CN115636856A - 一种基于β-Gal响应的紫外可见型多功能荧光链接体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于β‑Gal响应的紫外可见型多功能荧光链接体及制备方法和应用，包括以下步骤：2,3,4,6‑四‑O‑乙酰基‑α‑D‑吡喃半乳糖与5‑亚硝基水杨醛在K2CO3的作用下，得到带有双醛基的中间体；2,3,3‑三甲基吲哚与1,3‑丙磺酸内酯在甲苯回流的作用下，得到带有磺酸末端的中间体；带有双醛基的中间体与带有磺酸末端的中间体在Ac2O与NaOAc的作用下，得到基于β‑Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体。本发明利用该链接体所构建的探针分子可以改善纳米递送药物体系在诊疗一体化概念应用方面的生物毒性，在实现诊断与治疗一体化的可行性，同时扩充诊疗一体化概念的应用多元性。
Description
技术领域
本发明属于药物制备技术领域，涉及一种基于β-Gal响应的紫外可见型多功能荧光链接体及制备方法和应用。
背景技术
癌症是世界范围内导致死亡和疾病的主要原因，而肝癌(HCC)是最常见的癌症之一，是第六大常见癌症，也是癌症死亡的第二大原因。晚期肝癌患者易出现化疗无效、耐药、术后复发等严重问题。那么，肝癌的早期诊断和有效治疗将为患者的生活带来希望。
荧光标记技术因其灵敏度高、时空分辨率高而被广泛应用于疾病的标记，但简单的荧光团缺乏靶向性。因此，可以通过设计专门开启荧光的智能荧光分子来实现高效标记。此外，为了达到高效的抗肿瘤作用，血管生成抑制剂被用作靶识别分子。同时，为保证药物的治疗效果，引入可释放基团，构建“诊治一体化”双功能分子，实现肝癌的早期诊断和高效治疗。
根据肝癌细胞中β-乳糖苷酶(β-Gal)高表达的特点，设计一类可以实时感应β-乳糖苷酶表达水平的一类分子，融合诊断和治疗功能的癌症诊疗一体化技术将有力推动个性化医疗的发展。在此基础上，将成像和治疗功能整合在一起，可以实时掌握具有诊疗一体化药物在肿瘤组织中的动态分布，从而把握最佳的治疗时机。
通过诊断治疗集成化，有效区分最佳受试患者，减轻患者治疗经济压力，及时高效诊断治疗卵巢癌患者，降低患者病死率吧，提高国民生命健康及生活质量。
“诊疗一体化”技术中诊断一步主要是通过荧光标记技术进行实现。而现阶段主要应用的荧光标记技术通常是直接在靶向识别分子中引入荧光团构建荧光探针来实现标记示踪分析的。这样，必然会由于需要满足标记示踪条件所进行过量荧光探针引入的问题，往往会造成需要多次洗涤避免假阳性结果。与此同时，由于多次洗涤步骤的存在使得无法实现实时在体的监测示踪分析。
此外，现阶段的“诊疗一体化”双功能分子是直接利用荧光团与治疗分子链接而成，而一般情况下荧光团的结构过于大，往往会对药物分子的生物学活性造成一定的影响。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体及制备方法和应用，该基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体用于化学修饰靶向抗肿瘤药物分子，并且可以用于验证基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体构建的探针实现“诊疗一体化”的可行性。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体，该多功能荧光链接体结构式如下：
一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的制备方法，包括以下步骤：
a)2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖与5-亚硝基水杨醛在K2CO3的作用下，得到带有双醛基的中间体；
b)2,3,3-三甲基吲哚与1,3-丙磺酸内酯在甲苯回流的作用下，得到带有磺酸末端的中间体；
c)带有双醛基的中间体与带有磺酸末端的中间体在Ac2O与NaOAc的作用下，得到基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体，结构式如下：
进一步的，步骤a)的具体过程为：将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖，5-亚硝基水杨醛和K2CO3在DMF中于0℃混合后，在N2气氛下，进行反应，得到带有双醛基的中间体。
