CN115637253A

CN115637253A - 免疫浸出物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN115637253A
Application number: CN202211512500.4A
Authority: CN
Inventors: 卫彦; 邓旭亮; 郭馨蔚; 杨玥; 冯传良; 黄晨燕; 刘进营; 江圣杰
Original assignee: Peking University School of Stomatology
Current assignee: Peking University School of Stomatology
Priority date: 2022-11-30
Filing date: 2022-11-30
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2042-11-30
Also published as: CN115637253B

Abstract

本发明公开免疫浸出物及其制备方法和应用。本发明的免疫浸出物通过使巨噬细胞在左手性水凝胶环境培养分离得到，其中左手性水凝胶环境能够促进巨噬细胞向M2方向极化，免疫浸出液可促进间充质干细胞成骨，进一步敲低巨噬细胞的WTAP基因后可以使巨噬细胞的M2极化和其免疫浸出液诱导的间充质干细胞成骨更为明显。

Description

免疫浸出物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体地说，涉及一种细胞浸出液及其制备方法和应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞(BMSC)具有多向分化潜能，在不同调控因子作用下可以向成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等方向分化，其作为组织工程的种子细胞有明显的优势。其中成骨分化在组织修复过程中起着重要作用，可以用于骨缺损的治疗。目前干细胞治疗已经成为一个新兴治疗方向。以往对于组织缺损的治疗水平很有限，常需要植入模拟原组织的外界修复体或异体组织，不仅易产生免疫排斥反应，而且不能完全恢复患者原有的功能。干细胞的多向分化能力为恢复原有组织提供了可能，也极大地减少了免疫排斥反应。未来应用BMSC成骨分化的特点治疗骨质疏松、骨折很有前景。

然而，目前这一技术尚存有一定限制，因为BMSC需要进行成骨诱导，市面上大部分的成骨诱导液含有β-甘油磷酸钠、地塞米松、维生素C等成分，通常需要14-21天才能在显微镜下观察到矿化结节，如果需要大面积成骨，所需要的时间就更为漫长。另外一种诱导成骨的方式是植入成骨材料，但是外来材料容易使机体发生免疫排斥反应，影响成骨效果。

巨噬细胞在活化过程中有两个极端，分别是M1状态和M2状态，M1极化方向的主要作用是促炎，巨噬细胞会分泌iNOS、TNF-a、IL-6等促炎类细胞因子，机体在对抗病原菌感染时会处于这种状态。此外哮喘、过度肥胖等疾病时的巨噬细胞也会呈现出M1极化。M2极化方向的主要作用是抗炎、促进修复，这个状态的巨噬细胞会分泌IL-10、ARG-1、YM-1、CD206等细胞因子，对于组织缺损时的修复有着重要意义。巨噬细胞的极化调控非常复杂，受到细胞因子、药物、磁场、电场、三维微环境等影响。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

为解决现有技术中的至少部分技术问题，特别是促进成骨分化效果不好且存在副作用的技术问题，本发明提供可有效促进骨髓间充质干细胞成骨分化的细胞浸出液及其制备方法和应用。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种免疫浸出物的制备方法，其包括使巨噬细胞在左旋手性凝胶因子环境中培养，分离培养上清液的步骤。本发明发现左旋手性凝胶因子能够促进M2极化，由此所得到的免疫浸出物可进一步促进间充质干细胞成骨。

在某些实施方案中，根据本发明所述的免疫浸出物的制备方法，其中，所述巨噬细胞中WTAP的量或活性降低，或者WTAP基因的表达或活性降低。敲低或敲除巨噬细胞的WTAP基因后再将其培养在左手性水凝胶中可以使巨噬细胞的M2极化更为明显。WTAP是一种m6A甲基化转移酶，能够让mRNA上的碱基发生m6A甲基化修饰。

