CN115636865A - 抗体偶联药物及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗体偶联药物及其制备方法，还涉及制备该抗体偶联药物的中间体，还涉及包含该抗体偶联药物的药物组合物，还涉及该抗体偶联药物用于治疗和/或预防疾病的用途。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗体偶联药物及其制备方法，还涉及制备该抗体偶联药物的中间体，还涉及包含该抗体偶联药物的药物组合物，还涉及该抗体偶联药物用于治疗和/或预防疾病的用途。
背景技术
抗体偶联药物(antibody-drug conjugates，ADCs)已成为当前抗肿瘤领域的研究热点，有10款ADCs获批上市，另有约80款ADCs处于临床研究阶段。毒素喜树碱类化合物在ADCs领域已有成功应用,已有两款以喜树碱类化合物为毒素的ADCs上市，如DS-8201a和IMMU-132。另有IMMU-130、IMMU-140、U3-1402处于研发阶段。
普遍认为，亚纳摩尔的细胞毒性是ADCs效应分子的核心要素，而化疗药的肿瘤抑制活性往往是不满足这一要求的。但以SN-38为毒素的IMMU-132，通过调节药物载药量巧妙弥补了SN-38活性的不足(IC50＝1.0-6.0nM)，从而体现出了显著且广泛的抗肿瘤效果。其针对晚期三阴性乳腺癌，客观缓解率达33.3％，并在非小细胞肺癌、尿路上皮癌等多个癌种上开展临床研究。
在SN-38-ADC的设计中，一般是从SN-38内酯环的羟基出发来设计ADC，以屏蔽羟基，增强内酯环在生理条件下的稳定性。传统的理论认为，SN-38的内酯环存在pH依赖的可逆平衡，其在较高的pH下将开环成低活性的羧酸盐形式。在IMMU-132的设计中，以酸敏感的碳酸酯键连接SN-38羟基构建连接子-毒素，这虽然增强了内酯环的稳定性，但这种酯键的设计策略往往在体内循环中不稳定，易致脱靶毒性风险。
在ADCs的设计中，依赖组织蛋白酶B(CTSB)裂解的二肽连接子在ADCs中已有广泛的应用，有超过一半的临床在研的ADCs使用这类连接子。目前这类连接子的应用局限于连接含有氨基的毒素，如MMAE、MMAF。已有将这类连接子应用于含酚羟基毒素的尝试，在已有的间隔子后面额外引入另一个连接毒素的间隔子，然而这样会影响毒素的释放速率，进而影响ADC整体的抗肿瘤活性。
发明内容
发明人将依赖组织蛋白酶B裂解的连接子与含酚羟基毒素SN-38得到式I所示化合物，该化合物与抗体偶联后获得的ADC具有优秀的稳定性和释药性，该ADC在血浆中能够保持稳定，并且在组织蛋白酶B的作用下能够快速释放SN-38。因此，本发明得以完成。
本发明的一个目的是提供一种稳定性好的ADC，本发明的另一个目的是提供一种能够在组织蛋白酶B的作用下能够快速释放SN-38的ADC。
本发明提供式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，
其中：
B为
Z为-(CH2)mO(CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)n-，-(CH2CH2O)m-(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-(CH2CH2O)n-C(O)-，-(OCH2CH2)m-，-(CH2)m-，-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-、-(CH2)k-C(O)-，
L为
每个m各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
每个n各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
p为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
q为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
h为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
k为1、2、3、4、5、6、7、8或9。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中每个m各自独立地为2或5。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中每个n各自独立地为2、3、4、5、6、7或，例如2、4、8。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中p为1、2、3、4、5或6，进一步优选为1、2、3、4或5，例如2。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中q为为2、3、4、5、6、7或8，例如2、4、8。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中h为为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7，例如5。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中i为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为2、3、4、5或6，例如4。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中j为2、3、4、5、6、7、8或9，进一步优选为4、5、6、7或8，例如8。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中k为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7，例如5。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中
B为
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中Z为-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-或-(CH2)k-C(O)-，其中p、q、h、i、j、k的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中L为
优选为
在某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中所述化合物选自：
本发明还提供所述式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物在制备抗体偶联药物中的用途。
本发明还提供式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中，
Z为-(CH2)mO(CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)n-，-(CH2CH2O)m-(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-(CH2CH2O)n-C(O)-，-(OCH2CH2)m-，-(CH2)m-，-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-、-(CH2)k-C(O)-，
L为
每个m各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
每个n各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
p为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
q为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
h为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
k为1、2、3、4、5、6、7、8或9；
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；
E为1至20之间的数。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中每个m各自独立地为2或5。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中每个n各自独立地为2、3、4、5、6、7或，例如2、4、8。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中p为1、2、3、4、5或6，进一步优选为1、2、3、4或5，例如2。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中q为为2、3、4、5、6、7或8，例如2、4、8。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中h为为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7，例如5。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中i为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为2、3、4、5或6，例如4。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中j为2、3、4、5、6、7、8或9，进一步优选为4、5、6、7或8，例如8。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中k为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7，例如5。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中Z为-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-或-(CH2)k-C(O)-，其中p、q、h、i、j、k的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中L为
优选为
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中A是以巯基为偶联位点的单克隆抗体，或以巯基为偶联位点的定点突变或修饰的单克隆抗体。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#上。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中A选自：抗HER2人源化单克隆抗体mil40、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)，帕妥珠单抗(PERJETA)，西妥昔单抗(ERBITUX)，帕尼单抗(VECTIBIX)，利妥昔单抗(RITUXAN)，阿仑单抗(CAMPATH)，替伊莫单抗(ZEVALIN)，托西莫单抗(BEXXAR)，奥法木单抗(ARZERRA)，贝伐单抗(AVASTIN)，伊匹单抗(YERVOY)，地诺单抗(XGEVA)，派姆单抗(KEYTRUDA)，纳武单抗(Opdivo)，Avelumab(Bavencio)，Atezolizumab(Tecentriq)，durvalumab(Imfinzi)，sacituzumab，rovalpituzumab，及其生物类似物，优选地，A为抗HER2人源化单克隆抗体mil40。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中E为1至20之间的数，优选地E为2至18之间的数或6至12之间的数，更优选地E为6至9之间的数，例如E约为7或8。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中所述化合物选自：
