CN115645352B - 一种皮肤舒缓修护组合物及其应用和修护面霜 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种皮肤舒缓修护组合物及其应用和修护面霜，涉及化妆品技术领域。该皮肤舒缓修护组合物的组分包括任意重量比的间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。本申请通过将间充质干细胞外泌体和余甘子提取物进行复配使用，可以起到协同增效以显著性增加细胞迁移距离和显著抑制炎性介质NO的作用，并且间充质干细胞外泌体和余甘子提取物复配组合物还具有修护皮肤屏障，降低皮肤的水分流失，减少泛红的作用，还能减轻外界刺激引起的皮肤刺激程度，起到较好的舒缓修护效果。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体而言，涉及一种皮肤舒缓修护组合物及其应用和修护面霜。
背景技术
外泌体是旁分泌的组成部分之一，是干细胞有效性的主要贡献者。它们是小的、单一的膜质、富含蛋白质、脂质、核酸和碳水化合物的分泌细胞器。它们也被认为能开展各种各样的活动，如重塑细胞外基质和向其他细胞传递信号和分子。外泌体避免了干细胞的许多缺点，因为它们稳定且容易储存。此外，它们不会被免疫系统排斥，有归巢作用，且剂量易于控制。间充质干细胞具有旁分泌功能，可合成分泌多种类型细胞因子和成分，包括生长因子(表皮生长因子、血管内皮生长因子、转化生长因子-β等)、炎性相关因子(干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素等)和微囊泡等亚细胞颗粒。
因此，可以考虑将间充质干细胞来源的外泌体用于皮肤修护、抗衰老等相关领域。
干性皮肤又称为干燥型皮肤，皮肤角质层含水量低，皮脂腺分泌较少，皮肤表现为缺少油脂、干燥。由于皮肤保湿性能较差，因此弹性差，易起皱纹，同时在风吹日晒或者秋冬季节，皮肤容易受到外界刺激，产生灼痛、红斑等不适的感觉。提供一种能够起到修复、舒缓效果的护肤活性物，能够针对性的解决干皮特有的皮肤问题。
专利CN115089543A公开了一种间充质干细胞来源提取物的舒缓液的制备方法，含有间充质干细胞外泌体和丝聚蛋白，能够在一定程度上改善皮肤炎症部位的泛红、瘙痒，改善皮肤微环境，达到再生复原的作用。但是该舒缓液复配的丝聚蛋白成本相对较高，对于需要日常使用的美容护肤产品来说，成本较高不利于推广使用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种皮肤舒缓修护组合物及其应用和修护面霜。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明提供一种皮肤舒缓修护组合物，其组分包括任意重量比的间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。
在可选的实施方式中，所述间充质干细胞外泌体和所述余甘子提取物的重量比为1:0.1-200。
在可选的实施方式中，所述间充质干细胞外泌体和所述余甘子提取物的重量比为1:0.1-9。
第二方面，本发明提供如前述实施方式任一项所述的皮肤舒缓修护组合物在制备人表皮细胞划痕修复促进剂中的应用。
第三方面，本发明提供如前述实施方式任一项所述的皮肤舒缓修护组合物在制备皮肤炎性介质NO释放抑制剂中的应用。
第四方面，本发明提供如前述实施方式任一项所述的皮肤舒缓修护组合物在制备皮肤舒缓修护产品中的应用。
在可选的实施方式中，所述皮肤舒缓修护产品包括化妆品或护肤品。
在可选的实施方式中，所述皮肤舒缓修护组合物的添加量为所述化妆品或所述护肤品总质量的0.1％-10％。
在可选的实施方式中，所述护肤品选自面霜、精华、爽肤水、洗面乳中的至少一种。
第五方面，本发明提供一种修护面霜，其添加有如前述实施方式任一项所述的皮肤舒缓修护组合物，还包括保湿剂、乳化剂、增稠剂、油脂、抗氧化剂、芳香剂、防腐剂、螯合剂、pH调节剂、皮肤调理剂中的一种或两种以上的组合，其中，所述皮肤舒缓修护组合物的添加量为所述护肤品总质量的0.1％-10％。
本发明具有以下有益效果：
