CN115639357B - 一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒及其应用，所述试剂盒包含用于检测待测样本中生物标志物的表达水平的试剂，所述生物标志物为腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2‑氨基己二酸、S‑甲基‑5‑硫腺苷中的任意一种或者任意两种以上的组合。与正常对照组相比，腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2‑氨基己二酸在神经认知恢复延迟患者组中的表达含量上升，S‑甲基‑5‑硫腺苷的表达含量下降，针对所述四种生物标志物可以用于制备术前诊断神经认知恢复延迟的产品，该产品用于术前预测术后发生神经认知恢复延迟的风险，从而有针对性的进行早期干预或术后早期治疗，以促进术后恢复。

Description

一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒及其应用。

背景技术

神经认知恢复延迟(delayed neurocognitive recovery,dNCR)包含术后认知功能障碍，是指麻醉手术后患者出现的记忆力、抽象思维、定向力障碍，同时伴有社会活动能力的减退，即术后人格、社交能力及认知能力和技巧的变化。

目前，尚无对神经认知恢复延迟进行预测的方法，现有的技术主要是通过认知功能量表对神经认知恢复延迟进行诊断，包括MMSE

(Mini-mmentalstate examination)评估量表、MoCA(Montreal CognitiveAssessment)评估量表等，分别在术前和术后1天、3天、7天进行量表的评估，均是通过术后才能诊断是否发生神经认知恢复延迟，没有术前预测的技术。在利用认知功能量表评估时，患者已经发生认知障碍，故无法在发生前进行干预治疗，从而防止或者减轻其症状，加快患者的术后康复，减少住院时间和住院费用。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中缺乏术前诊断神经认知恢复延迟的产品和方法，只能通过术后才能诊断神经认知恢复延迟，无法进行术前预测。

为了达到上述目的，本发明提供了一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒，所述试剂盒包含：用于检测待测样本中生物标志物的表达水平的试剂，所述生物标志物为腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷中的任意一种或者任意两种以上的组合。

较佳地，所述试剂盒包含：用于同时检测待测样本中腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷的表达水平的试剂。

较佳地，所述试剂盒包含：用于检测待测样本中生物标志物的表达水平的试剂，所述生物标志物为草酰乙酸、2-氨基己二酸、鸟嘌呤核苷1、S-甲基-5-硫腺苷、乙醇酸酯、3-甲基苯乙酸、肌酐二磷酸、腺嘌呤核苷二磷酸、乙醇胺、富马酸盐、二氢乳清酸盐、2-羟基戊二酸、吡哆醇、对羟基苯甲酸酯、黄素腺嘌呤二核苷酸中的任意一种或者任意两种以上的组合。

较佳地，所述试剂盒还包含腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷的标准品，用于分别与待测样本中腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷作对照。

较佳地，所述试剂盒还包含内标。

较佳地，所述待测样本包含血清、脑代谢物、脑脊液中的任意一种。

本发明还提供了用于检测待测样本中生物标志物的表达水平的试剂在制备术前诊断神经认知恢复延迟的产品中的应用，所述生物标志物选自腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷中的任意一种或者任意两种以上的组合。

较佳地，与正常人相比，所述腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸在神经认知恢复延迟患者中的表达水平上调，S-甲基-5-硫腺苷在神经认知恢复延迟患者中的表达水平下调。

较佳地，所述检测待测样本中生物标志物的表达水平包含使用色谱法、质谱法、色谱-质谱联用法中的任意一种或任意两种以上组合进行检测。

较佳地，所述色谱法包含气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法中的任意一种。

本发明的有益效果：

(1)本发明通过代谢组学得方法首次发现生物标志物腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷能够用于术前神经认知恢复延迟的诊断和预测，通过检测血清中腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷的表达水平，可以有效预测术后发生神经认知恢复延迟障碍的风险；如果在患者血液中发现单个生物标志物的差异改变，则需警惕此类患者术后可能发生神经认知恢复延迟，如果四种生物标志物都发生了差异改变，则需高度警惕此类患者术后可能发生神经认知恢复延迟，从而有针对性的进行早期干预或术后早期治疗，以促进术后恢复；

(2)制备得到的试剂盒，可用于早期发现、诊断和预测认知障碍，检测样本为血清，需血量少，采样方便简便，操作简单，检测出结果所需时间较短，具有广阔的市场应用前景和社会效益。

附图说明

图1为本发明的评估方法流程图。

图2为OPLS-DA模型中VIP值排名前15的术前血清代谢物。

图3为采用四种差异代谢物分别诊断区分神经认知恢复延迟患者组和非神经认知恢复延迟患者组的ROC曲线图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。本发明中未具体提及的实验仪器、试剂、方法均为本领域常规的实验仪器、试剂和方法。