在某些实施方案中，根据本发明所述的免疫浸出物的制备方法，其中，所述左旋手性凝胶因子包括左旋苯丙氨酸类物质。优选地，所述左旋苯丙氨酸类物质具有如下式所示的结构。

在某些实施方案中，根据本发明所述的免疫浸出物的制备方法，其中，所述环境包括纳米三维网状结构的手性三维环境。

在某些实施方案中，根据本发明所述的免疫浸出物的制备方法，优选地，包括以下步骤：

(1) 提供包含巨噬细胞和左旋手性凝胶因子的水凝胶的步骤；

(2) 使所述水凝胶在巨噬细胞培养液中培养得到培养物的步骤；和

(3) 从所述培养物分离得到上清液的步骤。

在某些实施方案中，根据本发明所述的免疫浸出物的制备方法，其中，所述水凝胶的制备包括使左旋手性凝胶因子溶液与巨噬细胞悬液混合的步骤，其中左旋手性凝胶因子溶液中左旋手性凝胶因子的质量体积浓度为0.1-0.5mg/µL。

在某些实施方案中，根据本发明所述的免疫浸出物的制备方法，其中，进一步包括培养所述水凝胶的步骤。

本发明的第二方面，提供一种免疫浸出物，其特通过第一方面所述的制备方法得到。

本发明的第三方面，提供根据本发明所述的免疫浸出物在促进间充质干细胞成骨分化中的应用。

在某些实施方案中，根据本发明所述的应用，其中，所述成骨分化包括至少以下情形之一：

a. 骨髓间充质干细胞中成骨基因开始表达或表达升高；

b. 产生钙化结节或促进钙化结节生成；

c. 成骨量增加；

d. 骨缺损恢复或修复。

本发明的第四方面，提供一种植入材料，其包括第二方面所述的免疫浸出物；优选地，进一步包括间充质干细胞；还优选地，所述植入材料的形式包括凝胶、微球、注射剂、支架、植入体。

本发明具有以下有益效果：

(1) 诱导时间更快，成骨率更高，在第三天时PCR检测成骨指标即明显升高，普通诱导BMSC成骨的方法需加成骨诱导液，一般7天才能检测到成骨指标升高。

(2) 不需体内植入外来材料即可免疫成骨，直接应用自体巨噬细胞的免疫浸出物作为刺激条件，减小了免疫排斥反应。

(3) 诱导因子来源于自体细胞免疫浸出物，不需要添加地塞米松、β-甘油磷酸钠等药物，减少了药物不良反应。

(4) 诱导巨噬细胞的手性水凝胶环境在体外，减少了交联剂DMSO对体内组织的刺激，更为安全。

附图说明

图1 为示例性左手性水凝胶中WTAP敲低和未敲低的巨噬细胞向M2方向极化示意图。其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。结论：左手性水凝胶促进巨噬细胞向M2方向极化。

图2为示例性左手性水凝胶中WTAP敲低和未敲低的巨噬细胞向M2方向极化示意图。其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。结论：左手性水凝胶中WTAP敲低后的巨噬细胞向M2方向极化更明显。

图3 为WTAP敲低和未敲低的巨噬细胞免疫浸出液对BMSC成骨方向诱导过程中成骨基因表达的影响示意图。其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。结论：左手性水凝胶免疫浸出物明显促进成骨，左手性水凝胶中WTAP敲低后的巨噬细胞的免疫浸出物更加促进成骨。

图4 WTAP敲低和未敲低的巨噬细胞免疫浸出液对BMSC产生钙化结节影响的示意图。其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。结论：左手性水凝胶免疫浸出物促进钙化结节产生，左手性水凝胶中WTAP敲低后的巨噬细胞的免疫浸出物更加促进钙化结节产生。

图5 WTAP敲低和未敲低的巨噬细胞免疫浸出液对骨缺损处成骨的影响示意图。其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。结论：左手性免疫浸出物促进成骨，左手性水凝胶中WTAP敲低后的巨噬细胞的免疫浸出物更加促进成骨。

图6 WTAP基因敲低与手性环境对于成骨水平的影响。

图7 左手性水凝胶纤维扫描电镜下表征。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。除非另有说明，否则“%”为基于重量的百分数。

本文中，术语“免疫浸出物”是指包含巨噬细胞经过左旋手性凝胶因子环境培养后产生的复杂成分的组合物，包含能够促进骨髓间充质干细胞成骨的成分。分离时免疫浸出物可以上清液的形式出现，还可以是从该上清液进一步分离得到的组分。

