CN1156251A - 直接读取结果的试纸 - Google Patents

Abstract

一种测量点在其上的生物体液样品中被分析物浓度的多层试纸。它是把样品引到排列在试纸上的许多检测区，被分析物与试剂反应产生颜色变化。每个检测区中还包括一种变色反应的抑制剂。该抑制剂的浓度在连续的检测区中逐渐增加，因此，变色的检测区的数就是被分析物浓度的度量。该试纸尤其用于测量全血样品中的葡萄糖浓度。在优选的实施方案中，样品是沿着膜的粉碎区形成的路径进入检测区，检测区是膜的非粉碎区。

Description

直接读取结果的试纸

本申请是下列美国申请的部分接续申请：1995年3月27日申请的第411238号；1995年5月15日申请的第442035号。

本申请涉及一种测量生物体液中的被分析物浓度的干试纸；更确切地说，是一种不借助仪表直接测量浓度的试纸。

目前对生物体液中某些被分析物浓度的测量，已开发出了多种目测试验装置。例如，这些装置可以测量血液、尿液或唾液中的葡萄糖、胆固醇、蛋白质、酮、苯丙氨酸或酶的浓度。

结合了以酶为主的组合物的干相试纸在临床实验室、医生的诊所、医院和家庭中已被广泛用于测量生物体液样品的葡萄糖浓度。实际上，这种试纸已经成为国内几百万糖尿病患者的每日必需品。由于糖尿病可能引起血液化学异常改变的危险，从而会导致视觉丧失、肾衰竭及其它严重的医学后果。为把这些后果的危险减少到最小程度，大多数糖尿病人必须定期进行自身的测量，然后据此通过控制饮食和/或注射胰岛素来调整葡萄糖浓度。一些病人每天必须四次或更多次地测量血溏浓度。

糖尿病人必须控制饮食以调节糖的摄入和/或胰岛素的注射，而且在经常性地测量血浓度方面必须接受指导，因此，对于他们来说，用于快速、价廉和准确的葡萄糖测定的试纸尤为重要。

公知的试纸包含一种指示剂，当某种生物体液点到试纸上后，指示剂依赖于其中的葡萄糖浓度产生颜色深浅的变化。尽管一些试纸应用了还原过程，但更普遍的是试纸含有一种可氧化的染料或染料对。这样的试纸包括一种酶，例如葡萄糖氧化酶，它能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸或过氧化氢。它们也含有一种可氧化的染料和一种具有过氧化活性的物质，后者在过氧化氢存在的条件下，能选择性地催化氧化可氧化的染料。(参见1994年4月26日公布的Kiser等的美国专利5,306,623)。

1976年6月22日公布的Hochstrasser的美国专利3964871公开了一种一次性的指示剂试纸，它可直接测量生物体液中的物质，例如葡萄糖的浓度。该指示剂能够记录下物质的浓度；它包括一种与物质反应后氧化变色的指示试剂，还包括一种＂拮抗试剂＂，这种＂拮抗试剂＂以某种方式防止氧化过的指示试剂的累积；直到它被完全消耗掉为止。

Palmer等在1989年5月24日公布的欧洲专利申请0317070中公开了一种葡萄糖和其它被分析物的＂数字＂定量测定系统。系统测量某种生物体液中的一种有机化合物的浓度，首先要将这种化合物用一种专属氧化酶氧化产生过氧化氢。该系统包括一个作为过氧化氢还原剂发色团和一个具有更大还原电势的空气中稳定的过氧化氢还原剂。更大的还原电势延迟了任何由发色团带来的颜色变化，直到首先消耗掉空气中稳定的过氧化氢还原剂。因此，如果要测的过氧化氢低于预定的水平，即小于空气中稳定的过氧化物还原剂的浓度，将不会发生变色。结果是，系统定量测量了浓度，而不依赖于颜色改变的强度。

Englemann在1988年4月19日公布的美国专利4738823中公开了一种测定被分析物的试纸，它有一个载体，含有一种有吸收性的材料，可除去点到试纸上过剩的样品。试纸还可以包括一个用来引入样品的开口的覆盖层。

Burkhardt等人在1989年3月7日公布的美国专利4810470中公开了一种测量液体样品中被分析物浓度的装置。该装置包括一种或多种吸水基质，其上涂覆一层液体不能渗透的包衣或薄膜。把样品沉积在吸水基的部分上，用色谱法测量。通过毛细作用，把样品移至含有被分析物检测试剂的测定区。