本申请提供的皮肤舒缓修护组合物，其采用间充质干细胞外泌体和余甘子提取物进行复配使用，间充质干细胞外泌体能够显著性增加细胞迁移距离，而余甘子提取物则没有这一效果。但是间充质干细胞外泌体和余甘子提取物复配作为组合物添加时，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物起到协同增效的作用，同时，余甘子提取物对LPS诱发RAW264.7细胞产生炎症而释放的炎性介质NO具有显著的抑制作用，而间充质干细胞外泌体的抑制作用则没有显著性差别，但是间充质干细胞外泌体和余甘子提取物复配作为组合物添加时，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物起到协同增效的作用，并且间充质干细胞外泌体和余甘子提取物复配组合物还具有修护皮肤屏障，降低皮肤的水分流失，减少泛红的作用，还能减轻外界刺激引起的皮肤刺激程度，起到较好的舒缓修护效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请实验例一提供的不同实验例对人表皮细胞存活率影响的统计图；
图2为本申请实验例二提供的不同实验例对细胞迁移距离影响的统计图；
图3为本申请实验例三提供的不同实验例对炎性介质NO水平影响的统计图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
第一方面，本发明提供一种皮肤舒缓修护组合物，其组分包括任意重量比的间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。
本申请中，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的制备方法均可以采用常规方法进行制备，为了后续实验可直接使用，本申请列出了间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的具体制备过程。
皮肤舒缓修护组合物的制备方法如下：
S1、制备间充质干细胞外泌体。
(1)人脐带来源的间充质干细胞分离培养
将整条脐带浸泡于5％青霉素-链霉素的磷酸盐缓冲液(1x,PH7.2-7.4)中，清洗后，剪成3-4cm的小段，分离其中的华通胶，剪碎。加入0.1％I型胶原酶，在37℃，5％ CO2培养箱中孵育9-12h。将消化好的悬液混匀后，用磷酸盐缓冲液稀释，离心后收集沉淀，再用磷酸盐缓冲液重悬。加入间充质干细胞培养基(DMEM/F12+10ng/mlbFGF+10％胎牛血清+1％青霉素-链霉素)，滤网过滤后接种于培养皿，即得到人脐带来源的间充质干细胞。
(2)间充质干细胞外泌体的分离和制备
将间充质干细胞培养至细胞对数生长期时，去除培养基，用磷酸盐缓冲液漂洗两次后，加入DMEM/F12培养24h。24h后收集培养基，4℃，300g离心10min，去除细胞碎片后，29500g，4℃，离心20min。取上清用0.22μm滤器过滤。再以12000g，4℃，离心90min。去上清，管底即为间充质干细胞外泌体。用50μL磷酸盐缓冲液重悬，即得到间充质干细胞外泌体悬液。
S2、制备余甘子提取物。
将余甘子果洗净烘干，粉碎后，利用浓度为60-80％的乙醇进行提取，从而可以获得提取液；其中，余甘子果原料和乙醇的质量比为1:10-40；更优选为1:25，提取温度为30-50℃；提取的次数为2-4次；提取时间为2-8小时。
将获得的余甘子提取液过滤并存放于储存罐，让储存罐中的滤液缓慢流入外循环罐和沉降罐进行浓缩，获得液体成分和沉淀物，将液体成分进行喷雾干燥得到第一提取物，将沉淀物进行烘干后过80-100目筛得到第二提取物，混合第一提取物和第二提取物，并筛分获得粒径合适的余甘子提取物。制备获得的余甘子提取物为浅棕色粉末，以质量计，灰分含量在10％以下，水分含量在5％以下。
S3、混合。
将上述步骤S1制备获得的间充质干细胞外泌体和步骤S2制备获得的余甘子提取物按照一定的重量比进行混合即得。
优选地，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的重量比为1:0.1-200。更优选地，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的重量比为1:0.1-9。
应理解的是，本申请仅仅是对间充质干细胞外泌体和余甘子提取物进行了一种举例说明，并不排除其他可以制备间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的方法，因此本申请也可以采用其他方法制备间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。
此外，本申请还提供了上述皮肤舒缓修护组合物的多种应用，例如包括：皮肤舒缓修护组合物在制备人表皮细胞划痕修复促进剂中的应用、皮肤舒缓修护组合物在制备皮肤炎性介质NO释放抑制剂中的应用，以及皮肤舒缓修护组合物在制备皮肤舒缓修护产品中的应用，其中，皮肤舒缓修护产品包括化妆品或护肤品。皮肤舒缓修护组合物的添加量为化妆品或护肤品总质量的0.1％-10％。护肤品选自面霜、精华、爽肤水、洗面乳中的至少一种。
