CN115644051A - 一种选育三系杂交水稻不育系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种选育三系杂交水稻不育系的方法，具体涉及一种采用保持系和恢复系材料选育保持系材料，再通过与不育系材料杂交，再回交的方式选育出新的三系杂交水稻不育系的方法；本发明的方法，结合全基因测序技术，进一步改进了选育的流程以及筛选的手段和条件，回交三代以上即可育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状优良且稳定遗传的三系水稻不育系；本发明的方法能够将育种年限进一步缩短1‑2年，提高育种的成功概率，大大提高研发效率；以及，本发明的方法利用保持系和恢复系材料来选育，能够扩大三系杂交水稻不育系的遗传背景，改善现有品种同质化严重问题，利于创制新型种质资源，获得突破性品种。

Description

一种选育三系杂交水稻不育系的方法

技术领域

本发明涉及一种选育三系杂交水稻不育系的方法，特别涉及使用恢复系材料选育三系杂交水稻不育系的方法，属于水稻育种技术领域。

背景技术

水稻是我国的主要粮食作物，随着我国社会经济快速发展和人民生活水平的不断提高，人们对水稻量的需求越来越大，对质的要求也越来越高。加上，目前投入生产的水稻品种呈现同质化严重的问题，若遇极端自然气候灾害，对水稻的高产和稳产性将带来毁灭性的打击。因此，需选配更多品质优、产量高、抗性好的水稻品种应用于生产。

三系杂交水稻是水稻育种和推广的一个巨大成就，所谓三系是:1)雄性不育系：雌蕊发育正常，而雄蕊的发育退化或败育，不能自花授粉结实。2)保持系：雌雄蕊发育正常，将其花粉授予雄性不育系的雌蕊，不仅可结成对种子，而且播种后仍可获得雄性不育植株。3)恢复系：其花粉授予不育系的雌蕊，所产生的种子播种后，长成的植株又恢复了可育性。

在三系杂交水稻组合选配中，选育优异的不育系是关键。

目前育种家选育三系不育系的方法普遍是利用保持系与保持系或常规稻杂交，创制三系保持系新材料；再在保持系新材料中选择优良单株，与现有不育系杂交并连续回交，最终选育出新的三系不育系。

该方法的缺点是现有保持系遗传背景单一，同质化严重，难以获得遗传距离远差异大的不育系。

现有技术中，本领域技术人员一般不会选择/尝试采用恢复系材料来扩大三系杂交水稻不育系的遗传背景；原因是，三系杂交水稻不育系属于核质互作雄性不育，恢复系材料中所携带的核恢复基因会促进不育系的育性恢复。目前水稻雄性不育系主要有三种类型：野败型(wa),红莲型(hl)和包台型(bt)。已有研究表明，作用于水稻野败型不育胞质的恢复基因有RF3和RF4两个主效基因，定位于1和10号染色体；作用于水稻红莲型不育胞质的恢复基因有RF5和RF6两个主效基因，定位于10号染色体；作用于水稻包台型不育胞质的恢复基因有Rf1a和Rf1b两个主效基因，定位于10号染色体。

从技术手段上来说，在筛选的过程中，如果恢复基因无法剔除干净，最终会导致获得的三系不育系败育不彻底。

在CN108157165B的专利文献(本申请的研发团队于2017年递交的专利申请)中，提及了一方面通过分子标记辅助选择，将不含恢复基因的保持系区分开，实现育性恢复基因的有效剔除；另一方面，基于水稻全基因组测序的基因分型技术进行遗传背景筛选，可以筛选获得遗传背景更接近目标亲本的不育系和对应的保持系。

然而，本申请的研发团队经过最近这些年的持续田间试验和研究发现，上述育种方法中采用分子标记辅助选择的方式，能够在很大程度上剔除育性恢复基因，但在实践中仍然存在败育不彻底的情况，采用该方法，仍需要4-5年才能精准选育出综合性状优良的三系水稻不育系，育种所需要的年限仍然较长。

本申请发明人在上述专利文献成果的基础之上进行了进一步研发，希望能够改进育种年限，进一步提高育种的成功概率，有效扩大三系不育系的遗传背景，解决现有品种同质化严重问题，利于创制新型种质资源，提高杂交稻产量，获得突破性品种。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种选育三系杂交水稻不育系的方法，其中，