Daffern等人在1991年2月19日公布的美国专利4994238中公开了一种化学分析装置，该装置由一个吸收层、一个防水层和一个试剂层组成，试剂层有确定值。试剂层上面盖压着吸收层和防水层，吸收层和防水层上有呈线性排列的小孔，样品即通过小孔点到试剂层上。

浓度测量无论在家庭、医务室、诊所还是在医院中进行，葡萄糖测量结果的准确性和重复性都是绝对重要的。指示颜色的试纸要求变色必须明显、突出，而且对生物体液中除葡萄糖以外的各种成分都不敏感。对可读取结果的试纸，依赖于葡萄糖浓度的改变而产生明显的颜色变化，对于有可能视力减弱的糖尿病人来说，尤为重要；显示在指定波长因吸收值的改变而引起的颜色变化，对用仪表测量的试纸的准确性也是很重要的。

由于变色涉及一系列化学反应过程，变色不是瞬时发生的。因此，用户必须等上一段时间—一般为一分钟以内—反应才会发生。当代表从试纸上读取结果时，计时器线路会产生一个信号，表明反应完毕。不过，当试纸可直接读取结果，而无需仪表时，用户也许会低估了反应所用的时间，过早读取试纸的结果，而得到不正确的结果。或者，用户也许会在读取试纸结果之前，为反应进行需要等上足够的时间，以确定反应完毕，这种不必要的耽搁是令人不快的。这就需要一种＂化学＂计时剂，也就是说，试纸中含有一种成份，发生变色且与样品葡萄糖(或其它有关被分析物)浓度无关；但是变色仅仅发生在足够长的时间之后，以使和样品进行的颜色形成反应完成。

按照本发明，用于测量点在试纸上的生物体液样品中被分析物的浓度的一种延长的多层试纸，包括：

a)一个底层，有一个接受样品的直通孔；

b)一个膜层，上有正对底层的样品面和另一面为检测面，膜层含有能与被分析物反应发生变色的试剂，该试剂包括：

  i)第一种成份，和被分析物作用形成过氧化氢；

  ii)第二种成份，和过氧化氢作用引起颜色变化，和

  iii)第三种成份，抑制第二种成份的变色；

c)在膜层和底层之间的中间层；和

d)沿试纸分布样品的测量系统，由下列组成：

  i)膜层中的非吸水区；和

  ii)在中间层形成的液体输送通道，引导样品从非吸水区的表面流向大量沿膜层长度排列的分散的吸水检测区；抑制剂浓度以一种预定方式从试纸样端开始增加，所以，如果变色有效的话，样品中必须含有浓度相应增长的被分散物。当样品点到试纸上，一个或更多的检测区会改变颜色，而离点样端最远的变色区显示了样品中被分析物的浓度。

在操作方面，测量生物体液样品中被分析物浓度的方法由下列步骤组成：

a)在试纸上点样，该试纸包括：

  i)多个吸水检测区，该检测区和至少含有一种预定量的被分析物的液体接触时，每一个都变色，体液中被分析物的预定量大于靠近试纸点样端的检测区变色所需的被分析物的量，和

  ii)测量系统，该测量系统会使样品和沿一种预定的非吸水路径将样品分布到每一个检测区，以及

b)观察远离试纸点样端的检测区的颜色变化。

把含有被分析物的生物体液点到试纸的样品面上后，试纸的种类要能保证被分析物的浓度可以看到的显示。可以看到的显示出现在试纸的另一(或＂检测＂)面上。

试纸的化学组成，当然取决于所要测量的被分析物/生物体液。试纸可以被设计成能检测血液、尿液和唾液等生物体液以及水中的葡萄糖或其它种糖、乙醇、胆固醇、蛋白质、酮、尿酸、苯丙氨酸、或酶等被分析物。为方便和简捷，本申请说明书比较详细公开的试纸能检测血液中的葡萄糖。本领域的普技术人员根据本说明书信息，很容易用于检测其它被分析物/生物体液的组合物。

本发明的试纸提供一种相对简单快速地测定待测血液样品中葡萄糖浓度的方法。试纸包括一个有孔的底层，样品可由该孔被引入到多孔基质的样品面上，样品面的反面是检测面。基质通常为一种膜，在本申请说明书和权利要求书中这两个术语可互换使用。检测试剂结合到基质上，或多或少地浸渍在基质的微孔中。为简单起见，本申请说明书和权利要求书中基质上的试剂称作＂包衣＂，以表示该试剂包衣渗透到基质中。