进一步的，本发明进一步的改进在于，步骤b)的具体过程为：将2,3,3-三甲基吲哚与1,3-丙磺酸内酯溶于甲苯中，回流24h后，得到带有磺酸末端的中间体。
进一步的，步骤c)的具体过程为：将双醛基的中间体、磺酸末端的中间体和乙酸钠溶解在无水醋酸酐中，然后在50℃搅拌3h，得到基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体。
一种如上所述的基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体在制备诊疗一体化药物中的应用。
进一步的，将基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体、抗肿瘤药物与DMAP溶于无水二氯甲烷中，40℃下搅拌12h，得到诊疗一体化药物。
进一步的，抗肿瘤药物为抗血管生成药物与单克隆抗体药物中的一种。
一种如上1所述的基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体在构建用于示踪的药物探针方面的应用。
一种如上所述的基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体在原位肿瘤成像方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明通过使用2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖、5-亚硝基水杨醛、2,3,3-三甲基吲哚合成基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体，该链接体分子能够化学修饰靶向抗肿瘤药物分子进而构建“诊疗一体化”药物，其进入体内，在肿瘤高β-Gal酶高表达的肿瘤微环境的催化下，荧光开启进行标记示踪，同时进行靶向抗肿瘤药物释放，从而实现诊疗一体化的目的。本发明的β-Gal酶响应的多功能荧光链接体制备方法简单，易于实现，并且应用范围广。
本发明中的β-Gal酶响应的多功能荧光链接体可以对靶向抗肿瘤药物分子进行化学共价修饰构建“诊疗一体化”药物，进而通过肿瘤(肝癌)微环境的刺激，触发荧光点亮进行肿瘤部位的荧光标记，同时释放靶向抗肿瘤药物分子，从而达到对肿瘤的标记示踪以及治疗。利用该链接体所构建的探针分子可以改善纳米递送药物体系在诊疗一体化概念应用方面的生物毒性，同时扩充诊疗一体化概念的应用多元性。本发明的β-Gal酶响应的多功能荧光链接体能够用于构建“诊疗一体化”药物以及验证该药物在实现诊断与治疗一体化的可行性。
附图说明
图1为本发明提供的β-乳糖苷酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的合成路线图；
图2为细胞成像图；其中，(a)为功能BD7分子对肝癌细胞的标记成像图，(b)为细胞核成像图，(c)为细胞与细胞核的叠合图。
图3为荧光点亮定量结果图；
图4为细胞增殖抑制效果图。
其中，化合物1为2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖，化合物2为5-亚硝基水杨醛，化合物3为2,3,3-三甲基吲哚，化合物4为1,3-丙磺酸内酯，试剂与条件：(a)K2CO3,DMF,N2,0℃to rt,overnight；(b)Toluene,reflux,24h；(c)Ac2O,NaOAc,80℃,30min。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明在小分子的基础上构建诊疗一体化分子，利用其实现标记及治疗的作用，以扩充诊疗一体化在癌症治疗方面的实现手段。
本发明通过使用2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖，5-亚硝基水杨醛，2,3,3-三甲基吲哚以及1,3-丙磺酸内酯合成β-Gal响应的紫外可见型多功能荧光链接体分子，该链接体可以用于化学修饰靶向抗肿瘤药物分子构建“诊疗一体化”药物。
本发明提供的β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体，其结构如下：
本发明所述的β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体名称如下：