该方法包括以下依次进行的步骤：

步骤1)：以待改良的水稻保持系为第一母本，以具有目标性状的水稻恢复系为第一父本，进行常规有性杂交后，获得第一杂交种F1代种子，并种植获得第一杂交F1代植株群体；

并且，对所述第一母本和所述第一父本进行全基因组测序，确定所述第一母本和所述第一父本中所包含的具有恢复性的恢复基因型，以及确定所述目标性状对应的功能基因的基因型；

步骤2)：将步骤1)获得的所述第一杂交F1代植株群体与所述第一母本回交一次，种植获得BC1F1代植株群体；

对所述BC1F1代植株群体中每一株植株进行全基因组测序，并通过基因型分析检测，筛选去除包含所述具有恢复性的恢复基因型的单株和不含所述目标性状对应的功能基因的基因型的单株；再从保留的植株中，以田间农艺性状优良为筛选指标，筛选出数株合适的BC1F1代单株；

步骤3)：将步骤2)筛选获得的数株合适的BC1F1代单株，分别进行自交收种，并种植获得它们各自的BC1F2代植株群体；对每一株所述BC1F2代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度80％以上的数株BC1F2代单株分别作为第二父本，以及将与所述第一母本对应的不育系植株作为第二母本，进行常规有性杂交后，收获第二杂交F1代种子，并种植获得第二杂交F1代植株群体；

步骤4)：对步骤3)获得的所述第二杂交种F1代植株群体进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的第二杂交种F1代植株分别作为目标F1代单株；

将所述目标F1代单株对应的父本，自交一次，种植获得对应的BC1F3代植株群体；对每一株所述BC1F3代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度90％以上且田间农艺性状优良的目标BC1F3代单株；

以所述目标F1代单株为母本，以对应的所述目标BC1F3代单株为父本，进行回交，并种植收获B1F1代植株群体；

步骤5)：按照步骤4)中的方式再回交二代以上，直至育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状稳定遗传的水稻不育系。

在本申请的一个优选实施方案中，所述第一母本和第一父本选择含有野败型恢复基因RF3和RF4的材料；并且，所述第一母本所含有的野败型恢复基因RF3和RF4为不具有恢复性的野生型；所述第一父本所含有的野败型恢复基因RF3和RF4为具有恢复性的突变型。

更优选的，所述第一母本为荃9311B，所述第一父本为YY70。可选的，所述第一母本和第一父本可以选择荃9311B与YR0822的组合，中9B与五山丝苗的组合，或者野香B与YY70的组合。

在本申请的另一个优选实施方案中，所述第一母本和第一父本选择含有红莲型恢复基因RF5和RF6的材料；并且，所述第一母本所含有的红莲型恢复基因RF5和RF6为不具有恢复性的野生型；所述第一父本所含有的红莲型恢复基因RF5和RF6为具有恢复性的突变型。

可选的，所述第一母本和第一父本可以选择粤泰B与YY70的组合、粤泰B与香66的组合，或者珞红5B与YR0822的组合。

在本申请的另一个优选实施方案中，所述第一母本和第一父本选择含有包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的材料；并且，所述第一母本所含有的包台型恢复基因Rf1a和Rf1b为不具有恢复性的野生型；所述第一父本所含有的包台型恢复基因Rf1a和Rf1b为具有恢复性的突变型。

可选的，所述第一母本和第一父本可以选择荃粳1B与卓恢20的组合、嘉禾212B与沪恢68的组合，或者荃粳1B与YR081的组合。

在本申请的另一个优选实施方案中，所述步骤2)中，所述田间农艺性状优良的筛选指标为同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、剑叶直挺且短小、穗长21cm以上、每穗粒数180粒以上和株型紧凑的条件。

在本申请的另一个优选实施方案中，所述步骤2)-4)中所述的全基因组测序均为低覆盖率的全基因组测序；优选的，所述低覆盖率的全基因组测序的测序深度为0.5X。

在本申请的另一个优选实施方案中，所述步骤1)中的全基因组测序的测序深度为30X。

本发明提供了一种选育三系杂交水稻不育系的方法，具体涉及一种采用保持系和恢复系材料选育保持系材料，再通过与不育系材料杂交，再回交的方式选育出新的三系杂交水稻不育系的方法；本发明的方法，结合全基因测序技术，进一步改进了选育的流程以及筛选的手段和条件，回交三代以上即可育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状优良且稳定遗传的三系水稻不育系；能够将育种年限进一步缩短1-2年，提高育种的成功概率，大大提高研发效率；以及，本发明的方法利用保持系和恢复系材料来选育，能够扩大三系杂交水稻不育系的遗传背景，改善现有品种同质化严重问题，利于创制新型种质资源，获得突破性品种。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于这些具体实施方式。