中间层位于底层和基质之间。中间层的切口沿膜的非吸水区排列，将样品引入到排列在试纸上的一系列的吸水检测区。(本申请说明书和权利要求书所述＂吸水的＂理解为＂有吸水性的。＂)检测区周围和上方空间环绕一系列中间层的凹口，能使样品流向这些区域。

这样，把固定体积的样品—一般为含有红细胞和葡萄糖的全血—引向一系列检测区的膜的每个样品面。优选地，底层具有和检测区呈线性排列的出口孔，有利于样品注入体积的均匀一致。由于基质的多孔性，体液，例如通过毛细作用，从样品面流向检测面。这样，检测试剂能在检测面上或附近与血液中的葡萄糖反应而变色。由于红细胞颜色较深，不利于检测到颜色的变化，基质优选为各向异性的，微孔的直径，从样品面到检测面逐渐由大到小，以使红细胞从检测区中分离出去。本发明试纸和计时剂的各和成份可用各种材料制成。这些材料已经分别在公布1994年4月26日的美国专利5306623和1995年5月23日公布的美国专利5418142中公开。

检测试剂包括一种将葡萄糖转化为过氧化氢的成份，例如是葡萄糖氧化酶；一种或几种能检测由存在于样品中的葡萄糖生成物的过氧化氢的成份；和一种抑制剂。过氧化氢的检测成份可以是过氧化酶，优选为辣根过氧化酶，和一种在反应过程中变色的＂指示剂＂。该指示剂可以是一种可氧化的染料或染料对。在过氧化氢存在的条件下，过氧化酶催化指示剂的氧化过程。检测试剂的最后一种成份是能延迟指示剂氧化变色的抑制剂。

沿着试纸的长度，可将其以这样一种方式分割即膜的邻近的节段中有不同的抑制剂浓度。每个节段有一个吸水检测区，吸水检测区变色的条件是，存在足够的葡萄糖，首先消耗掉所有的抑制剂，然后才氧化指示剂，从而导致特征颜色的改变。这样，在一个特定的检测区中的变色显示出最初血液样品的葡萄糖浓度范围。沿一特定方向，试纸每一连续的节段上，抑制剂浓度逐步增大，对应于葡萄糖的浓度范围也逐步增加。所有的节段上，指示剂的浓度是相同的。原则上讲，其它各种抑制剂/指示剂配比也是可能的。

如果对某一特定试样，节段具有在适宜范围内的抑制剂浓度相邻的检测区和被分析物反应，那么一个检测区变色而相领区不变色。结果表明，样品中的葡萄糖浓度和该区变色所需的阈浓度相同，而不大于邻近区变色所需的浓度范围。

在血糖监测中，可选的计时剂片段包衣包括了指示剂试纸的成份—一种多孔基质，检测试剂包覆其上—除了葡萄糖之外。干燥状态下，试剂的化学性不能被葡萄糖激活，而当样品点到试纸上，使计时剂包衣水化，包衣中的葡萄糖在预定时间后使指示剂变色。葡萄糖最好是以大大超过克服抑制剂作用所需的量存在于计时剂中。在这种情况下，所需时间的长或短取决于抑制剂的多或少。可直接通过肉眼，或者可借助检测反射值变化的光学仪器观察试纸中的变色和计时剂中的变色。

图1是本发明直接读取结果的试纸基质的透视图。

图2是本发明直接读取结果的试纸的样品面的底平面截面图。

图3是图2的试纸内部延伸的不连续的透视图，局部截切。

图4是图2的试纸沿A-A线的截面图。

图5是本发明试纸的底平面图。

图6是顶平面图，显示图5试纸的检测面。

图7是图6点样后的试纸。

本发明是一种测量生物体液中被分析物浓度的可直接读取结果的试纸。试纸的主要成份是一种结合有检测试剂的多孔基质，试剂随着点到试纸上的生物体液样品中的被分析物而发生变色。