其中A、E的定义如本发明所述。
在某些实施方案中，本发明所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中所述化合物选自：
其中，E的定义如本发明所述，
本发明还提供制备所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物的方法，包括：
1)使式I-a所示化合物与SN-38反应，得到式I-b所示化合物；
2)使式I-b所示化合物脱去Boc保护基，得到式I-c所示化合物；
3)使式I-c所示化合物与式i所示化合物反应，得到式I所示化合物，
其中B、Z、L的定义如本发明所述。
本发明还提供制备所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物的方法，包括：
使式I所示化合物与A反应，得到式IV所示的化合物，
优选地，所述反应在pH＝5～10，温度为0～40℃条件下进行；
其中Z、L、A的定义如本发明所述，B为
本发明还提供一种药物组合物，其包含至少一种所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
在某些实施方案中，本发明所述的药物组合物中，所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物以治疗的有效量存在。
本发明还提供所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物在制备用于诊断和/或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自肿瘤、感染性疾病、血液学疾病、代谢性疾病、炎症。
在某些实施方案中，所述肿瘤选自癌症、淋巴瘤、淋巴样肿瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。
在某些实施方案中，所述癌症选自：乳腺癌(例如，HER2阳性的乳腺癌)；鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌；腹膜癌；肝癌；胃癌；胃肠癌；膜腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；尿道癌；肝细胞瘤；肠癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；肛门癌；阴茎癌；黑色素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤；脑癌；胆囊癌；食管癌；胆管癌；头颈癌和相关转移瘤。
定义
如本文所用，术语“抗体”是一种常见的免疫性球蛋白，是免疫系统用来识别并中和外来物(如细菌和病毒)的Y形蛋白。抗体可以特异性识别外来靶标的独特部分(称为抗原)，是由于Y形蛋白抗体的的每个尖端含有可对抗原特异性识别的位点，抗体对特异性抗原结合后，可以介导多种相关的生物效应。抗体由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，各链间通过半肮氨酸残基中的巯基形成二硫键相连接。“单克隆抗体”是单一特异性抗体，其所有抗体分子均由均作为唯一亲代细胞的克隆的相同免疫细胞组成，因此所有抗体分子是相同的。
如本文所用，术语“细胞毒素”是指那些在癌细胞中释放后可对该细胞产生毒性的分子。在本发明中特别关注的毒素包括甲基奥里斯他汀E(MMAE)，奥里斯他汀、美登木素或其衍生物(例如类美登木素、DM1、DM3、DM4)、卡里奇霉素、倍癌霉素、多柔比星、喜树碱或PBD类细胞毒素及其衍生物。
如本文所用，术语“连接子”是具有两个反应活性末端的分子，其一个末端可与抗体相偶联，另一个末端用于与活性化合物，例如细胞毒素相偶联。连接子的抗体偶联性末端通常为能够通过抗体上的半胱氨酸的巯基或赖氨酸胺基相偶联的位点，连接子的毒素的偶联性末端通常为能够通过毒素分子中的上的巯基、氨基、羧基或羟基等活性位点，当术语连接子用于描述偶联形式的连接子时，由于连接子已与抗体和细胞毒素中的一个或两个相反应形成共价键，因此，其可能将不再包括一个或两个反应性末端反应位点(如巯基反应性基团的离去基团、胺基反应性基团的离去基团)。
如本文所用，术语“抗体偶联药物”或“ADC”是各自通过连接子偶联多分子(1-20，例如1-8个)的细胞毒素于抗体分子上形成的产物。缀合于一个或多个细胞毒素的抗体。抗体通常为对癌症的特异抗原具有选择性的单克隆抗体。
如本文所用，术语“约”可理解为在所述值的+/-20％、+/-18％、+/-15％、+/-12％、+/-10％、+/-9％、+/-8％、+/-7％、+/-6％、+/-5％、+/-4％、+/-3％、+/-2％、+/-1％、+/-0.5％、+/-0.4％、+/-0.3％、+/-0.2％、+/-0.1％以内。除非另外根据上下文显而易见，否则本文提供的所有数值都由术语“约”修饰。
本发明所述的抗体偶联药物所关注的肿瘤疾病类型包括但不限于癌症、乳腺癌、淋巴瘤、淋巴样肿瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。这样的癌症的更具体的实例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌；腹膜癌；肝癌；胃癌或胃癌，包括胃肠癌；膜腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；尿道癌；肝细胞瘤；乳腺癌，包括例如HER2阳性乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜或子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；肛门癌；阴茎癌；黑色素瘤；骨髓瘤和B细胞淋巴瘤；脑癌；头颈癌和相关转移瘤。
术语“盐”或“药学上可接受的盐”指保留某化合物的生物有效性和性质的盐，它们用于药物中在生物学或其它方面不是不符合需要的。在许多情况下，本文所公开的化合物能够借助氨基和/或竣基或类似基团的存在形成酸和/或碱盐。药学上可接受的酸加成盐可由无机酸和有机酸组成。可以衍生形成盐的无机酸包括，例如，盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。可以衍生形成盐的有机酸包括，例如，醋酸、丙酸、羟基乙酸、丙酮酸、草酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、反丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。药学上可接受的碱加成盐可由无机碱和有机碱组成。可以衍生形成盐的无机碱包括，比如，钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、猛、铝等；特别优选的是铵，钾，钠，钙和镁盐。可以衍生形成盐的有机碱包括，例如，伯，仲和叔胺，取代的胺，包括天然存在的取代胺，环胺，碱性离子交换树脂等，具体地例如异丙胺，三甲胺，二乙胺，三乙胺，三丙胺和乙醇胺。许多这类盐是本领域已知的，如W087/05297，Johnston等人描述的，出版于1987年9月11日(通过引用将其整体并入本文)。
缩写/缩略语
ADC(antibody-drug conjugate)：抗体偶联药物；
DAR(Drug to antibody ratio)：药物/抗体摩尔比；
DCM(Dichloromethane)：二氯甲烷；
DIPEA(N,N-Diisopropylethylamine)：二异丙基乙胺；
DMAC(Dimethylacetamide)：N,N-二甲基乙酰胺；
DMF(N,N-Dimethylformamide)：N,N-二甲基甲酰胺；
DMSO(Dimethyl Sulphoxide)：二甲基亚砜；
EA(Ethyl acetate)：乙酸乙酯；
EDCI(1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide Hydrochloride)：1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；
HOBt(1-Hydroxybenzotriazole)：1-羟基苯并三唑；
HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)：人表皮生长因子受体2；
MAB(Monoclonal Antibody)：单克隆抗体
MMAE(Monomethyl auristatin E)：单甲基奥里斯他汀E；
NAC(N-Acetyl-L-cysteine)：N-乙酰半胱氨酸；
TCEP(Tris(2-carboxyethyl)phosphine)：三(2-羧乙基)膦；
THF(Tetrahydrofuran)：四氢呋喃；
Tris(Tris(hydroxymethyl)aminomethane)：三羟甲基氨基甲烷；
PAB(4-Aminobenzyl alcohol)：对氨基苯甲醇；
Boc(Tert-Butoxycarbonyl)：叔丁基氧羰基。
本文中使用的化合物名称与化学结构式不一致时，以化学结构式为准。
如本文所述的药物组合物包含本发明式Ⅳ所示化合物，或其盐、溶剂化物，与常规药用载体或赋形剂。该药物组合物可通过例如口服或非肠道，例如静脉注射、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射，等途径给药。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现所需治疗效果的量，例如，实现减轻与待治疗疾病相关的症状的量。
另外需要指出，本发明化合物使用剂量和使用方法取决于诸多因素，包括患者的年龄、体重、性别、自然健康状况、营养状况、化合物的活性强度、服用时间、代谢速率、病症的严重程度以及诊治医师的主观判断。优选的使用剂量介于0.01－100mg/kg体重/天。
某些实施方案中，本发明所述的式I所示化合物(即连接子-SN-38)的合成路线如下：
其中的反应试剂和反应条件如下：
(a)phosphorus tribromide,dimethylformamide,dichloromethane,3h,0℃；(b)SN-38,cesium carbonate,dimethylformamide,10h；(c)trifluoracetic acid,dichloromethane,15min；(d)the specific maleimides were all listed inExperimental Section,DIPEA,dimethylformamide,overnight；(e)Fmoc-Lys(PEG8)-NHSester,DIPEA,dimethylformamide,10h；(f)piperidine,dichloromethane,2h；(g)6-Maleimidohexanoic acid N-hydroxysuccinimide ester,DIPEA,dimethylformamide,overnight.