关于术语的解释说明如下：

术语“测序深度”，对应的英文术语：Sequencing Depth，是指测序得到的碱基总量(bp)与基因组大小(Genome)的比值，它是评价测序量的指标之一。

术语“低覆盖率的全基因组测序”，也称“低深度全基因组测序”。基因组测序深度是指测序得到的总碱基数与待测基因组大小的比值。

术语“背景纯合度”，在个体中指纯合基因座的比例。

本申请的一个具体实施方案提供了一种选育三系杂交水稻不育系的方法，其中，

该方法包括以下依次进行的步骤：

步骤1)：以待改良的水稻保持系为第一母本，以具有目标性状的水稻恢复系为第一父本，进行常规有性杂交后，获得第一杂交种F1代种子，并种植获得第一杂交F1代植株群体；

并且，对所述第一母本和所述第一父本进行全基因组测序，确定所述第一母本和所述第一父本中所包含的具有恢复性的恢复基因型，以及确定所述目标性状对应的功能基因的基因型；

步骤2)：将步骤1)获得的所述第一杂交F1代植株群体与所述第一母本回交一次，种植获得BC1F1代植株群体；

对所述BC1F1代植株群体中每一株植株进行全基因组测序，并通过基因型分析检测，筛选去除包含所述具有恢复性的恢复基因型的单株和不含所述目标性状对应的功能基因的基因型的单株；再从保留的植株中，以田间农艺性状优良为筛选指标，筛选出数株合适的BC1F1单株；

步骤3)：将步骤2)筛选获得的数株合适的BC1F1单株，分别进行自交收种，并种植获得它们各自的BC1F2代植株群体；对每一株所述BC1F2代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度80％以上的数株BC1F2代单株分别作为第二父本，以及将与所述第一母本对应的不育系植株作为第二母本，进行常规有性杂交后，收获第二杂交F1代种子，并种植获得第二杂交F1代植株群体；

步骤4)：对步骤3)获得的所述第二杂交种F1代植株群体进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的第二杂交种F1代植株分别作为目标F1代单株；

将所述目标F1代单株对应的父本，自交一次，种植获得对应的BC1F3代植株群体；对每一株所述BC1F3代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度90％以上且田间农艺性状优良的目标BC1F3代单株；

以所述目标F1代单株为母本，以对应的所述目标BC1F3代单株为父本，进行回交，并种植收获B1F1代植株群体；

步骤5)：按照步骤4)中的方式再回交二代以上，直至育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状稳定遗传的水稻不育系。

如本申请背景技术中所阐述的，本申请的研发团队希望在之前的研发成果(CN108157165B，利用分子标记辅助选择的方式剔除育性恢复基因，选育三系水稻不育系)基础之上进一步改进，进一步缩短育种年限，提高育种的成功概率，以及有效扩大三系不育系的遗传背景，解决现有品种同质化严重问题，利于创制新型种质资源，提高杂交稻产量，获得突破性品种。

对于这个研发方向，发明人团队做了5年的育种实践的尝试，并且在这个过程中发现：现有方法对BC1F3群体进行分子标记筛选，选择不含所述育性恢复基因的单株套袋自交，在后续的育种实践中仍然存在败育不彻底的情况。因此，发明人希望进一步提高育性恢复基因的剔除率；发明人尝试选择采用全基因组测序的方法来剔除育性恢复基因。

