CN115666568A - 小分子聚合酶抑制剂 - Google Patents

Abstract

本文公开了用于抑制RNA聚合酶、尤其是病毒RNA聚合酶的化合物。该化合物可有效治疗副粘病毒科病毒，尤其是麻疹病毒和人类副流感病毒。

Description

小分子聚合酶抑制剂

相关申请的交叉引用

本申请要求于2019年11月15日提交的美国临时申请62/935,896的权益，将其内容以其整体并入本文。

政府支持声明

本发明在美国国家过敏症和传染病研究所授予的A1071002号政府资助下完成。政府对本发明享有一定的权利。

技术领域

本发明涉及抑制RNA聚合酶、包括病毒RNA聚合酶的化合物。这些化合物特别适用于治疗各种副粘病毒，包括人类副流感和麻疹。

背景技术

负义RNA病毒的副粘病毒科(Paramyxoviridae)包含主要人类疾病的病原体，例如人类副流感病毒(HPIV；1-4型)和麻疹病毒(MeV)。HPIV是导致幼儿呼吸系统疾病住院的主要原因，使得美国每年超过70000人住院。在发展中国家，儿童HPIV感染与高得多的死亡率相关，估计每年有超过112000人死亡。免疫功能低下的个体，例如移植受体，特别容易罹患严重且往往致命的HPIV疾病，死亡率高达75％。既无疫苗也无有效的抗病毒药物来预防或治疗HPIV感染，因此开发一种有效的抗病毒药物成为迫切的临床需求。

估计3型HPIV(HPIV-3)每年在美国引起超过300万例就诊的急性呼吸道感染病例，是HPIV疾病最普遍的来源。针对病毒聚合酶的抗病毒疗法已成功用于对抗从HIV到流感病毒的各种病毒威胁。然而，聚合酶抑制剂的使用，特别是变构小分子抑制剂的使用，通常仅限于单一病毒种或属。

仍然需要针对所有类型病毒的改进的聚合酶抑制剂。仍然需要对多种病毒物种都有效的小分子抑制剂。仍然需要对副粘病毒科病毒有效的改进的小分子聚合酶抑制剂。

发明内容

一个或多个实施方式的细节在以下描述中阐述。从该描述和权利要求中，其他特征、目的和优点将是显而易见的。

附图说明

图1A-1G.GHP-88309的鉴定和初步表征。图1A，原始HPIV3 HTS筛选和命中候选者的复筛结果(放大区域)。图1B，GHP-88309的化学结构。图1C，重新合成的GHP-88309的生物活性和毒性分析。图1D，GHP-88309具有较宽的活性谱，涵盖两个属的副粘病毒(左图)。表总结了针对不同病毒靶标的EC₅₀和EC₉₀浓度和SI值(右图)。图1E，GHP-88309针对疾病相关原代人气道细胞上的HPIV3临床分离株的抗病毒活性。针对HBTEC评估GHP-88309对细胞增殖的影响(CC₅₀＝1mM)。图1F，MeV ToA研究。包括已知的MeV融合(AS-48)和MeV聚合酶(ERDRP-0519)抑制剂和宿主定向聚合酶抑制剂(JMN3-003)以供参考。图1G，GHP-88309对副粘病毒和肺病毒小基因组报告系统的抑制活性。在(图1C-1G)中，符号代表生物学重复，线则连接数据平均值。

图2A-2M.GHP-88309靶向L蛋白中的一个保守微结构域，其抑制RNA的从头(denovo)合成。图2A，从三种不同的靶病毒(HPIV3、MeV、SeV，分别为红色、蓝色和橙色刻度线)对GHP-88309的适配中鉴定出的已确认的抗性突变的示意性概览和汇总。图2A-2C，VSV L(PDB:5A22)模型上所有已确认的抗性突变的颜色编码图(图2B)。来自所有病毒靶标的热点在模板通道入口处的RdRP结构域和加帽结构域之间界定出一个微结构域(HPIV3，红色球；SeV，橙色球；MeV，蓝色球)。RdRP结构域的GDN活性位点显示为紫色球。(图2C)。d，将所有已确认的抗性突变匹配到HPIV3L抗性位点的同源性模型上。图2E，GHP-88309在MeV(蓝色)、SeV(橙色)和HPIV3(洋红色)的同源性模型中的计算机模拟对接揭示了GHP-88309和L微结构域之间的保守结合位姿。得分最高的对接位姿的叠加据显示位于HPIV3 L微结构域的前方，凭借RdRP结构域(青色)和加帽结构域(绿色)来着色。抗性位点以红色显示并标记。图2F，BLI用于测试GHP-88309与纯化的MeV L以及具有选定抗性突变的MeV L之间的直接相互作用。图2G，在(图2F)中测试的所有标准和抗性MeV L构建体的K_D值汇总。图2H-2J，感染后2小时(图2H；HPIV3)、4小时(图2I；HPIV3)或4小时(图2J；MeV)测量的GHP-88309对初始病毒mRNA转录的抑制。图2K，在感染细胞后3小时测量的GHP-88309对相对MeV Le RNA浓度的影响。图2L-2M，体外MeV RdRP测定产品经聚丙烯酰胺凝胶分级后的放射自显影图。反应包含纯化的MeV P-L蛋白、合成RNA模板和³²P-GTP示踪剂。浓度逐渐增加的GHP-883089不会阻止反向启动(back priming)后的3'RNA延伸(图2K)，但该化合物会抑制启动子处的RNA合成的从头启动(图2L)。与非活性L_N774A的反应用于特异性对照。在(图2H-K)中，符号代表生物学重复，列显示平均值±SD。通过单因素方差分析和Dunnett的多重比较事后检验来检验显著性。显示了各个P值。

图3A-3E.GHP-88309在气-液界面处生长的充分分化的人类气道上皮培养物(3D-ALI-HBTEC)中有效。图3A，浓度增加的GHP-88309对3D-ALI-HBTEC培养物中的跨上皮电阻(TEER)的影响。图3B，3D-ALI-HBTEC培养物与640μM GHP-88309温育后，共聚焦显微镜检查紧密连接完整性(αZO-1)。图3C-3D，在3D-ALI-HBTEC培养物中GHP-88309对HPIV3株JS和两种临床HPIV3分离株(10L3和9R4)(图3C)以及临床HPIV1分离株5F6(图3D)的抗病毒效力。以指定的浓度范围将化合物添加到基底外侧小室。图3E，HPIV3-JS感染的3D-ALI-HBTEC培养物的共聚焦显微镜检。染色纤毛细胞(αβ-微管蛋白)、HPIV3抗原(αHPIV3)和细胞核(DAPI)。以10μM添加到基底外侧室的GHP-88309是消毒性的。在(图3A、图3C-3D)中，符号代表生物学重复，线连接平均值。通过4参数变量斜率回归模型确定了GHP-88309的活性浓度(图3C-D)。

图4A-4E.GHP-88309的药代动力学(PK)表征。图4A，分别与小鼠或人血浆或小鼠或人肝脏微粒体温育后GHP-88309的稳定性。在所有测试条件下，GHP-88309的半衰期(t_1/2)经估算>15小时。阳性对照是普鲁卡因、苯氟雷司和维拉帕米。图4B，小鼠中单剂量口服与静脉注射的GHP-88309的PK研究。显示了选定的计算得到PK参数和口服生物利用度。图4C，GHP-88309在小鼠中的组织分布。以150mg/kg单次口服给药后90分钟提取指定的组织。d，以150mg/kg的剂量向小鼠多剂量施用GHP-88309后的血药水平，口服每日两次，总共4.5天。在峰值(Cmax；给药后0.5小时；蓝色)和谷底(给药后11.5小时；红色)采集血液。图4E，单次和多次口服GHP-88309(150mg/kg)后小鼠血液PK曲线的比较。来自(图4D)的多剂量动物，给药开始后第5天的样品。使用Dunnett的多重比较事后检验，通过双向ANOVA进行统计学分析。在整个过程中，符号代表生物学重复，线连接平均值(图4A、4B、4D、4E)。列代表数据平均值±SD(图4C)。

图5A-5H.GHP-88309在HPIV感染的SeV小鼠替代测定中有效。图5A-5E，对鼻内感染1.5x10⁵ TCID₅₀单位SeV的小鼠每日两次以150mg/kg给药后，GHP-88309的口服功效。在感染前两小时(预防性)或在感染后48小时(治疗性)开始治疗。每天监测临床体征(体重(图5A)和温度(图5B))。感染后9天计算存活率(图5E)。在感染后的第3、6和9天(pI天数)，测定了气管(图5C)和肺(图5D)中的病毒负荷。符号代表个体动物，线连接中位数。通过双因素方差分析和Dunnett的多重比较事后检验进行统计学分析。图5F，如(图5A-5E)中那样用GHP-88309处理后的模拟感染或SeV感染的小鼠的H&E染色后的代表性肺切片。感染后6天取出肺。比例尺代表100μm。黑色箭头指向免疫浸润部位。g，(图5E)所示的肺切片的组织病理学评分。在每种情况下，分析了3只动物的>16个不同切片。对于模拟感染的载体处理的图像，使用来自一只小鼠的6个不同切片。符号代表单个的组织病理学评分，列显示平均值±SD。通过单因素方差分析和Tukey的多重比较事后检验进行统计学分析。图5H，在预防性和治疗性治疗组的小鼠中，与抗病毒响应途径相关的选定宿主基因的相对mRNA量的热图，所有显示内容都分别针对感染后第3天和第6天的载体处理的小鼠。相对于载体处理的动物，颜色编码表示显著更高(红色)、更低(蓝色)或不变(灰色)的mRNA量。通过单因素方差分析和Dunnett的多重比较事后检验进行统计学分析。

图6A-6K.GHP-88309治疗对适应性免疫和再激发的影响，以及耐药性与病毒致病性之间的相关性。图6A，长期存活和再激发(rechallenge)研究示意图。用150mg/kg剂量浓度的GHP-88309对动物进行治疗性治疗，每日两次施用。b-c，用鼻内施用的1.5x10⁵ TCID₅₀单位SeV进行初始激发后，每日监测临床体征(体重(图6B)和温度(图6C))。图6D，SeV感染的小鼠在初次感染和治疗性(感染后+48小时)GHP-88309治疗后的存活曲线。图6E，治疗前(抗血清(-2d))、再激发前(抗血清(21天))和再激发后(抗血清(48天))小鼠的针对SeV的中和抗体的评估。测试了FBS和培养基的中和作用以作为对照。图6F-6G，在初次感染后第28天，用1.5x10⁵ TCID₅₀的SeV对来自(b)的恢复者进行鼻内再激发。监测临床体征(体重(图6E)和温度(图6F))。作为参考，在平行实验中等同地感染一组新的空白小鼠。h，来自(图6F-6G)的SeV感染的小鼠的存活曲线。图6I，标准recSeV和在培养细胞中具有确认的GHP-88309抗性突变的recSeV的生长曲线。图6J-6K，抗性突变对小鼠中的SeV致病性的影响。用1.5x10⁵TCID₅₀的标准recSeV或具有特定特征性抗性突变的三种不同的recSeV鼻内感染后，每日监测体重(图6I)和总生存期(图6J)。自始至终，符号代表生物学重复，线连接平均值(图6B-6C；6F-6G；6J)或中位数(图6I)。(图6E)中的误差条表示SD。通过双因素方差分析和Dunnett的多重比较事后检验(图6B-6C、6E-6F、6I)或单因素方差分析和Dunnett多重比较事后检验(图6E)进行统计学分析。通过对数秩(Mantel-Cox)检验来研究探索死亡时间的统计学差异。

图7A-7K.(图7A-7H)抗HPIV3 HTS命中项的识别和验证。图7A，recHPIV3-JS-NanoLuc的基因组组织示意图。图7B，使用recHPIV3-JS-NanoLuc作为检测剂，以384孔格式验证自动化HTS规程。三个384孔测定验证平板具有交替的行，其中包含载体(Max)或者中间浓度(0.5×EC₅₀；Med)或消毒浓度(10×EC₅₀；Min)的广谱宿主定向抑制剂JMN3-003。在每个验证平板上，对照行以不同的顺序排列。计算每个参考平板的平均信号、信号-背景比(S/B)和Z'评分，并列在表中。图7C，使用来源命中候选物GHP-88309和GHP-64627的剂量响应抗病毒活性和细胞毒性测试。图7D，商够来源的和再合成的GHP-88309的抗病毒活性比较。图7E，GHP-88309对不同的永生化细胞系的细胞增殖的影响。在测试的浓度范围内(最高100μM)未检测到毒性。图7F)GHP-88309对原代人BTEC代谢活性的影响。通过测量相对于经载体处理的HBTEC的COX-1蛋白水平来评估细胞毒性。以最高浓度等于1000μM的剂量响应方式来评估化合物温育的效果。通过测量相对于经载体处理的HBTEC的SDH-A蛋白水平，平行地测试线粒体毒性。在与GHP-88309温育72小时后测量蛋白质水平。图7G，在不同条件下测定的GHP-88309的抗病毒活性(在高MOI感染后；在不同培养基pH下；在BSA存在下)。没有发现显著差异(P＝0.329)。通过额外的平方和F检验进行统计学分析。图7H，HPIV3 ToA研究。在感染后的指定时间点以20μM添加GHP-88309。包含宿主定向聚合酶抑制剂JMN3-003作为参考。在(图7C-7H)中，符号代表生物学重复，线来自4参数变量斜率回归建模(图7C-7G)或连接数据平均值(图7H)。在适用的情况下，活性(EC₅₀)和细胞毒性(CC₅₀)浓度与括号中的95％置信区间(CI)一起显示。(图7I-7K)GHP-88309命中验证。(图7I-7K)GHP-88309对不同的临床分离株的功效：HPIV3(10L3(KY973583)、9R4(KY674929)、3-1、3-2和3-3)(图7I)，MeV(图7J)，和HPIV1(4C5、2D4(MF554715.1)、5M6(MF554714.1)和5F6)(图7K)。通过TCID₅₀滴定确定来自剂量响应测试的子代病毒产量。GHP-88309始终以低微摩尔至亚微摩尔级效力抑制了所有目标病毒株；显示了EC₅₀浓度。

图8A-8L.(图8A-8F)针对GHP-88309的病毒抗性突变的表征。图8A，重建了由HPIV3适应而产生的所有候选抗性突变及其两种工程化组合，并且在GHP-88309的存在下在RdRP活性的HPIV小基因组测定中对它们进行测试。图8B，来自(图8A)的突变，其在recHPIV3-JS-NanoLuc中重建并在报告基因剂量响应测定中针对GHP-88309进行了测试。图8C，重建了由MeV适应而产生的候选突变，并在RdRP活性的MeV小基因组测定中对其进行测试。图8D，在recSeV中重建了所有由SeV适应而产生的候选抗性突变，并在基于病毒产量的剂量响应测定中针对所得的recSeV进行测试。图8E，纯化的MeV P-L复合物的SDS-PAGE，用于BLI实验。样品在7.5％凝胶上进行分级，然后进行考马斯蓝染色。图8F，NiV小基因组测定，用于测试GHP-88309对标准NiV RdRP和具有L_H1165Y点突变的NiV RdRP的抑制活性。在(图8A-8F)中，符号代表生物学重复，线来自4参数变量斜率回归建模，活性浓度(EC₅₀和EC₉₀，如果适用)与95％CI一起显示。黄色高亮表示实验证实的抗性突变。(图8G-8L)通过光亲和性标记而得到的GHP-88309-016靶标匹配。图8G，GHP-88309-016的结构。图8H，GHP-88309-016具有生物学活性，强效抑制MeV和HPIV3复制而没有明显的细胞毒性(n＝3)。来自4参数变量斜率回归模型的EC50值与95％CI一起显示。图8I，MeV L蛋白的二维示意图，显示出了已知抗性突变的位置(顶部)和通过光亲和性标记鉴定的肽的位置(底部；黑条)。青色、绿色、黄色、橙色和红色描绘了RdRP、加帽、连接因子、MTase和C端结构域。图8J，MeV L的同源性模型，显示了与GHP-88309-016交联的肽的位置(黑色球)。确认的GHP-88309抗性位点以红色显示。肽1和2位于聚合酶的外部。图8K，只有肽3的残基(黑色)暴露于聚合酶的内部通道，靠近抗性位点(红色)。同源性模型基于为HPIV5 L(PDB:6v85)报道的坐标。(图8L)BLI结合饱和度的稳态分析和NiV L对GHP-88309的敏化。为不同的MeV L1708样品(标准(WT)或如图所示携带抗性突变)绘制浓度依赖性稳态BLI传感器响应信号，以探测是否达到结合饱和。