该基质可以是一种均一的组合物，或者是一种有包覆层的酶作用物，基质可以是各向同性的，也可以是各向异性的。基质有一个样品面，样品点到样品面上，还有一个可进行变色观测的检测面，基质优选为一各向异性膜；更优选地，各向异性膜有一较宽的微孔孔经范围。例如，膜微孔孔经梯度从约0.1微米到约150微米。在微孔较大的一侧，孔经优选范围为约30微米至约40微米。在膜的微孔最小的一侧，空隙体积相对较小，膜材料在一层内一般相当稠密，典型的情况是构成直至膜厚度的20％。在这层内，微孔孔经优选范围为约0.1微米至0.8微，其公称尺寸优选为约0.3微米。生物体液点到样品面上后，样品在透过膜时遇到孔径越来越小的微孔。最后，例如红细胞等的固形物在到达膜的某一位置后就不能再进一步透过了。余下的样品，包含了溶解的葡萄糖，继续透过到达检测面。膜的各向异性和/或分离成份的使用(下文将要述及)相对加快了透过膜的流速，即使同时伴随着固形物的过滤。

样品通过基质时，和试剂的反应使光吸收、染料在检测面附近的空隙体积中形成或分解，从而实际上影响了基质的反射能力。

基质材料的适宜例子是聚砜类和聚酰胺类(尼龙类)。有类似性质的其它聚合物也同样适用。聚合物可以经修饰引入其它功能基，而具有荷电结构，使基质的表面可以是中性、阳性或阴性。

制备形成基质的多孔材料的优选方法是在聚合物中不加入载体核。这种基质，举例来说，是由Timonium，MD，Memtec公司生产的各向异性聚砜膜。通常选用厚度小于200微米的基质，优选为115至155微米。尤其基质是尼龙或各向异性聚砜时，厚度更优选为130至140微米。

将膜浸入检测试剂的混合成份中，对膜进行饱和处理。优选地，至少一些成份相继加入到膜中。过量的试剂可用机械方法除去，如空气刀、刮刀或玻璃棒。然后将膜干燥。试剂往往会在膜的微孔较小的(检测)面富集。

检测试剂包括：(i)将葡萄糖转化为过氧化氢的成份，(ii)检测过氧化氢的成份，和(iii)过氧化氢检测成份的抑制成份。可选地，试剂进一步包括一种分离成份，分离成份可使固形物如红细胞从基质中诱离，有效地从生物体液中除去固形物。此外，下文和实施例中还将描述其它成份。

将葡萄糖转化为过氧化氢的成份优选为葡糖氧化酶，它通常从黑曲霉或青霉属中得到。葡糖氧化酶与葡萄糖和氧反应，产生葡糖酸内酯和过氧化氢。

最适宜的葡萄糖氧化酶浓度依据指示剂系统的组成而定。例如，如果指示剂系统是MBTHSB-ANS(具体描述见下文)，那么，葡糖氧化酶浓度范围约500-1000V./ml是合适的，更优选约700-2000V./ml，最优选约1000V./ml。一般来说，葡糖氧化酶的浓度越高，反应进行得越快，浓度越低，进行得越慢。

这样产生的过氧化氢与用于检测过氧化氢的成份发生反应，反应中包括有一种过氧化物酶，它能有选择性地催化过氧化氢与一种指示剂之间的反应，过氧化物酶用过氧化氢作为一种能或从各种基质上转移氢原子的氧化剂。合适的过氧化物酶可以是正铁血红素，这是一种从植物中得到的氯高铁血红素。合适的过氧化物酶也可从动物身上得到，例如从动物的甲状腺中得到。把马萝过氧化物酶(HRPO)用于检测过氧化氢的成份中的一种组分是特别优选的。

最好由过氧化物酶催化的过氧化氢，能与指示剂直接或间接地反应面生成或分解成一种指示剂染料，该指示剂染料能在预定的波长范围内吸收光。优选的是，该指示剂染料强吸收处的波长与检测试剂强吸收处的波长不同。指示剂被氧化后的最终产物可以是有色的、暗浅色的、或无色的，并可由此证明在基质的测试面所产生的颜色变化。也就是说，检测试剂能通过一个有色区变白了或改变了颜色，或者一个无色区产生了颜色等方式来指示样品中被分析物的存在。