在这5年的育种实践中，发明人团队基于原有的整体选育思路(采用保持系和恢复系材料选育保持系材料，再通过与不育系材料杂交，再回交的方式选育出新的三系杂交水稻不育系的方法)，结合全基因测序技术，进一步改进了选育的流程以及筛选的手段和条件。具体来说，发明人团队做了大量的田间种植和数据采集工作，以及大量的基因组测序工作和数据统计和分析，经过多种替代方案的尝试，发现：一方面，在步骤2)中，提前对BC1F1代群体进行全基因组测序，筛选去除包含具有恢复性的恢复基因型的单株和不含所述目标性状对应的功能基因的基因型的单株，再从保留的植株中，以田间农艺性状优良为筛选指标，筛选出数株合适的BC1F1单株；另一方面，将“遗传背景更接近目标亲本”的筛选方式改变为“背景纯合度”的筛选方式；具体来说，首先，“背景纯合度”的筛选并不在步骤2)的BC1F1代筛选中进行，而是在步骤3)中，对合适的BC1F1单株自交后的BC1F2植株群体中进行进一步选择；选择背景纯合度80％以上的BC1F2代单株作为第二父本，与第一母本对应的不育系植株作为第二母本进行杂交；其次，在步骤4)以及之后的每一次回交中，选择背景纯合度90％以上的BC1F_(2+N)代单株(其中N表示第N次回交)作为父本；——通过这样的方式，回交三代以上即可育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状优良且稳定遗传的三系水稻不育系；相比于之前的研发成果(CN108157165B)能够将育种年限进一步缩短1-2年，提高育种的成功概率，大大提高研发效率。并且，本发明的方法利用保持系和恢复系材料来选育，能够扩大三系杂交水稻不育系的遗传背景，改善现有品种同质化严重问题，利于创制新型种质资源，获得突破性品种。

实施例1的三系杂交水稻不育系选育过程

本申请的三系杂交水稻不育系的大体思路是：采用保持系(待改良的保持系)和恢复系(具有目标性状的恢复系)选育保持系材料，再通过与不育系材料杂交，再回交的方式选育出新的三系杂交水稻不育系。

具体在在本实施例中，利用现有市场上广泛应用的野败型三系不育系荃9311A的保持系荃9311B(待改良的水稻保持系)与恢复系材料YY70(具有目标性状的水稻恢复系)杂交，选育出具有目标性状的野败型新不育系。

在本申请的一个具体实施方案中，目标性状选自优质、高产、抗虫、抗稻瘟病、抗白叶枯、氮高效中的一种或多种优良性状。

具体在本实施例中，恢复系材料YY70所具有的目标性状为抗稻瘟病。

实施例1的选育过程包括以下步骤：

步骤1)：以野败型三系不育系荃9311A的保持系荃9311B(待改良的保持系)为第一母本，以恢复系材料YY70(具有抗稻瘟病性状的恢复系)为第一父本，进行常规有性杂交后，获得第一杂交种F1代种子，并种植获得第一杂交F1代植株群体。

同时，对保持系荃9311B(第一母本)和恢复系材料YY70(第一父本)进行全基因组测序，测序深度为30X。经检测，保持系荃9311B(第一母本)的中野败型恢复基因RF3和RF4为野生型，不具有恢复性；而恢复系材料YY70(第一父本)中的RF3、RF4为突变型，具有恢复性。

因此，确定了第一母本和第一父本中所包含的具有恢复性的恢复基因型为YY70的RF3、RF4突变基因型；因此，需要在后续的选育后代过程中剔除来源于YY70的RF3、RF4的突变基因型，保留来源于荃9311B的RF3、RF4野生基因型。

同时，上述的全基因组测序确定了恢复系材料YY70所具有的目标性状抗稻瘟病对应的功能基因(pi2)的基因型为突变型。

步骤2)：将步骤1)获得的所述第一杂交F1代植株群体(剔除假杂株)，与保持系荃9311B(第一母本)回交一次，收获BC1F1代种子，种植获得BC1F1代植株群体；

对BC1F1代植株群体中每一株植株进行全基因组测序，并通过基因型分析检测，筛选去除包含所述具有恢复性的恢复基因型的单株和不含所述目标性状对应的功能基因的基因型的单株；再从保留的植株中，以田间农艺性状优良为筛选指标，筛选出数株合适的BC1F1代单株；

具体在本实施例中，收获BC1F1代种子792粒，在海南种植获得BC1F1代群体700株；并于苗期取每一株BC1F1代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X。

具体在本实施例中，对于全基因组测序结果，通过基因型分析检测，筛选去除含有“来源于YY70的RF3、RF4突变基因型(具有恢复性的恢复基因型)”的植株，保留包含有“来源于荃9311B的RF3、RF4野生基因型”的植株；筛选去除不含“稻瘟病抗性基因pi2的基因型(目标性状对应的功能基因的基因型)”植株，即保留含有“稻瘟病抗性基因pi2的基因型”的植株。具体在本实施例中，筛选出了140株BC1F1代单株，然后再根据田间农艺性状(同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、剑叶直挺且短小、穗长21cm以上、每穗粒数180粒以上和株型紧凑的条件)，筛选出25株合适的BC1F1代单株。