图9A-9N.(图9A-9I)计算机模拟的GHP-88309对接。图9A-9I，将GHP-88309对接至HPIV3(图9A-9C)、MeV(图9D-9F)和SeV(图9G-9I)L蛋白的同源性模型中。使用MOE生成得分最高的配体相互作用的2D图(图9A、9D和9G)，并预测GHP-88309和L蛋白靶标之间的保守的相互作用模式。预测的GHP-88309对接位姿(docking pose)的带形图(图9B、9E和9H)和表面图(图9C、9F和9I)，配体显示为棒模型。病毒的加帽结构域和RdRP结构域分别为绿色和蓝色，确认的抗性位点为红色并加标记。数字表示每个对接位姿的预测自由能。(图9J-9N)计算机模拟的GHP-88309对接。图9J，MeV L内部通道的带形图，显示了确认的抗性位点(红色)和带光亲和性标记的肽3中最近的残基(D993；黑色)之间的距离。聚合酶结构域颜色编码如图2A所示。图9K，将GHP-88309(蓝色棒)和GHP-88309-016(黄色棒)对接到MeV L模型中，使用D993和确认的抗性热点作为靶位点指引。得分最高的位姿在GHP-88309和GHP-88309-016之间是保守的，并且定位在加帽结构域和RdRP结构域之间。芳基叠氮化物部分位于距肽3中残基D993约

处。数字表示与此对接位姿相关的预测自由能。图9L，用MOE生成的预测得分最高的配体相互作用的2D图。预测的是GHP-88309的异喹啉环与残基Y942和R865之间的氢键相互作用。苯甲酰胺部分位于残基Q1007和R1011之间，因此整体连接RdRP和加帽结构域。图9M-9N，将(图9K)中等同的计算机对接方法应用于NiV(图9M)和RSV L(图9N)。NiV(粉色棒)和RSV(白色棒)L中的最高得分位姿与MeV L(叠加为蓝色棒)中的明显不同。已知的抗性突变为红色(a-b、d、e)。NiV同源性模型基于HPIV5 L(PDB：6v85)；RSV L是原生的(PDB:6pzk)。

图10A-10J.(图10A-10D)GHP-88309处理对MeV初始转录的影响。图10A，通过qRT-PCR测定的相对MeV反基因组水平来自(图2I)中所示的RNA提取物。图10B-10D，GHP-88309对病毒P(图10B)和L(图10C)基因的初始转录的影响。在病毒添加后3小时，从MeV感染的细胞中提取RNA。d，来自(图10B-10C)的RNA提取物中的相对MeV反基因组浓度。在这种感染后早期，基因组复制还没有开始。(图10E-10J)GHP-88309处理对HPIV3和MeV初始转录的影响。图10E-10G，在感染后12小时，GHP-88309显著降低了MeV P(图10E)、H(图10F)和L(图10G)mRNA转录物的水平。图10H，在感染后2小时，GHP-88309显著降低了HPIV3 Le RNA的合成。图10I-10J，GHP-88309没有显著改变HPIV3(e；感染后2小时)和MeV(f；感染后4小时)初始mRNA转录梯度。数值代表与载体处理的样品相比的相对变化(a-d)或与HPIV3 N(图10I)或MeV P(图10J)mRNA水平相比的相对变化。实验以至少三个生物学重复进行，每个一式两份地测定。符号代表生物学重复，列显示平均值±SD。使用单因素方差分析和Dunnett的多重比较事后检验(双侧)进行统计分析。

图11A-11D.MeV体外RdRP测定的制备和优化。图11A和11B，在Ni-NTA树脂上纯化的MeV P-L(图11A)和MeV P-L_N774A(图11B)蛋白制备物的SDS-PAGE。在7.5％凝胶上对生化RdRP测定中使用的洗脱蛋白的等分试样进行分级，然后通过考马斯蓝染色进行可视化。图11C-11D，MeV体外RdRP测定的优化。聚丙烯酰胺凝胶分级后的体外合成产物的放射自显影图；通过³²P-GTP示踪剂对产物进行标记。显示了合成RNA模板的序列。探索了一系列MgCl₂和MgCl₂浓度，以确定与最大体外聚合酶活性相关的二价阳离子辅因子的性质和浓度。

图12A-12E.在MeV体外RdRP测定中使用的不同的合成RNA模板。图12A-12B，RSV衍生的RNA模板(图12A)，其能够进行(图12B)中描述的反向启动。图12C，MeV衍生的RNA模板。图12D-12E，使用RSV(图12D)和MeV(图12E)衍生的模板的MeV RdRP测定结果。只有RSV衍生的模板发生反向启动，由此评估了启动子处的聚合酶起始和反向启动后的3'延伸，而MeV衍生的模板经测试仅在启动子处发生聚合酶起始。

图13A-13B，感染和GHP-88309治疗对宿主先天免疫应答激活的影响的单独测量结果，如图5G中总结的。图13A，在SeV感染小鼠后3天、6天和9天，通过qRT-PCR测定了参与先天宿主抗病毒反应途径的基因的相对表达。显示了经载体处理、预防性治疗(感染前2小时)和治疗性治疗(感染后48小时)的小鼠的结果，这些结果均归一化至模拟感染的和未处理的参照动物。符号表示来自单个小鼠的测量值(所有组中n＝3)。使用双因素方差分析和Tukey的多重比较事后检验进行统计学分析。图13B，HPIV3感染和用6μM GHP-88309处理后，未分化的HBTEC中1型IFN和干扰素刺激基因的相对诱导。在感染前2小时(预防性)或感染后6小时(治疗性)开始，细胞被模拟感染并暴露于GHP-88309(经处理的模拟inf)，被HPIV3感染并经载体处理(载体)，或被HPIV3感染并经GHP-88309处理。所有结果均相对于未经处理的模拟感染的细胞来表示。

图14是GHP-88309-003和GHP-88309-004的合成方案

图15是在硼酸偶联反应后引入炔丙基以合成GHP-88309-010的示意图。

图16是通过相应的酰胺进行酯转化来合成GHP-88309-10和GHP-88309-015的方案。

图17显示了GHP-88309SAR的开发。针对HPIV3和MeV报告基因病毒对GHP-88309框架进行化学加工和生物活性测试。EC₅₀和EC₉₀浓度通过剂量响应数据的4参数变量斜率回归建模来计算。通过PrestoBlue测定法来评估细胞毒性(n＝3)。

图18显示了RSV L加帽阻断剂和AZ-27抗性热点的匹配。当可定位时，针对RSV L加帽抑制剂化合物C的抗性突变(E1269D和I1381S；洋红色球)和针对起始阻断剂AZ-27的抗性突变(Y1631；橙色球)的模拟位置被投影到HPIV3 L同源性模型上。针对加帽抑制剂的抗性突变接近于保守的PRNTase基序(蓝色球)且远离GHP-88309抗性突变(红色球)。RdRP、连接因子和加帽结构域按图2A所示进行颜色编码。HPIV3L同源性模型基于为HPIV5 L(PDB:6v85)报道的坐标。

图19是显示HPIV3 HTS复筛(counterscreen)的表格。概述了直接和正交复筛，并应用于初始HTS后的命中项识别。显示了用于进一步推进GHP-88309和GHP-64627的命中候选者和性能的请求截止值。

图20是显示光亲和性标记结果的表。通过LC-MS/MS检测到三种不同的肽，它们含有与GHP-88309-016对应的额外质量。显示了预测的交联定位、覆盖率和在pFind中计算的肽谱匹配(PSM)分数。

图21是显示recSeV对GHP-88309的体内适应的表格。在50mg/kg体重的GHP-88309的存在下，在小鼠中连续传代recSeV。

图22显示了副粘病毒L序列比对。涵盖了已确认的GHP-88309抗性位点，并且突出显示了GHP-88309抗性突变的位置(方框)。对GHP-88309易感性至关重要的单个残基在NiVL的第1156位上不是保守的。属和亚科用颜色编码(呼吸系病毒，绿色；麻疹病毒属，蓝色；亨尼帕病毒，橙色；蛇副粘病毒，黄色；禽类副粘病毒亚科(avulavirinae)，粉红色；水生副粘病毒，浅绿色；腮腺炎病毒亚科(rubulavirinae)，浅蓝色)。

具体实施方式

在公开和描述本方法和系统之前，应当理解的是，这些方法和系统不限于特定的合成方法、特定的组分或特定的组合物。还应理解的是，本文使用的术语仅出于描述特定实施方式的目的，并不旨在进行限制。

如在说明书和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数个所指代物，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一个”、“一种”和“所述”与要素一起使用时可以表示“一个”，但也符合“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”的情况。因此，在无更多限制的情况下，以“一个”或“一种”开头的要素不会排除其他相同要素的存在。

在本文中，范围可以表示为从“约”一个特定值起，且/或至“约”另一个特定值止。当表达这样的范围时，另一实施方式包括从一个特定值起且/或至另一个特定值止。类似地，当通过使用在前的“约”将值表示为近似值时，应理解该特定值构成另一个实施方式。应进一步理解的是，每个范围的端点都是有效的，不论与另一个端点相关还是独立于另一个端点。

“可选的”或“可选地”是指随后描述的事件或情况可能会或可能不会发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的情况和不发生的情况。

在本说明书的整个描述和权利要求书中，词语“包括”及其变体，诸如“含有”和“包含”，意思是“包括但不限于”，并且不旨在排除例如其他添加剂、成分、整数或步骤。

尽管在本文中已经使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方式，但是可以使用术语“基本上由……组成”和“由……组成”代替“包含”和“包括”以提供本发明的更具体的实施方式，并且这些术语也被公开。除非另有说明，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件、几何形状、尺寸等的所有数字都应理解为至少应根据有效数字的数量和通常的舍入方法来解释，而不是试图限制权利要求等效范围的原理的应用。

如在本说明书和所附权利要求中使用的，术语“包含”(以及其各种形式、派生词或变体)和“包括”(以及其各种形式、派生词或变体)是包容性的(即，开放式的)并且不排除其他元素或步骤。例如，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包含”指定了所述特征、整数、步骤、操作、元素和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元素、组件和/或它们的组。因此，这些术语旨在不仅涵盖所列举的元素或步骤，而且还可以包括未明确列举的其他元素或步骤。

“示例性”是指“……的实例”，并非旨在表示优选或理想的实施方式。“例如”不是用于限制性意义，而是用于解释目的。

向受试者“施用”包括将试剂引入或递送至受试者的任何途径。施用可以通过任何合适的途径进行，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、通过植入的储库、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用”或“同时地施用”是指多种化合物在同一时间点施用或基本上彼此紧接着施用。在后一种情况下，两种化合物的施用时间足够接近，以至于观察到的结果与当化合物在同一时间点施用时所获得的结果无区别。“全身施用”是指通过将试剂引入或递送至受试者身体的广泛区域(例如，大于身体的50％)的途径来将试剂引入或递送至受试者，例如通过进入循环系统或淋巴系统。相比之下，“局部施用”是指通过将试剂引入或递送到施用点区域或紧邻施用点的区域的途径将试剂引入或递送至受试者，并且不以治疗显著量全身性地引入该试剂。例如，局部施用的试剂在施用点的局部附近很容易检测到，但在受试者身体的远端部分检测不到或检测到的量可忽略不计。施用包括自我施用和他人施用。

如本文所用，术语“有益试剂”和“活性剂”在本文中可互换使用以指代具有有益生物学效应的化合物或组合物。有益的生物学效应包括治疗作用，即治疗病症或其他不良生理状况，和预防作用，即预防病症或其他不良生理状况。该术语还涵盖本文具体提及的有益试剂的药学上可接受的药理学活性衍生物，其包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“有益试剂”或“活性剂”时，或者当具体确定特定药剂时，应当理解的是，该术语包括该试剂本身以及药学上可接受的具有药理学活性的盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。

“降低”可以指导致更少量的症状、疾病、组成、状况或活动的任何变化。如果在某物质存在时基因产物的遗传输出相对于没有该物质时的基因产物输出较少，则该物质也被理解为降低该基因的遗传输出。此外，例如，降低可以是病症的症状变化，使得症状比之前观察到的要少。降低可以是病况、症状、活动、组成方面的任何单个、中值或平均值的统计学显著量的降低。因此，只要降低在统计学上是显著的，降低可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100％的降低。

“抑制”是指降低活性、响应、病况、疾病或其他生物学参数。这可以包括但不限于活动、响应、病况或疾病的完全消除。这还可以包括例如与天然或对照水平相比，活性、响应、病况或疾病降低10％。因此，与天然或对照水平相比，该降低可以是10、20、30、40、50、60、70、80、90、100％或其间的任何量的降低。

“失活”是指由于配体与其生物学靶标之间的化学(共价键形成)作用而降低或消除活性、响应、病况、疾病或其他生物学参数。

“减少”或该词的其他形式是指事件或特征(例如，肿瘤生长)变少。应理解，这通常与某些标准或预期值有关，换句话说，它是相对的，但并不总是需要参考标准或相对值。例如，“减少肿瘤生长”是指相对于标准或对照减少肿瘤的生长速率。

如本文所用，针对受试者的术语“治疗”或“处理”包括向受试者施用药物以达到预防、治愈、愈合、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进、稳定或影响疾病或病症或者疾病或病症的症状的目的。术语“治疗”和“处理”还可以指减轻症状的严重性和/或频率，消除症状和/或根本原因，预防症状的发生和/或其根本原因，以及改善或补救损伤。特别是，术语“治疗”包括部分或全部减轻冠状病毒感染的症状(例如，喉咙痛、鼻塞和/或流鼻涕、咳嗽和/或与感冒相关的体温升高)。此类治疗可包括根除与炎症相关的微生物剂或减缓其数量增长。

“防止”或该词的其他形式是指停止特定事件或特征，稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或最小化特定事件或特征的出现机会。防止不需要与对照进行比较，因为它通常比例如“减少”更绝对。如本文所用，某些可以减少但不能防止，但某些可以减少的也可以防止。同样，某些可以防止但不能减少，但某些可以防止的也可以减少。应当理解的是，在使用“减少”或“防止”时，除非另有明确说明，另一词的使用也被明确公开。例如，术语“防止”或“抑制”可以指预先阻止或减缓疾病或病况的发作或减少疾病或病况的严重程度的治疗。因此，如果治疗可以治疗具有疾病症状的受试者的疾病，那么它还可以防止或抑制尚未患有某些或全部症状的受试者的疾病。如本文所用，术语“防止”受试者中的病症或不期望的生理事件具体指防止症状的出现和/或其根本原因，其中受试者可能表现出或不表现出对病症或事件的高度易感性。在特定实施方式中，“防止”包括减少患者感染冠状病毒的风险。然而，应当理解的是，这种防止可能不是绝对的，即，它可能不能防止所有这样的患者发生冠状病毒感染，或者只能部分地防止单个个体的感染。因此，术语“防止”和“预防”可以互换使用。

术语“有效量”的治疗剂是指无毒但足以提供所需效果的有益试剂的量。“有效”的有益试剂的量将因受试者而异，这取决于受试者的年龄和一般状况、特定的有益试剂等。因此，并不总是可以指定准确的“有效量”。然而，在任何受试者情况下的适当“有效”量可由本领域普通技术人员使用常规实验确定。此外，如本文所用，除非另有明确说明，有益的“有效量”还可以指涵盖治疗有效量和预防有效量的量。

达到治疗效果所必需的药物“有效量”可能会根据受试者的诸如年龄、性别和体重等因素而有所不同。可以调整剂量方案以提供最佳治疗响应。例如，可以每天施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急情况按比例减少剂量。

如本文所用，治疗剂的“治疗有效量”是指有效实现所需治疗结果的量，而治疗剂的“预防有效量”是指有效防止不希望发生的生理状况的量。给定治疗剂的治疗有效量和预防有效量通常会根据诸如所治疗的病症或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。术语“治疗有效量”还可以指有效促进所需治疗效果的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间变化的量)。确切的期望治疗效果将根据待治疗的病况、受试者的耐受性、待施用的药物和/或药物制剂(例如，治疗剂(药物)的效力、药物在制剂中的浓度等)以及本领域普通技术人员理解的多种其他因素而变化。

如本文所用，术语“药学上可接受的”组分可以指在生物学上或其他方面不是不期望的组分，即，该组分可以并入本发明的药物制剂中并如本文所述施用于受试者而不引起任何显著的不期望的生物学效应或以有害方式与包含它的制剂中的任何其他组分相互作用。当术语“药学上可接受的”用于指代赋形剂时，通常暗示该成分已满足毒理学和制造测试的要求标准，或者它包含在美国食品和药物管理局制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)是指可用于制备通常安全且无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药物或治疗用途上可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可以包括但不限于磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳液(如油/水或水/油乳液)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域熟知的用于药物制剂的本文中进一步描述的其他材料。

此外，如本文所用，术语“药理学活性”(或简称“活性”)，如在“药理学活性”的衍生物或类似物中，可以指具有与母体化合物相同类型的药理学活性并且程度大致相当的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。