本发明中有用的指示剂包括：(a)结合有了3-二甲氨基苯甲酸(DMAB)的3-甲基-2-盐酸苯并噻唑啉酮腙(MBTH)；(b)结合有3，5-二氯-2-羟基苯磺酸(DCHBS)的MBTH；(c)4-氨基安替比林(4-AAP)和5-氧代-1-(对磺苯基)-2-吡唑啉-3-羧酸(OPSP)；(d)4-AAP和N-(间甲苯基)-二乙醇胺(NDA)；(e)2，2′-联氮基-二(3-乙基苯噻唑啉)磺酸(ABTS)(f)4AAP和4-甲氧基萘酚；(g)焦棓酚红(PGR)；(h)溴焦棓酚红(BPR)；(i)酸性绿25(AG)；或者(j)结合有8-苯胺基-1-萘磺酸铵的(ANS)[3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙]N-磺氮苯磺酸-钠(MBTHSB)。MBTHSB-ANS是优选的。关于MBTHSB-ANS的其它资料见1994年9月8日申请的美国专利申请302,575，并作为本文的参考资料。

抑制成份例如通过减少过氧化氢或者减少被氧化的指示剂，可减慢过氧化氢与指示剂之间的反应。原则上，对于抑制剂的处理有几种不同的方式。首先，抑制剂可与指示剂竞争，并由此减慢指示剂发生颜色变化的速率。其次，抑制剂也可以是非竞争性的，以便于在指示剂发生任何真正的颜色变化之前，所有抑制剂能被充分地消耗掉。其它的抑制剂的处理方式也是可能的。本发明中的抑制剂优选非竞争性的。

合适的抑制剂包括：2，3，4-三羟基苯甲酸；丙桔酸；3，4-二羟基肉桂酸；3，4-二羟基苯甲醛；没食子酸；5，6-二氨基尿嘧啶；抗坏血酸；和异抗坏血酸。抗坏血酸是优选的，但是，抗坏血酸在溶液中容易被氧化，为了能把试剂包裹必须使抗坏血酸稳定。优选的稳定剂是伯醇，如乙醇、甲酸、或丙醇。乙醇是优选的，特别是其浓缩液，即50％或50％以上的乙醇溶液。

尽管优选的基质—各向异性膜可过滤红细胞并阻止它们渗入检测面，任选的检测试剂也可含有一种分离成份。这种分离成份应该能够通过将红细胞螯合到基质上由含有红细胞的液体如全血中产生一种相对透明无色的液体。本发明中使用的分离成份包括但不局限于PH值约4.0-8.0之间的聚乙二醇，聚(甲基·乙烯基醚/马来酐)，聚丙二醇，聚苯乙烯磺酸，聚丙烯酸，聚乙烯醇，和聚乙烯磺酸。这些存在于基质中的分离成份的量将根据它们的电荷及分子量、嵌镶在基质上的其它成份，基质的PH值及孔径大小，以及基质干燥后的残留水分等因素而变化。这些参数很容易由公众熟知的方法来测定。例如，当使用聚丙二醇作为分离成份(如BASF，Wyandotte，MI的PPG-410)时，其优选的重量体积比(W/V)为约2-30％，更优选8-10％(W/V)。使用其它的分离成份时也可采用浓度约2-30％W/V的。在生产过程中，聚合的分离成份可以被浸渍或嵌镶到基质上或者铸造到膜上。

某些水溶性的盐也能影响血液的分离。适于分离血液成份的盐包括：柠檬酸盐、甲酸盐、硫酸盐。也可以是某种酸，如氨基酸，柠檬酸、肌醇六磷酸和马酸。(参见，例如MC Fetter G8 1971年1月5日公布的U.S.Pat.3,552,928)加入分离成份的一个优点是：象红细胞这样的固体能被大部分从生物液体中分离出来，使测试部位的背景颜色很浅，而由检测试剂产生的颜色上的变化则变得清晰。

其它的成份也可以被嵌镶到基质上以增强试剂带的显色反应和清晰度，并使基质保持均匀和完整。例如，检测试剂可含有盐和/或缓冲剂以有助于基质中染料的分离。这样的缓冲剂可以是，例如以约0.01M到1.0M优选约0.1M的存在的柠檬酸溶液。也可使用其它的缓冲剂。

也可使用使基质亲水的化合物或能用作稳定剂的化合物，如水解蛋白。这样的化合物包括但不局限于例如牛血清白蛋白，多肽和象Crotein SPA(CRODAInc.New York，N.Y.)这样可获及的低分子量蛋白。这些化合物在使用时的浓度可以约1mg/ml到约100mg/ml。在使用Crotein时，优选约30mg/ml。