步骤3)：将步骤2)筛选获得的数株合适的BC1F1代单株，分别进行自交收种，并种植获得它们各自的BC1F2代植株群体；对每一株所述BC1F2代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度80％以上的数株BC1F2代单株分别作为第二父本，以及将与所述第一母本对应的不育系植株作为第二母本，进行常规有性杂交后，收获第二杂交F1代种子，并种植获得第二杂交F1代植株群体。

具体在本实施例中，将上述筛选出的25株合适的BC1F1代单株，分别进行自交收种，并种植获得它们各自的BC1F2代植株群体；并于苗期取每一株BC1F2代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X；通过基因型分析检测，选择背景纯合度80％以上的数株BC1F2代单株。

关于“背景纯合度”，是指在个体中指纯合基因座的比例；具体在本实施例中，所选择的BC1F2代单株中，纯合基因座可能来自于第一母本荃9311B，也可能来自于第一父本YY70。

现有技术基础方案(CN108157165B)中，通过全基因组测序筛选含有双亲优良基因且遗传背景更接近父本1的优良植株；筛选的标准较为复杂、模糊。然而，在本案中，无需考虑纯合基因座来自于父本还是母本，只需要判断纯合基因座占全基因组的比例为80％以上即可，标准清晰，筛选的工作效率更高。

具体在本实施例中，筛选了47株背景纯合度80％以上的BC1F2代单株，将它们分别作为第二父本，将与第一母本(保持系荃9311B)对应的不育系(荃9311A)植株作为第二母本，进行常规有性杂交后，收获第二杂交F1代种子，并种植获得第二杂交F1代植株群体。具体来说，每一株作为第二父本的BC1F2代单株(47株单株)，都对应获得了一个第二杂交F1代植株群体；即获得了47个组合，每个组合包含一株筛选的BC1F2代单株，以及与其对应的第二杂交F1代植株群体。

步骤4)：对步骤3)获得的所述第二杂交种F1代植株群体进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的第二杂交种F1代植株分别作为目标F1代单株；

将所述目标F1代单株对应的父本，自交一次，种植获得对应的BC1F3代植株群体；对每一株所述BC1F3代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度90％以上且田间农艺性状优良的目标BC1F3代单株；

以所述目标F1代单株为母本，以对应的所述目标BC1F3代单株为父本，进行回交，并种植收获B1F1代植株群体。

具体在本实施例中，将47个组合中的第二杂交种F1代植株群体分别进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的第二杂交种F1代植株分别作为目标F1代单株；

再找到每一株目标F1代单株对应的父本(即每一个目标F1代单株所在的组合中的BC1F2代单株)；将该BC1F2代单株自交一次，种植获得其对应的BC1F3代植株群体；并于苗期取每一株BC1F3代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X；通过基因型分析检测，选择背景纯合度90％以上的BC1F3代单株，再通过田间农艺性状(同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、分蘖数10个以上、株型紧凑、叶片直挺的条件)，筛选出31株目标BC1F3代单株。

再通过这31株目标的BC1F3代单株，找到其对应的BC1F2代单株，再找到对应组合中的目标F1代单株；以这些目标F1代单株为母本，以对应的目标BC1F3代单株为父本，进行第一次回交，种植收获31个B1F1代植株群体。

步骤5)：按照步骤4)中的方式再回交二代以上，直至育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状稳定遗传的水稻不育系。

具体在本实施例中，对上述获得的31个B1F1代植株群体分别进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的B1F1代植株分别作为目标B1F1代单株；

再找到每一株目标B1F1代单株对应的父本(即对应的BC1F3代单株)；将该BC1F3代单株自交一次，种植获得其对应的BC1F4代植株群体；并于苗期取每一株BC1F4代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X；通过基因型分析检测，选择背景纯合度90％以上的BC1F4代单株，再通过田间农艺性状(同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、分蘖数10个以上、株型紧凑、叶片直挺的条件)，筛选出8株目标BC1F4代单株。

再通过这8株目标BC1F4代单株，找到其对应的BC1F3代单株，再找到对应的目标B1F1代单株；以这些目标B1F1代单株为母本，以对应的目标BC1F4代单株为父本，进行第二次回交，种植收获8个B2F1代植株群体。