“对照”是在实验中用于比较目的的替代性受试者或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”的。

如本文所用，“受试者”是指个体。因此，“受试者”可以包括驯养动物(例如猫、狗等)、家畜(例如牛、马、猪、绵羊、山羊等)、实验动物(例如小鼠、兔、大鼠、豚鼠等)和鸟类。“受试者”还可以包括哺乳动物，例如灵长类动物或人类。因此，受试者可以是人类或兽医患者。

治疗剂的施用可以以有效治疗受试者的剂量和时间段进行。在某些实施方式中，受试者是人。

公开了可用于执行本公开的方法和系统的组件。这些和其他组件在本文中被公开，并且应当理解，当这些组件的组合、子集、相互作用、组等被公开时，虽然可能未明确公开对每个各种单独和集体组合以及这些组合的排列的具体引用，但对于所有方法和系统，每个都在本文中被具体考虑和描述。这适用于本申请的所有方面，其包括但不限于公开方法中的步骤。因此，如果存在可以执行的多个附加步骤，则应理解这些附加步骤中的每一个都可以通过所公开方法的任何特定实施方式或实施方式的组合来执行。

除非另有说明，化学键仅显示为实线而不显示为楔形或虚线的化学式考虑了每种可能的异构体，例如每种对映异构体、非对映异构体和内消旋化合物，以及异构体的混合物，例如外消旋或非外消旋混合物。

如本文所用，术语“烷基”是支化或非支化的烃基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、十二烷基等。烷基也可以是经取代的或未经取代的。除非另有说明，否则术语“烷基”涵盖取代和未经取代的烷基。烷基可以取代有包括但不限于烷氧基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇的一个或多个基团。不含碳-碳双键或三键的烷基称为饱和烷基，而具有一个或多个此类键的烷基称为不饱和烷基。具有双键的不饱和烷基可以称为烯基，具有三键的不饱和烷基可以称为炔基。除非另有说明，否则术语烷基包括饱和和不饱和基团。

如本文所用，术语“环烷基”是由至少三个碳原子组成的非芳族碳类环。环烷基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。术语“杂环烷基”是如上定义的环烷基，且其环的至少一个碳原子被例如但不限于氮、氧、硫、硒或磷等杂原子替换。环烷基和杂环烷基可以是取代的或未取代的。除非另有说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”涵盖取代和未取代的环烷基和杂环烷基。环烷基和杂环烷基可以取代有包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇的一个或多个基团。不含碳-碳双键或三键的环烷基称为饱和环烷基，而具有一个或多个此类键的环烷基(但仍不是芳族)称为不饱和环烷基。除非另有说明，否则术语环烷基包括饱和和不饱和的非芳族环体系。

如本文所用，术语“芳基”是由碳原子组成的芳环。芳基的实例包括但不限于苯基和萘基等。术语“杂芳基”是如上定义的芳基且其环的至少一个碳原子被例如但不限于氮、氧、硫、硒或磷等杂原子替换。芳基和杂芳基可以是取代的或未取代的。除非另有说明，否则术语“芳基”和“杂芳基”涵盖取代和未取代的芳基和杂芳基。芳基和杂芳基可以取代有包括但不限于烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇的一个或多个基团。

示例性的杂芳基和杂环基环包括：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并硫代呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并噁唑啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并四唑基、苯并异噁唑基、苯并异噻唑基、苯并咪唑啉基、咔唑基、4aH咔唑基、咔啉基、色满基、色烯基、噌啉基(cirrnolinyl)、十氢喹啉基、2H,6H～1,5,2-二噻嗪基、二氢呋喃并[2,3b]四氢呋喃、呋喃基、呋咱基、咪唑烷基、咪唑啉基、咪唑基、1H-吲唑基、吲哚烯基(indolenyl)、吲哚啉基、吲哚嗪基、吲哚基、3H-吲哚基、靛红酰基、异苯并呋喃基、异色满基、异吲唑基、异吲哚啉基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、异噁唑基、亚甲基二氧基苯基、吗啉基、萘啶基、八氢异喹啉基、噁二唑基、1,2,3-噁二唑基、1,2,4-噁二唑基、1,2,5-噁二唑基、1,3,4-噁二唑基、噁唑烷基、噁唑基、氧代吲哚基、嘧啶基、菲啶基、菲咯啉基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁噻基、吩噁嗪基、酞嗪基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮基、4-哌啶酮基、胡椒基、蝶啶基、嘌呤基、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、哒嗪基、吡啶并噁唑、吡啶并咪唑、吡啶并噻唑、吡啶基、氮苯基、嘧啶基、吡咯烷基、吡咯啉基、2H-吡咯基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、4H-喹嗪基、喹噁啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、6H-1,2,5-噻二嗪基、1,2,3-噻二唑基、1,2,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基，1,3,4-噻二唑基、噻蒽基、噻唑基、噻吩基、噻吩并噻唑基、噻吩并噁唑基、噻吩并咪唑基、硫代呋喃基和呫吨基。

术语“烷氧基”、“环烷氧基”、“杂环烷氧基”、“环烷氧基”、“芳氧基”和“杂芳氧基”对于烷基、环烷基、杂环烷基、芳基和杂芳基具有上述含义，其进一步规定所述基团通过氧原子连接。

如本文所用，术语“取代的”旨在包括有机化合物的所有允许的取代基。在广泛的方面，允许的取代基包括有机化合物的非环和环状的、支化和非支化的、碳环和杂环的以及芳族和非芳族的取代基。示例性的取代基包括例如下面描述的那些。对于合适的有机化合物，允许的取代基可以是一个或多个并且相同或不同。出于本公开的目的，诸如氮等杂原子可以具有氢取代基和/或满足杂原子化合价的本文所述有机化合物的任何允许的取代基。本公开不旨在以任何方式受到有机化合物的允许取代基的限制。此外，术语“取代”或“被取代”包括隐含的条件，即这种取代符合被取代原子和取代基的允许化合价，并且取代产生稳定的化合物，例如不会通过例如重排、环化、消除等自发地转化的化合物。除非特别说明，否则称为“被取代”的取代基是指该取代基可以被以下一种或多种取代：烷基、烷氧基、烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、醛、氨基、羧酸、酯、醚、卤化物、羟基、酮、硝基、甲硅烷基、磺基-氧代或硫醇。在一个具体实例中，称为被取代的基团被质子基团取代，质子基团是可以根据pH而质子化或去质子化的基团。

除非另有说明，否则术语“患者”是指任何哺乳动物，其包括但不限于人类。

如本文所用，“药学上可接受的盐”是所公开化合物的衍生物，其中母体化合物通过制造其无机和有机、无毒、酸或碱加成盐来改性。本发明化合物的盐可以通过常规化学方法由含有碱性或酸性部分的母体化合物来合成。通常，此类盐可以如下制备：使这些化合物的游离酸形式与化学计量量的适当碱(例如钠、钙、镁或钾的氢氧化物、碳酸盐、碳酸氢盐等)反应，或使这些化合物的游离碱形式与化学计量量的适当酸反应。此类反应通常在水中或有机溶剂中或在两者的混合物中进行。通常，在可行的情况下，诸如乙醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈等非水介质是典型的。本发明化合物的盐还包括化合物和化合物盐的溶剂化物。

药学上可接受的盐的实例包括但不限于诸如胺等碱性残基的无机酸盐或有机酸盐；诸如羧酸等酸性残基的碱金属盐或有机盐；等等。药学上可接受的盐包括常规的无毒盐和由例如无毒无机或有机酸形成的母体化合物的季铵盐。药学上可接受的盐是保留母体化合物的所需生物学活性并且不产生不期望的毒理学作用的盐。这种盐的实例是用无机酸(例如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸和硝酸等)形成的酸加成盐；用有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、葡糖酸、柠檬酸、苹果酸、甲磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸和聚半乳糖醛酸等)形成的盐；由元素阴离子(例如氯离子、溴离子和碘离子)形成的盐；由金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化锂和氢氧化镁)形成的盐；由金属碳酸盐(例如碳酸钠、碳酸钾、碳酸钙和碳酸镁)形成的盐；由金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠和碳酸氢钾)形成的盐；由金属硫酸盐(例如硫酸钠和硫酸钾)形成的盐；以及由金属硝酸盐(例如硝酸钠和硝酸钾)形成的盐。药学上可接受的和非药学上可接受的盐可以使用本领域熟知的方法制备，例如通过使足够碱性的化合物(例如胺)与包含生理学上可接受的阴离子的合适的酸反应。也可以制备羧酸的碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙)盐。其他合适的盐的列表可见于例如Remington's Pharmaceutical Sciences，第17版，MackPublishing Company，Easton,Pa.第1418页(1985)。

在某些实施方式中，RNA聚合酶抑制剂可以是式(1)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

X¹选自CR¹或N；

X²选自CR²或N；

X³选自CR³或N；

X⁴选自CR⁴或N；

Z选自：

-(CH₂)_nL，C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基；

n是0-10；

L选自R⁵；OR⁵或NR⁵R⁶；

Y¹选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^a、-N(R^a)₂、-Q¹C(M)Q¹R^a、-Q¹C(O)N(R^a)₂、-Q¹SO₂Q¹R^a或-Q¹SO₂)N(R^a)₂，

Y²选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^b、-N(R^b)₂、-Q¹C(M)Q¹R^b、-Q¹C(O)N(R^b)₂、-Q¹SO₂Q¹R^b或-Q¹SO₂N(R^b)₂，

Y³选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^c、N(R^c)₂、-Q¹C(M)Q¹R^c、-Q¹C(M)N(R^c)₂、-Q¹SO₂Q¹R^c或-Q¹SO₂N(R^c)₂，

Y⁴选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^d、-N(R^d)₂、-Q¹C(M)Q¹R^d、-Q¹C(M)N(R^d)₂、-Q¹SO₂Q¹R^d或-Q¹SO₂N(R^d)₂，

Y⁵选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^e、-N(R^e)₂、-Q¹C(M)Q¹R^e、-Q¹C(M)N(R^e)₂、-Q¹SO₂Q¹R^e或-Q¹SO₂N(R^e)₂，

Y⁶选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^f、-N(R^f)₂、-Q¹C(M)Q¹R^f、-Q¹C(M)N(R^f)₂、-Q¹SO₂Q¹R^f或-Q¹SO₂N(R^f)₂，

Y⁷选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^g、-N(R^g)₂、-Q¹C(M)Q¹R^g、-Q¹C(M)N(R^g)₂、-Q¹SO₂Q¹R^g或-Q¹SO₂N(R^g)₂，

M在每种情况下独立地选自O、NH、S、NOH或CH；

Q在每种情况下独立地选自无、O、NH或S；

Q¹在每种情况下独立地选自无、O、NH或S；

R¹、R²、R³和R⁴独立地选自R^p、OR^p、N(R^p)₂、CN、NO₂、COR^p、C(O)OR^p、Fl、Cl、Br或I，其中，R^p在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基；

R⁵、R⁶、R^a、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基，

其中，L、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、Y⁶、Y⁷、R^a、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g中的任两个或多个可以一起形成环。

在某些实施方式中，Y⁴是H，而在其他实施方式中，R⁴选自OH、F、Cl、Br、I、NO₂、CN、CO₂H或C_1-8烷基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基或异丙氧基。在某些实施方式中，Y⁴和Y⁵一起形成环，例如芳基、杂芳基、环烷基或杂环基环。示例性的体系包括：

其中，R⁸选自H或C_1-3烷基并且Y⁸在每种情况下独立地选自R^p、OR^p、N(R^p)₂、CN、NO₂、COR^p、C(O)OR^p、Fl、Cl、Br或I，其中，R^p在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。Y⁸基团不直接连接到特定原子的结构应理解为包括Y⁸连接到任何一个或多个可能原子的化合物。另外的杂芳基包括噁唑类、噻唑类、三唑类、二嗪类、二氢呋喃类、二氢吡喃类等。

示例性的Z杂环和杂芳基包括四唑类、三唑类、噁唑类、咪唑类、吡咯烷类、哌啶类、呋喃类、吡喃类等。在某些实施方式中，RNA聚合酶抑制剂可以具有下式：

其中，R^h可以是氢或C_1-3烷基。尽管上面绘出的杂环和杂芳基中的每个碳原子是未取代的，但这些杂环和杂芳基可以进一步被取代。

示例性的C_1-10卤代烷基包括CX₃、CX₂H、CXH₂、CH₂CX₃、CH₂CX₂H、CH₂CXH₂、CX₂CX₃等，其中，X是F、Cl、Br、I或其组合。在某些实施方式中，X是F。

在某些情况下，式(1)化合物可以是苯并吡啶衍生物，即X¹、X²、X³和X⁴中只有一个是N，而在其他实施方式中，式(1)化合物是苯并嘧啶，即X¹、X²、X³和X⁴中的两个是N。在其他实施方式中，式(1)的化合物可以是苯并三嗪，即X¹、X²、X³和X⁴中的三个是N，并且在另外的实施方式中，式(1)的化合物是苯并四嗪。

在某些实施方式中，式(1)化合物是苯并吡啶，其中，X¹是N，X²是CR²，X³是CR³并且X⁴是CR⁴。在其他实施方式中，式(1)化合物是苯并吡啶，其中，X²是N，X¹是CR¹，X³是CR³并且X⁴是CR⁴。在其他情况下，X³是N，X¹是CR¹，X²是CR²并且X⁴是CR⁴；或者X⁴是N，X¹是CR¹，X²是CR²并且X³是CR³。

在某些情况下，Z可以是具有下式的基团：

其中，M为O，Q为无。在这种情况下，L可以是NR⁵R⁶，其中，R⁵和R⁶各自选自氢或C_1-3烷基。在某些实施方式中，R⁵可以是H，并且R⁶可以选自可以选自氢或C_1-3烷基，优选甲基或H。

在某些实施方式中，Y⁷可以选自F、Cl、Br、NO₂、CN或-C(M)Q¹R^c，其中M是O，Q¹是无或O，且R^c是H、C_1-10烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

式I化合物的实例如下所示：

和其药学上可接受的盐。

在某些实施方式中，RNA聚合酶抑制剂可以是式(2)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中，Z、Y⁷、X¹、X²、X³和X⁴具有上述含义。在某些实施方式中，式(2)的化合物的特征可以进一步为X⁴＝CR⁴，其中，R⁴是H、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、F、Cl、Br、I、NO₂或CN。

在某些实施方式中，RNA聚合酶抑制剂可以是式(3)的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中，Z、Y³、Y⁴、Y⁷、X¹、X²、X³和X⁴具有上述含义。在某些实施方式中，式(2)的化合物的特征可以进一步为X⁴＝CR⁴，其中，R⁴是H、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基、异丙氧基、F、Cl、Br、I、NO₂或CN。在某些实施方式中，Y⁴选自H、甲基、乙基、丙基、异丙基、甲氧基、乙氧基或异丙氧基。

在某些实施方式中，RNA聚合酶抑制剂可以是式(4a)或(4b)的化合物：

其中，R¹、R³、Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、Y⁶、Y⁷和Z如上所定义，并且在某些情况下，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶中的每一个都是氢。在某些实施方式中，R¹和R³之一或两者可以是OH、NH₂或H，例如R³可以是OH或NH₂并且R¹是H，R¹可以是OH或NH₂并且R³是H，R¹和R³各自为H，或者R¹和R³各自为OH或NH₂。

在某些实施方式中，式(4a)和(4b)化合物的特征可以是基团Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵和Y⁶中的每一个都是氢。在式(4a)和(4b)的某些情况下，Z可以是C_1-10杂芳基，或具有下式的基团：

其中，M、L和Q如上所定义。在式(4a)和(4b)化合物的某些实施方式中，Q可以是O或无，优选无，M可以是O，并且L可以是OH或NH₂。作为另一种选择，L可以是OR⁵或NR⁵R⁶，其中，R⁶是氢，并且R⁵是C_1-3烷基，或者R⁵与Y⁷或Y³一起形成环。在这种情况下，L可以是NR⁵R⁶，其中R⁵和R⁶各自选自氢或C_1-3烷基。在其他情况下，Y⁷选自H、F、Cl、Br、I、NO₂或CN。

在某些实施方式中，式(4a)的化合物的特征在于其中Y²、Y³、Y⁴、Y⁵和Y⁶各自为氢，并且Y⁷选自-H、-F、-Cl、-Br、-I或-N(R^g)₂，其中，R^g如上所定义。在特定的实施方式中，R^g在每种情况下独立地选自H或C_1-10烷基，并且在进一步的实施方式中，R^g在两种情况下都是H。在其他实施方式中，Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、Y⁷各自为氢，并且Y⁶选自-F、-Cl、-Br、-I或Q¹R^f，其中，Q¹和R^f如上所定义。在某些实施方式中，Q¹为无或O，并且R^f为H或C_1-10烷基。在其他实施方式中，Y²、Y³、Y⁵、Y⁶各自为氢，并且Y⁷选自-F、-Cl、-Br、-I或-N(R^g)₂，并且Y⁴为Q¹R^d，其中，Q¹、R^d和R^g各自如上所定义。在某些实施方式中，Q¹为无或O，R^d为H或C_1-10烷基，并且R^g在每种情况下独立地选自H或C_1-10烷基，并且在进一步的实施方式中，R^g在两种情况下均为H。