对应的，本申请还提供了一种具体的应用方案(修护面霜)，其添加有如前述实施方式任一项的皮肤舒缓修护组合物，还包括保湿剂、乳化剂、增稠剂、油脂、抗氧化剂、芳香剂、防腐剂、螯合剂、pH调节剂、皮肤调理剂中的一种或两种以上的组合，其中，皮肤舒缓修护组合物的添加量为护肤品总质量的0.1％-10％。
在一些实施方案中，以面霜的总质量计，保湿剂的加入量为0.01％-20％；增稠剂的加入量为0.2％-1.8％；乳化剂的加入量为0.01％-2％；油脂的加入量为1％-15％；抗氧化剂的加入量为0.01％-1％；芳香剂的加入量为0.005％-0.5％；防腐剂的加入量为0.01％-1.5％；螯合剂的加入量为0.01％-1％；pH调节剂加入量为0.01％-1％；皮肤调理剂加入量为0.01％-5％。
在一些实施方案中，保湿剂包括但不限于木糖醇、甜菜碱、甘油、吡络烷酮羧酸钠、双丙甘醇、甘油聚醚-26、透明质酸钠、泛醇、PEG/PPG-17/6共聚物、丁二醇、透明质酸钠、神经酰胺中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，增稠剂包括但不限于卡波姆、黄原胶、山嵛醇、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物和异十六烷和聚山梨醇酯-60的复合物、丙烯酰二甲基牛磺酸铵/VP共聚物、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物和异十六烷和聚山梨醇酯-60的复合物的一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，乳化剂包括但不限于PEG-20甲基葡糖倍半硬脂酸酯、鲸蜡硬脂醇或鲸蜡硬脂醇聚醚-20、山嵛醇聚醚-25、鲸蜡硬脂醇、鲸蜡硬脂醚-30、硬脂醇聚醚-21、硬脂醇聚醚-2、鲸蜡硬脂醇和椰油基葡糖苷、单月桂酸失水山梨醇酯中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，油脂包括但不限于角鲨烷、辛酸葵酸三甘油酯、碳酸二辛酯、牛油果树果脂、白油、凡士林、羊毛脂衍生物、硅油、高级脂肪酸脂、天然植物油脂、天然动物油脂、高级脂肪醇中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，抗氧化剂包括但不限于维生素E、VE醋酸酯、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚、番茄红素、抗坏血酸乙基醚中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，芳香剂选自香精。
在一些实施方案中，防腐剂包括但不限于苯氧乙醇、羟苯甲酯、羟苯丙酯、苯甲酸及其盐中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，螯合剂选自EDTA-2Na和EDTA-4Na。
在一些实施方案中，pH调节剂包括柠檬酸、酒石酸、磷酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、三乙醇胺中的一种或两种以上的组合。
在一些实施方案中，皮肤调理剂包括尿囊素、D-泛醇、水解胶原蛋白、燕麦肽、神经酰胺3、墨角藻提取物、小球藻发酵产物、绿藻提取物、褐藻提取物、北美金缕梅水、红没药醇、尿囊素、白果槲寄生叶提取物、白茅根提取物、丝氨酸、巨藻提取物、β-葡聚糖、仙人掌提取物中的一种或两种以上的组合。
本申请还提供了的修护面霜的制备方法，其包括将各组合混合的步骤。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种皮肤舒缓修护组合物，其包括质量比为1:9的间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。
实施例2
本实施例提供了一种皮肤舒缓修护组合物，其包括质量比为1:1的间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。
实施例3
本实施例提供了一种皮肤舒缓修护组合物，其包括质量比为9:1的间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。
实施例4
本实施例提供了一种皮肤舒缓修护组合物，其包括质量比为1:200的间充质干细胞外泌体和余甘子提取物。
对比例1
本对比例提供了一种皮肤舒缓修护剂，其仅包括间充质干细胞外泌体。
对比例2
本对比例提供了一种皮肤舒缓修护剂，其仅包括余甘子提取物.