再按照上述方式，以目标B2F1代单株为母本，以对应的目标BC1F5代单株为父本，进行第三次回交，种植收获B3F1代植株群体。

具体在本实施例中，种植收获的B3F1代植株群体，达到了败育彻底，具有抗稻瘟病目标性状(并且经全基因测序，确定含有抗稻瘟病目标性状对应的功能基因的基因型pi2)，并且田间农艺性状一致且稳定，成为B3F1代株系；具体来说，B3F1代植株群体(B3F1代株系)中，每一株植株的镜检花粉败育率100％，都同时具有抗稻瘟病目标性状，以及“株高100cm以下，茎秆粗壮、分蘖数10个以上、株型紧凑、叶片直挺”的田间农艺性状，并且株系群体之间达到一致，能够稳定遗传。

具体在本实施例中，对于获得的B3F1代株系，将其对应父本(对应的目标BC1F5代单株)自交一次，种植获得其对应的BC1F6代植株群体。具体在本实施例中，该BC1F6代植株群体也具有抗稻瘟病目标性状(并且经全基因测序，确定含有抗稻瘟病目标性状对应的功能基因的基因型pi2)，并且田间农艺性状一致且稳定。

本申请的发明人将获得的B3F1代株系命名为荃卓1A(三系水稻不育系)，对应的BC1F6代株系命名为荃卓1B(对应的保持系)。

实施例2

步骤1)：以红莲型三系不育系粤泰A的保持系粤泰B(待改良的水稻保持系)为第一母本，以恢复系材料香恢1号(具有特殊香味性状的水稻恢复系)为第一父本，进行常规有性杂交后，获得第一杂交种F1代种子，并种植获得第一杂交F1代植株群体。

同时，对保持系粤泰B(第一母本)和恢复系材料香恢1号(第一父本)进行全基因组测序，测序深度为30X。经检测，保持系荃粤泰B(第一母本)的中红莲型恢复基因RF5和RF6为野生型，不具有恢复性；而恢复系材料香恢1号(第一父本)中的RF5、RF6为突变型，具有恢复性。

因此，确定了第一母本和第一父本中所包含的具有恢复性的恢复基因型为香恢1号中的RF5、RF6突变基因型；因此，需要在后续的选育后代过程中剔除香恢1号中的RF5、RF6的突变基因型，保留粤泰B中的RF5、RF6野生基因型。

同时，上述的全基因组测序确定了恢复系材料香恢1号所具有的特殊香味性状对应的功能基因(fgr)的基因型为突变型。

步骤2)：将步骤1)获得的所述第一杂交F1代植株群体(剔除假杂株)，与保持系粤泰B(第一母本)回交一次，收获BC1F1代种子1064粒，在海南种植获得BC1F1代群体986株；并于苗期取每一株BC1F1代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X。

通过基因型分析检测，筛选去除含有“来源于香恢1号的RF5、RF6突变基因型(具有恢复性的恢复基因型)”的植株，保留包含有“来源于粤泰B的RF5、RF6野生基因型”的植株；筛选去除不含“香恢1号中的香味基因fgr的基因型(目标性状对应的功能基因的基因型)”植株，即保留含有“香恢1号中的香味基因fgr的基因型”的植株。具体在本实施例中，筛选出了215株BC1F1代单株，然后再根据田间农艺性状(同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、剑叶直挺且短小、穗长21cm以上、每穗粒数180粒以上和株型紧凑的条件)，筛选出43株合适的BC1F1代单株。

步骤3)：将上述筛选出的43株合适的BC1F1代单株，分别进行自交收种，并种植获得它们各自的BC1F2代植株群体；并于苗期取每一株BC1F2代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X；

通过基因型分析检测，筛选了67株背景纯合度80％以上的BC1F2代单株，将它们分别作为第二父本，将与第一母本(保持系粤泰B)对应的不育系(粤泰A)植株作为第二母本，进行常规有性杂交后，收获第二杂交F1代种子，并种植获得第二杂交F1代植株群体。具体来说，每一株作为第二父本的BC1F2代单株(67株单株)，都对应获得了一个第二杂交F1代植株群体；即获得了67个组合，每个组合包含一株筛选的BC1F2代单株，以及与其对应的第二杂交F1代植株群体。

步骤4)：将67个组合中的第二杂交种F1代植株群体分别进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的第二杂交种F1代植株分别作为目标F1代单株；