在式(4a)化合物的某些实施方式中，Z选自：

其中，L、M和Q如上所定义。在特定的实施方式中，L是OR⁵或NR⁵R⁶，M是O、NH或NOH，并且R⁵和R⁶在每种情况下独立地选自氢或C_1-10烷基。在某些实施方式中，Q可以为无。

在式(4a)化合物的其他实施方式中，Z选自：

-(CH₂)_nL，

其中，L和n如上所定义。在某些实施方式中，L可以是R⁵，R⁵可以是H。

在式(4a)化合物的某些实施方式中，Y¹可以是Q¹R^a或NO₂，其中Q¹和R^a如上所定义。在Y¹是Q¹R^a的某些实施方式中，Q¹可以为无或O，并且R^a可以是H或C_1-10烷基。

在其他实施方式中，RNA聚合酶抑制剂可以是式(4c)或(4d)的化合物：

其中，R¹、R²和R⁴如上所定义，并且Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁶、Y⁷和Z中的每一个如上所定义，并且在某些情况下，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶中的每一个是氢。在某些实施方式中，R²和R⁴之一或两者可以是OH、NH₂或H，例如R²可以是OH或NH₂并且R⁴是H，R⁴可以是OH或NH₂并且R²是H，R⁴和R²各自为H，或R⁴和R²各自为OH或NH₂。在式(4c)和(4d)的某些情况下，Z可以是C_1-10杂芳基，或具有下式的基团：

其中，M、L和Q如上所定义。在式(4c)和(4d)化合物的某些实施方式中，Q可以是O或无，优选无，M可以是O，并且L可以是OH或NH₂。作为另一种选择，L可为OR⁵或NR⁵R⁶，其中R⁶为氢，且R⁵为C_1-3烷基，或R⁵与Y³一起形成环。在这种情况下，L可以是NR⁵R⁶，其中，R⁵和R⁶各自选自氢或C_1-3烷基。在式(4c)和(4d)化合物的某些实施方式中，Y⁵选自H、F、Cl、Br、I、NO₂或CN。

在其他实施方式中，RNA聚合酶抑制剂可以是式(4e)、(4f)或(4g)的化合物：

其中，R¹、R²、R³和R⁴如上所定义，Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁶、Y⁷和Z中的每一个如上所定义，并且在某些情况下，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶中的每一个是氢。在某些实施方式中，R²和R³之一或两者可以是OH、NH₂或H，例如R²可以是OH或NH₂并且R³是H，R³可以是OH或NH₂并且R²是H，R³和R²各自为H，或者R³和R²各自为OH或NH₂。在式(4e)化合物的某些实施方式中，R⁴可以是NH₂，而在式(4f)的某些实施方式中，R¹可以是NH₂。在式(4e)、(4f)和(4g)的某些情况下，Z可以是C_1-10杂芳基，或具有下式的基团：

其中，M、L和Q如上所定义。在式(4e)、(4f)和(4g)化合物的某些实施方式中，Q可以是O或无，优选无，M可以是O，并且L可以是OH或NH₂。作为另一种选择，L可为OR⁵或NR⁵R⁶，其中R⁶为氢，且R⁵为C_1-3烷基，或R⁵与Y³一起形成环。在这种情况下，L可以是NR⁵R⁶，其中R⁵和R⁶各自选自氢或C_1-3烷基。在式(4e)、(4f)和(4g)化合物的某些实施方式中，Y⁵选自H、F、Cl、Br、I、NO₂或CN。

在某些实施方式中，Y¹和Y⁴可以一起形成环，例如Y¹和Y²一起来自一个基团。

在某些实施方式中，Z和Y³可以一起形成环：

示例性环体系包括具有下式的那些：

其中，Y¹、Y²、Y⁴、Y⁵、Y⁶、R⁶、Y⁷、X¹、X²、X³和X⁴具有上文给出的含义。在其他实施方式中，Z和Y⁷可以一起形成环：

示例性环体系包括

本文公开的化合物可以配制成多种药物组合物以施用于患者。此类组合物包括但不限于：单位剂型，其包括片剂、胶囊(填充有粉末、团粒、珠、小片剂、丸剂、微粒剂、小片剂单元、多单元粒剂系统(MUPS)、崩解片、分散片、颗粒和微球、多颗粒)、小袋(填充有粉末、团粒、珠、迷你片剂、丸剂、微粒剂、小片剂单元、MUPS、崩解片、分散片、颗粒和微球、多颗粒)、用于重构的粉末、透皮贴剂和喷剂，然而，还有其他剂型，例如控释制剂、冻干制剂、改性释放制剂、延迟释放制剂、延长释放制剂、脉冲释放制剂、双重释放制剂等。液体或半固体剂型(液体、混悬剂、溶液、分散液、软膏、乳膏、乳液、微乳液、喷雾剂、贴剂、点滴剂)、注射剂、肠胃外、局部、吸入、含服、鼻腔制剂等以也在本发明的范围内。

合适的赋形剂可用于配制本发明的剂型，例如但不限于表面稳定剂或表面活性剂、粘度调节剂、包括延长释放型聚合物的聚合物、稳定剂、崩解剂或超级崩解剂、稀释剂、增塑剂、粘合剂、助流剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、抗结块剂、遮光剂、抗微生物剂、消泡剂、乳化剂、缓冲剂、着色剂、载体、填充剂、抗粘附剂、溶剂、掩味剂、防腐剂、抗氧化剂、质地增强剂、通道剂、涂层剂或它们的组合。

本文公开的化合物可以通过多种不同途径施用。例如，化合物可以口服、局部、透皮、静脉内、皮下、吸入或脑室内递送施用。

在某些实施方式中，本文公开的化合物可配制成纳米颗粒。该纳米颗粒可具有1-1000nm、优选10-500nm、甚至更优选10-200nm的平均粒径。

本文公开的化合物具有RNA聚合酶抑制活性，因此可用于治疗由易感病毒引起的病毒感染。在某些情况下，这些化合物可用于治疗副粘病毒科的负义RNA病毒中的一种或多种，例如人副流感病毒(HPIV，1-4型)或麻疹病毒(MeV)。在其他实施方式中，本文公开的化合物可用于治疗其他病毒感染，包括呼吸道合胞病毒(RSV)、包括H1N1亚型的甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、轮状病毒A、轮状病毒B、轮状病毒C、轮状病毒D、轮状病毒E、SARS冠状病毒、人腺病毒类型(HAdV-1至55)、人乳头瘤病毒(HPV)16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59型、细小病毒B19、传染性软疣病毒、JC病毒(JCV)、BK病毒、默克尔细胞多瘤病毒、柯萨奇A病毒、诺如病毒、风疹病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、黄热病病毒、流行性腮腺炎病毒、牛瘟病毒、加州脑炎病毒、汉坦病毒、狂犬病病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、单纯疱疹病毒-1(HSV-1)、单纯疱疹病毒-2(HSV-2)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、疱疹淋巴病毒、玫瑰红病毒、卡波西肉瘤相关疱疹病毒、甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)、戊型肝炎病毒(HEV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T淋巴细胞病毒I型(HTLV-1)、Friend脾病灶形成病毒(SFFV)或异嗜性MuLV相关病毒(XMRV)。

本文公开的化合物可以与一种或多种额外的抗病毒剂组合施用。在某些实施方式中，本文公开的方法旨在与其他抗病毒剂组合施用，例如阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近、阿比朵尔、阿扎那韦、阿曲普利、波普瑞韦、西多福韦、康比韦、康普莱、地瑞那韦、地拉韦定、地达诺新、二十二烷醇、多替拉韦、依度尿苷、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦肽、恩替卡韦、泛昔洛韦、福米韦森、呋山那韦、膦甲酸、膦乙醇、更昔洛韦、伊巴他滨、伊莫诺韦、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦利特、马拉韦罗、吗啉胍、美替沙腙、奈非那韦、奈韦拉平、奈沙韦、奥司他韦、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普康那利、鬼臼毒素、拉替拉韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、乙胺嘧啶、沙奎那韦、司他夫定、Stribild、替诺福韦、替诺福韦二吡呋酯、富马酸替诺福韦艾拉酚胺、替拉那韦、曲氟尿苷、三协唯、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、维克韦罗、阿糖腺苷、塔利韦林、扎西他滨、扎那米韦或齐多夫定，以及它们的组合。

实施例

以下实施例仅出于说明本发明的目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。

由于大量的成年患者群体和可行的治疗窗口对于推进临床试验至关重要，因此HPIV代表了抗副粘病毒药物筛选的有希望的主要目标。除儿童外，HPIV对免疫功能低下的成年人(例如造血干细胞移植患者)构成重大威胁，其中病死率可达到惊人的75％。某些成年高危人群的HPIV疾病进展似乎相对缓慢，在出现初始上呼吸道症状后进展为严重下呼吸道感染的中位数时间为3天。因此，在这项研究中，我们选择了HPIV3作为高通量抗病毒药物发现程序的筛选剂，它是HPIV疾病的主要病原体，在美国每年估计有300万例就诊病例。该筛选鉴定了GHP-88309，一种口服有效的广谱副粘病毒聚合酶抑制剂。

实施例1：GHP-88309的合成

化学品

除非另有说明，否则所有材料均从商业供应商处获得且无需进一步纯化即可使用。在氮气下包装在隔垫密封瓶中的无水有机溶剂购自EMD Millipore和Sigma-AldrichCo.。使用EMD硅胶60F254 TLC平板或使用带有二极管阵列检测器和Agilent 6120四极杆质谱检测器的Agilent 1200系列LCMS系统来监测反应。在Teledyne Isco CombiFlash RF+快速色谱系统上通过液相色谱完成化合物纯化。在室温下在Agilent NMR光谱仪(400MHz)上记录NMR谱。相对于残留DMSO-d6信号，化学位移以ppm为单位报告。使用剩余位移作为内部参考并以百万分之几(ppm)报告。从商业文库(ChemBridge和ChemDiv，它们都针对具有不良反应性的化学结构来管理)以及源自先前药物化学优化程序的专属化合物集合来组装筛选集合。所有化合物都溶解在DMSO中至浓度为10μM，并在-80℃储存。为了生成筛选集，所有化合物都在MScreen中进行了盘点，并使用Nimbus96液体处理器(Hamilton Robotics)重新格式化为带条形码的384孔格式子板。每个384孔板上保留32个孔用于阳性和阴性(载体)对照，并在两侧的两个侧行中以棋盘样式排列。

化学合成

2-氟-6-(5-异喹啉基)苄腈的合成

将2-溴-6-氟-苄腈(5.0gm，25mmol)、5-异喹啉基硼酸(6.0gm，35mmol)和Na₂CO₃(10.6gm，100mmol)置于250ml密封烧瓶中并用(2:1)1,4-二噁烷:水(90ml)处理。混合物用氩气吹扫5分钟。添加Pd(PPh₃)₄(2.25gm，1.94mmol)并再吹扫5分钟。将反应混合物密封并在100℃搅拌3-5小时。完成后，将反应混合物冷却至室温，用过量二氯甲烷稀释并用水提取。水层用二氯甲烷提取，合并的有机层经无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化。得到作为无色固体的纯产物，产率77％(4.8克)。

¹H NMR 400MHz,DMSO-d6,δ9.44(1H,s),8.51(1H,d,J＝8Hz),8.30(1H,d,J＝8Hz),7.96-7.66(3H,m),7.68(1H,t,8Hz),7.50(1H,d,J＝8Hz),7.42(1H,d,J＝4Hz)；¹⁹FNMR 376MHz,DMSO-d6δ-107.10至-107.14,(1F,m)；MS(ES-API)[M+1]+：249.0。

2-氟-6-(5-异喹啉基)苯甲酰胺(GHP-88309)的合成

将2-氟-6-(5-异喹啉基)苄腈(4gm，16.1mmol)置于100ml圆底烧瓶中并用乙酸(12ml，209mmol)和浓H₂SO₄(6ml，112mmol)处理。将反应混合物在120℃搅拌2-3小时。完成后，将反应混合物冷却至室温并倾倒在碎冰上并小心地用氢氧化钠水溶液中和。水性混合物用乙酸乙酯提取三次，合并有机层，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩。粗产物通过使用二氯甲烷和甲醇作为洗脱剂的快速柱色谱法纯化。得到作为无色固体的纯产物，产率46％(2克)。

¹H NMR 400MHz,DMSO-d6,δ9.34(1H,s),8.43(1H,d,J＝4Hz),8.14(1H,ddd,J＝8Hz,2Hz,0.8Hz),7.87(1H,bs),7.70(2H,m),7.54(1H,m),7.39(3H,m),7.16(1H,dd,J＝8Hz,0.8Hz)；¹⁹F NMR 376MHz,DMSO-d6δ-116.27至-116.31,(1F,m)；¹³C NMR 100MHz,DMSO-d6,δ165.81,158.75(d,J＝250Hz),152.93,143.54,138.39,136.05,134.18,131.66,130.40(d,J＝9Hz),128.68,128.10,127.81,127.61,127.10,119.08,115.55(d,J＝22Hz)；MS(ES-API)[M+1]+：267.0。

化学类似物的合成

除GHP-88309-003、GHP-88309-004、GHP-88309-009、GHP-88309-010和GHP-88309-015外，使用与合成GHP-88309所述相同的程序生成类似物。GHP-88309-003和GHP-88309-004的合成是通过5-溴-8-硝基喹诺酮和8-溴-4-甲氧基喹唑啉分别与(2-氰基苯基)硼酸反应而实现的，如图14所示。

对于含有酸不稳定烷基醚的GHP-88309-009，腈转化为酰胺是通过交替的碱性条件1实现的，如图14所示。在GHP-88309-010中，在硼酸偶联反应后引入炔丙基以避免来自炔烃功能的潜在干扰，如图14所示。

类似物GHP-88309-010和GHP-88309-015通过分别使用条件(b)和(c)将酯转化为相应的酰胺而获得，如图16所示。

分析数据

GHP-88309-001:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.82(d,J＝4Hz,1H),8.09-8.04(m,2H),7.77(dd,J＝8Hz,4Hz,1H),7.58-7.51(m,2H),7.44(dd,J＝4Hz,1H),7.31-7.26(m,1H),7.18(dd,J＝8Hz,1Hz,1H)；¹⁹F NMR(376MHz,甲醇-d₄)δ-115.81(dd,J＝5.6Hz,J＝9.4Hz)；MS(ES-API)[M+1]⁺:267.1。

GHP-88309-002:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.95(s,1H),8.42(d,J＝5.8Hz,1H),7.95(d,J＝9.0Hz,1H),7.84(d,J＝5.8Hz,1H),7.81-7.77(m,1H),7.63–7.54(m,1H),7.59-7.52(m,1H),7.35-7.30(m,1H),7.23(d,J＝7.6Hz,1H)；¹⁹F NMR(376MHz,甲醇-d₄)δ-116.34(dd,J＝9.3,5.7Hz)；MS(ES-API)[M+1]⁺:267.1。

GHP-88309-003:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.90(s,1H),8.54(d,J＝6.0Hz,1H),8.47(d,J＝7.9Hz,1H),7.84-7.76(m,2H),7.71-7.62(m,2H),7.60(dd,J＝6.0Hz,1.0Hz,1H),7.46-7.42(m,1H).MS(ES-API)[M+1]⁺:293.9。

GHP-88309-004:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.63(s,1H),8.23(dd,J＝8.3Hz,1.5Hz,1H),7.86(dd,J＝7.3Hz,1.5Hz,1H),7.73-7.65(m,2H),7.59(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.52(td,J＝7.5,1.4Hz,1H),7.43(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),4.21(s,3H)。MS(ES-API)[M+1]⁺:280.0。

GHP-88309-005:¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.43(宽s,1H),8.40(宽s,1H),8.13(d,J＝8Hz,1H),7.88 7.80(m,3H),7.70(宽s,1H),7.65-7.57(m,2H).7.37(dd,J＝8Hz,1Hz,1H),5.66(宽s,2H)；MS(ES-API)[M+1]⁺:249.1。

GHP-88309-006:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.26(s,1H),8.35(d,J＝4Hz,1H),8.05(d,J＝8Hz,1H),7.76-7.68(m,3H),7.25(dd,J＝8Hz,1H),6.84(dd,J＝8Hz,1Hz,1H),6.63(dd,J＝8Hz,1Hz,1H)。MS(ES-API)[M+1]⁺:264.1。

GHP-88309-007:¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ9.38(s,1H),8.44(d,J＝5.9Hz,1H),8.16(d,J＝7.8Hz,1H),7.89(s,1H),7.77–7.66(m,2H),7.48(d,J＝5.9Hz,1H),7.39(s,1H),7.32(伪t,J＝8.6Hz,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,1H),3.94(s,3H)。¹⁹F NMR(376MHz,DMSO-d₆)δ-138.50(d,J＝8.8Hz)。MS(ES-API)[M+1]⁺:297.1。