本文中，术语“上清液”是指巨噬细胞培养后得到的培养物经分离得到的上层液体，其可以包含巨噬细胞经自然分泌而到胞外的分泌物或其成分，还可以包含巨噬细胞经人为裂解而释放到胞外的裂解物或其成分。上清液可以是单独的分泌物或其成分，也可以是单独的裂解物或其成分，还可以是两者的混合物。

本文中，术语“左旋手性凝胶因子”为本领域公知的左旋手性的小分子有机化合物，其能够在低浓度下使溶剂凝胶化，进而使整个体系形成类似粘弹性液体或固体的超分子凝胶。此类超分子凝胶通常通过凝胶因子分子间氢键、π-π键、疏水力和范德华力等非共价键相互作用，在溶剂中自发地聚集、自组装成有序结构，进而使整个体系凝胶化而形成的物理凝胶，具有三维网络结构。

本文中，术语“WTAP的量”与“含量”或“水平”具有相当的含义，既包括WTAP相对量的含义，也包括绝对量的含义。

本文中，术语“WTAP活性”即WTAP蛋白在细胞内发挥其作用的性质，包括但不限于可能存在的催化活性、与其他蛋白或分子的结合活性等。

本文中，术语“基因的表达”或“基因表达”是指基因的转录过程和/或蛋白翻译过程。“基因表达”的高低既与“基因的活性”或“基因活性”的大小有关，又与基因组中该基因的存在量有关。因此，基因表达既可以通过调节细胞内基因的量(一般是指DNA水平的量)来实现，例如，基因敲低、基因转染等，也可以通过调节基因的活性(一般是指RNA水平的量)来实现，例如基因抑制、RNA干扰等。

本文中，术语“降低”是指相对于对照巨噬细胞中目标蛋白的量而言相对或绝对量减少、变低或变没有，或者相对于对照巨噬细胞中的目标蛋白的活性而言相对活性或绝对活性变弱、衰减、抑制、下降或变为没有；或者相对于对照巨噬细胞中目标基因表达而言表达变弱、衰减、抑制、下降或变为没有。对照巨噬细胞是指机体内未经处理的正常巨噬细胞，或体外人工培养的正常巨噬细胞。

本文中，术语“巨噬细胞”巨噬细胞包括由血液中的单核细胞穿出血管后分化而成的细胞。单核细胞进入结缔组织后，体积增大，内质网和线粒体增生，溶酶体增多，吞噬功能增强。巨噬细胞一般来源于哺乳动物和人组织。哺乳动物的实例包括但不限于小鼠、大鼠、猴、狗、猪、猩猩等。巨噬细胞的组织来源不特别限定，优先为骨髓来源，即由骨髓来源的前体细胞分化得到单核细胞，然后再由单核细胞得到巨噬细胞。

本发明中，术语“M2极化”是指巨噬细胞向抗炎性方向极化，M2极化可通过检测由巨噬细胞分泌的分子标志物如IL-10、ARG-1、YM-1、CD206来确认。

制备方法

本发明的第一方面，提供一种免疫浸出物的制备方法，其至少包括使巨噬细胞在左旋手性凝胶因子环境中培养，并分离培养上清液的步骤。

本发明中，巨噬细胞可以使用天然来源的细胞，也可以使用人工处理或加工的细胞。天然来源的细胞可直接从动物组织分离获得，或者从商业机构购买预先分离得到的巨噬细胞。人工处理或加工包括对天然来源的巨噬细胞进行基因工程化改造。优选地，通过改造使巨噬细胞中WTAP量的降低，或WTAP活性降低，或者WTAP基因的表达降低。通过改造能够大大提升免疫浸出物的功能，特别是促进间充质干细胞成骨分化的功能。在示例性实施方案中，通过基因敲低技术降低巨噬细胞内WTAP基因活性。

本发明中，左旋手性凝胶因子一般是指小分子有机化合物，其示例性实例为C₂对称的苯丙氨酸类衍生物凝胶因子，其为本领域已知的一类物质的统称，可通过化学合成获得，包括苯丙氨酸及其衍生物。衍生物为酰胺基或脲基共价连接L-苯丙氨酸和苯环。水凝胶纳米纤维呈左手螺旋。