对比例3
本对比例提供了一种皮肤舒缓修护组合物，其包括质量比为1：1的间充质干细胞外泌体和丝聚蛋白。
对比例4
本对比例提供了一种皮肤舒缓修护组合物，其包括质量比为1：1：1的间充质干细胞外泌体、玉郎伞提取物和贻贝粘蛋白。
应用实施例
根据下表1中的应用实施例1-4的修护面霜配方中各组分的含量(质量百分比)，并按照下述生产工艺步骤制备得到修护面霜。
生产工艺步骤如下：
1、将A相原料加入油相锅，搅拌并加热至82℃，完全溶解后82℃保温10min；
2、将B相原料加入水相锅，搅拌溶解完全，并加热至82℃，保温10min；
3、抽真空预热并烘干乳化锅，然后先抽入A相，开均质后再抽入B相，保持均质5分钟，开搅拌速度1200转/分，82℃保温搅拌30分钟；
4、降温70℃，低速均质条件下，缓慢加入溶解均匀的C相；搅拌均匀；
5、降温至45℃，加入D相搅拌均匀后，最后加入E相；
6、继续搅拌冷却至室温；
7、检验合格后出料，静置24小时；
8、检验合格后，分装、包装，再检验，成品入库。
注：工艺中的A、B、C、D、E相分别表示如下：
A相：鲸蜡硬脂醇和椰油基葡糖苷、硬脂醇聚醚-2、鲸蜡硬脂醇、角鲨烷、辛酸葵酸三甘油酯、碳酸二辛酯、牛油果树果脂、VE醋酸酯、羟苯甲酯、罗勒叶提取物、蓝桉叶油；
B相：水、尿囊素、丁二醇、甘油、氯化钠、EDTA-Na2、木糖醇、甜菜碱、透明质酸钠、D-泛醇、柠檬酸钠；
C相：丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物和异十六烷和聚山梨醇酯-60的复合物、水、甘油；
D相：香精、PEG-40氢化蓖麻油；
E相：水、苯氧乙醇、吡咯烷酮羧酸钠。
配方中，鲸蜡硬脂醇、角鲨烷、辛酸葵酸三甘油酯、碳酸二辛酯、牛油果树果脂是油脂；椰油基葡糖苷、硬脂醇聚醚-2是乳化剂；丁二醇、甘油、木糖醇、甜菜碱、透明质酸钠、吡咯烷酮羧酸钠是保湿剂；VE醋酸酯是抗氧化剂；EDTA-Na2是螯合剂；苯氧乙醇、羟苯甲酯是防腐剂；香精是芳香剂；PEG-40氢化蓖麻油为增溶剂。丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物和异十六烷和聚山梨醇酯-60的复合物是增稠剂，购自赛比克公司，牌号SimugelFL。尿囊素、D-泛醇是皮肤调理剂；氯化钠在此体系中可以提升乳化性能。
表1面霜组分及其用量
其中，应用实施例1-4按照添加量为10％进行添加。
应用实施例1中，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的质量比为1:9。
应用实施例2中，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的质量比为1:1。
应用实施例3中，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的质量比为9:1。
应用实施例4中，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的质量比为1:200。
应用对比例
其面霜配方与表1相同，区别仅在于：
应用对比例1中省略间充质干细胞外泌体和余甘子提取物；
应用对比例2中间充质干细胞外泌体的添加量为10％，余甘子提取物的添加量为0％；
应用对比例3中间充质干细胞外泌体的添加量为0％，余甘子提取物的添加量为10％。
应用对比例4中，余甘子提取物更换为丝聚蛋白，并且间充质干细胞外泌体和丝聚蛋白的质量比为1:1。
应用对比例5中，余甘子提取物更换为玉郎伞提取物和贻贝粘蛋白，并且间充质干细胞外泌体、玉郎伞提取物和贻贝粘蛋白的质量比为1:1:1。
实验例一：间充质干细胞外泌体和余甘子提取物对人表皮细胞存活率的影响
先单独对间充质干细胞外泌体和余甘子提取物进行细胞活性测试，获得用于细胞测试的安全范围。
实验步骤如下：
(1)用DMEM培养基配制间充质干细胞外泌体悬液，初始浓度为100μg/ml。用DMEM培养基配制余甘子提取物溶液，初始浓度为10mg/ml，并经0.22μm针头式过滤器过滤除菌。
(2)取对数生长期的HaCaT细胞，以4×104/孔接种在96孔板，将培养板放置于37℃的CO2培养箱中。