GHP-88309-008:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.30(s,1H),8.25(s,1H),8.09(dd,J＝7Hz,2Hz,1H),7.73-7.68(m,2H),7.60-7.56(m,2H),7.42-7.40(m,1H),7.22(d,J＝2Hz,1H)。MS(ES-API)[M+1]⁺:283.1。

GHP-88309-009:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.25(s,1H),8.35(d,J＝6.1Hz,1H),8.10(dd,J＝6.4Hz,3.1Hz,1H),7.74-7.69(m,2H),7.55(d,J＝6.1Hz,1H),7.34(d,J＝8.4Hz,1H),7.30(d,J＝2.7Hz,1H),7.22(dd,J＝8.4Hz,2.7Hz,1H),4.31(t,J＝4.8Hz,2H),3.6(t,J＝4.8Hz,2H)；MS(ES-API)[M+1]⁺:333.9。

GHP-88309-010:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.26(s,1H),8.34(d,J＝6.0Hz,1H),8.12(dd,J＝6.8Hz,1H),7.77-7.68(m,3H),7.64-7.58(m,1H),7.53(d,J＝6.0Hz,1H),7.40(d,J＝7.8Hz,1H),4.75(s,2H),4.30(d,J＝2.4Hz,2H),2.96(t,J＝2.4Hz,1H)；MS(ES-API)[M+1]⁺:317.1。

GHP-88309-011:¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.34(宽s,1H),8.49(宽s,1H),8.09-8.05(m,1H),7.97(dd,J＝8Hz,4Hz,1H),7.73-7.69(m,2H),7.43(d,J＝8Hz,1H),7.29-7.24(m,1H).7.07(dd,J＝8Hz,1Hz,1H)；¹⁹F NMR(376MHz,氯仿-d)δ-108.31to-108.36,(m)。MS(ES-API)[M+1]⁺:267.1。

GHP-88309-012:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.29(s,1H),8.37(s,1H),8.17(d,J＝8.1Hz,1H),7.78-7.74(m,1H),7.69(d,J＝6.8Hz,1H),7.47-7.44(m,1H),7.33(d,J＝4.5Hz,1H),7.27-7.23(m,1H),1.87(s,3H)；¹⁹F NMR(376MHz,甲醇-d₄)δ-122.16to-122.20,(m)。MS(ES-API)[M+1]⁺:281.1。

GHP-88309-013:¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.39(s,1H),8.49(s,1H),8.09(d,J＝8.0Hz,1H),7.75-7.63(m,2H),7.60-7.50(m,2H),7.29(dd,J＝7.6Hz,0.8Hz,1H),7.19(dd,J＝7.6Hz,0.8Hz,1H),3.42(s,3H)。¹⁹F NMR(376MHz,氯仿-d)δ-113.33(dd,J＝9.4,5.2Hz)；MS(ES-API)[M+1]⁺:282.1。

GHP-88309-014:¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ9.32(s,1H),8.46(d,J＝5.6Hz,1H),8.01(d,J＝8Hz,1H),7.67(dd,J＝8Hz,7.2Hz,1H),7.56(dd,J＝7.2Hz,1.2Hz,1H),7.32-7.21(m,2H),7.14(伪t,J＝8.4Hz,1H),7.02(d,J＝7.6Hz,1H),1.93(s,3H)；¹⁹F NMR(376MHz,氯仿-d)δ-115.68至-115.77(m)。MS(ES-API)[M+1]⁺:238.1。

GHP-88309-015:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.24(d,J＝0.8Hz,1H),8.34(d,J＝6Hz,1H),8.10(td,J＝4.4Hz,0.8Hz,1H),7.71(dd,J＝4.8Hz,0.8Hz,2H),7.52(dt,J＝6Hz,0.8Hz,1H),7.33(dd,J＝8.4Hz,0.8Hz,1H),7.25-7.13(m,2H),3.92(s,3H)。MS(ES-API)[M+1]⁺:295.0。

GHP-88309-016:¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.26(s,1H),8.35(d,J＝6.0Hz,1H),8.13(m,1H),7.73(d,J＝4.9Hz,2H),7.52(dd,J＝6Hz,1Hz,1H),7.46-7.41(m,1H),7.40-7.37(m,1H),7.35-7.32(m,1H)；MS(ES-API)[M+1]⁺:290.0。

细胞

将人癌细胞(HEp-2，ATCC CCL-23)、人胚胎肾细胞(293T，ATCC CRL-3216)、人支气管上皮细胞(BEAS-2B，ATCC CCL-9609)、人马丁达比犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL-34)、稳定表达人信号传导淋巴细胞激活分子(Vero-hSLAM)或犬信号传导淋巴细胞激活分子(Vero-cSLAM)的非洲绿猴肾上皮细胞(CCK-81；ATCC)保持在37℃和5％CO₂下的补充有7.5％胎牛血清的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)中。HEp-2细胞在通常被错误识别的细胞系的ICLAC数据库中列出，使用这些细胞是必要的，因为它们对呼吸道合胞病毒高度接纳。正常原代人支气管气管上皮细胞(HBTEC；Lifeline Cell Technology)在37℃和5％CO₂下的BronchiaLife细胞培养基中繁殖和维持。LifeLine Cell Technology分析了HBTEC的微生物污染。昆虫细胞(SF9)使用Sf-900II SFM培养基(Thermo Scientific)悬浮繁殖。人外周血单个核细胞(Fisher)在RPMI-1640中培养，并在使用前用0.2μg植物血凝素(PHA；Sigma)刺激24小时。本研究中使用的所有永生化细胞系都例行检查支原体和微生物污染。除非另有说明，否则使用GeneJuice转染试剂(Invitrogen)进行转染。

分子生物学

使用CloneAmp 2×PCR Master mix(Takeda)对插入片段进行PCR扩增，由此进行对呼吸系病毒反向遗传学质粒(recSeV和recHPIV3)的所有修饰。recSeV-Fushimi-Gluc-P2A-eGFP来源于recSeV-Fushimi-eGFP(recSeV-eGFP)，其中用来自recHPIV3-JS-GlucP2AeGFP的先前报告的Gluc-P2A-eGFP报告基因盒替换了eGFP报告基因。recHPIV3-JS-NanoLuc来源于recHPIV3-JS-GlucP2AeGFP，其中用来自pNL1.1.CMV[Nluc/CMV](Promega)的NanoLuc开放阅读框替换了Gluc-P2A-eGFP报告基因盒。对于小基因组研究，使用PCR诱变将潜在的抗性突变克隆到T7控制下的MeV-Edm和HPIV3-JS L质粒中。对所有质粒进行测序以确认抗性突变和序列完整性。为了生成用于RdRP测定的杆状病毒蛋白表达系统，MeV(IC-B株)L和P基因经过密码子优化并克隆到Fastbac双载体(ThermoFisher Scientific)中。MeV L在多面体启动子下表达，具有C端His标签的MeV P在P10启动子下表达。为了生成用于纯化C端MeV L片段L₁₇₀₈的杆状病毒表达系统，MeV L₁₇₀₈(编码具有C端FLAG和His标签的MeVL的aa1-1708)经过密码子优化并与MeV P一起克隆到Fastbac双表达系统中。

病毒

recHPIV3-JS NanoLuc在32℃下在HeLa细胞上扩增，在60％蔗糖垫上纯化，并在25％-65％蔗糖梯度上进一步纯化。MVi/Alaska.USA/16.00(MeV-Anc)、recCDV-5804p和recRSV储液分别在Vero-hSLAM、Vero-cSLAM和HEp-2细胞上繁殖(MOI＝0.01pfu/细胞)。使用单个冻融循环来释放细胞相关的子代病毒粒子。使用适当的引物进行RT-PCR后，通过Sanger测序确认拯救病毒的身份。MeV、CDV、recHPIV3-JS-NanoLuc、RSV或SeV病毒滴度的子代滴度分别通过对Vero-hSLAM、Vero-cSLAM、Vero-E6、HEp-2细胞、Vero-E6细胞进行TCID₅₀滴定来确定。通过对Vero-E6细胞进行TCID₅₀-HA滴定然后使用豚鼠红细胞进行HA测定，确定HPIV3和HPIV1分离株的临床滴度。为了生成多步病毒生长曲线，Vero-E6细胞(24孔板格式中每孔约1×10⁵个)用指定的recHPIV3或recSeV感染(MOI 0.01)。1小时后用新鲜的生长培养基更换接种物，每12小时收集一次感染的细胞等分试样，并通过TCID₅₀滴定确定释放的病毒滴度。

HTS和命中项识别

共筛选了141936种化合物对recHPIV3-JS NanoLuc(MOI＝0.2)的抑制活性。HTS是在感染后30小时通过自动读取平板来进行的。原始数据被导入MScreen IT环境中，并使用内部开发的或内置在MScreen包中的数据挖掘工具进行分析。命中的候选者被定义为抗HPIV3活性>2.66×SD(对照依赖性平均百分比抑制计算结果)和>2.1×SD(对照独立的平均稳健z分数计算结果)的化合物。

复筛

对于复筛，将化合物以3倍稀释液(0.009–20μM)添加到接种有Vero-E6细胞(1.1×10⁴/孔)的96孔板中，然后用recHPIV3-JS-NanoLuc、recMeV-NanoPEST、recSeV-Fushimi-Gluc-P2A-eGFP、recVSV-NanoLuc或RSV A2-L19F_D489EfireSMASh报告病毒(MOI＝0.2)感染，并在感染后30小时自动读板。为了鉴别干扰报告因子的候选者，用recVSV-NanoLuc(MOI＝0.2)感染一式两份的平板。在未感染的细胞暴露于测试物品30小时后，在等同的连续稀释平板中测定细胞毒性浓度，然后添加PrestoBlue底物(Invitrogen)以量化细胞代谢活性。使用四参数变量斜率回归来确定EC₅₀、EC₉₀和CC₅₀浓度。为了确定潜在的化学易感性和化合物混杂性，通过PAINS过滤器(www.swissadme.ch)和使用Badapple(http://pasilla.health.unm.edu/tomcat/badapple/badapple)的聚集预测在计算机中处理命中的候选者。为了测量GHP-88309的潜在混杂活性或化学易感性，在改变的条件下进行剂量响应测定：i)将剂量响应平板中的细胞用大量recHPIV3-JS-NanoLuc(MOI＝3)感染；ii)为了测量非特异性脱靶聚集效应，将GHP-88309稀释在含有10％FBS和10mg/mL牛血清白蛋白的DMEM中，并在预温育30分钟后将稀释液添加到细胞中，然后进行感染；和iii)在不同的培养基pH值(pH 5.5、6.5、8.3)下产生3倍稀释的GHP-88309。在所有情况下，在37℃、5％CO₂环境中培养细胞30小时后测量荧光素酶活性。对于基于病毒产量的剂量响应测定，在化合物的连续稀释液的存在下，用recHPIV3-JS NanoLuc、recMeV-Anc、recCDV-5804、recSeV-Fushimi-eGFP、HPIV1、HPIV2或HPIV3以24孔板形式感染细胞(MOI＝0.1)。感染后48小时通过TCID₅₀滴定测定子代细胞相关病毒粒子(MeV和CDV)或释放的病毒粒子(recSeV-Fushimi、HPIV1、HPIV3)的滴度。根据制造商的说明，使用MitoBiogenesis细胞内ELISA(Abcam)测量将HBTEC与GHP-88309温育72小时后的线粒体毒性和细胞毒性。为了评估培养的细胞中的线粒体毒性是否被Crabtree效应掩盖，在作为替代性碳水化合物源的半乳糖培养基中生长VeroE6，然后如概述对代谢活性进行基于PrestoBlue的评估。

小基因组报告基因分析

HPIV3和NiV衍生的小基因组是纳米荧光素酶(NanoLuciferase)、MeV和CDV小基因组萤火虫萤光素酶。NiV小基因组被修饰以编码插入在纳米荧光素酶开放阅读框开头的NiV特异性P-mRNA编辑位点，以确保仅在NiV L进行mRNA编辑后才产生功能性纳米荧光素酶mRNA。在三倍梯度稀释的GHP-88309的存在下测定报告基因活性，从300μM(针对NiV)、100μM(针对HPIV3和MeV)以及20μM(针对CDV)开始。如上计算抑制浓度。

添加时间变化研究

分别用recHPIV3-JS-NanoLuc或recMeV-NanolucPEST感染(MOI＝2)Vero-E6或Vero-hSLAM细胞。在相对于感染的指定时间点，将化合物(GHP-88309、JMN3-003、AS-48或ERDRP-0519)添加到培养基中至最终浓度为20μM。在感染后24小时测量报告基因的表达。

HPIV3宏基因组NGS文库生成和抗病毒耐药性分析

病毒RNA用Turbo DNase I(Thermo Fisher)处理。使用SuperScript III逆转录酶从随机六聚体生成cDNA，使用Sequenase 2.0生成第二链。使用Zymo DNA Clean和Concentrator纯化双链cDNA。在ds-cDNA上使用五分之二体积的Nextera XT并进行20个循环的PCR扩增来生成测序文库。使用0.8×Ampure XP珠来清洁文库，并在1.2％琼脂糖FlashGel上可视化，并进行等摩尔混合，而后在Illumina MiSeq(1×192bp运行)上测序。使用cutadapt(-q 20)(https://doi.org/10.14806/ej.17.1.200)修剪原始fastq读出结果。为了查询潜在的抗性等位基因，在定制分析管道中进行了病毒等位基因的纵向分析(LAVA-https://github.com/michellejlin/lava)。LAVA使用bwa从早期传代病毒构建了候选参照基因组，使用Picard去除PCR重复，使用VarScan调用变量，并使用Annovar将这些变化转换为氨基酸变化。HPIV3 NGS程序的测序读出结果在NCBI BioProject PRJNA561835中可以获得。

SeV L基因NGS

使用SuperScript III One-step RT-PCR试剂盒(Invitrogen)将来自感染的细胞的RNA提取物逆转录并扩增，其中使用引物组“L-扩增子f1”和“L扩增子r8”扩增L基因的1155-4266(从L基因起始密码子开始计数)核苷酸。以此为模板，进行嵌套PCR以产生8个用于NGS的扩增子(400-450bp)。将扩增的8个扩增子混合在一起并提交至NGS。按照制造商的推荐(Illumina)使用NEBNext Ultra DNA文库Prep试剂盒试剂在GENEWIZ进行DNA文库制备、测序反应和初始生物信息学分析。末端修复的接头在3'末端腺苷酸化后连接。根据制造商的说明将合并的DNA文库加载到Illumina仪器上，并通过MiSeq在2×250成对末端(PE)配置上进行测序。碱基检出由Illumina仪器上的Illumina控制软件(HCS)进行。成对末端fastq文件由BBTools合并，并使用bowtie2与参照序列(串联连接的8个扩增子)进行比对。bowtie2所创建的BAM文件经由IGVtools处理以进行变体检测。

病毒和细胞转录本的qRT-PCR分析

对于MeV转录本，用recMeV-Anc(MOI＝3)感染Vero-hSLAM细胞并在GHP-88309、ERDRP-0519或载体的存在下在37℃温育3-6小时，或用recMeV-Anc(MOI＝0.2)感染并在对照的存在下温育12小时。对于HPIV3转录本，用recHPIV3-JS NanoLuc(MOI＝3)感染VeroE6细胞并在GHP-88309或载体的存在下在37℃温育2-4小时。使用Trizol在指定时间点提取总RNA，并使用指定的oligo-dT、MeV先导特异性引物或MeV或HPIV3反基因组特异性引物进行逆转录。随后的qPCR使用的引物对分别对MeV先导RNA、MeV反基因组RNA、MeV P mRNA、MeV HmRNA、MeV L mRNA、HPIV3 N mRNA、HPIV3反基因组mRNA或人GAPDH mRNA中的片段具有特异性，并将样品针对GAPDH进行归一化。为了测定HPIV3感染后HBTEC中的1型IFN通路的诱导，用recHPIV3-JS NanoLuc(MOI＝1)感染细胞并在GHP-88309(6μM)或载体的存在下于37℃温育。感染后16小时分离RNA，并如上产生cDNA。qPCR使用的引物对对人类ifit1、ifn-α、isg15、mx-a或人类gapdh中的片段具有特异性。模拟感染的细胞和经化合物处理的细胞用于确定单独的GHP-88309是否刺激1型IFN通路。对于小鼠肺组织的细胞因子分析，从总肺RNA提取物中确定相对ifn-β、ifn-γ、acod1、il6、tnf、cxcl15、il12b、ddx60、gbp2、ifit3、isg15、slfn4和sp100 mRNA浓度，这些提取物在用recSeV-Fushimi-eGFP感染小鼠后3、6和9天产生。以鼠GAPDH mRNA作为内标，与从模拟感染的动物中提取的肺组织相比，计算相对mRNA诱导。基于载体和GHP-88309处理的动物之间的显著差异生成热图。

