势
a,b,c为同一行不同字母的±SEM显示出统计上的显著差异(p<0.05).
②牛磺胆酸盐的影响
将4mL新鲜制备的乳液样品加体积为1mL，浓度为0、25、50、100、200、300mg/mL牛磺胆酸钠溶液，摇晃均匀后，静置40min，用超纯水稀释100倍测定不同盐浓度对乳液的影响。并用Malvern Zetasizer(Zetasizer Nano ZS，Malvern，Worcestershire，UK)测量乳液粒径、PDI和ζ电位的变化，进而采集乳液外观的变化。
所制备的S/O/W纳米乳液在不同浓度的牛磺胆酸钠溶液(0、25、50、100、200、300mg/mL)中静置4h后，乳液状态如图7所示，在胆酸盐浓度为25mg/mL和50mg/mL时，纳米乳液的外观没有显著变化。在100-300mg/mL时，纳米乳液显示出明显的分层。粒径数据分析的结果(表2)也表明随着胆酸盐浓度的增大，S/O/W乳液的粒径逐渐减小，PDI的数据则呈现先减小后增大的趋势，而ζ电位却没有显著变化。
表2乳液在不同浓度牛胆汁酸钠下粒径、多分散性指数和Zeta电势表
a,b,c为同一行不同字母的±SEM显示出统计上的显著差异(p<0.05).
③温度影响
新鲜样品用巴氏杀菌法在75℃下处理30分钟，在4℃、25℃下保存15天，每个温度下3份5mL新鲜样品，然后每5天收集1mL样品乳液外观、收集后用超纯水稀释至100倍，在Malvern Zetasizer(Zetasizer Nano ZS，Malvern，Worcestershire，UK)电位仪上测定粒径、PDI和ζ电位的变化。并用超纯水将乳液稀释100倍，在激光共聚焦显微镜(CLSM)(TCSSP5ⅱ，徕卡，德国)上收集贮存15天的样本乳液形态。
S/O/W纳米乳液在4℃和25℃下表现出不同的贮藏状态如图8所示。由图8可以看出，样品在4℃保存15天后外观未出现明显分层，而在25℃保存15天后外观出现明显分层，这可能是因为较高的温度导致油相从S/O/W乳液中暴露出来。贮存期间的粒径、PDI和电位变化如表3所示，其中粒径和电位有增加的趋势，PDI具有降低的趋势，这可能是保存过程中，在静电引力的作用下小液滴逐渐向大液滴靠近并发生聚集，形成粒径更大的乳液体系，但是溶液中液滴的粒径更加的均匀。在25℃下贮藏时，粒径、PDI和电位均呈上升趋势，这种现象可以描述为奥斯特瓦尔德成熟和聚集，较小的液滴会变的越来越小，最后消失并附着在较大的液滴上，乳液既发生了破乳也发生絮凝和聚集，较大的液滴会越来越大。
表3乳液在不同温度下贮藏15d粒径、多分散性指数和Zeta电势表
(6)共聚焦显微镜(CLSM)
为了解贮藏过程中乳液界面的变化，采用DAPI标记的Ca-Casein-CAPE-NaAlg纳米颗粒(蓝色荧光)，尼罗红标记的椰子油(红色荧光)和异硫氰酸荧光素(FITC)标记的酪蛋白酸钠(绿色荧光)制备的S/O/W纳米乳液为样品，经共聚焦显微镜观察的结果如图9，图9中，蓝色为DAPI标记的纳米颗粒层；红色为尼罗红标记的椰子油层；绿色为异硫光素标记的酪蛋白酸钠层。与新鲜制备的S/O/W纳米乳液相比，在4℃贮存15天后，仍然可观察到三种荧光信号，说明S/O/W纳米乳液的界面结构仍然完整，但具有明显的絮凝和聚集现象。在25℃贮存15天后，红色荧光几乎不存在，只检测到绿色荧光和蓝色荧光，且光点基本不重合，表明S/O/W纳米乳液的界面结构已破坏，油相已与水相分离，所以很难在同一区域检测到红色荧光信号。因此实验表明所制备的S/O/W纳米乳液在4℃下具有更长的贮存时间。
测试例2体内消化研究
12只昆明种(KG)小鼠(体重28±2g)购自成都达硕实验动物有限公司，KG小鼠在实验前禁食24小时，并用蒸馏水喂养。给每只小鼠灌胃0.5mL标记的纳米乳剂(DAPI标记纳米颗粒，尼罗红标记椰子油，异硫氰酸荧光素异构体ⅰ标记酪蛋白酸钠)。每隔1h灌胃一次，总共灌胃12次，共计12h后脱颈处死小鼠，取出解剖小鼠胃、小肠、大肠和结肠。用超纯水将消化道内容物快速冲洗到离心管中，立即-20℃冷藏，在激光共聚焦显微镜(CLSM)收集数据，操作需要在24小时内完成。10μL小鼠消化物的吸取在干净的载玻片上，并用盖玻片覆盖，等待样品干燥，用激光共聚焦显微镜在三种不同的光路通道激发观察。取1mL不同消化时间段小鼠消化残渣冷冻干燥，用扫描电镜观察其形态。