(3)根据实验设计，采用DMEM培养基稀释间充质干细胞外泌体悬液至100，20，4，0.8，0.16μg/mL，稀释余甘子提取物至10000，2000，400，80，16μg/mL。同时，设定只加入DMEM培养基的空白组。
(4)吸去原培养基后，以100μL/孔加入相应浓度的样品。
(5)给药24h后，每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃的CO2培养箱。
(6)孵育2h后，在450nm波长下，测定吸光度。
(7)细胞存活率(％)＝模型组或样品组OD/正常组OD×100
所得实验结果如图1和表2所示。
表2.不同实验例对人表皮细胞存活率的影响
根据图1和表2可以看出，间充质干细胞外泌体能够显著性提高HaCaT细胞的存活率，余甘子提取物对HaCaT细胞的存活率没有明显影响。
实验例二：间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的组合物提升人表皮细胞划痕修复水平
皮肤损伤修复的过程中，角质形成细胞的迁移率对修复速度及程度起到了一定的作用。通过检测受试物对HaCaT细胞划痕修复水平的影响，可以一定程度上指征受试物促进皮肤修复的水平。
实验步骤如下：
(1)取生长至对数期的HaCaT细胞，铺设于标记好的12细胞培养板中，生长至融合度约90-95％时，用1ml枪头在细胞上造成一道竖直划痕。
(2)用磷酸缓冲液清洗细胞3次，尽量去除死细胞后加入添加有添加物的培养基，添加内容物和浓度如实施例11-13所示。
(3)实验以实验以3％FBS+MEM/EBSS为阳性对照，MEM/EBSS为阴性对照。每组设置3个副孔。
(4)在显微镜下，分别拍摄记录0h和24h划痕情况。用显微镜拍照软件对划痕宽度进行测量，计算细胞迁移距离。
细胞迁移距离＝(24h划痕宽度-0h划痕宽度)/2
(5)使用SPSS软件，对数据进行分析。使用T test分析组间差异显著性。
其中，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的浓度分组，分别设置为：
实验例2.1，间充质干细胞外泌体的添加浓度为10μg/ml，余甘子提取物添加浓度为0μg/ml(即对比例1的皮肤舒缓修护剂稀释至上述浓度)。
实验例2.2，间充质干细胞外泌体的添加浓度为0μg/ml，余甘子提取物添加浓度为2000μg/ml(即对比例2的皮肤舒缓修护剂稀释至上述浓度)。
实验例2.3，间充质干细胞外泌体50μg/ml，丝聚蛋白50μg/ml(即对比例3的皮肤舒缓修护剂稀释至上述浓度)。
实验例2.4，间充质干细胞外泌体50μg/ml，玉郎伞提取物50μg/ml，贻贝粘蛋白50μg/ml(即对比例4的皮肤舒缓修护剂稀释至上述浓度)。
实验例2.5，间充质干细胞外泌体的添加浓度为10μg/ml，余甘子提取物添加浓度为90μg/ml(即实施例1的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例2.6，间充质干细胞外泌体的添加浓度为50μg/ml，余甘子提取物添加浓度为50μg/ml(即实施例2的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例2.7，间充质干细胞外泌体的添加浓度为90μg/ml，余甘子提取物添加浓度为10μg/ml(即实施例3的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例2.8，间充质干细胞外泌体的添加浓度为10μg/ml，余甘子提取物添加浓度为2000μg/ml(即实施例4的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
所得实验结果如图2和表3所示。
表3.不同实验例对细胞迁移距离的影响
由表2和图3可以看出，间充质干细胞外泌体能够显著性增加细胞迁移距离，而余甘子提取物则没有这一效果。但是间充质干细胞外泌体复配和余甘子提取物，作为组合物添加时，达到了1+1＞2的效果。即组合物促进细胞迁移的效果，显著性大于间充质干细胞外泌体单独添加(实验例2.1、实验例2.2与实验例2.8对比有显著性差异)。