体外MeV聚合酶测定

在感染后76小时，在20mM咪唑、50mM NaH₂PO₄、pH 7.5、150mM NaCl、0.5％NP-40缓冲液中裂解细胞后，通过Ni-NTA亲和层析来纯化在杆状病毒/昆虫细胞系统(Fastbac双表达系统和SF9细胞)中表达的MeV P和L蛋白。将蛋白洗脱在250mM咪唑、50mM NaH₂PO₄、pH7.5、150mM NaCl、0.5％NP-40中，然后用Zeba旋转柱将缓冲液更换为150mM NaCl、20mMTris-HCl、pH 7.4、1mM DTT和10％甘油。将P-L异源寡聚体的等分试样混合在具有指定的合成RNA寡核苷酸模板和包含0.07μM ³²P-GTP示踪剂的rNTP(缺乏GTP)的Mg²⁺或Mn²⁺缓冲液中。如所示，将GHP-88309添加到反应混合物中。扩增的材料通过SDS-PAGE分级分离，凝胶通过放射自显影来显影。

生物层干涉仪

使用EZ-Link NHS-Biotin(ThermoFisher)将纯化的MeV L₁₇₀₈生物素化。生物素化后，去除过量的生物素，并使用Zeba脱盐旋转柱将缓冲液更换为Octet Kinetics缓冲液(Fortebio)。使纯化的生物素化的MeV L₁₇₀₈制备物与Super Streptavidin(SSA)高结合生物传感器(Fortebio)结合，并浸入浓度增加的GHP-88309(1.2μM至300μM)中，然后浸入缓冲液中以产生小分子结合和解离曲线。

GHP-88309-016对MeV L₁₇₀₈的光亲性和标记

在激活交联剂之前，将纯化的MeV L₁₇₀₈与光反应性类似物(GHP-88309-016[40μM])一起温育15分钟。将MeV L₁₇₀₈-GHP-88309-016混合物置于冰上并暴露于紫外线(365nm)30分钟，然后再暴露于紫外线(254nm)15分钟。然后使用FLAG树脂收获蛋白质，随后用Laemmli缓冲液在56℃温育15分钟。然后使用Laemmli缓冲液在4-15％丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE电泳。切出感兴趣的条带并进行质谱分析。交联的肽用Wistar研究所的蛋白质组学和代谢组学设施来鉴定。

LC-MS/MS分析和数据处理

液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析通过Wistar研究所的蛋白质组学和代谢组学设施使用连接有Nano-ACQUITY UPLC系统(Waters)的Q Exactive Plus质谱仪(ThermoFisher Scientific)来进行。切出含有MeV L₁₇₀₈的凝胶条带，用胰蛋白酶在凝胶内消化并注入UPLC Symmetry捕集柱(Waters)。在BEH C18纳米毛细管分析柱上通过反相HPLC分离胰蛋白酶肽。洗脱的肽通过质谱仪进行分析，以正离子模式从300到2000m/z重复扫描。以70000的分辨率收集完整的MS扫描，然后对超过最小阈值20000的20个最丰富的离子以17500的分辨率进行数据相关的MS/MS扫描。肽匹配被设置为首选，排除同位素选项并且启用电荷状态筛选以拒绝未指定的带电离子。使用pFind 3.1.5鉴定肽序列。针对包含MeV L、Sf9和杆状病毒以及蛋白序列的自定义数据库搜索MS/MS谱。搜索参数包括完整的胰蛋白酶特异性(最多三个漏切)、10ppm的肽质量容差、15ppm的碎片离子质量容差、半胱氨酸的静态羧酰胺甲基化和蛋氨酸的可变氧化。为了鉴定GHP-88309-016交联的肽，考虑对所有氨基酸残基添加261.0902的质量(GHP-88309-016的分子量)。

计算机模拟对接

使用Amber10力场以MOE 2018.1001进行对接研究。使用基于为RSV(PDB 6pzk)报告的坐标的HPIV3、MeV、NiV和SeV同源性模型来进行对接研究。在质子化和能量最小化之后，根据抗性数据信息，使用诱导契合规程将GHP-88309对接在L结构中。对于HPIV3、MeV和SeV，选择残基E858、E863、S/A866、I1009、T1010和Y1106来鉴定用于对接的目标位点，并比较来自每个聚合酶靶标的所形成的对接位姿。选择RSV和NiV中的同源残基来在计算机上与它们相应的L蛋白对接。

GHP-88309的离体代谢稳定性

为了确定血浆中的稳定性，在37℃摇床培养箱(150rpm)中的玻璃管中，将GHP-88309在汇集的人或CD-1小鼠血浆(BioIVT)中一式三份地温育。普鲁卡因和苯氟雷司用作阳性对照并进行平行分析。在0、5、15、30、60和120分钟的温育时间后，取等分试样，与400μL酸化(0.1％(v/v)甲酸)的乙腈溶液中的内标混合，通过离心使其澄清，上清液通过LC-MS/MS分析。为了确定肝微粒体中的稳定性，在37℃摇床培养箱(150rpm)中的玻璃管中，将GHP-88309在50mM Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液中一式三份温育，缓冲液中含有8mM MgCl₂、25μg/mL阿拉霉素、I和II阶段辅因子(分别为NADPH再生系统(NRS)和2mM UDPGA)以及0.5mg总蛋白汇集的混合性别人肝微粒体(BioIVT)或汇集的CD-1小鼠肝微粒体(Xenotech)。维拉帕米作为I阶段阳性对照，阴性对照缺乏辅因子并且在水中含有2％(w/v)NaHCO₃而不是NRS。在0、15、15、30、60和120分钟后取等分试样，并按上述方法进行处理。

全部动物研究

除非另有说明，标准组大小为每组5只动物。功效计算(P<0.05；80％功效)显示该样本量将检测到平均病毒滴度>0.71对数单位的差异。将动物随机分配到不同的研究组；除了肺切片的组织病理学评分外，研究人员没有进行盲测。

小鼠药代动力学分析

所有体内实验均在8周龄的雌性129x1/SvJ小鼠(Jackson实验室)中进行；至少每天监测一次动物。静脉注射和口服物质施用后进行单剂量PK研究。对于静脉注射给药，将GHP-88309在28％PEG200、5％二甲基乙酰胺、无菌PBS中的67％30％HPB环糊精中配制为1.25mg/ml。对于口服给药，将化合物配制在水中的1％甲基纤维素中，形成至多18.76mg/ml的均匀悬浮液。通过尾静脉注射5mg/kg或通过口服管饲50mg/kg或150mg/kg来对小鼠进行施用，然后在0、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8和24小时后采血(静脉注射组)或在0、0.25、0.5、1、2、4、6、8和24小时后采血(每个口服组)。在采血后15分钟内从全血制备血浆(2000×g，5分钟，4℃)，并将样品储存在-80℃直至进行LC-MS/MS分析。校准曲线范围为10-10000ng/ml，超过定量限的样品用商购的CD-1小鼠血浆稀释并重新测试。品控样品散布在整个运行过程中，并且在空白CD-1或129x1/SvJ小鼠血浆中未检测到色谱干扰。对于多剂量PK研究，小鼠以每日两次的方案口服150mg/kg剂量浓度的GHP-88309五天。在给药的前4天，在早晨给药后0.5小时(C_max)和11.5小时(谷值)收集血样。在第5天，如概述在早晨给药后进行了完整的PK研究(缺少6小时时间点)。如上所述处理和分析血样。为确定GHP-88309器官分布，向小鼠施用单次口服150mg/kg剂量的GHP-88309。给药后90分钟摘取选定的器官(脑、肺、脾、肾、肝和心脏)，在液氮中快速冷冻，并在-80℃储存，直至进行后续的所述LC-MS/MS分析。

中和抗体滴度的测定

如上所述制备血浆，热灭活，在无血清DMEM中连续稀释(每步2倍)，与100TCID₅₀单位的recSeV-Fushimi-eGFP混合，并在25℃温育1小时。将混合物转移到Vero-E6细胞单层中，三天后通过观察GFP阳性感染细胞来测量病毒中和作用。等量的FBS中的recSeV-Fushimi-eGFP、含7.5％FBS的DMEM和无血清DMEM用作对照。每个血样都以两次技术重复来测试。

SeV小鼠模型中的功效研究

除非另有说明，各组大小为每组5只动物，激发病毒是recSeV-Fushimi eGFP，以50μl PBS中的1.5×10⁵TCID₅₀单位进行鼻内施用。感染前2小时开始用GHP-88309进行预防性治疗，感染后48小时开始进行治疗性治疗。对于所有治疗研究，药物是通过口服强饲法以每日两次的方案以150mg/kg体重来施用的。每天两次监测感染的小鼠的临床体征(体重减轻、体温变化、整体镇静)。通过对Vero-E6细胞上的组织匀浆进行TCID₅₀滴定，在感染后第3、6和9天的小鼠组中测定肺和气管病毒滴度。用于qRT-PCR的组织样本保存在RNAlater中直至分析。对于再激发研究，初次感染后的GHP-88309治疗在9天后停止，随后使动物休息至初次感染后28天，并用1.5×10⁵TCID₅₀的recSeV-Fushimi eGFP进行鼻内再感染。在再激发时等同地感染对照组的SeV-空白小鼠。小鼠在第二次感染后未接受任何治疗，在研究第21天和第32天收集血液以确定中和抗体滴度。对于耐药性recSeV的感染，如上所述用工程化的、耐药性重组体或遗传亲本病毒对动物进行鼻内感染，并如上所述监测临床体征。在感染后第14天终止研究，当时没有检测到临床体征，并且感染了亲代recSeV的动物已经死于该疾病。

组织病理学评分

完整的肺用福尔马林固定，石蜡包埋，切片并用苏木精和伊红染色。盲样根据矩阵进行评分：0，与未感染小鼠的肺相比没有变化；1，极少的免疫细胞浸润迹象；2，轻度炎症和/或免疫细胞浸润；3，中度炎症和/或免疫细胞浸润，轻微的细支气管增厚；4，明显的炎症和/或免疫细胞浸润，中度的细支气管增厚以及气道和血管周围的免疫浸润；5，严重的炎症和/或免疫细胞浸润，吞噬至多50％的肺叶，严重的细支气管成套/增厚以及气道和血管周围的免疫浸润；6，严重的炎症和/或免疫细胞浸润，吞噬超过50％的肺叶，严重的细支气管成套/增厚以及气道和血管周围的免疫浸润。

在GHP-88309存在下对recSeV-eGFP的体内适应

对于体内适应，以1.5×10⁵TCID₅₀单位向小鼠鼻内施用50μl PBS中的recSeV-Fushimi eGFP或抗性重组体。在感染前2小时开始使用GHP-88309进行预防性治疗，按照口服管饲法以每天两次的方案施用50mg/kg体重。每天两次监测感染的小鼠的临床体征(体重减轻、体温变化、整体镇静)。在感染后6.5天收获小鼠，并在Vero-E6细胞上通过组织匀浆的TCID₅₀滴定来确定肺病毒滴度。对于每个传代的recSeV-Fushimi eGFP，用50μL的第1代肺匀浆感染第二只小鼠。在感染后6.5天收获第2代小鼠，并在Vero-E6细胞上通过组织匀浆的TCID₅₀滴定来确定肺病毒滴度。对来自组织匀浆的SeV RNA进行RT-PCR。对PCR片段(L残基815-1181)进行测序以鉴定在GHP-88309存在下在recSeV-eGFP的体内传代过程中产生的任何潜在抗性突变。

为了确定体内传代的病毒的易感性，以96孔格式(5x10³个细胞/孔)用收获的SeV-eGFP感染Vero-E6细胞。将感染的细胞与浓度增加的GHP-88309(0.13-100μM)一起温育。在感染后80小时，使用Cytation5成像阅读器(Biotek)量化GFP信号。使用Gen5软件包(Biotek；v3.05)使用面积扫描功能(49读数/孔；激发/发射＝479/520nm)确定平均荧光强度。用DMSO和放线菌酮处理的感染的细胞分别用作阴性和阳性对照。通过4参数变量斜率回归建模从剂量响应数据集计算有效浓度。

人类3D-ALI-HBTEC模型

将3.3×10⁴个HBTEC接种到6.5mm Costar Transwell细胞培养插槽(孔径0.4μm)上，并浸没在BronchiaLife细胞培养基中生长至100％融合。然后将HBTEC气液界面分化培养基(LifeLine Cell Technology)添加到基底外侧室中，并从顶端室中取出培养基。细胞在ALI培养21天，每48小时清洗一次新出现的3D培养物以去除多余的粘液，并使用连接有STX2电极的EVOM伏特/欧姆计(World Precision Instruments)测量跨上皮/跨内皮电阻(TEER)。电阻≥700Ω/cm²的培养物用于实验。对于感染研究，用recHPIV3-JS-NanoLuc、HPIV-1-5F6、HPIV3-9R4或HPIV3-10L3(5,000TCID₅₀/孔)顶端接种3D-ALI-HBTEC 2小时，并用培养基洗涤三次。从基底室给予GHP-88309或等同体积的DMSO进行处理。每24小时从顶室收集释放的病毒。通过对脱落病毒进行TCID₅₀(recHPIV3-JS-NanoLuc)或TCID₅₀-HA(HPIV-1和HPIV3临床分离株)滴定来评估治疗功效。

共聚焦显微镜

3D培养物用4％多聚甲醛-PBS固定20分钟，然后用0.5％TritonX-100-PBS透化2小时。用5％BSA-PBS封闭非特异性蛋白结合位点1小时。使用山羊抗HPIV3(Abcam)和抗山羊Alex-568(Thermo Scientific)检测HPIV3。使用小鼠抗Muc5AC(Thermo Scientific)检测Muc5AC。使用小鼠抗ZO1(BD Biosciences；610966)检测ZO-1(紧密连接)。使用抗小鼠FITC二抗(SantaCruz)进行Muc5AC和ZO-1染色。使用抗β-微管蛋白647抗体(NovusBiologicals)检测β-微管蛋白。使用补充有0.1mM 4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI；分子探针)的封固介质将膜置于载玻片上，盖上盖玻片，边缘用指甲油密封。连接有AiryScan模块的Zeiss LSM 800共聚焦显微镜用于检测，Zeiss Zen Blue软件用于图像分析。

结果

HTS规程以表达纳米荧光素酶(HPIV3-JS-NanoLuc)的重组HPIV3为中心(图7A)。完全验证(图7B)，我们将该规程用于筛选141936种化合物。结合对照依赖性和对照独立的统计学方法进行命中项识别(图1A)，我们允许451种化合物进入直接和正交复筛(图7C；图19)。性能要求是EC₅₀<1μM、CC₅₀>20μM、缺乏报告基因干扰、不存在化学型混杂和化学反应性。两种化合物GHP-88309和GHP-64627符合所有标准并且是有来源的。GHP-88309(图1B)通过随后的过滤器，在化学再合成(图1C-D)后，返回针对recHPIV3-JS-NanoLuc的活性浓度0.4-0.78μM，这与来源材料在统计学上无法区分(P＝0.7233)(图7D)。在至多1mM GHP-88309的存在下温育细胞多天，显示没有细胞毒性，在未感染(图1E；图7E-7F)和感染(测试的最高浓度300μM；图7G)的培养细胞中对应于SI>2,500。

具有增宽的抗副粘病毒活性谱的化学型

GHP-88309的抑制活性不仅限于HPIV3，还包括测试的呼吸系病毒属的其他成员(HPIV1、SeV)并扩展到麻疹病毒属(MeV、犬瘟热病毒(CDV))(图1D)。亲缘关系更远的正腮腺炎病毒属(HPIV2)的副粘病毒、肺炎病毒属(RSV)和正粘病毒(甲型流感病毒)未受到抑制。

为了测试GHP-88309的广谱活性是否归因于不希望的多药理学行为，评估了化合物聚集或化学反应性(Auld，D.S.等，Assay Guidance Manual(2004)，Coan，K.E.等，MolBiosyst 3，208-213(2007)和Habig，M.等J Biomol Screen 14，679-689，(2009))。(图7G)在响应于改变的pH值、不同数量的病毒接种物或以高浓度添加的牛血清白蛋白，仅注意到统计学上不显著(P＝0.329)的抗病毒效力变化(EC₅₀＝0.59-1.16μM)。支架的合成精细化揭示了对于HPIV3和MeV靶标而言一致的构效关系(SAR)(图17)，并表明GHP-88309不是单个的命中项，而是独特的抗病毒化学型的创始成员。