通过胃排空时间和通过小肠时间来确定口服后到达结肠的时间。由于小肠的通过时间相对恒定(约3～4小时)，通常不会受到产品性质的影响，因此12小时的延迟时间可完成胃至结肠中内容物的收集。分别收集消化1h后的胃内容物、消化4h后的小肠内容物、消化8h后的大肠和结肠内容物，在激光共聚焦显微镜下分别用蓝色荧光(DAPI标记的Ca-Casein-CAPE-NaAlg纳米颗粒的信号)、红色荧光(尼罗红标记的椰子油)和绿色荧光(FITC(异硫氰酸荧光素)标记的酪蛋白酸钠)对消化道内容物进行观察，结果如图10所示。消化道内容物冻干后在扫描电子显微镜下观察，结果如图11所示，图11中，(a)为胃，(b)为小肠，(c)为大肠，(d)为结肠。
在消化1h的胃部收集物中均可看到蓝色、绿色和红色三种荧光，表明外层酪蛋白酸钠没有被完全消化。绿色荧光和红色荧光散布在蓝色荧光周围，内容物的粒径约为50～100μm，这表明乳液已在胃内絮凝。同时胃内容物的Zeta电位也变为+200mV(S/O/W乳液的Zeta电位为-48.1±3.32mV)，这可能是由于乳液进入胃部后，因为胃蛋白酶吸附在乳液表面水解酪蛋白钠，消除其表面电荷使电位发生变化，导致乳液空间位置和静电屏障无法维持；同时由于胃蛋白酶和胃液的腐蚀，乳液表面的界面张力会降低，最终引起S/O/W三重纳米乳液发生絮凝。此外，由于胃部的pH＝2.0，而乳液稳定性的实验也证明，S/O/W纳米乳经历pH值的急剧变化，在酸性和极酸性条件下会发生絮凝和聚集。这种絮凝是由于乳液形成了具有高内相的三维结构凝胶，且无法完全逆转，并导致乳液粒径增加。而SEM的结果也证明胃内容物中的乳液已发生絮凝和聚集，粒径约为100μm。
消化3h后的小肠内容物中可观察到红色和蓝色荧光，而绿色荧光十分微弱。这表明经过胃部的消化，乳液表面的酪蛋白酸钠几乎完全被水解，此时乳液为以卵磷脂/椰子油为表面的S/O脂质体。共聚焦图像和SEM图像中都观察到纳米乳的粒径比胃中粒径较小(约为2μm)，是以一种乳糜的形式存在。小肠环境中胆酸盐可乳化脂肪，提高脂肪酶与油层界面的结合，加速脂肪消化，促进消化产物和囊泡形成了新的胶束。同时，已有的研究表明乳剂到达小肠后，胆汁盐和胰蛋白酶共同作用促进乳剂乳化成为新的胶束，降低了液滴与液滴之间的静电斥力和表面ζ电势，从而促进了乳液絮凝和聚集。此外，还有一种可能是S/O脂质体表面的脂肪被消化后，内部的Cas-CAPE-NaAlg纳米粒子表面的海藻酸钠吸收小肠中的水分，发生膨胀，也可引起乳液形成胶束。
消化8h后的大肠内容物中仅能观察到很强的蓝色荧光。这表明S/O/W乳液通过胃和小肠的消化，表面的酪蛋白酸钠和中间的卵磷脂/椰子油均被完全水解，释放出内部的Ca-Casein-CAPE-NaAlg纳米颗粒。在大肠内容物的SEM图中，可观察到大量的纤维状和颗粒状物质，也证明了S/O脂质体在小肠中并未被消化和吸收，而仅消化掉脂肪层，释放出Ca-Casein-CAPE-NaAlg纳米颗粒，并转运到了大肠。因此，Ca-Casein-CAPE-NaAlg纳米粒子表面的钙壳在大肠环境中可被肠道菌群降解，可释放出CAPE，并转运至结直肠。
不过在消化8h后的结肠内容物中仍可见少量蓝色荧光颗粒，这可能是还没有被微生物降解的纳米颗粒。有趣的是，在消化12h后的结肠内容物中，也有少量较大的不溶性物质可检测出3种荧光信号。这可能是S/O/W乳液在胃中转变成高内相的凝胶，使得消化酶或肠道菌都不易与其接触，从而无法消化。
体内消化的结果表明三重包埋的S/O/W纳米乳液可实现CAPE到结肠的靶向递呈，并可以实现12h的连续释放。S/O/W乳液乳剂在体内消化的示意图如图12所示，即新鲜样本进入胃部后，由于pH及胃蛋白酶的作用，发生了明显的絮凝和聚集，最外层的酪蛋白酸钠被水解。在小肠中，原本聚集的纳米乳液被重新乳化成为一种糜状物，并在脂肪酶作用下消化脂肪层，释放出内层的Ca-Casein-CAPE-NaAlg纳米颗粒。在大肠中，由于肠道菌群对纳米颗粒表面的蛋白和多糖发酵，释放出CAPE并抵达结肠。
结论
本发明使用纳米颗粒作为固体相，酪蛋白酸钠-卵磷脂溶液作为水相，椰子油作为油相制备S/O/W三重纳米乳液。接触角结果表明制备的S/O/W三重纳米乳液水油界面层具有非常低的表明张力，构建成稳定的纳米乳液体系。激光粒度仪，扫描电镜和透射电镜的结果表明，纳米乳液的分散相为155nm的球形液滴。XPS和FTIR数据结果表明水油界面层之间发生了明显的结合且CAPE被包埋在S/OW乳液体系中。研究表明S/O/W纳米乳液在pH为2.0～3.0时，储能模量G'大于耗损模量G”，主乳液呈现为凝胶状态；pH为6.00～7.4时，耗损模量G”大于储能模量G'，主要表现为乳液状态，且在pH 6.00至7.4之间能保持稳定。