某些实施方案中，本发明所述的ADC的合成路线如下：
其中的反应试剂和反应条件如下：
(h)MAB,TCEP,NAC,H2O,rt。
本发明的有益技术效果
本发明从SN-38酚羟基出发，与依赖组织蛋白酶B裂解的连接子直接连接，二者以醚键连接，设计得到更稳定的ADCs。该ADCs被内吞进入胞内后，在溶酶体内组织蛋白酶B的作用下裂解连接子，电子转移至醚键后释放细胞毒素。理论上，溶酶体的酸性环境可使SN-38的内酯环由开环转变为闭环状态，从而保持其强的杀伤肿瘤细胞活性。
本发明提供的式II或II’所示的ADC具有优秀的稳定性和释药性。该ADC在血浆中能够保持稳定。该ADC在组织蛋白酶B的作用下能够快速释放SN-38。
附图说明
图1为化合物I-7在CTSB作用下光谱的变化曲线，其中左图为在3UN/mL CTSB作用下，化合物I-7在550nM波长处荧光强度随时间逐渐增强(向下箭头代表该波长处荧光强度随时间逐渐减弱，向上箭头代表该波长处荧光强度随时间逐渐增强)，右图为在不同CTSB浓度(3UN/mL、1UN/mL、0.3UN/mL)下，化合物I-7释放SN-38的酶动力曲线，结果显示荧光强度随时间变化的速率很大程度上取决于CTSB浓度。
图2为式II-6所示ADC在人血浆中的稳定性实验结果；
图3为式II-1、II-3、II-4、II-5、II-6所示ADCs体外细胞毒实验结果；
图4为式II-6所示ADC在异种移植动物模型上的体内药效实验结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：连接子-SN-38的制备
其中，Y＝0代表Y不存在。
(1)化合物I-1b的制备
在磁力搅拌下，于100mL茄形瓶中加入化合物I-1a(1g,2.5mmol)和干燥DMF(20mL)得淡黄色澄清溶液。冰水浴下缓慢滴加三溴化磷(240uL，2.54mmol)的二氯甲烷(3mL)溶液，边滴加边缓慢搅拌，至溶液颜色逐渐变成深黄，封口反应3小时，用TLC监测反应终点。反应结束后，将反应液倒入100mL冰水中，经300mL DCM(100mL*3)萃取，收集有机层，无水硫酸钠脱水过夜，浓缩有机相，得到黄色固体粗品化合物I-1b，约815mg。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.06(s,1H),8.03(d,J＝9.2Hz,2H),7.60(d,J＝8.6Hz,2H),7.55(d,J＝2.6Hz,1H),7.51(dd,J＝9.2,2.7Hz,1H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H),7.23(s,1H),6.70(d,J＝8.6Hz,1H),6.48(s,1H),5.39(s,2H),5.25(s,4H),4.42-4.37(m,1H),3.83-3.77(m,1H),3.13(s,2H),1.91(dd,J＝13.5,6.5Hz,1H),1.86–1.78(m,2H),1.34(s,9H),1.27(d,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.6Hz,3H),0.84(t,J＝7.2Hz,6H),0.78(d,J＝6.7Hz,3H).ESI m/z calculated forC42H49N5O9[M+H]+768.35,found 768.31.
(2)化合物I-1c的制备
在磁力搅拌下，于100mL茄形瓶中加入化合物I-1b(800mg，1.75mmol)和SN-38(689mg,1.75mmol)以及干燥DMF(25mL)，得淡黄色溶液。室温下加入碳酸铯(573mg，1.75mmol)，边加边搅拌，溶液颜色变为黄色，继续室温搅拌10小时，采用TLC法监测到反应结束。将反应用茄形瓶置于4℃环境下冷藏1小时，使反应中使用的碳酸铯析出。过滤除去不溶性固体物质，液体直接使用旋转蒸发仪旋干反应液，并加入硅胶拌样。使用硅胶色谱柱分离纯化，其中洗脱液为二氯甲烷与甲醇混合液，比例逐步由100:1上升至40:1，得到淡黄色固体形式的化合物I-1c。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.06(s,1H),8.03(d,J＝9.2Hz,2H),7.60(d,J＝8.6Hz,2H),7.55(d,J＝2.6Hz,1H),7.51(dd,J＝9.2,2.7Hz,1H),7.46(d,J＝8.6Hz,2H),7.23(s,1H),6.70(d,J＝8.6Hz,1H),6.48(s,1H),5.39(s,2H),5.25(s,4H),4.42-4.37(m,1H),3.83-3.77(m,1H),3.13(s,2H),1.91(dd,J＝13.5,6.5Hz,1H),1.86–1.78(m,2H),1.34(s,9H),1.27(d,J＝7.1Hz,3H),1.23(t,J＝7.6Hz,3H),0.84(t,J＝7.2Hz,6H),0.78(d,J＝6.7Hz,3H).ESI m/z calculated for C42H49N5O9[M+H]+768.35,found 768.31.