GHP-88309在原代细胞中和在对抗临床分离株中具有生物活性

当在疾病相关的人支气管气管气道上皮细胞(HBTEC)培养物中针对HPIV3-JS及临床分离株HPIV3-9R4和HPIV3-10L3进行测试时，在原代细胞/病毒分离株系统中抗病毒效力增加至约5倍(EC₅₀分别为0.07和0.08μM)，而低程度的GHP-88309细胞毒性则保持不变(CC₅₀约1mM)(图1E)。两种分离株的实验室暴露量都极少，已在体外扩增最多两代。在培养的细胞上针对另外三种HPIV3、三种HPIV1和六种MeV临床分离株的扩展测试表明，在不同的靶病毒和病毒株中具有一致的抗病毒效力(图7I-7K)。使用HPIV3和MeV作为目标的添加时间(ToA)变化研究提供了对GHP-88309抗病毒机理的初步了解。先前表征的MeV入口(AS-48)和聚合酶(ERDRP-0519)抑制剂和宿主定向RdRP阻滞剂JMN3-003用作参考。GHP-88309ToA特征谱与聚合酶抑制剂ERDRP-0519和JMN3-003的特征谱重叠(图1F；图7H)。针对MeV-Edm、HPIV3-JS和CDV-Onderstepoort建立的后续小基因组报告基因测定显示出GHP-88309(图1G)对病毒RdRP活性的特异性抑制，因为RSV衍生的小基因组测定未受影响。

耐药性热点定位于L蛋白

我们确定了MeV、HPIV3和SeV(代表我们的替代小动物功效模型的激发病毒)的GHP-88309抗性特征谱。每个靶标在六个系列中进行剂量递增病毒适应(0.5-200μM浓度范围)，直到化合物存在下的病毒生长得到改善。Sanger和下一代测序揭示了所有在表型上具有抗性的HPIV3、SeV和MeV群体的L蛋白突变(图2A)。对抗性HPIV3群体的全基因组进行分析后显示，在与RdRP复合物、核衣壳(N)和磷蛋白(P)相关的其他病毒蛋白成分中没有突变。一些替换影响了附着和融合糖蛋白，但据报道这些变化是由于HPIV3对永生化细胞系的适应而引起的，因此没有继续研究。L_G1036E多态性在暴露于GHP-88309或载体后出现在几个SeV谱系中，表明天然多态性或细胞培养适应效应。所有其他L突变都在相应的HPIV3、SeV或MeV小基因组系统和/或重组病毒以及所鉴定的特定抗性位点中重建(图8A-D)。

为了在结构上定位已确认的位点，我们基于相关的PIV5 L蛋白的低温电子显微镜重建生成了HPIV3、SeV和MeV L的同源性模型。所有经过验证的位点都聚集在一个保守的L微结构域中，该微结构域位于RdRP和加帽结构域的交点附近的模板通道内表面(图2A-D)，对应于聚合酶复合物的拇指结构域。这种抗性突变的紧密且保守的空间排列表明接近于GHP-88309的物理靶标位点。

对接位姿的光交联靶标映射和提取

在新出现SAR的启发下，我们设计了一种光激活性叠氮化物类似物GHP-88309-016(图8G)，它在基于细胞的测定中保持了对HPIV3和MeV的抗病毒活性(图8H)。使用纯化的MeVL复合物(图8F)，我们共价光耦合了GHP-88309-016，并通过LC-MS/MS鉴定了对接位点。三种不同的肽含有对应于配体的额外质量(图20；图8I)。MeV L结构模型中的定位表明，其中两种肽(图8J)可能形成非特异性交联，这对于例如GHP-88309-016等苯基叠氮化物已有报道，而肽3中的残基992-994则形成紧邻抗性簇的中央L腔壁的一部分(图8K)。

基于最接近的相互接近度(图9J)，我们选择了肽3的残基D993和抗性位点E863、A866、S869、Y942、I1009、T1010和Y1106作为计算机模拟对接的靶标。GHP-88309和GHP-88309-016的保守的最高得分位姿将配体置于加帽结构域和聚合酶结构域的界面处(图2E)，使GHP-88309-016的芳基叠氮官能团位于肽3中的残基992-994的约

内(图9K)。预计GHP-88309的异喹啉环与L残基Y942和R865形成π-氢键，这些残基在易感病毒中是保守的，并且苯甲酰胺部分位于残基Q1007和R1011的

内(图9L)。这种排列在药理学上将L加帽结构域和RdRP结构域连接起来。等同的计算机模拟GHP-88309对未受抑制的尼帕病毒(NiV)和RSV的L蛋白的对接尝试未能产生可比较的结合位姿(图9M-9N)。

抗性降低了抑制剂结合亲和力

生物层干涉仪(BLI)用于监测GHP-88309对固定在生物传感器上的纯化的MeV L的亲和力。GHP-88309与标准MeV L的结合达到饱和(图8L)并显示出6.2μM的亲和力(K_D)，而与具有真正抗性突变的L蛋白(L_S869P、L_I1009F、L_Y1106S、L_S869P/Y942H)的结合显著降低(图2F；图2G)。在MeV L背景下，在呼吸系病毒抗性热点L_E858D处的替换仅产生中度逃逸。EC₅₀和K_D浓度之间约10倍的差异据推测反映了副粘病毒聚合酶制剂的构象异质性，其中只有一部分具有生物活性，因此以EC₅₀值表示。

对HPIV3、HPIV1和MeV L的序列数据库搜索未在已确认的GHP-88309抗性位点显示出天然多态性。一个例外是实验室产生的温度敏感型HPIV3候选疫苗，该候选疫苗通过L_Y942H突变而减毒。然而，在靶标微结构域中含有序列变异的副粘病毒属，例如正腮腺炎病毒HPIV2，并没有被GHP-88309抑制(图22)。同样，在1156位具有组氨酸(与MeV和SeV中的L_Y1106H抗性替换同源)的NiV L不受抑制(EC₅₀＝314.1μM；图8E)。将L_H1156Y突变引入NiV L后得到GHP-88309易感性(微型复制子测定中抑制浓度降低59倍；EC₅₀＝5.3μM)(图8E)，表明化合物靶位点从副粘病毒进化中在结构上是保守的，并且在不同属之间仅获得孤立的点突变。

GHP-88309损害RNA合成的启动

初始转录期间在感染的细胞中合成的相对病毒mRNA量的定量揭示了该化合物导致HPIV3和MeV mRNA的剂量依赖性减少(图2H-2J；图10E-10G)。这一结果可能反映出磷酸二酯键形成受到抑制、L介导的mRNA加帽被阻断或启动子处的RdRP启动受损。我们通过量化GHP-88309对HPIV3或MeV先导(Le)-RNA(进入细胞后病毒转录酶的第一个产物)的影响来测试中止的mRNA成熟。该化合物剂量依赖性地抑制了Le-RNA的合成(图2K；图10H)，但未改变HPIV3和MeV mRNA转录梯度(图10I-10J)。这些结果与受损的mRNA加帽不相容，因为i)单负链病毒Le-RNA既没有被加帽也没有被多腺苷酸化，因此不应受到加帽阻断的影响；ii)当新生的mRNA保持未加帽时⁴⁵，转录酶模式下的RdRP中止，这将导致病毒转录梯度变陡。

我们基于纯化的重组聚合酶复合物在体外MeV RdRP测定中评估了对RdRP起始与RNA延伸的抑制作用(图2L；图11A-11D；图12A-E)。一个25聚体合成RNA模板探索了GHP-88309对磷酸二酯键形成和延伸的影响，这利用了当模板自发形成圆形发夹结构时的人工反向启动步骤(图2L；图12A-12B)(Behrens，S.E.等，EMBO J 15，12-22(1996)和Noton，S.L.等，PLoS Pathog.8，e1002980，(2012))。GHP-88309在反向启动后未阻止RNA延伸，因此不会阻止磷酸二酯键的形成(图2L；图12C)。然而，当使用不支持反向启动的16-聚体RNA模板时，我们注意到从头RNA合成受到剂量依赖性抑制(图12D-12E)，尽管化合物浓度比EC₅₀值高得多。对无催化活性的L_N774A突变体的测试证实了体外聚合酶测定的特异性(图2L；图12C、12E)。

GHP-88309在与疾病相关的3D人体气道类器官中有效

在人类中，HPIV3感染通常仍然局限于呼吸道。为了评估疾病相关人组织模型中的抗病毒效力，我们生成了在气液界面生长的充分分化的原代人支气管气管气道上皮培养物(3D-ALI-HBTEC)。在基底外侧室中类器官暴露于至多640μM的GHP-88309后，跨上皮电阻(TEER)和显微镜检查的紧密连接组织没有变化(图3A-B)，这证实了广泛的安全边界。

针对HPIV3分离株10L3和9R4以及HPIV1分离株5F6生成的剂量响应曲线在3D-ALI-HBTEC中返回了纳摩尔范围内的EC₅₀(分别为90nM、105nM、280nM)(图3C-D)。受感染和处理过的类器官培养物的共聚焦显微镜证实了病毒主要在纤毛细胞中复制，与之前的报告一致，并确定了基底外侧室中10μM的静态GHP-88309浓度是消毒性的(图3E)。

GHP-88309的口服生物利用度

由于已建立的HPIV3小动物模型只是半允许性的，并且没有一个能够概括人类疾病的所有关键特征，因此我们选择了SeV小鼠替代模型来监测自然宿主中对呼吸系病毒疾病的功效。因此，在小鼠中测定了PK曲线。

在人和小鼠肝微粒体存在下的代谢稳定性测试显示出分别为15.3和>24小时的长半衰期(图4A)。在以50和150mg/kg口服GHP-88309的小鼠中进行的单剂量PK测定显示出剂量依赖性但非线性的总体药物暴露，在150mg/kg剂量后持续药物血浆浓度>30μM，并且口服生物利用度接近90％(图4B；图21)。血浆C_max后60分钟的药物组织分布确证了高血浆稳定性，在包括肺在内的所有经测试的软组织中显示出GHP-88309器官浓度为70-246nmol/g(图4C)。在以150mg/kg的剂量每日两次施用的5天多剂量口服PK研究中，该化合物被良好耐受。暴露的动物没有出现生物毒性迹象，尽管在4天的治疗期期间持续药物血浆浓度非常高，其在谷底时稳定在约34μM——相当于SeV细胞培养物EC₅₀的17倍(图4D)。多日给药没有显著(P>0.82)改变GHP-88309的PK特性(图4E)。

GHP-88309在HPIV疾病替代模型中口服有效

小鼠中的SeV概括了HPIV病理学，但小鼠在8-10天内死于感染，从而建立了简洁的治疗终点。由于GHP-88309对HPIV3、HPIV1和MeV的细胞培养物EC₉₀浓度比SeV低约6-17倍，因此SeV/小鼠系统有望成为抗病毒功效的稳健预测因子。

GHP-88309以150mg/kg每日两次口服施用，从感染时开始施用(预防性)或从确定下呼吸道疾病的感染后(pI)48小时开始施用(治疗性)。两种方案都减轻了体重损失并防止了体温过低(图5A-B)。所有治疗的动物都存活下来，而载体处理组的小鼠在9天内死亡(预定义的终点>20％的体重减轻)(图5E)。治疗显著降低了气管(图5C；P_治疗性＝0.0068和P_预防性<0.0001)和肺(图5D；P<0.0001)中的病毒载量。

pI 6天的肺切片组织学评估揭示了载体处理的动物的细胞浸润，这与细支气管炎症一致(图5F-G)。预防性治疗的动物的肺切片未显示统计学显著的(P＝0.62)病理学变化。在接受治疗性治疗的动物的肺中，炎症和细胞浸润得到缓解。

治疗导致药理学病毒减毒作用

我们确定了pI 3、6和9天的肺组织中宿主先天性抗病毒响应的特征基因的相对诱导(图5H；图13A)。与SeV致病性直接相关的IFN-β诱导在pI第3天在经处理的小鼠中显著低于载体动物(P_治疗性＝0.0088；P_预防性＝0.0011)。用GHP-88309对感染了HPIV3的HBTEC进行离体处理并没有减少IFN-β水平(图13B)，证实没有直接干扰IFN表达。

副粘病毒的非结构蛋白，在SeV的情况下是C和V，会抵消宿主的抗病毒反应。尽管病毒负荷低于未治疗的动物，治疗组的小鼠在第3天显示出IL12b表达增加，表明宿主免疫激活未减弱，因此GHP-88309直接导致了药理学病毒减毒作用。然而，到第6天，经治疗的动物表现出炎症标志物的表达显著降低(IL-6(P_预防性＝0.0265)、TNF(P_预防性＝0.0329和Acod1(P_预防性<0.0001，P_治疗性＝0.020))和一些具有抗病毒效应功能的干扰素刺激基因(isg15、slfn4)的表达显著降低。感染的、经处理的HBTEC表现出增强的ISG表达(图13B)，这与未减弱的IFN-β信号通路一致。

康复者的强适应性免疫

如针对福尔马林灭活的实验性MeV和RSV疫苗所描述的，对副粘病毒和肺病毒感染的免疫反应改变可导致再次激发时加重非典型疾病。为了评估治疗经验对下游致病性的影响，我们设计了一项再激发研究(图6A)。感染了SeV的动物接受治疗性治疗，从注射后48小时开始，持续9天每日两次。治疗显著缓解了临床体征(图6B-C)，并且所有动物存活，而对照组则死亡(图6D)。康复者产生了强健的体液抗SeV响应(图6E)。随后在原始感染后28天用1.5×10⁵TCID₅₀ SeV再次激发，导致完全存活且没有出现临床体征(图6G-H)，而新一组空白动物死亡。

GHP-88309抗性病毒是无致病性的

为了探索对GHP-88309的抗性是否与感染反弹一致，我们重建了重组病毒中所有已确认的SeV L抗性突变。在细胞培养物中，与亲本病毒相比，这些recSeV显示出显著的生长延迟(P<0.0013)(图6I)。根据热点位置的多样性、细胞培养物中的最佳相对适性以及HPIV3(recSeV-L_E863D)和MeV(recSeV-L_I1009L和recSeV-L_Y1106S)适应中的交叉出现，选择了三种recSeV进行体内测试。所有感染这些病毒的动物都存活下来，且体重减轻很小(图6J-K)。当标准recSeV滴度达到峰值时，pI 6天时肺病毒载量降低或低于检测水平，并且两种抗性病毒已恢复为野生型L(图22)。

为了探索体内病毒适应是否识别出额外的逃逸突变，我们在用亚抑制性50mg/kgGHP-88309治疗的小鼠中传代了两次recSeV。在五个独立的谱系中，有两个在第二次传代后检测不到病毒。从其他三个谱系中分离出的病毒对GHP-88309的易感性没有改变，并且对与抗性相关的L区域的Sanger测序未揭示已知逃逸位点处的多态性(图22)。这些结果表明，SeV对GHP-88309的抗性与体内强烈的病毒减毒作用一致。尽管多种补偿性突变的组合可以恢复GHP-88309抗性病毒的适性，但在没有相应的致病性损失的情况下，存在防止病毒逃逸的高屏障。

讨论

大部分变构小分子抗病毒药物的活性谱很窄。对于单负链病毒，尚未报道任何直接作用性非核苷抑制剂具有针对超过一个属的抗病毒活性。GHP-88309的发现改变了这种范式。基于序列比对，我们预测所有呼吸系病毒和麻疹病毒都是易感的。显然，由于L₁₁₅₆位的组氨酸，NiV没有受到抑制，但亨尼帕病毒属的某些成员，例如松湾病毒(Cedar virus)或加纳蝙蝠病毒，具有酪氨酸，可能是敏感的。

NiV对药物的天然抗性提出了一个问题：针对呼吸系病毒和麻疹病毒的使用是否会引发使这些病毒更像NiV、从而可能导致疾病加重的抗性突变。在recSeV小鼠致病性模型中进行测试，所有SeV抗性突变都会导致主要的病毒减毒作用，从而减轻致病性的担忧。

多项机理研究一致地指向GHP-88309所导致的启动子处的从头聚合酶启动受损，这反映出阻断副粘病毒聚合酶的强有力的策略。尽管某些相关病毒的抑制剂(例如RSV限制性AZ-27)抑制从头聚合酶启动，但GHP-88309和AZ-27的抗性谱以及预测的靶位点是不同的(图18)。我们的得分最高的对接位姿将GHP-88309置于RdRP结构域和加帽结构域之间的交点，这是通过桥接两个域来防止聚合酶持续合成能力所需的结构重排的基础位置。值得注意的是，针对一系列RSV加帽抑制剂的逃逸突变定位于与GHP-88309抗性不同的聚合酶区域(图18)，这突出说明了GHP-88309不直接干扰病毒mRNA加帽。

GHP-88309的PK表征表明，出色的口服生物利用度和代谢稳定性很容易弥补中度效力的不足。尽管剂量尚未失效，但目前口服有效的150mg/kg也相当于并非不切实际的12mg/kg的人体等效剂量。与麻疹病毒聚合酶抑制剂ERDRP-0519(Krumm，S.A.等Sci.Transl.Med.6，232-252(2014))不同，在SeV模型中GHP-88309并未引发ISG表达水平与载体相比的大幅增加，这可能反映了SeV感染仅限于呼吸道上皮细胞，而麻疹病毒引起病毒血症。GHP-88309为剖析药物干预对相关替代模型中局部和全身副粘病毒感染的影响提供了独一无二的基础。