3-(2-((E)-3-((E)-2-(3,3-二甲基-1-(3-磺化丙基)-3H-4-吲哚-2-基)乙烯基)-4-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3,4,5-三乙酰氧基-6-(乙酰氧甲基)四氢-2H-吡喃-2-基)氧)苯乙烯基)-3,3-二甲基-3H-吲哚-1-基)丙烷-1-磺酸盐。
下面结合图1中所示的合成路线和具体的合成实施例来详细说明本发明提供的具有构建“诊疗一体化”药物的β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的制备方法。
实施例1
参见图1，一种β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的制备方法，包括以下步骤：
a)2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖与5-亚硝基水杨醛在K2CO3的作用下，得到带有双醛基的中间体；
所述步骤a)的具体操作为：
将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖，5-亚硝基水杨醛和K2CO3在DMF中于0℃混合N2气氛。将反应在室温下搅拌过夜，向混合物中加入H2O，得到带有双醛基的中间体。
b)2,3,3-三甲基吲哚与1,3-丙磺酸内酯在甲苯回流的作用下，得到带有磺酸末端的中间体；
所述步骤b)的具体操作为：
将2,3,3-三甲基吲哚，1,3-丙磺酸内酯溶于甲苯中，加热回流24h，待反应完成后，将上述反应体系冷却至室温，通过过滤分离粗混合物并干燥，经过石油醚洗涤即可得到带有磺酸末端的中间体。
c)带有双醛基的中间体与带有磺酸末端的中间体在Ac2O,NaOAc的作用下，得到基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体，
所述步骤c)的具体操作为：
将双醛基的中间体、磺酸末端的中间体和乙酸钠溶解在无水醋酸酐中，将混合物在50℃搅拌3h。粗品经硅胶柱层析纯化得到基于β-Gal酶特异性响应的紫外可见型荧光链接体。
上述含有β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体在构建“诊疗一体化”药物方面的应用。
a)2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖与5-亚硝基水杨醛在K2CO3的作用下，得到带有双醛基的中间体；
所述步骤a)的具体操作为：
将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖(4.86mmol，2.00g)，5-亚硝基水杨醛(4.86mmol，0.82g)和K2CO3(7.29mmol,1.02g)在DMF(20mL)中于0℃混合N2气氛。将反应在室温下搅拌过夜，向混合物中加入H2O(40mL)，得到带有双醛基的中间体，重1.32g，收率56.77％。
LC-MS(ESI,m/z):479.52[M+H]+，477.59[M-H]--
b)2,3,3-三甲基吲哚与1,3-丙磺酸内酯在甲苯回流的作用下，得到带有磺酸末端的中间体；
所述步骤b)的具体操作为：
将2,3,3-三甲基吲哚(0.10g，0.63mmol)，1,3-丙磺酸内酯(0.08g，0.63mmol)溶于甲苯(10mL)中，加热回流24h，待反应完成后，将上述反应体系冷却至室温，通过过滤分离粗混合物并干燥，经过石油醚洗涤(10mL×3)即可得到带有磺酸末端的中间体，重0.13g，收率73.57％。
LC-MS(ESI,m/z):282.45[M+H]+，280.67[M-H]--
c)带有双醛基的中间体与带有磺酸末端的中间体在Ac2O,NaOAc的作用下，得到基于β-Gal酶响应的多功能荧光链接体。
所述步骤c)的具体操作为：
将双醛基的中间体(0.20g，0.70mmol)、化合物2(0.16g，0.33mmol)和乙酸钠(0.03g，0.40mmol)溶解在5mL无水醋酸酐中，将混合物在50℃搅拌3h。粗品经硅胶柱层析纯化得到基于β-Gal酶特异性响应的荧光团，重0.30g，收率42.55％。
LC-MS(ESI,m/z):1008.23[M+H]+，1006.49[M-H]--