在某些实施方案中，本发明的免疫浸出物的制备方法，至少包括以下三个步骤：

(1) 提供包含巨噬细胞和左旋手性凝胶因子的水凝胶的步骤；

(3) 从所述培养物分离得到上清液的步骤。

步骤(1)中，巨噬细胞可以包含于左旋手性凝胶因子的凝胶内的方式存在。此处的凝胶包括有机溶剂形成的凝胶和水凝胶。凝胶的制备不特别限定，示例性的制备包括使左旋手性凝胶因子溶液与巨噬细胞悬液混合的步骤。其中用于溶解左旋手性凝胶因子的溶剂可以是有机溶剂，优选为水溶性溶剂。水溶性溶剂的实例包括但不限于二甲基亚砜。左旋手性凝胶因子溶液中的浓度不特别限定，一般为0.01-1g/ml，优选0.05-0.5 g/ml，更优选0.1-0.5 g/ml，还优选0.2-0.3 g/ml，例如0.2 g/ml、0.25g/ml、0.3g/ml。

本发明中，巨噬细胞悬液可使用水等进行重悬，优选使用培养基进行重悬，悬液中的细胞浓度不特别限定，可由本领域技术人员根据需要而自由设定。巨噬细胞悬液可使用预先制备的备用悬液。备用悬液可以直接与左旋手性凝胶因子溶液混合使用。此时，备用悬液中的细胞浓度一般为1-3×10⁶个/ml。在某些示例性实施方案中，在制备凝胶时由巨噬细胞制备巨噬细胞悬液，其制备步骤在本领域已知，一般包括巨噬细胞的复苏和消化悬浮。消化时可通过例如胰酶处理使巨噬细胞从贴壁状态或细胞团状态变为游离单细胞，胰酶的用量一般为1.5-2ml/75cm²

步骤(2)为使所述水凝胶在巨噬细胞培养液中培养得到培养物的步骤，优选地，培养条件为适于巨噬细胞分泌产生分泌物的条件，具体不特别限定。例如，巨噬细胞培养液一般使用高糖培养液(本文有时也称作高糖培养基)，其为本领域已知的培养基,其增加量不限定，可根据细胞量而设定。培养时间不限定，一般为10小时至10天，优选20小时至5天，更优选1天至3天。

步骤(3)为从所述培养物分离得到上清液的步骤。巨噬细胞经培养后的培养物可以是分泌物，也可以是裂解物。分离手段不特别限定，包括离心分离如密度梯度离心等、过滤分离、透析分离等。

本领域技术人员应理解，编号(1)、(2)等仅为了区别不同步骤目的，并没有表示步骤先后顺序的含义。只要能够实现本发明的目的，上述步骤的顺序并不特别限定。另外，本领域技术人员还应理解的是，在上述步骤(1)-(3)前后，或这些任意步骤之间还可包含其他步骤或操作，例如进一步优化和/或改善本发明所述的方法。

在某些实施方案中，在步骤(1)之后和步骤(2)之前还包含对巨噬细胞和左旋手性凝胶因子的凝胶可以预培养的步骤。预先培养的条件和时间不限定，只要适于巨噬细胞生长即可。例如，25-40，优选37℃下孵育10分钟至10小时，优选20分钟至5小时，例如30分钟、1小时、2小时等。

在某些实施方案中，在步骤(3)之后包括对上清液进一步分离得到组分的步骤。

细胞浸出物

本发明的第二方面，提供一种细胞浸出物，其通过第一方面所述的方法制备得到。

本发明中，细胞浸出物可以是液体形式，例如溶液、悬液形式，也可以是固体形式，例如细胞浸出液经冷冻干燥得到的干粉。

本发明中，细胞浸出物可以是纯的巨噬细胞培养物的分离物，也可以进一步包括其他成分。其他成分的实例包括稳定剂、溶剂、其他药物成分。

应用

本发明的第三方面，提供免疫浸出物的应用。已知巨噬细胞不是成骨的主要细胞，仅向M2方向极化不能完全代表材料植入体内就会启动骨修复。因此，本发明的应用一般为体外应用，包括促进间充质干细胞，特别是骨髓间充质干细胞向成骨分化的应用。即该应用一般用作体外诱导剂，用于体外诱导间充质干细胞向成骨分化，而不是其他方向分化。