考虑到GHP-88309的活性谱拓宽和免疫功能低下的成年人的高HPIV疾病负担，该化合物解决了损害副粘病毒药物临床开发的主要顾虑。为疗效评估提供可行的途径，试验可能涉及患有破坏性HPIV3感染的成年移植受体。除了所发现的扩大的治疗干预机会窗口外，对该组的频繁监测还可以及早发现感染。我们的数据展示了GHP-88309化学型的强大治疗潜力，它结合了巨大的安全边际和已证明的口服疗效，为最终解决患有呼吸系病毒或麻疹病毒疾病的患者的目前未满足的临床需求提供了机会。

结论

在对HPIV3(急性呼吸道感染的主要原因)抑制剂的高通量筛选中，我们鉴定了GHP-88309，这是一种病毒聚合酶活性的非核苷抑制剂，其对包括呼吸系病毒(即HPIV1和HPIV3)和麻疹病毒(即MeV)在内的多种副粘病毒具有不同寻常的广谱活性。不同靶病毒的抗性谱在空间上重叠，揭示了病毒聚合酶(L)蛋白中心腔中的保守结合位点，该位点通过光亲和性标记靶标映射得到确证。通过病毒RNA特征收集和体外MeV聚合酶测定进行的机理表征确定了病毒聚合酶启动阶段的阻断。GHP-88309在充分分化的人类气道类器官培养物中显示出对HPIV3分离株的纳摩尔级效力，耐受性良好(选择性指数>7,111)，口服生物利用度高，并在感染后48小时进行治疗性给药时，在仙台病毒(SeV)-人HPIV3疾病的小鼠替代模型中提供了针对致命感染的完全保护。康复者已经获得了针对再感染的强健免疫保护，并且病毒耐药性与严重的减毒作用同时发生。这项研究提供了表现良好的广谱变构抗病毒药物的可行性证明，并描述了一种具有高治疗潜力的化学型，其可解决抗副粘病毒药物开发的主要障碍。

数据库搜索

使用门户网站NCBI Virus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/labs/virus/vssi/#/)获取来自RefSeq、GenBank和其他NCBI存储库的全基因组序列。使用HPIV-1(NCBI：txid12730，92个序列)、HPIV-3(NCBI：txid11216，392个序列)和MeV(NCBI：txid11234，293个序列)的分类学ID来搜索完整的L蛋白序列。

统计学和再现性

MScreen、GraphPad Prism和Excel软件包用于数据分析。当比较多于两个组或数据集包含两个独立变量时，使用未经进一步调整的具有Dunnett、Sidak或Tukey的多重比较事后检验的单向或双向ANOVA来分别评估统计显著性。应用于个体研究的特定统计测试在图例中指定。源数据文件(Plemper_SourceData_Statistics)总结了本研究中进行的每个统计学分析的检验统计量(效应量、自由度、P值)。样本大小的适当性通过源数据文件(Plemper_SourceData_Statistics)中指定的来源方程和功效分析来确定。方差分析中组间的效应量计算为η²＝(SS_效应)/(SS_总)[单因素方差分析]和ω²＝(SS_效应-(df_效应)(MS_错误))/MS_错误+SS_总[双因素方差分析]。使用事件时间对数秩(Mantel-Cox)检验来分析生存数据。为了确定抗病毒效力和细胞毒性，通过4参数变量斜率回归建模从剂量响应数据集计算有效浓度；值以95％置信区间(CI)表示。生物学重复是指从不同样本中获取的测量值，针对每个单独的生物学重复获得的结果与生物学独立样本、动物或独立实验的确切大小(n的数量)一起显示在图中。中心测量(连接线和列)均为平均值，但图5a-e和6i除外，它们显示了图例中指定的中位数。误差条均代表标准偏差(SD)。对于所有实验，统计学显著性水平α设置为<0.05，精确的P值尽可能显示在单独的图表中。

道德声明

所有动物研究均按照《实验动物护理和使用指南》进行。所有实验均经乔治亚州立大学机构动物护理和使用委员会(协议AL17019)批准，并按照符合实验动物护理认证协会指南、美国国立卫生研究院法规、佐治亚州立大学政策以及地方、州和联邦法律进行。用异氟醚麻醉小鼠并用二氧化碳使其安乐死。

人类受试者

本项目中使用的正常原代人支气管气管上皮细胞(HBTEC)来自供应商LifeLineCell Technology(https://www.lifelinecelltech.com/human-cell-systems/management/)。这些样本由售卖者在知情同意下获得，并遵守赫尔辛基宣言、人体组织法(英国)、CFR Title 21和HIPAA法规(如https://www.lifelinecelltech.com/technical-support/ethics/中规定的)。所有监管批准责任都归于售卖者。LifeLine CellTechnology没有参与研究设计，也没有在该项目中发挥主动或建议性作用，这包括不参与实验执行和研究结果的解释。为保护捐赠者和组织供应商的隐私，LifeLine CellTechnology不提供捐赠者记录或组织来源协议的副本。售卖者持有捐赠者同意书和法律授权，允许所有研究使用。这些同意和授权文件没有鉴别特定类型的研究测试。如果仅用于研究目的，则适用捐赠者同意书。

所附权利要求的组合物和方法的范围不受本文所述的特定组合物和方法的限制，它们旨在作为权利要求的几个方面的说明，并且任何功能等效的组合物和方法都旨在落入所述权利要求的范围内。除了本文所示和描述的那些之外，组合物和方法的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。此外，虽然仅具体描述了本文公开的某些代表性组合物和方法步骤，但即使没有具体记载，组合物和方法步骤的其他组合也旨在落入所附权利要求的范围内。因此，步骤、元素、组件或成分的组合可以在本文中明确提及或更少提及，然而，即使没有明确说明，也包括步骤、元素、组件和成分的其他组合。如本文所用，术语“包含”及其变体与术语“包括”及其变体同义使用，并且是开放式的、非限制性的术语。尽管在本文中已经使用术语“包含”和“包括”来描述各种实施方式，但是可以使用术语“基本上由……组成”和“由……组成”代替“包含”和“包括”以提供本发明更具体的实施方式并且其也被公开。除了在实施例中或另有说明的地方，在说明书和权利要求书中使用的表示成分的量、反应条件等的所有数字都应理解为至少应根据有效数字的数量和通常的舍入方法来解释，而不是试图限制权利要求等效范围的原理的应用。

实施方式

实施方式1：一种用于抑制RNA聚合酶的化合物，其具有式(I)的结构：

或其药学上可接受的盐，其中：

X¹选自CR¹或N；

X²选自CR²或N；

X³选自CR³或N；

X⁴选自CR⁴或N；

Z选自：

-(CH₂)_nL、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基；

n是0-10；

L选自R⁵；OR⁵或NR⁵R⁶；

Y¹选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^a、-N(R^a)₂、-Q¹C(M)Q¹R^a、-Q¹C(O)N(R^a)₂、-Q¹SO₂Q¹R^a或-Q¹SO₂)N(R^a)₂，

Y²选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^b、-N(R^b)₂、-Q¹C(M)Q¹R^b、-Q¹C(O)N(R^b)₂、-Q¹SO₂Q¹R^b或-Q¹SO₂N(R^b)₂，

Y³选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^c、N(R^c)₂、-Q¹C(M)Q¹R^c、-Q¹C(M)N(R^c)₂、-Q¹SO₂Q¹R^c或-Q¹SO₂N(R^c)₂，

Y⁴选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^d、-N(R^d)₂、-Q¹C(M)Q¹R^d、-Q¹C(M)N(R^d)₂、-Q¹SO₂Q¹R^d或-Q¹SO₂N(R^d)₂，

Y⁵选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^e、-N(R^e)₂、-Q¹C(M)Q¹R^e、-Q¹C(M)N(R^e)₂、-Q¹SO₂Q¹R^e或-Q¹SO₂N(R^e)₂，

Y⁶选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^f、-N(R^f)₂、-Q¹C(M)Q¹R^f、-Q¹C(M)N(R^f)₂、-Q¹SO₂Q¹R^f或-Q¹SO₂N(R^f)₂，

Y⁷选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^g、-N(R^g)₂、-Q¹C(M)Q¹R^g、-Q¹C(M)N(R^g)₂、-Q¹SO₂Q¹R^g或-Q¹SO₂N(R^g)₂，

M在每种情况下独立地选自O、NH、S、NOH或CH；

Q在每种情况下独立地选自无、O、NH或S；

Q¹在每种情况下独立地选自无、O、NH或S；

R¹、R²、R³和R⁴独立地选自R^p、OR^p、N(R^p)₂、CN、NO₂、COR^p、C(O)OR^p、Fl、Cl、Br或I，其中，R^p在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基；

R⁵、R⁶、R^a、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基，

其中，L、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、Y⁶、Y⁷、R^a、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g中的任意两个以上可以一起形成环。

实施方式2：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其具有以下结构：

其中，R⁸选自H或C_1-3烷基并且Y⁸在每种情况下独立地选自R^p、OR^p、N(R^p)₂、CN、NO₂、COR^p、C(O)OR^p、Fl、Cl、Br或I，其中，R^p在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式3：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其具有以下结构：

实施方式4：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，R¹、R²、R³和R⁴独立地选自OH、NH₂、OR^p或H；其中，R^p是C_1-10烷基。

实施方式5：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Z是C_1-10杂芳基或具有下式的基团：

实施方式6：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Q是O或无，优选无，M是O并且L是OR⁵或NR⁵R⁶，优选OH或NH₂。

实施方式7：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y⁵选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^e、-N(R^e)₂、-Q¹C(M)Q¹R^e、-Q¹C(M)N(R^e)₂、-Q¹SO₂Q¹R^e或-Q¹SO₂N(R^e)₂，其中，R^e选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式8：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y⁵选自-F、-Cl或Q¹R^e1，其中，Q¹是无或O，并且R^e1是C_1-4烷基或C_1-4卤代烷基。

实施方式9：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y⁵是CF₃、OCF₃、CH₂CF₃或OCH₂CF₃。

实施方式10：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y⁷选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^g、-N(R^g)₂、-Q¹C(M)Q¹R^g、-Q¹C(M)N(R^g)₂、-Q¹SO₂Q¹R^g或-Q¹SO₂N(R^g)₂，其中，R^g选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式11：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y⁷选自-F、-Cl或-Q¹R^g1，其中，Q¹是无或O，并且R^g1是C_1-4烷基或C_1-4卤代烷基。

实施方式12：如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y⁷是CF₃、OCF₃、CH₂CF₃或OCH₂CF₃。

实施方式13：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶中的一个或多个各自是氢。

实施方式14：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶中的四个是氢。

实施方式15：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶全都是氢。

实施方式16：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y¹选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^a、-N(R^a)₂、-Q¹C(M)Q¹R^a、-Q¹C(O)N(R^a)₂、-Q¹SO₂Q¹R^a或-Q¹SO₂N(R^a)₂，其中，R^a是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式17：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y²选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^b、-N(R^b)₂、-Q¹C(M)Q¹R^b、-Q¹C(O)N(R^b)₂、-Q¹SO₂Q¹R^b或-Q¹SO₂N(R^b)₂，其中，R^b是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式18：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y³选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^c、N(R^c)₂、-Q¹C(M)Q¹R^c、-Q¹C(M)N(R^c)₂、-Q¹SO₂Q¹R^c、或-Q¹SO₂N(R^c)₂，其中，R^c是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式19：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y⁴选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^d、-N(R^d)₂、-Q¹C(M)Q¹R^d、-Q¹C(M)N(R^d)₂、-Q¹SO₂Q¹R^d或-Q¹SO₂N(R^d)₂，其中，R^d是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式20：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其中，Y⁶选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^f、-N(R^f)₂、-Q¹C(M)Q¹R^f、-Q¹C(M)N(R^f)₂、-Q¹SO₂Q¹R^f或-Q¹SO₂N(R^f)₂，其中，R^f是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

实施方式21：如前述实施方式中任一项所述的化合物，其具有以下结构：

或其药学上可接受的盐。

实施方式22：一种治疗副粘病毒科病毒的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的任何前述权利要求的化合物。

实施方式23：如实施方式22所述的方法，其中，所述病毒是麻疹病毒或人类副流感病毒。

Claims (15)

1.一种用于抑制RNA聚合酶的化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物具有式(I)的结构：

其中：

X¹选自CR¹或N；

X²选自CR²或N；

X³选自CR³或N；

X⁴选自CR⁴或N；

Z选自：

-(CH₂)_nL、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基；

n是0-10；

L选自R⁵、OR⁵或NR⁵R⁶；

Y¹选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^a、-N(R^a)₂、-Q¹C(M)Q¹R^a、-Q¹C(O)N(R^a)₂、-Q¹SO₂Q¹R^a或-Q¹SO₂N(R^a)₂，

Y²选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^b、-N(R^b)₂、-Q¹C(M)Q¹R^b、-Q¹C(O)N(R^b)₂、-Q¹SO₂Q¹R^b或-Q¹SO₂N(R^b)₂，

Y³选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^c、N(R^c)₂、-Q¹C(M)Q¹R^c、-Q¹C(M)N(R^c)₂、-Q¹SO₂Q¹R^c或-Q¹SO₂N(R^c)₂，

Y⁴选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^d、-N(R^d)₂、-Q¹C(M)Q¹R^d、-Q¹C(M)N(R^d)₂、-Q¹SO₂Q¹R^d或-Q¹SO₂N(R^d)₂，

Y⁵选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^e、-N(R^e)₂、-Q¹C(M)Q¹R^e、-Q¹C(M)N(R^e)₂、-Q¹SO₂Q¹R^e或-Q¹SO₂N(R^e)₂，

Y⁶选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^f、-N(R^f)₂、-Q¹C(M)Q¹R^f、-Q¹C(M)N(R^f)₂、-Q¹SO₂Q¹R^f或-Q¹SO₂N(R^f)₂，

Y⁷选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^g、-N(R^g)₂、-Q¹C(M)Q¹R^g、-Q¹C(M)N(R^g)₂、-Q¹SO₂Q¹R^g或-Q¹SO₂N(R^g)₂，

M在每种情况下独立地选自O、NH、S、NOH或CH；

Q在每种情况下独立地选自无、O、NH或S；

Q¹在每种情况下独立地选自无、O、NH或S；

R¹、R²、R³和R⁴独立地选自R^p、OR^p、N(R^p)₂、CN、NO₂、COR^p、C(O)OR^p、Fl、Cl、Br或I，其中，R^p在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基；

R⁵、R⁶、R^a、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g在每种情况下独立地选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基，

其中，L、R¹、R²、R³、R⁴、R⁵、R⁶、Y¹、Y²、Y³、Y⁴、Y⁵、Y⁶、Y⁷、R^a、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g中的任意两个以上可以一起形成环。

2.如前述权利要求所述的化合物，其中，R¹、R²、R³和R⁴独立地选自OH、NH₂、OR^p或H；其中，R^p是C_1-10烷基。

3.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Z是C_1-10杂芳基或具有下式的基团：

4.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Q是O或无，优选无，M是O，并且L是OR⁵或NR⁵R⁶，优选OH或NH₂。

5.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y⁷选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^g、-N(R^g)₂、-Q¹C(M)Q¹R^g、-Q¹C(M)N(R^g)₂、-Q¹SO₂Q¹R^g或-Q¹SO₂N(R^g)₂，其中，R^g选自H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

6.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y⁷是CF₃、OCF₃、CH₂CF₃或OCH₂CF₃。

7.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶中的一个或多个各自是氢。

8.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶中的四个是氢。

9.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y¹、Y²、Y³、Y⁴和Y⁶全都是氢。

10.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y¹选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^a、-N(R^a)₂、-Q¹C(M)Q¹R^a、-Q¹C(O)N(R^a)₂、-Q¹SO₂Q¹R^a或-Q¹SO₂N(R^a)₂，其中，R^a是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

11.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y⁴选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^d、-N(R^d)₂、-Q¹C(M)Q¹R^d、-Q¹C(M)N(R^d)₂、-Q¹SO₂Q¹R^d或-Q¹SO₂N(R^d)₂，其中，R^d是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

12.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，Y⁶选自-F、-Cl、-Br、-I、-NO₂、-CN、-Q¹R^f、-N(R^f)₂、-Q¹C(M)Q¹R^f、-Q¹C(M)N(R^f)₂、-Q¹SO₂Q¹R^f或-Q¹SO₂N(R^f)₂，其中，R^f是H、C_1-10烷基、C_1-10卤代烷基、芳基、C_1-10杂环基或C_1-10杂芳基。

13.如前述权利要求中任一项所述的化合物，其具有以下结构：

或其药学上可接受的盐。

14.一种治疗副粘病毒科病毒的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的前述权利要求中任一项所述的化合物。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述病毒是麻疹病毒或人类副流感病毒。

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