间充质干细胞外泌体与余甘子提取物的组合搭配，促进细胞迁移的效果明显优于间充质干细胞外泌体与其它活性物的搭配，如丝聚蛋白(实验例2.3)、玉郎伞提取物和贻贝黏蛋白(实验例2.4)，实验例2.6的效果与实验例2.3和实验例2.4对比，具有明显差异性。
对比实验例2.5、2.6和2.7可知，间充质干细胞外泌体在促进细胞迁移的效果中具有明显作用，并且随着添加浓度的增加，效果得到明显提升。但是间充质干细胞的生产成本较高，复配价格相对低廉的余甘子提取物，也能够达到类似效果(实验例2.6与实验例2.7的结果无明显差异)。
实验例三：间充质干细胞外泌体组合物抑制炎性介质NO水平
实验步骤如下：
(1)小鼠巨噬细胞RAW264.7培养至生长对数期时，接种于96孔细胞培养板中。细胞密度控制在实验前达到50-60％为宜。
(2)接种24h后，去上清，除空白组以外，各组均加入终浓度为1.25μg/mL的LPS。随后加入各组受试物的混合溶液，具体浓度和受试物详见表3。实验以2mg/mL地塞米松磷酸钠为阳性对照，1.25μg/mL LPS为阴性对照，空白培养基为空白对照，同时设置加药组，其中，加药组中间充质干细胞外泌体和余甘子提取物的浓度分组，分别设置为：
实验例3.1，间充质干细胞外泌体的添加浓度为10μg/ml，余甘子提取物添加浓度为0μg/ml(即对比例1的皮肤舒缓修护剂稀释至上述浓度)。
实验例3.2，间充质干细胞外泌体的添加浓度为0μg/ml，余甘子提取物添加浓度为2000μg/ml(即对比例2的皮肤舒缓修护剂稀释至上述浓度)。
实验例3.3，间充质干细胞外泌体的添加浓度为50μg/ml，丝聚蛋白添加浓度为50μg/ml(即对比例3的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例3.4，间充质干细胞外泌体的添加浓度为50μg/ml，玉郎伞提取物添加浓度为50μg/ml，贻贝粘蛋白的添加浓度为50μg/ml(即对比例4的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例3.5，间充质干细胞外泌体的添加浓度为10μg/ml，余甘子提取物添加浓度为90μg/ml(即实施例1的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例3.6，间充质干细胞外泌体的添加浓度为50μg/ml，余甘子提取物添加浓度为50μg/ml(即实施例2的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例3.7，间充质干细胞外泌体的添加浓度为90μg/ml，余甘子提取物添加浓度为10μg/ml(即实施例3的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
实验例3.8，间充质干细胞外泌体的添加浓度为10μg/ml，余甘子提取物添加浓度为2000μg/ml(即实施例4的皮肤舒缓修护组合物稀释至上述浓度)。
(3)加样后在37℃，5％CO2条件下孵育24h。
(4)孵育培养结束后，每孔收集50μL细胞培养基上清，加入50μLGriess试剂(1mg/ml)，混匀后避光反应10min。
(5)用酶标仪在540nm处测试OD值。计算NO相对含量(％)和NO相对抑制率(％)，计算公式如下：
NO相对含量(％)＝OD样品/OD阴性对照x100％。
NO相对抑制率(％)＝(1-NO相对含量)x100％
(6)用SPSS软件对数据进行分析，并使用T test分析组间差异。
表4.不同实验例对炎性介质NO水平的影响
由表4和图3可以看出，余甘子提取物对LPS诱发RAW264.7细胞产生炎症而释放的炎性介质NO具有显著的抑制作用(实验例3.2)。而间充质干细胞外泌体的抑制作用则没有显著性差别(实验例3.1)。在余甘子提取物复配间充质干细胞外泌体后，其抑制炎性介质NO的效果达到了达到了1+1＞2的效果(实验例3.8)，起到了协同增效的作用。