麻醉与手术后的神经认知恢复延迟(delayed neurocognitive recovery,dNCR)是指手术结束到术后30天在排除术后谵妄的前提下，若患者在这段时间段出现认知障碍，称为神经认知恢复延迟(delayed neurocognitive recovery，DNR)；现有的术后诊断神经认知恢复延迟的方法无法防止或者减轻患者症状，因此，对于术前诊断神经认知恢复延迟显得尤为重要，通过早期术前评估诊断，可以为患者尽早预测发生神经认知恢复延迟的危险性，从而可以个体化制定早期治疗的优化策略，减少dNCR术后发病率。随着时间的推移，老年人的代谢过程逐渐改变，衰老过程会导致人脑发生改变，包括但不限于大脑重量和体积、皮质厚度和突触密度的减少。此外，葡萄糖代谢、耗氧量和脑血流量均减少。大脑代谢途径的紊乱与神经退行性疾病有关，包括轻度认知障碍(MCI)、阿尔茨海默病(AD)和其他老年认知缺陷，麻醉/手术也会对代谢状态和途径产生影响。

血清学检测因采样方便、省时省力，能够在短时间内得到检测结果，在疾病的诊断和预测方面具有广泛的应用。检测血清中代谢标志物可以有效预测疾病的发生风险。

腺嘌呤核苷二磷酸(Adenosine Diphosphate，ADP)是由一分子腺苷与两个相连的磷酸根组成的化合物，在生物体内通常为ATP水解失去一个磷酸根，即断裂一个高能磷酸键，并释放能量后的产物，主要参与机体的糖代谢。

草酰乙酸(Oxaloacetate，OAA)是三羧酸循环(TCA循环)的重要中间产物，参与新陈代谢和能量，草酰乙酸能够降低大脑和血液中的谷氨酸水平，因此对脑损伤具有神经保护作用。草酰乙酸也已证明对阿尔兹海默病患者是安全的，病通过参与能量代谢而提供益处。阿尔兹海默病的早期通常与大脑需氧糖酵解改变有关，而星形胶质细胞糖酵分解缺陷与神经功能减退有关。先前研究发现，全身麻醉药物可以激活大脑中的糖酵解，这可能是麻醉下葡萄糖代谢的主要方式，草酰乙酸可通过多种途径抑制糖酵解。草酰乙酸在胞浆内，苹果酸脱氢酶1(MDH1)将OAA还原为苹果酸，消耗NADH电子生成NAD+，提高胞质中NAD+/NADH比值能提高糖酵解通量。

2-氨基己二酸(2-Aminoadipic Acid，2-AAA)是由赖氨酸降解产生的，赖氨酸残基经金属催化氧化脱氨基生成丙氨酸，丙氨酸氧化生成2-AAA。在先前动物实验中，向内侧前额叶皮质(mPFC)注射2-氨基己二酸会导致mPFC脑区的星形胶质细胞丢失，进而引发随后的神经元损伤，导致认知障碍。2-AAA升高与老年人，尤其是MCI和AD患者的认知功能损害密切相关，因此有必要研究术前血清中2-AAA和神经认知恢复延迟之间的关系。

S-甲基-5-硫腺苷(S-methyl-5-thioadenosine)可转化为腺嘌呤和S-甲基-5-硫代嘌呤-1-磷酸，与肠道菌群有关，肠道菌群失调和认知功能可能存在联系。

另，本发明所述的正常人均是指术后没有发生神经认知恢复延迟的人。

(一)代谢组学数据统计分析筛选差异代谢物

实验方法：

1.1入选标准

1)性别：性别不限；

2)年龄：65周岁及以上；

3)在本院完成手术；

4)ASA分级I～II级；

5)同意参与本研究并同意签署知情同意书。

1.2排除标准

1)术前精神病史及精神药物使用史；

2)受试者被诊断阿兹海默症(AD)；

3)术前精神量表评估异常；

4)围术期有紧急抢救相关病史。

1.3诊断标准

1)病例组诊断标准：

通过认知功能量表和谵妄3D-CAM量表得出相应的分值综合判断是否存在术后认知功能障碍。认知功能量表包括MMSE(Mini-mental state examination)评估量表：评估量表27-30正常，21-26轻度认知功能障碍，10-20中度认知功能障碍，0-9重度认知功能障碍，MoCA(Montreal Cognitive Assessment)评估量表：大于等于26分正常，18-26轻度认知功能障碍，10-17中度认知功能障碍，小于10重度认知功能障碍。