胆酸盐耐受程度的研究表明，该乳液在0～50mg/mL胆酸盐的条件下处于稳定状态，浓度越高，乳液会发生分层。温度影响研究结果表明，随着储藏时间的增加，4℃贮存的S/O/W乳液比25℃贮存的更稳定。乳剂在小鼠肠道消化结果表明，S/O/W三重纳米乳液界面层在胃部会发生聚集，在小肠会被胆汁盐等乳化成新的胶束，在大肠和结肠中释放出里层的CAPE，因此该系统可以有效地将小分子送到结直肠，为后续的结直肠靶向给药和乳剂制备提供了理论支持。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，包括分散相和连续相；所述分散相自内至外依次包括固相层、油相层和水相层，所述固相层包括酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒，所述油相层包括椰子油，所述水相层包括酪蛋白酸钠，所述油相和水相通过两性离子表面活性剂结合；所述连续相为水；
所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒包括内核和壳层，所述内核为酪蛋白负载咖啡酸苯乙酯，壳层为海藻酸钙。
2.根据权利要求1所述的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，其特征在于，包括以下质量份数的组分：
酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒3～5份；
3.根据权利要求1或2所述的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，其特征在于，所述两性离子表面活性剂为卵磷脂。
4.根据权利要求1或2所述的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，其特征在于，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒中，酪蛋白钙、咖啡酸苯乙酯与海藻酸钠的质量比为0.1～0.2:9:12.5。
5.根据权利要求1或2所述的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液，其特征在于，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的粒径为120～150nm；
所述分散相的粒径为150～200nm。
6.权利要求1～5任意一项所述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液的制备方法，包括以下步骤：
提供酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒；
将所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒与椰子油超声混合，得到S/O脂质体；
将酪蛋白酸钠、两性离子表面活性剂与水混合，得到水相；
将所述S/O脂质体与水相均质混合，得到靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：
将酪蛋白与缓冲溶液混合，得到酪蛋白溶液；
将所述酪蛋白溶液、咖啡酸苯乙酯的醇溶液、海藻酸钠溶液、可溶性钙盐依次混合，冻干，得到酪蛋白-咖啡酸苯乙酯@海藻酸钙复合纳米颗粒。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述超声混合的功率为500～800W，时间为4～6min。
9.根据权利要求6或8所述的制备方法，其特征在于，所述均质混合的速率为20000～25000psi，时间为4～6min。
10.权利要求1～5任意一项所述靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液或权利要求6～9任意一项所述制备方法制备得到的靶向传递咖啡酸苯乙酯的S/O/W三重纳米乳液在制备结直肠抗炎药物中的应用。
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- 2022-07-29 CN CN202210902177.5A patent/CN115671049B/zh active Active
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