其它的稳定剂和防腐剂也可以被包括在用于基的涂层中。例如乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和一些相关的化合物也可以。例如约0.01mg/ml到约10mg/ml的浓度使用。使用防腐剂的目的之一是帮助稳定抑制剂。

有一些指示剂(如BPR)在基质中具有一种迁移的不理想的倾向。当使用这样的指示剂时，可加入一种离子对试剂以防止这种迁移。例如，象Polyquart(H)(Henkel，Inc，Ambler，PA)这样的可买到的聚乙二醇衍生物尤为适用，因为它们能有助于在指示剂与其它的基质取代基之间形成离子对。

当被分析物的存在以显色的方式(如MBTHSB-ANS)显示时，可以加入一种表面活性剂以加深颜色和增强与未显色的背景之间的对比度。

本发明中也可以使用有机溶剂，它可被包括在用于基质的检测试剂配方中，当然，前提是它们应与基质和检测试剂的组分互容。可适用的有机溶剂包括氯仿，丙醇、乙醇、二氯甲烷，乙酸乙酯和石油醚，乙腈以及它们的混合物。本发明中优选70％的乙醇水溶液。

被涂敷到基质上或浸渍到基质中的检测试剂在试纸的表面上是不均匀的。其实，试剂优选以一系列平行带或＂段＂顺着试纸的狭长范围延伸的方式用于基质中。相邻段的组分中的有效抑制浓度逐渐增大。每个段有一个吸水的检测区。正是在检测区中，检测试剂与血液中的葡萄糖反应引起颜色变化，前提是葡萄糖的浓度大得能超过分析区中抑制剂的含量。这样，为了使检测区变色，每一个有效的分析区都需要样品有一个逐渐增高的较大的葡萄糖浓度。

可任选一个检测区适用作计时剂，以标示试剂与葡萄糖在每一个检测区中反应所需的足够时间已经消逝。基质的计时剂段可以组合物的形式涂敷或浸渍到基质上，该组合物除含有检测试剂外，还含有葡萄糖。由于检测试剂的目的是与葡萄糖反应而显色，所以同时含有这两种试剂而不产生颜色的变化需要加倍小心。必须含有超过计时功能所需量的抑制剂以补偿这一效应。在使用了含有葡萄糖的溶液后，要控制计时剂节段的干燥速率。实际上，首先把含有缓冲剂、稳定剂和酶的溶液涂敷于膜上，将涂层干燥后形成第一层。然后，用含有指示剂、抑制剂和葡萄糖的溶液进行第二次涂敷。象织物速率、炉温和气流、以及涂敷溶液沉淀的量等参数必须事先设定，并适当调节抑制剂和/或葡萄糖的浓度。如果不直接形成第二涂层，也可另选一非最佳方案，即在一单独的织物上制成第二涂层，然后将其置于第一涂层上。

当样品被点到试纸上时，计时剂节段组分被润湿使得显色反应得以进行。然后通过温度和检测试剂的特性，尤其是抑制剂的浓度、葡萄糖的量、润湿速率及氧气扩散速率等来测定计时剂节段改变颜色所需的时间。

可使计时剂变色的时间依赖于样品中的葡萄糖浓度，也可使其不依赖于样品中的葡萄糖浓度。在计时剂节段中加入大大过量的葡萄糖，其变色时间就几乎不依赖于样品的葡萄糖浓度。而在计时剂节段中加入少量的葡萄糖，其变色时间就将依赖于样品中的葡萄糖浓度，即：如果样品中的葡萄糖浓度越高，时剂改变颜色越快。优选的是，计时剂中的葡萄糖浓度大于约1500mg/dl，这将使定时器几乎不依赖于范围在约40-400mg/dL之间的样品中的葡萄糖浓度。计时剂节段的组分包括过量的将葡萄糖转变为过氧化氢的成份(如葡萄糖氧化酶)和过量的葡萄糖。那么，计时剂的组分中至少应包括比具有最高抑制剂浓度的测试段相同、或更多的抑制剂(对应于最高葡萄糖读数)。

计时剂也起着重要的质量监测作用，它可使试纸因暴露于潮湿环境而导致失效时明显地显示出来，试纸在使用前必须保持干燥，因为将葡萄糖转变为过氧化氢的成份(通常是酶)在潮湿环境中容易降解。因此，如果试纸被过早地暴露于湿环境中，它将会失败。如果试纸的损坏没有被明显地显示出来，使用者可能不知它已损坏而使用了这样的试纸就会得到错误的结果。然而，如果包括有计时剂节段的试纸暴露于湿环境中引起计时剂的变色，这就会警告使用者注意该试纸已失效，就不会使用它了。