本发明的应用包括使免疫浸出物与间充质干细胞接触或者使免疫浸出物与间充质干细胞处于能够在需要时接触的状态。例如将免疫浸出物添加到间充质干细胞培养基中，促进其向成骨分化。再例如免疫浸出物和间充质干细胞共同承载到植入材料中。

本发明的应用的成骨分化包括以下情形之一即可：

a. 骨髓间充质干细胞中成骨基因开始表达或表达升高；

b. 产生钙化结节或促进钙化结节生成；

c. 成骨量增加；

d. 骨缺损恢复或修复。

植入材料

本发明的第四方面，提供一种植入材料，其可施加到机体内部而发挥作用，其至少包括本发明第二方面所述的免疫浸出物，可选地，进一步包括间充质干细胞。本发明中，植入材料的形式不限定，可以是例如凝胶、微球、注射剂、支架、植入体等。

实施例 1

本实施例为免疫浸出液的示例性制备例，其包括以下步骤：

1、将左旋苯丙氨酸类水凝胶因子溶于二甲基亚砜溶液，每12.5µl加入3mg因子，置于48孔板底部，每孔12.5µl；左旋凝胶因子化学式如下式。

2、1ml移液枪吸取巨噬细胞悬液，每孔加入250µl形成凝胶；

3、37℃孵育1小时；

4、在每孔凝胶上方加入250µl DMEM高糖培养基，继续培养3d；

5、无菌注射器吸取上清，经过孔径为0.22µm的灭菌针头过滤器过滤纯化，即为所需免疫浸出液。每孔可获得250µL免疫浸出液。

其中，步骤2中的巨噬细胞为从ScienCell公司购买的小鼠骨髓源巨噬细胞(BMDM)或WTAP基因敲低的巨噬细胞。其中，WTAP基因敲低包括以下步骤：

1-1、从ScienCell公司购买小鼠骨髓源巨噬细胞(BMDM)进行培养；

1-2、转染前24小时将巨噬细胞以1.2*10⁶个/孔的密度铺于6孔板中；

1-3、每孔换成500µl无血清培养基，加入20µlWTAP慢病毒载体。

1-4、12小时后将培养基换成含血清的高糖培养基；

1-5、细胞贴壁生长稳定后，每孔加入500µl胰酶将细胞消化，离心，重悬。

实施例 2

本实施例为免疫浸出液的示例性制备例，其包括以下步骤：

1、将左旋苯丙氨酸类水凝胶因子溶于二甲基亚砜溶液，每12.5µl加入2.5mg因子，置于48孔板底部，每孔12.5µl；

2、1ml移液枪吸取巨噬细胞悬液，每孔加入230µl形成凝胶；

3、37℃孵育1小时；

4、在每孔凝胶上方加入230µl DMEM高糖培养基，继续培养3d；

5、无菌注射器吸取上清，经过孔径为0.22µm的灭菌针头过滤器过滤纯化，即为所需免疫浸出液。凝胶形成稳定，每孔可获得230µL免疫浸出液。

实施例 3

本实施例为免疫浸出液的示例性制备例，其包括以下步骤：

1．将左旋苯丙氨酸类水凝胶因子溶于二甲基亚砜溶液，每12.5µl加入3.75mg因子，置于48孔板底部，每孔12.5µl；

2、1ml移液枪吸取巨噬细胞悬液，每孔加入260µl形成凝胶；

3、37℃孵育1小时；

4、在每孔凝胶上方加入260µl DMEM高糖培养基，继续培养3d；

5、无菌注射器吸取上清，经过孔径为0.22µm的灭菌针头过滤器过滤纯化，即为所需免疫浸出液。凝胶形成稳定，每孔可获得260µL免疫浸出液。

测试例

测试例以实施例1得到的免疫浸出液进行。

一、巨噬细胞的极化方向检测

收集WTAP未敲低的巨噬细胞水凝胶，用移液枪吹散，分散在PBS中，细胞过滤器过滤。用5%BSA封闭后，用CD206、CCR7、CD86流式抗体标记巨噬细胞，流式细胞仪检测抗体标记，如图1所示，其中L为左手性水凝胶，D为右手性水凝胶。由图1可知，左手性（L）水凝胶中巨噬细胞向M2方向极化。