2)对照组样本的选择：

根据神经认知恢复延迟实际发病情况，如发病率较低，则采用倾向性评分法1:1匹配对照组，如发病率较高，则纳入所有对照组样本，主要采用回归进行混杂因素校正。

1.4血液监测数据

患者术前和术后1天时采集血液，进行代谢组学分析研究等测定，实验样本也可选自患者的脑代谢物、脑脊液、粪便。

1.5代谢组学检测

1)实验仪器和试剂：

液相色谱串联三重四级杆质谱(Thermo TSQ Altis)、色谱柱(ACQUITY UPLC HSST3(100*2.1mm，1.8μm))、冷冻浓缩仪(北京吉艾姆CV600)、离心机(Eppendorf 5424)、涡旋混匀仪(德国IKA)。甲醇、乙腈(Merck，LC-MS级)、甲酸(ThermoFisher,，LC-MS级)。

2)样品处理：

S1：取样品50μL于1.5mL离心管中，加入-80℃预冷甲醇300μL；

S2：4℃、2000rpm涡旋10min；

S3：4℃、12000rpm离心10min；

S4：吸取上清300μL至另一离心管中，冷冻浓缩至完全干燥；

S5：以50μL 2％乙腈水溶液复溶；

S6：4℃、2000rpm涡旋10min；

S7：4℃、12000rpm离心10min；

S8：吸取上清至进样小瓶，进样1μL。

3)样品分析：

色谱条件：流动相A为水相(含：0.1％甲酸)，流动相B为乙腈(含：0.1％甲酸)；采用梯度洗脱；流速为0.2Ml/min，进样量为1μL，柱温为40℃。

质谱条件：采用MRM模式进行检测，Thermo HESI离子源参数见表1。

表1HESI源参数

如图1所示为本发明的评估方法流程图。首先在受试者中排除不符合入选标准的或符合排除标准的受试者，在符合入选标准的条件下，分别对临床长时间七氟烷静吸复合麻醉的老年口腔肿瘤患者在术前和术后1天、3天、7天的进行认知功能评估，并收集患者术前和术后1d的血液。通过认知功能量表，评估患者是否发生神经认知恢复延迟，并分别纳入到神经认知恢复延迟组和非神经认知恢复延迟组，通过代谢组学检测患者血清中的代谢产物。

实验结果：

代谢组学原始数据首先通过主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)法进行分析，进一步采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)，以获得与类别对应的代谢表型方差信息。正交偏最小二乘判别分析能够将X矩阵信息分解成与Y相关和不相关的两类信息，通过去除不相关的差异来筛选差异变量。载荷图VIP(Variable Important inProjection,VIP)值用于表示变量对建模的贡献，VIP值＞1.0被认为是建模有贡献的代谢物。因VIP＞1.0的变量对Y矩阵解释的影响高于平均值。除了多元统计方法外，Student t检验和倍数变化也用于测量每个代谢物的显著性。然后，根据OPLS-DA分析中VIP图中投影的可变重要性标准(VIP＞1.0)和Student t检验中的p＜0.05选择差异代谢物。

代谢组学分析包括100份血清样本，代谢组学数据包含182种代谢物的丰富信息。如图2所示，筛选得到OPLS-DA模型中VIP值排名前15的术前血清代谢物，分别为草酰乙酸(Oxaloacetate)、2-氨基已二酸(2-aminoadipic acid)、鸟嘌呤核苷1(guanosine-1)、S-甲基-5-硫腺苷(S-methyl-5-thioadenosine)、乙醇酸酯(glycolate)、3-甲基苯乙酸(3-methylphenylacetic acid)、肌酐二磷酸(IDP)、腺嘌呤核苷二磷酸(AdenosineDiphosphate，ADP)、乙醇胺(Ethanolamine)、富马酸盐(Fumarate)、二氢乳清酸盐(Dihydroorotate)、2-羟基戊二酸(2-hydroxygluterate)、吡哆醇(Pyridoxine)、对羟基苯甲酸酯(p-hydroxybenzoate)、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)。

(二)构建ROC曲线用于评估差异代谢物用于预测神经认知恢复延迟实验方法：

通过构建受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC曲线)，ROC曲线是反映敏感性和特异性连续变量的综合指标，是利用构图法揭示敏感性和特异性的相互关系，它通过将连续变量设定出多个不同的临界值从而计算出一系列敏感性和特异性。ROC曲线越凸越接近左上角表明其诊断价值越大，曲线下面积越大越接近于1，诊断准确性越高。ROC曲线的曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标已被普遍认可，AUC为0.5时，即无诊断意义；AUC在0.5～0.7时，表示诊断准确率较低；AUC在0.7～0.9时，表示诊断准确性中等；AUC大于0.9时，表示诊断有较高的准确性。