(3)化合物I-1d的制备
在磁力搅拌下，于50mL茄形瓶中加入化合物I-1c(862mg，1.12mmol)和浓度为20％的TFA的DCM溶液，得到明黄色溶液。室温下搅拌15min，TLC监测反应完成。将反应液在真空中浓缩，加入硅胶拌样，使用硅胶色谱柱分离纯化，其中洗脱液为为二氯甲烷与甲醇混合液，二氯甲烷：甲醇＝50:1，得淡黄色固体形式的化合物I-1d。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.24(s,1H),8.75(d,J＝7.0Hz,1H),8.08(d,J＝9.2Hz,2H),7.64(d,J＝8.7Hz,2H),7.59(d,J＝2.6Hz,1H),7.55(dd,J＝9.2,2.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.7Hz,2H),7.27(s,1H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.30(s,4H),4.54-4.49(m,1H),3.63(d,J＝5.8Hz,1H),3.10(q,J＝7.3Hz,1H),2.08(dd,J＝13.4,6.7Hz,1H),1.91-1.81(m,2H),1.36(d,J＝7.1Hz,3H),1.27(t,J＝7.6Hz,3H),1.18(t,J＝7.3Hz,2H),0.95(dd,J＝6.9,3.1Hz,6H),0.88(t,J＝7.3Hz,3H).ESI m/z calculated for C37H41N5O7[M+H]+668.30,found 668.25.
(4)化合物I-1的制备
在氮气保护下，于50mL茄形瓶中加入化合物I-1d(100mg，0.15mmol)和干燥DMF(15mL)，得到淡黄色溶液。在室温搅拌下加入6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(55.38mg,0.18mmol)后，边搅拌边滴加DIPEA(26uL,0.165mmol)。滴加完毕后室温搅拌过夜，TLC监测到反应完成。将反应液在真空下旋干，加入硅胶拌样，过硅胶色谱柱分离纯化，其中洗脱液为二氯甲烷与甲醇混合液，二氯甲烷与甲醇的比例由100：1逐步上升至40:1，得到淡黄色固体形式的化合物I-1。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.01(s,1H),8.20(d,J＝6.9Hz,1H),8.08(d,J＝9.2Hz,1H),7.85(d,J＝8.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.60(d,J＝2.6Hz,1H),7.57-7.53(m,1H),7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(s,1H),7.01(d,J＝2.0Hz,2H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.29(s,4H),4.41-4.36(m,1H),4.16(d,J＝8.6Hz,1H),3.62(dd,J＝6.6,2.7Hz,4H),3.17-3.11(m,6H),2.14(dt,J＝21.9,7.3Hz,2H),1.96(dd,J＝13.6,6.6Hz,1H),1.93-1.77(m,2H),1.50-1.44(m,3H),1.23(s,3H),0.92-0.84(m,6H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H).ESI m/z calculated for C47H52N6O10[M+H]+861.37,found 861.30.
(5)化合物I-2、I-3、I-4、I-5的制备
采用与化合物I-1类似的制备方法制备化合物I-2、I-3、I-4、I-5。
I-2：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.02(s,1H),8.22(d,J＝6.9Hz,2H),8.08(d,J＝9.1Hz,1H),7.86(d,J＝8.8Hz,1H),7.66(d,J＝8.6Hz,2H),7.60(d,J＝2.3Hz,1H),7.55(dd,J＝9.2,2.6Hz,1H),7.50(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(s,1H),6.53(s,1H),6.25(q,J＝11.8Hz,2H),5.43(s,2H),5.29(s,4H),4.40(dd,J＝12.6,5.7Hz,1H),4.22-4.15(m,1H),3.63(s,2H),3.18(dd,J＝15.2,7.5Hz,2H),3.06(dd,J＝12.8,6.5Hz,2H),2.17(dq,J＝14.1,6.6Hz,2H),1.97(dd,J＝14.0,7.2Hz,1H),1.92-1.80(m,2H),1.33(d,J＝7.5Hz,2H),1.29(d,J＝5.1Hz,3H),1.27(d,J＝2.7Hz,3H),1.25(d,J＝3.6Hz,3H),1.23(s,2H),0.92-0.85(m,6H),0.84(d,J＝6.8Hz,3H).ESI-MS caculated for C48H56N6O11[M+H]+892.40,found 893.39.
I-3:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.01(s,1H),8.23(d,J＝7.1Hz,1H),8.06(dd,J＝14.3,7.3Hz,2H),7.92(d,J＝8.6Hz,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.59(d,J＝2.5Hz,1H),7.55(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),7.50(d,J＝8.6Hz,2H),7.26(s,1H),7.00(s,2H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.29(s,4H),4.42-4.37(m,1H),4.25-4.19(m,1H),3.62-3.56(m,4H),3.47(s,2H),3.34(s,2H),3.14(d,J＝3.4Hz,2H),2.47-2.38(m,2H),2.33(t,J＝7.3Hz,2H),1.98-1.93(m,1H),1.90-1.82(m,2H),1.31(d,J＝7.1Hz,2H),1.29-1.26(m,6H),1.25(d,J＝1.4Hz,2H),0.90-0.85(m,6H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H).ESI m/z calculated forC51H59N7O13[M+H]+978.42,found 978.42.
I-4:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.22(d,J＝7.1Hz,1H),8.08(d,J＝9.2Hz,1H),8.04(t,J＝5.6Hz,1H),7.91(d,J＝8.5Hz,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.60(d,J＝2.5Hz,1H),7.55(dd,J＝9.1,2.5Hz,1H),7.50(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(s,1H),7.00(s,2H),6.52(s,1H),5.43(s,2H),5.29(s,4H),4.42-4.37(m,1H),4.24-4.19(m,1H),3.62-3.56(m,4H),3.48(d,J＝5.4Hz,10H),3.18(d,J＝9.4Hz,2H),3.14(d,J＝5.7Hz,2H),2.47-2.38(m,2H),2.35-2.30(m,2H),1.96(dd,J＝13.6,6.8Hz,1H),1.91-1.82(m,2H),1.31(d,J＝7.1Hz,2H),1.28-1.24(m,6H),1.23(d,J＝1.7Hz,2H),0.91-0.85(m,6H),0.83(d,J＝6.8Hz,3H).ESI m/z calculated for C55H67N7O15[M+H]+1066.47,found 1066.50.