同时收集WTAP敲低和未敲低的巨噬细胞水凝胶，进行qPCR极化验证，如图2所示，由图2可知，左手性水凝胶中WTAP敲低后的巨噬细胞向M2方向极化更明显。

二、PCR检测免疫浸出液诱导的BMSC成骨指标

1、小鼠BMSC的培养

从赛业生物科技有限公司购买小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)进行培养。

2、免疫浸出液诱导BMSC成骨

(1) 胰蛋白酶消化BMSC，离心后a-MEM培养基重悬，转移至六孔板中；

(2) 6小时细胞贴壁后，加入免疫浸出液，每孔加入500µl；

(3) 培养3天后，去净上清，每孔加入1ml Trizol，冰上用移液枪吹打2-3次后转入离心管中；

(4) 加入200µl氯仿，上下倒置混匀，4℃离心15分钟，转速12000g/min；

(5) 吸取上清，加入500µl异丙醇，上下倒置混匀，4℃离心15分钟，转速12000g/min；

(6) 弃异丙醇，75%乙醇洗2次，转速7500g/min离心5分钟；

(7) 弃乙醇，常温晾干至沉淀呈无色，加入DEPC水溶解，Nanodrop测RNA浓度；

(8) 应用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA；

(9) 以RUNX2、BMP2、OPN为设计引物进行qPCR，验证基因表达量。结果如图3所示，其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。结论：左手性水凝胶免疫浸出物明显促进成骨，左手性水凝胶中WTAP敲低后的巨噬细胞的免疫浸出物更加促进成骨。

三、茜素红染色实验

1、将BMSC铺于六孔板，每孔加入500µl免疫浸出液，培养7天；

2、去净上清，用10%中性甲醛溶液固定30分钟；

3、超纯水冲洗3次；

4、每孔加入茜素红染液1ml，常温摇床上反应15分钟；

5、超纯水冲洗3次；

6、显微镜下观察钙结节，如图4所示。其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。

由图4可知，7天时左手性水凝胶的免疫浸出液可以诱导BMSC产生钙化结节，而对照组基本没有产生钙化结节。WTAP敲低后左手性水凝胶中钙化更为明显。

四、体内成骨实验

1、小鼠麻醉后在股骨近膝关节处用直径1mm的球钻打孔；

2、在骨缺损出植入含免疫浸出液的BMSC；

3、缝合伤口，小鼠清醒后继续饲养14天；

4、14天后颈椎脱臼处死，分离股骨，福尔马林固定24小时；

5、microCT拍摄小鼠股骨，结果为图5所示。其中，L是左旋手性水凝胶实验组，D是右旋手性水凝胶对照组。

由图5可知，与对照组相比，左手性水凝胶的免疫浸出液可明显诱导骨缺损处成骨。WTAP敲低后左手性水凝胶的免疫浸出液诱导成骨更为明显。

对比例1

对比例1使用右旋手性苯丙氨酸类水凝胶制作免疫浸出液，具体包括以下步骤：

1、将右旋手性凝胶因子溶于二甲基亚砜溶液，每12.5µl加入3mg因子，置于48孔板底部，每孔12.5µl；

2、1ml移液枪吸取细胞悬液，每孔加入250µl形成凝胶；

3、37℃孵育1小时；

4、在每孔凝胶上方加入250µl DMEM高糖培养基，继续培养3d；

5、无菌注射器吸取上清，经过孔径为0.22µm的灭菌针头过滤器过滤纯化，即为对照组所需免疫浸出液。

将BMSC铺于六孔板，每孔加入500µl免疫浸出液，培养三天时取样进行PCR，结果如图2；培养7天时进行茜素红染色，结果如图4。

小鼠麻醉后在股骨近膝关节处用直径1mm的球钻打孔，在骨缺损出植入含对照组右手性水凝胶免疫浸出液的BMSC，14日后取样，拍摄microCT，结果如图5所示。

结论：右手性水凝胶的免疫浸出液成骨能力明显弱于左手性。

对比例2

1、提取小鼠BMSC后，应用小鼠BMSCs成骨诱导分化培养基(Cyagen，中国)诱导成骨分化14日，显微镜观察钙化结节(杨玮哲、韩祥祯、郑美洁、周琦琪、何惠宇。环状RNA CDR1as促进小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化和成血管相关基因表达[J].口腔疾病防治，2022，30(06):390-397)，可观察到钙化结节。