实验结果：

将得到的15种差异代谢物分别单独进行预测实验，得到四种灵敏度最高的代谢物。如图3所示为筛选得到的四种代谢物的AUC曲线，图3的a表示2-氨基已二酸、图3的b表示草酰乙酸、图3的c表示腺嘌呤核苷二磷酸、图3的d表示S-甲基-5-硫腺苷的AUC曲线图。其AUC的值分别为0.86、0.86、0.87和0.8，说明预测效果较好。并且，与非神经认知恢复延迟组相比，神经认知恢复延迟组患者血清中的腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基已二酸的含量是升高的，而S-甲基-5-硫腺苷的含量是下降的。

结果表明，上述四种灵敏度较高的代谢物可以分别单独作为神经认知恢复延迟的生物标志物，如果在患者血液中发现上述四种中的任一种生物标志物发生了差异改变，就需要警惕此类患者术后可能会发生神经认知恢复延迟，应在术前采取预防措施，以尽量避免术后发生神经认知恢复延迟的问题。可以理解的是，所述生物标志物能够是腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷中的任意一种或者任意两种以上的组合。

使用logistics回归构建四个代谢物组合的预测模型，将上述四种代谢物进行组合进行预测，使用K值交叉验证法证明模型稳定性，K＝5。结果发现四个代谢物组合构建的预测模型的AUC值为0.869，灵敏度为0.933，特异度为0.927，准确度为0.9。

结果表明，腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷可以作为一个组合作为神经认知恢复延迟的生物标志物，组合预测包含的影响因素更多，AUC值越高，更能准确地判断神经恢复延迟的发生，如果在患者血清中腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基已二酸、S-甲基-5-硫腺苷都发生了差异改变，则需要高度警惕术后发生神经认知恢复延迟的发生，对于此类患者可能就要进行早期干预或者术后早期治疗，以促进术后恢复。

基于本发明筛选得到的四种与神经认知恢复延迟相关的生物标志物，本发明提供了一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒，该试剂盒包含以下成分：

生物标志物的标准品：腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基已二酸、S-甲基-5-硫腺苷中的任意一种或者任意两种以上组合的生物标志物的标准品，试剂盒还包含内标。

试剂盒的使用方法：收集受试者的血清于-80℃冰箱冻存，实验前将血清样本置于4℃冰箱中解冻后取100μL的血清样本，然后加入甲醇，进行混匀，混匀之后放入高速离心机中进行离心，在13000rpm条件下离心10min。吸取离心后的上清液至离心管中，将上清液用氮吹仪吹干，吹干后利用内标液进行复溶，复溶后进行混匀离心，将离心后的上清置于瓶中，使用上述液相色谱串联三重四级杆质谱中的设定方法对处理后的样本进行分析，并参照上述代谢组学分析方法对处理后的样本进行定量与定性分析。可以检测腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基已二酸、S-甲基-5-硫腺苷中任意一种生物标志物的含量，也可以同时检测四种生物标志物，以进一步提高检测准确度。

本发明提供的一种用于术前诊断神经认知恢复延迟的产品及其应用，通过代谢组学方法全面测定神经认知恢复延迟患者与非神经认知恢复延迟患者术前差异代谢物，筛选得到四种差异代谢物，该四种差异代谢物可以很好的预测术后神经恢复延迟的发生与否，能够作为术前诊断神经认知恢复延迟的生物标志物，能够在神经认知恢复延迟发生前进行预判，并给予相应的治疗，如果术前倾向性预测，就可以早期关注和早期干预，减少术后发病率。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (7)

1.用于检测待测样本中生物标志物的表达水平的试剂在制备术前诊断神经认知恢复延迟的试剂盒中的应用，所述生物标志物为腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷中的任意一种或者任意两种以上的组合；与正常人相比，所述腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸在神经认知恢复延迟患者中的表达水平上调，S-甲基-5-硫腺苷在神经认知恢复延迟患者中的表达水平下调。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包含：用于同时检测待测样本中腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷的表达水平的试剂。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包含腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷的标准品，用于分别与待测样本中腺嘌呤核苷二磷酸、草酰乙酸、2-氨基己二酸、S-甲基-5-硫腺苷作对照。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包含内标。

5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述待测样本包含血清、脑代谢物、脑脊液中的任意一种。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测待测样本中生物标志物的表达水平包含使用色谱法、质谱法、色谱-质谱联用法中的任意一种或任意两种以上组合进行检测。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述色谱法包含气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法中的任意一种。

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