含有β-Gal酶响应的多功能荧光链接体能够在诊疗一体化方面应用。其应用范围较广，为一类通用型的基于β-Gal酶响应的多功能荧光链接体，其可以用于修饰具有抗肿瘤活性的活性生物小分子如利尼伐尼，索拉菲尼等，也可以用于修饰具有治疗作用的单克隆抗体药物分子，例如抗血管生成类单克隆抗体药物贝伐珠单抗等，PD1/PDL1单克隆抗体药物阿替珠单抗等。
优选的，本发明利用β-Gal酶响应的多功能荧光链接体化学修饰靶向抗肿瘤药物分子BD7，构建了BD7“诊疗一体化”药物分子，并且利用其对一些肿瘤细胞进行示踪定位成像分析及活性筛选。
BD7“诊疗一体化”药物分子的构建：将BD7(0.12g,0.20mmol)，荧光链接体(0.60g,0.40mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶，0.08g,0.40mmol)溶于DMF(5mL)中。接下来，将上述反应混合物置于40℃油浴锅中搅拌反应12h，TLC检测反应直至反应完全。进而，加入10倍体积的H2O(50mL)，然后通过CH2Cl2(20mL×3)进行萃取，收集有机相。然后，向体系中加入饱和NaHCO3(20mL×3)进行洗涤，收集有机相，然后利用饱和NaCl(20mL×3)进行洗涤，收集有机相。最后，加入适量Na2SO4室温搅拌4h，利用旋转蒸发仪进行浓缩，进而利用60-100目硅胶进行拌样，经色谱柱纯化(二氯甲烷：甲醇(V:V)＝10:1)即可得到目标产物，重0.33g，收率61.2％，
含有β-Gal酶响应的多功能荧光链接体构建的“诊疗一体化”靶向抗肿瘤药物分子在原位肿瘤成像方面的应用。
荧光点亮效果考察：紫外吸收特性测定具体方法如下所述：精密称定荧光链接体(0.0050g)，将其溶于1mL DMSO中，配制成5mM的荧光链接体母液作为后续荧光特性探索的储备液。
紫外吸收特性探索：吸取荧光链接体母液(10μL)，将其溶于990μL三蒸水中，进而再次通过稀释10倍，配制成测量样浓度为5μM的荧光链接体待测样。利用紫外分光光度计进行测定，扫描波长为200-900nm，扫描速度为0.1nm/s。
在确定最大吸收波长后，以此作为荧光的激发波长进行后续的荧光点亮特性考察。针对于荧光点亮特性考察中主要关注荧光点亮的酶的浓度以及响应时间两个方面。具体的实验步骤如下所述。
β-乳糖苷酶溶液的配制：将1kU的β-乳糖苷酶溶解于1mL PBS(pH7.40，10mM)缓冲液中，配制成母液浓度为1kU/mL的β-乳糖苷酶溶液。然后对其进行稀释，配制成100U/mL,10U/mL的β-乳糖苷酶溶液。
样品的处理：精确移取荧光链接体的待测样90μL，向其中分别加入不同浓度的β-乳糖苷酶溶液10μL，混合均匀，将其置于37℃恒温摇床上进行不同时间段的孵育，然后利用荧光分光光度计及多功能酶标仪进行最大荧光波长处的荧光强度的测定。以465nm作为荧光激发波长对不同条件下荧光点亮特性进行进一步的考察分析。在此，采用同样的测定方法及处理条件同时对荧光链接体以及代表性的BD7功能化分子的荧光点亮特性均进行了测定。参见图3，BD7功能分子在β-乳糖苷酶的作用下发生荧光点亮，并且在1U/mLβ-乳糖苷酶作用15min后即可发生高效且快速的荧光点亮。
利用上述设计合成的BD7“诊疗一体化”药物分子对HepG2细胞进行成像分子。
具体细胞成像步骤：
1)细胞种板：每孔细胞密度为4.3*105细胞/mL，37℃孵育过夜；
2)细胞给药：每孔探针浓度为4μmol/L，37℃孵育2h；
3)洗涤：利用PBS洗涤三次细胞，除去过量探针分子；
4)细胞固定：洗涤完成后，在室温下，在细胞中加入1mL 3.7％多聚甲醛(925μL4％多聚甲醛+75μL PBS)，固定30min，用PBS洗涤两次(轻微搅拌1-2min)，并在室温下用含有0.1％Triton X-100的PBS溶液透化10min。然后用PBS将细胞洗涤两次，缓慢搅拌1min，在室温下，用含2％BSA的PBS(含0.05％Tween-20)封闭30min，并用PBS(含0.05％Tween-20)洗涤两次。每次5min，轻轻晃动。
5)封片：在各组加入5μL抗荧光淬灭封片剂，周围加指甲油封片。
6)荧光显微镜进行检测：细胞成像结果如图2中(a)、(b)与(c)所示，探针浓度为4μmol/L，从图2中(a)、(b)与(c)可以看出，肿瘤细胞被荧光标记，说明构建的探针可以实现“诊疗一体化”中的标记即诊断一步。
含有β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体构建的“诊疗一体化”靶向抗肿瘤药物分子在抗肿瘤活性方面的应用。