I-5:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.22(d,J＝7.1Hz,1H),8.08(d,J＝9.2Hz,1H),8.04(t,J＝5.3Hz,1H),7.91(d,J＝8.8Hz,1H),7.65(d,J＝8.6Hz,2H),7.60(d,J＝2.6Hz,1H),7.55(dd,J＝9.2,2.6Hz,1H),7.50(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(s,1H),7.01(d,J＝2.6Hz,2H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.30(s,4H),4.43-4.36(m,1H),4.24-4.18(m,1H),3.61-3.56(m,4H),3.50(t,J＝3.5Hz,24H),3.35(s,4H),3.21-3.12(m,4H),2.44-2.35(m,2H),2.34-2.30(m,2H),1.96(dd,J＝13.5,6.7Hz,1H),1.90-1.80(m,2H),1.29(dt,J＝27.5,8.8Hz,8H),0.91-0.78(m,9H).ESI m/z calculated for C63H83N7O19[M+H]+1242.57,found 1242.55.
(6)化合物I-1e的制备
将Fmoc-赖氨酸(PEG8)N-羟基琥珀酰亚胺酯(900mg，1.04mmol)和化合物I-1d(693.68mg，1.04mmol)加入到50mL茄形瓶中，向其中加入无水DMF(20mL)，滴加DIPEA(147.86mg，1.144mmol)，室温搅拌10小时。TLC监测反应进程，反应结束后在真空下旋干反应液，直接加入硅胶拌样，使用闪柱分离纯化，其中洗脱液为二氯甲烷甲醇混合，其中甲醇占比逐步由2％上升至7％。最终得淡黄色固体形式化合物I-1e。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.06(s,1H),8.24(d,J＝6.2Hz,1H),8.08(d,J＝9.2Hz,1H),7.88(d,J＝7.3Hz,2H),7.83(t,J＝5.8Hz,1H),7.72(t,J＝6.7Hz,3H),7.64(d,J＝8.5Hz,2H),7.60(d,J＝2.6Hz,1H),7.55(dd,J＝9.0,2.8Hz,2H),7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),7.27(s,1H),6.53(s,1H),5.43(s,2H),5.29(s,4H),4.42-4.35(m,1H),4.34-4.25(m,2H),4.24-4.18(m,2H),4.03(td,J＝9.3,5.2Hz,1H),3.57(t,J＝6.5Hz,2H),3.54-3.43(m,23H),3.41(dd,J＝5.8,3.3Hz,2H),3.35(s,2H),3.22(s,2H),3.18(d,J＝7.4Hz,2H),3.01(dt,J＝13.8,6.8Hz,2H),2.29(t,J＝6.5Hz,2H),1.98(dd,J＝13.1,7.0Hz,1H),1.91-1.82(m,2H),1.57(dd,J＝44.9,8.7Hz,3H),1.37(dd,J＝18.6,4.9Hz,3H),1.33-1.26(m,6H),1.24(d,J＝9.6Hz,3H),0.88(t,J＝7.1Hz,6H),0.83(d,J＝6.6Hz,3H).ESI m/zcalculated for C76H97N7O19[M+H]+1412.68,found 1412.69.
(7)I-1f的制备
脱去化合物I-1e的Fmoc保护制备得到化合物I-1f。将化合物I-1e(900mg，0.63mmol)加入至50mL茄形瓶中，在磁力搅拌下，滴加浓度为5％的哌啶的二氯甲烷溶液，室温搅拌2小时，在真空下直接旋干反应液，加硅胶拌样，使用闪柱进行分离纯化。洗脱液为二氯甲烷甲醇混合液，其中甲醇占比逐步由2％上升至5％。ESI m/z calculated forC61H87N7O17[M+H]+1190.62,found 1190.64.
(8)化合物I-6的制备
将化合物I-1f(100mg,0.08mmol)和6-马来酰亚胺己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(24.64mg，0.08mmol)加入至50mL的茄形瓶中，加入无水DMF(20mL)，室温下搅拌过夜。次日TLC监测反应完全，真空下旋干反应液，直接加入硅胶拌样，使用闪柱进行分离纯化，其中洗脱液为二氯甲烷甲醇混合液，其中甲醇占比逐步由2％上升至7％，最终得淡黄色固体形式化合物I-6。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.03(s,1H),8.19(d,J＝7.1Hz,1H),8.08(d,J＝9.2Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.80(t,J＝5.6Hz,1H),7.70-7.62(m,3H),7.60(d,J＝2.6Hz,1H),7.56(dd,J＝9.2,2.5Hz,1H),7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(s,1H),7.00(s,2H),6.52(s,1H),5.43(s,2H),5.30(d,J＝3.0Hz,4H),4.41-4.35(m,1H),4.24(dd,J＝10.9,5.9Hz,1H),4.21-4.16(m,1H),3.57(t,J＝6.5Hz,2H),3.48(d,J＝13.3Hz,22H),3.42(dd,J＝5.8,3.3Hz,2H),3.39-3.33(m,4H),3.23(s,2H),3.00(dd,J＝15.3,7.0Hz,2H),2.28(t,J＝6.6Hz,2H),2.15-2.04(m,2H),2.01-1.95(m,1H),1.92-1.80(m,2H),1.61(s,2H),1.47(dd,J＝13.3,6.6Hz,4H),1.40-1.32(m,4H),1.29(dd,J＝13.5,7.2Hz,6H),1.23(s,4H),1.19(d,J＝7.0Hz,3H),0.93-0.84(m,6H),0.82(d,J＝6.7Hz,3H).ESI m/z calculatedfor C71H98N8O20[M+Na]+1405.69,found 1405.62.
(9)化合物I-7的制备
采用与化合物I-6类似的制备方法制备化合物I-7。
I-7:1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.05(s,1H),8.21(d,J＝4.4Hz,2H),8.08(d,J＝9.2Hz,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.81(t,J＝5.9Hz,1H),7.71-7.62(m,3H),7.60(d,J＝2.3Hz,1H),7.56(dd,J＝9.1,2.6Hz,1H),7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.27(s,1H),6.52(s,1H),6.26(q,J＝11.8Hz,2H),5.43(s,2H),5.30(d,J＝4.2Hz,4H),4.39(s,1H),4.21-4.17(m,1H),3.62(s,2H),3.57(t,J＝6.5Hz,2H),3.51-3.48(m,14H),3.46(dd,J＝3.3,1.7Hz,2H),3.42(dd,J＝5.9,3.2Hz,2H),3.23(s,2H),3.19-3.11(m,2H),3.09-3.02(m,2H),2.99(d,J＝7.5Hz,2H),2.59(s,1H),2.28(t,J＝6.5Hz,2H),2.11(d,J＝7.8Hz,2H),1.93-1.80(m,2H),1.48(d,J＝7.4Hz,2H),1.45-1.36(m,4H),1.34(s,2H),1.32-1.22(m,23H),0.90-0.79(m,9H).ESI-MS m/z calculated for C72H102N8O21[M+H]+1414.72,found 1415.69.