余甘子提取物和间充质干细胞外泌体复配，能够显著性抑制LPS诱发RAW264.7细胞产生炎症释放的炎性介质NO，并且其抑制效果明显优于其它组合物，如间充质干细胞外泌体+丝聚蛋白(实验例3.3)，间充质干细胞外泌体+玉郎伞提取物+贻贝黏蛋白(实验例3.4)。
实验例五、舒缓修复功效测试
将本申请提供的应用实施例1-4和应用对比例1-5制备的面霜进行舒缓功效测试。
征集63名受试者，每组7名受试者，测试周期为28天。在产品使用前、使用后第14天，使用后第28天分别测试。通过测试得到的皮肤经皮失水率、皮肤泛红程度和乳酸刺痛反应程度来测试修护产品的舒缓程度。
其中，皮肤经皮失水率由Tewameter TM300测得，是反映皮肤水分丢失和屏障功能的重要参数，所测得数值越低，表示皮肤的屏障功能越好。
皮肤泛红程度用VISIA-CR进行面部图像采集，然后使用Image-Pro-Plus图像分析软件对Standard2光源下的图片进行皮肤a*值分析，该数值越小，表示皮肤泛红程度越轻。
乳酸测试实验指：使用10％乳酸溶液浸湿皮肤，对皮肤进行接触性刺激，在5分钟内由受试者评估测试部位瘙痒、刺痛、灼痛的不适程度。实验以生理盐水为对照。
实验结果如下：
表5皮肤经皮失水率的差异性分析
| 皮肤经皮失水率[g/m2h] | D0 | D14 | D28 |
| 应用实施例1 | 17.28±4.87 | 15.85±4.05 | 15.29±4.01 |
| 应用实施例2 | 17.76±3.71 | 14.52±4.17 | 14.62±4.12 |
| 应用实施例3 | 17.34±4.23 | 14.07±4.3 | 13.91±4.33 |
| 应用实施例4 | 17.66±3.67 | 15.74±3.64 | 14.79±3.7 |
| 应用对比例1 | 17.32±4.07 | 16.92±4.59 | 16.57±4.53 |
| 应用对比例2 | 17.05±3.44 | 15.61±4.18 | 15.86±3.83 |
| 应用对比例3 | 17.76±3.13 | 17.54±4.75 | 16.79±4.65 |
| 应用对比例4 | 17.32±3.55 | 16.33±3.59 | 15.47±3.98 |
| 应用对比例5 | 17.05±3.57 | 16.47±3.97 | 15.94±3.56 |
从表5中可以看出，添加了所述皮肤舒缓修复组合物分组中(应用实施例1-4)，其皮肤经皮失水率较未添加的组(应用对比例1)明显降低，也低于单独添加任一组分的组(应用对比例2-3)。添加了间充质干细胞外泌体的应用对比例4-5也具有一定减轻皮肤经皮失水率的效果，但是其效果也明显弱于应用实施例2。
表6皮肤a*值的差异性分析
| 皮肤a*值 | D0 | D14 | D28 |
| 应用实施例1 | 18.26±2.41 | 14.79±2.59 | 13.81±2.31 |
| 应用实施例2 | 17.58±2.61 | 15.53±2.2 | 13.16±2.76 |
| 应用实施例3 | 18.27±2.22 | 15.94±2.86 | 13.17±2.12 |
| 应用实施例4 | 17.91±2.99 | 15.72±2.75 | 13.17±2.9 |
| 应用对比例1 | 17.96±2.45 | 17.95±2.65 | 18.02±2.88 |
| 应用对比例2 | 17.82±2.62 | 16.11±2.25 | 15.93±2.59 |
| 应用对比例3 | 17.59±2.87 | 16.19±2.84 | 15.85±2.36 |
| 应用对比例4 | 17.97±2.87 | 17.39±2.62 | 16.51±2.51 |
| 应用对比例5 | 17.88±2.74 | 17.18±2.53 | 16.52±2.56 |
从表6中可以看出，添加了所述皮肤舒缓修复组合物分组中(应用实施例1-4)，其皮肤泛红程度较未添加的组(应用对比例1)明显降低，也低于单独添加任一组分的组(应用对比例2-3)。添加了间充质干细胞外泌体的应用对比例4-5也具有一定减轻皮肤泛红的效果，但是其效果也明显弱于应用实施例2。
表7乳酸刺痛评分的差异性分析
| 乳酸刺痛总评分(平均值) | D0 | D28 |