再找到每一株目标F1代单株对应的父本(即每一个目标F1代单株所在的组合中的BC1F2代单株)；将该BC1F2代单株自交一次，种植获得其对应的BC1F3代植株群体；并于苗期取每一株BC1F3代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X；通过基因型分析检测，选择背景纯合度90％以上的BC1F3代单株，再通过田间农艺性状(同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、分蘖数10个以上、株型紧凑、叶片直挺的条件)，筛选出25株目标BC1F3代单株。

再通过这25株目标的BC1F3代单株，找到其对应的BC1F2代单株，再找到对应组合中的目标F1代单株；以这些目标F1代单株为母本，以对应的目标BC1F3代单株为父本，进行第一次回交，种植收获25个B1F1代植株群体。

步骤5)：按照步骤4)中的方式再回交二代以上，直至育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状稳定遗传的水稻不育系。

具体在本实施例中，对上述获得的25个B1F1代植株群体分别进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的B1F1代植株分别作为目标B1F1代单株；

再找到每一株目标B1F1代单株对应的父本(即对应的BC1F3代单株)；将该BC1F3代单株自交一次，种植获得其对应的BC1F4代植株群体；并于苗期取每一株BC1F4代植株的叶片进行低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X；通过基因型分析检测，选择背景纯合度90％以上的BC1F4代单株，再通过田间农艺性状(同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、分蘖数10个以上、株型紧凑、叶片直挺的条件)，筛选出7株目标BC1F4代单株。

再通过这7株目标BC1F4代单株，找到其对应的BC1F3代单株，再找到对应的目标B1F1代单株；以这些目标B1F1代单株为母本，以对应的目标BC1F4代单株为父本，进行第二次回交，种植收获7个B2F1代植株群体。

再按照上述方式，以目标B2F1代单株为母本，以对应的目标BC1F5代单株为父本，进行第三次回交，种植收获B3F1代植株群体。

具体在本实施例中，种植收获的B3F1代植株群体，达到了败育彻底，具有特殊香味的目标性状(并且经全基因测序，确定含有香味目标性状对应的功能基因的基因型fgr)，并且田间农艺性状一致且稳定，成为B3F1代株系；具体来说，B3F1代植株群体(B3F1代株系)中，每一株植株的镜检花粉败育率100％，都同时具有特殊香味的目标性状，以及“株高100cm以下，茎秆粗壮、分蘖数10个以上、株型紧凑、叶片直挺”的田间农艺性状，并且株系群体之间达到一致，能够稳定遗传。

具体在本实施例中，对于获得的B3F1代株系，将其对应父本(对应的目标BC1F5代单株)自交一次，种植获得其对应的BC1F6代植株群体。具体在本实施例中，该BC1F6代植株群体也具有特殊香味的目标性状(并且经全基因测序，确定含有香味目标性状对应的功能基因的基因型fgr)，并且田间农艺性状一致且稳定。

上述本申请实施例1选用的第一母本为荃9311B，第一父本为YY70，均为含有野败型恢复基因RF3和RF4的材料。本领域技术人员可以在上述实施例1的方案基础之上替换成其他含有野败型恢复基因RF3和RF4的保持系和恢复系材料来选育三系水稻不育系；第一母本所含有的野败型恢复基因RF3和RF4为不具有恢复性的野生型；第一父本所含有的野败型恢复基因RF3和RF4为具有恢复性的突变型。

本领域技术人员可以根据待改良的水稻保持系(第一母本)，选择合适的具有目标性状的恢复系材料(第一父本)。

例如，本领域技术人员可以选择荃9311B与YR0822的组合，中9B与五山丝苗的组合，或者野香B与YY70的组合作为第一母本与第一父本，选育三系水稻不育系。

关于具体的田间农艺性状筛选标准上，本领域技术人员也可以根据第一母本和父本材料的具体情况，以及具体的种植情况，结合本领域的相关基础理论知识进行些微调整。

此外，本领域技术人员可以在上述实施例1的方案基础之上，将第一母本和第一父本替换成含有红莲型恢复基因RF5和RF6的保持系和恢复系材料来选育三系水稻不育系；第一母本所含有的红莲型恢复基因RF5和RF6为不具有恢复性的野生型；第一父本所含有的红莲型恢复基因RF5和RF6为具有恢复性的突变型。