实施例2：含连接子-SN-38的抗体偶联药物(ADC)的制备
其中，Y＝0代表Y不存在。
本实施例将实施例1制备的含连接子-SN-38偶联物偶联于抗HER2人源化单克隆抗体
上。
(1)常用缓冲盐溶液的配制：
缓冲盐溶液-1(buffer-1)：取3.11g的L-组氨酸，溶于1L二次蒸馏水中，全部溶解后，采用医用冰醋酸调其pH＝5.50左右(±0.05)；经0.22μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期存储，待用。
缓冲盐溶液-2(buffer-2)：称取TRIS·base 6.06g、EDTA·2Na 0.93g溶解后，定容到100mL，得到TRIS·base溶液；另称取TRIS·HCl 7.88g、EDTA·2Na 0.93g溶解后，同样也定容到100mL，得到TRIS·HCl溶液；向TRIS·base溶液中加入TRIS·HCl溶液，使其pH＝8.50(±0.05)；经0.22μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期存储，待用。
缓冲盐溶液-3(buffer-3)：采用移液枪量取医用冰醋酸1.715mL，溶解于200mL二次蒸馏水中，充分混匀后，经0.22μm的滤膜过滤除菌后，装瓶并置于4℃下短期存储，待用。
(2)抗体偶联反应
①药用抗体的置换：偶联所采用的抗HER2人源化单克隆抗体mil40(购买于浙江海正药业股份有限公司)，其为赫赛汀的生物仿制药，其初始的制剂溶液中包含盐酸组氨酸(一水)0.616mg/ml、L-组氨酸0.364mg/ml、海藻糖22.727mg/ml、吐温-20 100mg/ml等药用辅料，为去除辅料干扰，首先将抗体原液置于室温缓慢融化，并经G25葡聚糖凝胶柱，将其置换到buffer-1中。置换完成后，通过超滤离心进行浓缩(使抗体终浓度＞5mg/mL)，并通过紫外分光光度计对其浓度进行测定。
②偶联反应液的准备：根据所需偶联抗体的量(1eq)，采用移液枪精确移取抗体的buffer-1溶液，并补加一定量的buffer-1，使得抗体浓度约为10mg/mL。采用buffer-2调其pH＝6～8左右，并用移液枪将其转移至洁净的反应小瓶中。
③抗体的还原：缓慢搅拌小瓶中的反应液(100rpm)，并加入2～10eq的1.0mg/mL的TCEP·HCl溶液，加完后，室温下徐徐搅拌，反应60～180min。
④抗体的偶联：计算需要加入有机溶剂(DMAC或DMSO)的体积，使其占总体积的5％～15％；同时计算需要加入的ADC小分子荷载(实施例1制备的连接子-SN-38)的质量，通常小分子荷载需要稍微过量(通常为8eq)，进而计算出所需加入的小分子荷载的有机溶剂的浓度。精确配制ADC小分子荷载的溶液后，缓慢滴加到已经还原的抗体反应液中。室温下继续缓慢搅拌，根据具体偶联情况反应0.5～24h。
⑤反应的终止：反应液达到预定的偶联时间后，加入过量的包含还原性巯基的水溶性小分子N-乙酰基半胱氨酸溶液(1.0mg/mL)，缓慢搅拌继续反应30min。
⑥产物初步纯化：待偶联的终止反应结束后，加入buffer-3回调反应液的pH约为5.50；所得的反应液经过滤后，采用G25葡聚糖凝胶柱进行初步纯化，收集前段(约为80％)的组分流出液，再次经超滤浓缩后，无菌过滤并进行样品分装；除预留的用于产品分析的部分样品置于4℃下短期存储外，其它产品置于-80℃下存储待用。
本实施例所制备的ADC结构如下所示，其中E为DAR，其为3-8之间的数，
代表抗HER2人源化单克隆抗体mil40。
经检测，II-1的DAR为约4.2，II-2的DAR为约3.3，II-3的DAR为约3.6，II-4的DAR为约4.0，II-5的DAR为约3.7，II-7的DAR为约4.0，本实施例制备了两批具有不同DAR值的II-6样品，DAR分别为约3.8和约7.1。DAR值的测定可参考文献(J.Ouyang,in Antibody-DrugConjugates,Vol.1045(Ed.:L.Ducry),2013,pp.275-283.)中描述的方法进行。
实验例1化合物I-7的释放SN-38的机制验证
本实施例评估了实施例1制备的化合物I-7在CTSB作用下释放SN-38的过程。
用含10％DMSO的组织蛋白酶B(CTSB)活性缓冲液(50mM乙酸钠，100mM NaCl，8mML-半胱氨酸，1mM EDTA，pH＝5.0)溶解化合物I-7至终浓度为5μM/L。进行试验前化合物I-7先经NAC处理得到相应的NAC-I-7。NAC-I-7的制备方法参考文献(Y.Wang,S.Fan,W.Zhong,X.Zhou,S.Li,Int.J.Mo.l Sci.2017,18,e1860.)中的描述进行。向NAC-I-7的溶液中加入不同浓度的组织蛋白酶B(CTSB，购自Sigma)，37℃孵育4h后，使用EnSpire PerkinElmer酶标仪测量NAC-I-7溶液的荧光发射光谱(波长范围：400nm-720nm)。同时测定NAC-I-7在550nm的荧光值，用Graphprism拟合酶解曲线，如图1所示。
结果显示，与3UN CTSB孵育后NAC-I-7溶液的荧光光谱与文献报道的SN-38荧光光谱(Shin,W.S.,Han,J.,Kumar,R.,Sci Rep.2016Jul 4；6:29018.)完全一致，说明其水解释放SN-38。且在孵育3h和4h后，NAC-I-7在550nm处的荧光强度未增强，说明NAC-I-7在孵育3h后已达到释放SN-38的峰值，显示NAC-I-7释放SN-38的速率快。荧光强度随时间变化的速率很大程度上取决于CTSB浓度。
采用相同的方法评估了化合物I-1、I-2、I-3、I-4、I-5和I-6释放SN-38的过程，结果显示它们释放SN-38的行为与化合物I-7基本相同。
实验例2式II-6所示ADC在人血浆中的稳定性研究
本实施例评估了实施例2制备的ADC II-6在50％人血浆中的稳定性。
试验过程如下所述：
1)准备待测样品
a)将实施例2制备的ADC II-6稀释到50％的人血浆中，终浓度为200nM；b)将待测样品放置在37℃恒温箱中孵育；c)在设置的时间点(0，12h,1D,2D,3D,4D,5D,6D,7D,10D)取待测样品，将该时间点的样品放置于-80℃保存，待取完最后时间点样品，集中监测。
2)以10-羟基喜树碱为内标，将SN-38和10-羟基喜树碱溶于50％的人血浆中，绘制标准曲线。
LC-MS检测不同时间点待测样品中游离的SN-38浓度和式II-6所示ADC的浓度，结果如图2所示。
结果显示，式II-6所示的ADC在人血浆中孵育10天后，仅有0.16％的式II-6所示的ADC释放SN-38(～2.33nM)到人血浆中，该结果表明II-6所示的ADC在血浆中是高度稳定的。
实验例3式II-1、II-3、II-4、II-5和II-6所示ADC的体外细胞毒性研究
本实施例评估了实施例2制备的ADC II-1、II-3、II-4、II-5和II-6的体外细胞毒性。具体地，评估了式II-1、II-3、II-4、II-5和II-6所示ADC、毒素SN-38、裸抗Mil40的体外细胞毒性。测试的细胞系包括赫赛汀耐药株SKOV-3、BT474-HDR，HER2抗原弱阴性的细胞系MCF-7，MDA-MB-231(上述细胞系均购自ATCC)。
试验过程中所用的试剂、仪器和消耗品如下表所述：
试验过程如下所述：
1)细胞解冻