| 应用实施例1 | 4.86±1.05 | 3.23±0.97 |
| 应用实施例2 | 4.65±0.97 | 3.47±0.93 |
| 应用实施例3 | 4.41±0.95 | 3.4±0.92 |
| 应用实施例4 | 4.63±0.88 | 3.89±1.13 |
| 应用对比例1 | 4.99±0.95 | 4.87±0.87 |
| 应用对比例2 | 4.86±1.14 | 4.14±0.82 |
| 应用对比例3 | 4.62±0.86 | 4.08±1.04 |
| 应用对比例4 | 4.67±1.11 | 4.11±1.06 |
| 应用对比例5 | 4.89±0.92 | 4.49±1.02 |
从表7中可以看出，应用实施例1-4的乳酸刺痛评分在D28时相对于对比例1-5明显降低，即受试者皮肤的刺痛程度在使用了产品后的28天，相对于对比例明显降低。应用实施例起到了明显的舒缓修护效果。
这些结果表明，使用含有间充质干细胞外泌体和余甘子提取物组合物的修护面霜，能够显著性修护皮肤屏障，降低皮肤的水分流失，减少泛红，还能减轻外界刺激引起的皮肤刺激程度，起到较好的舒缓修护效果。
综上所述，本申请提供的皮肤舒缓修护组合物，其采用间充质干细胞外泌体和余甘子提取物进行复配使用，间充质干细胞外泌体能够显著性增加细胞迁移距离，而余甘子提取物则没有这一效果。但是间充质干细胞外泌体和余甘子提取物复配作为组合物添加时，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物起到协同增效的作用，同时，余甘子提取物对LPS诱发RAW264.7细胞产生炎症而释放的炎性介质NO具有显著的抑制作用，而间充质干细胞外泌体的抑制作用则没有显著性差别，但是间充质干细胞外泌体和余甘子提取物复配作为组合物添加时，间充质干细胞外泌体和余甘子提取物起到协同增效的作用，并且间充质干细胞外泌体和余甘子提取物复配组合物还具有修护皮肤屏障，降低皮肤的水分流失，减少泛红的作用，还能减轻外界刺激引起的皮肤刺激程度，起到较好的舒缓修护效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种皮肤舒缓修护组合物，其特征在于，其组分由间充质干细胞外泌体和余甘子提取物组成，所述间充质干细胞外泌体和所述余甘子提取物的重量比为1:0.1-200；
其中，所述余甘子提取物的制备方法如下：将余甘子果洗净烘干，粉碎后，利用浓度为60-80%的乙醇进行提取，从而可以获得提取液；其中，余甘子果原料和乙醇的质量比为1:10-40；提取温度为30-50℃；提取的次数为2-4次；提取时间为2-8小时。
2.根据权利要求1所述的皮肤舒缓修护组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体和所述余甘子提取物的重量比为1:0.1-9。
3.如权利要求1-2任一项所述的皮肤舒缓修护组合物在制备人表皮细胞划痕修复促进剂中的应用。
4.如权利要求1-2任一项所述的皮肤舒缓修护组合物在制备皮肤炎性介质NO释放抑制剂中的应用。
5.如权利要求1-2任一项所述的皮肤舒缓修护组合物在制备皮肤舒缓修护产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述皮肤舒缓修护产品包括护肤品。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述皮肤舒缓修护组合物的添加量为所述护肤品总质量的0.1%-10%。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述护肤品选自面霜、精华、爽肤水、洗面乳中的至少一种。
9.一种修护面霜，其特征在于，其添加有如权利要求1-2任一项所述的皮肤舒缓修护组合物，还包括保湿剂、乳化剂、增稠剂、油脂、抗氧化剂、芳香剂、防腐剂、螯合剂、pH调节剂、皮肤调理剂中的一种或两种以上的组合，其中，所述皮肤舒缓修护组合物的添加量为所述修护面霜总质量的0.1%-10%。
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