例如，本领域技术人员可以选择粤泰B与YY70的组合、粤泰B与香66的组合，或者珞红5B与YR0822的组合作为第一母本与第一父本，选育三系水稻不育系。

此外，本领域技术人员可以在上述实施例1的方案基础之上，将第一母本和第一父本替换成含有包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的保持系和恢复系材料来选育三系水稻不育系；第一母本所含有的包台型恢复基因Rf1a和Rf1b为不具有恢复性的野生型；第一父本所含有的包台型恢复基因Rf1a和Rf1b为具有恢复性的突变型。

例如，本领域技术人员可以选择荃粳1B与卓恢20的组合、嘉禾212B与沪恢68的组合，或者荃粳1B与YR081的组合作为第一母本与第一父本，选育三系水稻不育系。

应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：

该方法包括以下依次进行的步骤：

步骤1)：以待改良的水稻保持系为第一母本，以具有目标性状的水稻恢复系为第一父本，进行常规有性杂交后，获得第一杂交种F1代种子，并种植获得第一杂交F1代植株群体；

并且，对所述第一母本和所述第一父本进行全基因组测序，确定所述第一母本和所述第一父本中所包含的具有恢复性的恢复基因型，以及确定所述目标性状对应的功能基因的基因型；

步骤2)：将步骤1)获得的所述第一杂交F1代植株群体与所述第一母本回交一次，种植获得BC1F1代植株群体；

对所述BC1F1代植株群体中每一株植株进行全基因组测序，并通过基因型分析检测，筛选去除包含所述具有恢复性的恢复基因型的单株和不含所述目标性状对应的功能基因的基因型的单株；再从保留的植株中，以田间农艺性状优良为筛选指标，筛选出数株合适的BC1F1代单株；

步骤3)：将步骤2)筛选获得的数株合适的BC1F1代单株，分别进行自交收种，并种植获得它们各自的BC1F2代植株群体；对每一株所述BC1F2代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度80％以上的数株BC1F2代单株分别作为第二父本，以及将与所述第一母本对应的不育系植株作为第二母本，进行常规有性杂交后，收获第二杂交F1代种子，并种植获得第二杂交F1代植株群体；

步骤4)：对步骤3)获得的所述第二杂交种F1代植株群体进行筛选，将镜检花粉败育率达99％以上、柱头外露率达80％以上且株高95cm以下的第二杂交种F1代植株分别作为目标F1代单株；

将所述目标F1代单株对应的父本，自交一次，种植获得对应的BC1F3代植株群体；对每一株所述BC1F3代植株进行全基因组测序，选择背景纯合度90％以上且田间农艺性状优良的目标BC1F3代单株；

以所述目标F1代单株为母本，以对应的所述目标BC1F3代单株为父本，进行回交，并种植收获B1F1代植株群体；

步骤5)：按照步骤4)中的方式再回交二代以上，直至育成镜检花粉败育率100％且田间农艺性状稳定遗传的水稻不育系。

2.如权利要求1所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：所述第一母本和第一父本选择含有野败型恢复基因RF3和RF4的材料；并且，所述第一母本所含有的野败型恢复基因RF3和RF4为不具有恢复性的野生型；所述第一父本所含有的野败型恢复基因RF3和RF4为具有恢复性的突变型。

3.如权利要求2所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：所述第一母本为荃9311B，所述第一父本为YY70。

4.如权利要求3所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：在所述步骤5)中，按照所述步骤4)回交的次数为2次。

5.如权利要求1所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：所述第一母本和第一父本选择含有红莲型恢复基因RF5和RF6的材料；并且，所述第一母本所含有的红莲型恢复基因RF5和RF6为不具有恢复性的野生型；所述第一父本所含有的红莲型恢复基因RF5和RF6为具有恢复性的突变型。

6.如权利要求1所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：所述第一母本和第一父本选择含有包台型恢复基因Rf1a和Rf1b的材料；并且，所述第一母本所含有的包台型恢复基因Rf1a和Rf1b为不具有恢复性的野生型；所述第一父本所含有的包台型恢复基因Rf1a和Rf1b为具有恢复性的突变型。

7.如权利要求1至6中任意一项所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述田间农艺性状优良的筛选指标为同时满足株高100cm以下，茎秆粗壮、剑叶直挺且短小、穗长21cm以上、每穗粒数180粒以上和株型紧凑的条件。

8.如权利要求1至6中任意一项所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：所述步骤2)-4)中的全基因组测序均为低覆盖率的全基因组测序，测序深度为0.5X。

9.如权利要求1至6中任意一项所述的选育三系杂交水稻不育系的方法，其特征在于：所述步骤1)中的全基因组测序的测序深度为30X。