a)在37℃的水浴中轻轻晃动小瓶进行解冻；b)内容物全部解冻后，从水浴中取出小瓶，通过浸入或用70％乙醇喷洒进行净化消毒；c)将小瓶内容物转移到含有9mL完全培养基(细胞系BT474-HDR、MCF-7使用DMEM培养基，细胞系MDA-MB-231使用RPMI1640培养基，细胞系SK-OV-3使用Mccoy’s 5A培养基；下文所述的培养基与此处相同)的离心管中，并以约200×g转速离心5分钟；d)用培养基重悬细胞沉淀并分配到75cm2培养瓶中；e)将培养物在37℃，5％CO2培养箱中进行培养。
2)展开细胞
a)细胞在含有10％FBS(热灭活)和1％青霉素/链霉素溶液(Penicillin-Streptomycin)的培养基中以1:4的比例每周传代三次；b)对于传代细胞，首先用0.05％的胰蛋白酶/EDTA溶液(3mL)冲洗贴壁细胞，然后加入胰蛋白酶/EDTA(3mL)并涡旋以均匀涂覆细胞。培养物在37℃下培养直到细胞分离(在显微镜下验证细胞已分离)。加入等体积的细胞培养基灭活胰蛋白酶，收集分离的细胞，并采用200×g离心细胞5分钟，之后重新悬于新鲜培养基中。
3)准备受试药
a)以1：3比例串联稀释受试药以产生10点稀释(受试药母液为浓度约为2mg/mL的L-His缓冲盐溶液(将3.11g的L-His溶解于1L的去离子水中，用冰醋酸将溶液的pH值调节至5.5,用0.45μm的无菌水系滤膜过滤，得到L-His缓冲盐溶液)，采用PBS缓冲液进行稀释，细胞系MCF-7和细胞系MDA-MB-231测试点初始最大浓度约为500μg/mL，细胞系SK-OV-3和细胞系BT474-HDR测试点初始最大浓度约为100μg/mL)；b)溶媒对照组(vehicle sample)和空白对照组(well without compounds treatment)加入等体积PBS缓冲液。
4)细胞播种
a)收获细胞并计数细胞数量；b)将具有调整密度的细胞悬液加入到上述含有受试药的384孔板中，空白对照组加入具有调整密度的细胞悬液，溶媒对照组中加入等体积细胞培养基；c)盖上盖子，置于37℃，5％CO2和0.1％CO2培养箱中孵育96小时。
5)读板
a)96小时后，从培养箱中取出平板并在室温下平衡10分钟；b)CellTiter Glo试剂在实验前在37℃孵育；c)将40μL的CellTiter-Glo试剂加入待检测的每个孔中；d)然后将板放置在室温下30分钟，然后在EnSpire阅读器上阅读，进行细胞计数。
6)实验结果
测试结果如图3所示。结果显示，E值在3.6～4.2的ADCs(例如式II-1、II-3、II-4、II-5、II-6所示ADC)对Her2阳性的细胞SKOV-3和BT474 HerDR均表现出弱(weakly)的抑制活性，对Her2阴性细胞MDA-MB-231、MCF-7无抑制活性。Mil40在Her2阳性和Her2阴性细胞系上均无表现抑制活性，SN-38在Her2阳性和Her2阴性细胞系上均表现抑制活性，将SN-38偶联至抗体Mil40后，得到的E值在3.6～4.2的ADCs抑制Her2阳性和Her2阴性细胞系的活性均明显下降。将式II-6所示ADC的E＝3.8提升至7.1，式II-6所示ADC在SKOV-3和BT474 HerDR表现与SN-38相当的抗肿瘤活性。
实验例4式II-6所示ADC的体内药效研究
本实施例评估了本发明的II-6所示ADC在异种移植动物模型上的体内药效。
受试动物为4～6周龄的雌性BALB/c裸鼠(购买于南大模式动物所)，平均体重为16～20g，每组7～8只动物。将SK-OV-3细胞(购自ATCC)接种于实验动物的右侧胁肋部皮下，待肿瘤生长至80-120mm3左右时进行分组给药。给药时间点设置为第0天，第4天，第7天，第10天，共给药4次。裸抗体Mil40给药剂量为10mg/kg，20mg/kg，式II-6所示ADC(E＝7.1)给药剂量为5mg/kg，10mg/kg和20mg/kg，联合给药给药剂量为20mg/kg Mil40和0.66mg/kg伊立替康，此外设置溶媒(缓冲溶液-1)对照组。给药后每周使用游标卡尺对肿瘤体积进行2次的测量，测量肿瘤的长径和短径，其体积计算公式为：体积＝0.5×肿瘤长径×短径2。在进行肿瘤体积测量的同时，称量小鼠体重。结果如图4所示。在SKOV3-SCID鼠的异种移植模型中，式II-6所示ADC(E＝7.1)表现出了明显的肿瘤抑制活性和剂量依赖关系。参见图4中的(a)，相比于溶媒空白对照组和等剂量的裸抗mil40受试组，经式II-6所示ADC(E＝7.1)的体内药效表现出了具有统计学意义的显著性优势(P(Vehicle VS ADC)<0.05，P(mAb VS ADC)<0.05)。所有受试组的动物体重均未出现显著的由治疗过程中药物耐受性引起的体重下降(图4中的(b))。
上述实验结果表明，本发明提供的ADC(例如II-6所示ADC)可以快速被CTSB识别裂解并高效的释放SN-38，其在体内外的活性评价中均表现出抗肿瘤效果。
最后应当说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。
Claims (11)
1.式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，
其中：
B为
Z为-(CH2)mO(CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)n-，-(CH2CH2O)m-(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-(CH2CH2O)n-C(O)-，-(OCH2CH2)m-，-(CH2)m-，-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-、-(CH2)k-C(O)-，
L为
每个m各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9(例如2、5)；
每个n各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9(例如2、4、8)；
p为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为1、2、3、4、5或6，进一步优选为1、2、3、4或5(例如2)；
q为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8(例如2、4、8)；
h为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7(例如5)；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为2、3、4、5或6(例如4)；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7、8或9，进一步优选为4、5、6、7或8(例如8)；
k为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7(例如5)。
2.权利要求1所述的化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其特征在于以下i)～iii)中的任意一项或多项：
i)B为