常规茜素红染色需添加成骨诱导液，诱导14天才能看到矿化结节，但是本发明中不需添加成骨诱导液，观察7天即可看到钙化结节。

2、成骨诱导7天后，qPCR检测成骨指标(金齐尧、毛广艳、邓威、王晨星、李怀奇、王东苗、叶金海。炎性环境下FSTL1对小鼠骨髓间充质干细胞成骨性能的影响[J].口腔生物医学，2020,11(02):120-124)，可观察到指标上升。

常规成骨诱导后，第7天才能看到PCR成骨指标明显上升，本发明在第3天时即可看到成骨指标明显上升。

对比例3

分别用未实行WTAP基因敲低的巨噬细胞与左手性凝胶复合得到的免疫浸出液、未实行WTAP基因敲低且未植入手性凝胶中的巨噬细胞的免疫浸出液对BMSC进行诱导，检测BMSC的成骨情况。

将未进行WTAP基因敲低的巨噬细胞悬液与左手性凝胶因子混合得到培养物，在培养物上方加入培养基，培养3天，收上清进行过滤纯化，得到免疫浸出液A。

将基因未敲低的巨噬细胞铺于孔板中正常培养基培养3天，收上清液，进行过滤纯化，得到免疫浸出液B。

将WTAP基因敲低的巨噬细胞悬液与左手性凝胶因子混合得到培养物，在培养物上方加入培养基，培养3天，收上清进行过滤纯化，得到免疫浸出液C。

分别用免疫浸出液A、B、C对BMSC进行诱导，3天后对BMSC的成骨指标进行PCR检测。检测结果如图6所示。

与未敲低WTAP基因但左手性凝胶培养组和未基因敲低也未手性培养组相比，WTAP敲低并进行左手性凝胶培养的免疫浸出液可以明显使成骨水平升高。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims

1.一种免疫浸出物的制备方法，其特征在于，包括使巨噬细胞在左旋手性凝胶因子环境中培养，并分离培养上清液的步骤。

2.根据权利要求1所述的免疫浸出物的制备方法，其特征在于，所述巨噬细胞中WTAP的量或活性降低，或者WTAP基因的表达或活性降低。

3.根据权利要求1所述的免疫浸出物的制备方法，其特征在于，所述左旋手性凝胶因子包括左旋苯丙氨酸类物质。

4.根据权利要求3所述的免疫浸出物的制备方法，其特征在于，所述环境包括纳米三维网状结构的手性三维环境。

5.根据权利要求1-4任一项所述的免疫浸出物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1) 提供包含巨噬细胞和左旋手性凝胶因子的水凝胶的步骤；

(3) 从所述培养物分离得到上清液的步骤。

6.根据权利要求5所述的免疫浸出物的制备方法，其特征在于，所述水凝胶的制备包括使左旋手性凝胶因子溶液与巨噬细胞悬液混合的步骤，其中左旋手性凝胶因子溶液中左旋手性凝胶因子的质量体积浓度为0.1-0.5mg/µL。

7.根据权利要求5所述的免疫浸出物的制备方法，其特征在于，在步骤(1)和(2)之间进一步包括培养所述水凝胶的步骤。

8.一种免疫浸出物，其特征在于，通过权利要求1-7任一项所述的制备方法得到。

9.根据权利要求8所述的免疫浸出物在促进间充质干细胞成骨分化中的应用；优选地，所述成骨分化包括至少以下情形之一：

a. 骨髓间充质干细胞中成骨基因开始表达或表达升高；

b. 产生钙化结节或促进钙化结节生成；

c. 成骨量增加；

d. 骨缺损恢复或修复。

10.一种植入材料，其特征在于，包括根据权利要求8所述的免疫浸出物；优选地，进一步包括间充质干细胞；进一步优选地，所述植入材料的形式为凝胶、微球、注射剂、支架或植入体。