利用上述设计合成的BD7“诊疗一体化”药物分子对EA.hy926细胞(人脐血管静脉细胞)、HepG2细胞(人肝癌细胞)、B16(黑色素瘤细胞)、SKOV3细胞(卵巢癌细胞)、A549细胞(人肺癌细胞)进行增殖抑制分析评价。
利用MTT对其进行活性评价：
1)细胞种板：96孔板种板，每孔细胞密度为1*105细胞/mL，每孔加入180μL细胞悬液,37℃孵育过夜。
2)细胞给药：设置6个浓度梯度，分别为20μmol/L,4μmol/L,0.8μmol/L,0.16μmol/L,0.032μmol/L,0.0064μmol/L,每个孔加入20μL,37℃孵育24h；
3)细胞给MTT：每孔加入22μL，37℃孵育4h；
4)细胞处理：吸去每孔液体，加入150μL DMSO,室温于摇床上孵育10min。
5)吸光度测定：将96孔板置于酶标仪上测定其在490nm处的吸光度。
6)抑制率计算：抑制率＝阴性孔OD-给孔OD/阴性孔OD-空孔白OD
细胞增殖抑制结果如图4所示，从图4可以看出，构建的探针分子表现较好的抗细胞增殖活性。即可表明构建的探针分子可以实现“诊疗一体化”概念中治疗一步。
本发明结合肿瘤微环境的高还原特点，在双功能分子种引入可释放性基团二硫键，当双功能分子进入肿瘤微环境后可是释放出药物分子，从而减弱荧光团对于药物分子治疗活性的影响，从而发挥出高效的治疗作用。
Claims (10)
1.一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体，其特征在于，该多功能荧光链接体结构式如下：
2.一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖与5-亚硝基水杨醛在K2CO3的作用下，得到带有双醛基的中间体；
b)2,3,3-三甲基吲哚与1,3-丙磺酸内酯在甲苯回流的作用下，得到带有磺酸末端的中间体；
c)带有双醛基的中间体与带有磺酸末端的中间体在Ac2O与NaOAc的作用下，得到基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体，结构式如下：
3.根据权利要求1所述的一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，步骤a)的具体过程为：将2,3,4,6-四-O-乙酰基-α-D-吡喃半乳糖，5-亚硝基水杨醛和K2CO3在DMF中于0℃混合后，在N2气氛下，进行反应，得到带有双醛基的中间体。
4.根据权利要求1所述的一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，本发明进一步的改进在于，步骤b)的具体过程为：将2,3,3-三甲基吲哚与1,3-丙磺酸内酯溶于甲苯中，回流24h后，得到带有磺酸末端的中间体。
5.根据权利要求1所述的一种基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体的制备方法，其特征在于，步骤c)的具体过程为：将双醛基的中间体、磺酸末端的中间体和乙酸钠溶解在无水醋酸酐中，然后在50℃搅拌3h，得到基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体。
6.一种如权利要求1所述的基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体在制备诊疗一体化药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体、抗肿瘤药物与DMAP溶于无水二氯甲烷中，40℃下搅拌12h，得到诊疗一体化药物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，抗肿瘤药物为抗血管生成药物与单克隆抗体药物中的一种。
9.一种如权利要求1所述的基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体在构建用于示踪的药物探针方面的应用。
10.一种如权利要求1所述的基于β-Gal酶响应的紫外可见型多功能荧光链接体在原位肿瘤成像方面的应用。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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