ii)Z为-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-或-(CH2)k-C(O)-，其中p、q、h、i、j、k的定义如权利要求1所述；
iii)L为
优选为
3.权利要求1所述的化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中所述化合物选自：
4.权利要求1至3中任一项的化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物在制备抗体偶联药物中的用途。
5.式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中，
Z为-(CH2)mO(CH2)n-，-(CH2)mO(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-C(O)NH-(CH2)n-，-(CH2CH2O)m-(CH2)n-C(O)-，-(CH2)m-(CH2CH2O)n-C(O)-，-(OCH2CH2)m-，-(CH2)m-，-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-、-(CH2)k-C(O)-，
L为
每个m各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9(例如2、5)；
每个n各自独立地为1、2、3、4、5、6、7、8或9(例如2、4、8)；
p为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为1、2、3、4、5或6，进一步优选为1、2、3、4或5(例如2)；
q为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8(例如2、4、8)；
h为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7(例如5)；
i为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为2、3、4、5或6(例如4)；
j为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7、8或9，进一步优选为4、5、6、7或8(例如8)；
k为1、2、3、4、5、6、7、8或9，优选为2、3、4、5、6、7或8，进一步优选为3、4、5、6或7(例如5)；
A为靶向化合物，选自蛋白、抗体、多肽、酶和小分子；
E为1至20之间的数。
6.权利要求5所述化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其特征在于以下i)～xvi)中的任意一项或多项：
i)Z为-(CH2)p-C(O)NH-(CH2CH2O)q-CH2-CH2-C(O)-、-(CH2)h-C(O)NH-CH((CH2)i-NHC(O)-(CH2CH2O)j-CH3)-C(O)-或-(CH2)k-C(O)-，其中p、q、h、i、j、k的定义如权利要求5所述；
ii)L为
优选为
iii)A是以巯基为偶联位点的单克隆抗体，或以巯基为偶联位点的定点突变或修饰的单克隆抗体，
iv)A通过靶向化合物分子中的S原子偶联至位点#上；
v)A选自：抗HER2人源化单克隆抗体mil40、曲妥珠单抗(HERCEPTIN)，帕妥珠单抗(PERJETA)，西妥昔单抗(ERBITUX)，帕尼单抗(VECTIBIX)，利妥昔单抗(RITUXAN)，阿仑单抗(CAMPATH)，替伊莫单抗(ZEVALIN)，托西莫单抗(BEXXAR)，奥法木单抗(ARZERRA)，贝伐单抗(AVASTIN)，伊匹单抗(YERVOY)，地诺单抗(XGEVA)，派姆单抗(KEYTRUDA)，纳武单抗(Opdivo)，Avelumab(Bavencio)，Atezolizumab(Tecentriq)，durvalumab(Imfinzi)，sacituzumab，rovalpituzumab，及其生物类似物，优选地，A为抗HER2人源化单克隆抗体mil40；
xi)E为1至20之间的数，优选地，E为2至18之间的数或6至12之间的数，更优选地，E为6至9之间的数，例如E约为7或8。
7.权利要求5所述化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，其中所述化合物选自：
其中A、E的定义如权利要求5或6所述；
优选地，所述化合物选自：
其中，E的定义如权利要求5或6所述，
8.制备权利要求1-3任意一项所述的式I所示化合物、其几何或光学异构体、盐、水合物、溶剂化物或多晶型物的方法，包括：
1)使式I-a所示化合物与SN-38反应，得到式I-b所示化合物；
2)使式I-b所示化合物脱去Boc保护基，得到式I-c所示化合物；
3)使式I-c所示化合物与式i所示化合物反应，得到式I所示化合物，
其中B、Z、L的定义如权利要求1-3中的任意一项所述。
9.制备权利要求5-7中任意一项所述的式II或II’所示化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物的方法，包括：
使式I所示化合物与A反应，得到式IV所示的化合物，
优选地，所述反应在pH＝5～10，温度为0～40℃条件下进行；
其中Z、L、A的定义如权利要求5-7中任意一项所述，B为
10.药物组合物，其包含至少一种权利要求5至7中任一项所述的化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物，以及一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂，
优选地，其中所述的化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物以治疗的有效量存在。
11.权利要求5至7中任意一项所述的化合物、其几何或光学异构体、药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物或多晶型物在制备用于诊断和/或治疗疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症选自肿瘤、感染性疾病、血液学疾病、代谢性疾病、炎症，
优选地，所述肿瘤选自癌症、淋巴瘤、淋巴样肿瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病，
优选地，所述癌症选自：乳腺癌(例如，HER2阳性的乳腺癌)；鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌；腹膜癌；肝癌；胃癌；胃肠癌；膜腺癌；胶质母细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；尿道癌；肝细胞瘤；肠癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌；子宫癌；唾液腺癌；肾癌或肾癌；前列腺癌；外阴癌；甲状腺癌；肝癌；肛门癌；阴茎癌；黑色素瘤；多发性骨髓瘤和B细胞淋巴瘤；脑癌；胆囊癌；食管癌；胆管癌；头颈癌和相关转移瘤。
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