除了含有试剂的基质外，本发明中的试纸还包括一个底层以支持基质。该底层优选热塑塑料片，更优选聚酯，并有一个孔把样品点到基质的样品面。血液样品从样品孔沿着基质的长度分布。如果底层基本上是不透明的，那么，一个或更多透明的窗口部分可位于与样品孔有一适当距离的地方，样品在窗口中的出现就可确证足够的样品已被点到试纸上了。

血液从样品孔分布到检测区还涉及到一个中间层，它位于底层和膜之间并任意地粘合到二者上。中间层优选热塑塑料片，更优选聚酯。它是一个保险装置确保样品顺着试纸的长度方向并沿着膜上的非吸水路径直接到达每一个检测区。在中间层上正对检测区的位置处有一个凹口，以使每一个检测区都绝大部分被中间层的壁所环绕。

膜上的非吸水路径的结构优选通过破坏膜孔的结构来形成。这可通过直接加热或使用激光加热或超声波加热的方法来完成，优选在加压的情况下进行。然而，优选的方法是粉碎。因此，除了检测区部位，其它部位的膜都被粉碎以使它吸水(但仍是亲水的)。对于本发明中优选的膜，需要粉碎的区域优选在高压至少6tons/in²(80000KPa)和加热(至少110℃)的条件下进行粉碎。当然，优选的压力和温度依赖于粉碎过程及停留时间，也依赖于膜的参数。最佳值可由常规试验来测定。

为了精确测量，重要的一点是提供到每个检测区中的血液的量可重复。如果缺口完全包围住分析区，而且假定在中间层与底层及被粉碎的膜之间有一个不透液的密封部分，那么，每个分析区都将伴有一个闭合的体积(圆筒型的)，它的壁由中间层构成，底由膜及底层构成。然而，有一个分布通道沿着试纸伸展并将样品送到每一个检测区。高精度需要分布通道提供一个固定量的样品到每个检测区，但至少在约1或2分钟的测量时间内不再提供。由于初始样品是可变的，因此优选在每一个膜的底部有一个吸收层将过量的样品从分布通道的底端带走。在通道末端的吸收层也可促使样品沿着试纸的长度方向吸水上升。优选由公众熟知方法制成的非织造织物构成吸收层。

出现在膜的测试面测试样品中的葡萄糖引起颜色的改变。在膜的测试面上覆盖一个有孔的上层是很简单的，这个孔是与检测区对齐的。通过该孔可看到颜色的改变，并且可使氧气到达反应点。上层可以用粘合剂附着到膜上。如果粘合剂会干挠葡萄糖检测反应，那么优选将其限制于膜的非吸水区。然而，如果粘合剂不会干挠反应，则对它的位置没有苛求。

由于含有优选试剂的检测区暴露于光或氧气中会缓慢变色，任选的计时剂对潮湿环境敏感，因此试纸优选用不透氧和水的材料密封包装，例如用锡箔纸密封包装。如果试纸是单独包装的，使用时它也可以保留在一个可剥开的外壳中。

下面结合附图对本发明作进一步的描述。图1所示为本发明中用于测定生物体液中被分析量的基质10。尽管是以拱形位置显示的，但基质10是易揉曲的，并且使用时通常为平面。基质包括一个可将生物体液样品点在上面的样品面12，和一个测试面14，在其上或附近的颜色变化将指示被分析物的存在。变色是被分析物与浸渍在孔16中的试剂相互反应的结果。优选在测定血液中葡萄糖浓度时，靠近样品面12的孔径相对较大，靠近测试面14时逐渐减小。孔径梯度变化是用来阻止红细胞靠近样品面12，以便它们的颜色不会妨碍对指示被分析物存在的颜色变化的可见能力。

三个平行段a，b和c如图所示。每个有效段中含有的抑制剂依次增加。在优选的方案中，当试剂被点到平行段中的膜上后，如图所示，除了发生被分析物与试剂反应的检测区外，其它部位的膜被粉碎。位于每个平行段中的单独吸水区和被粉碎的非吸水区的模式将在图2的平面图与图3的片断放大的透视图中显示。

图2是局部切去一角后，膜10的样品面12和被中间层24及底层26覆盖的吸收层20和22的底平面图。膜10和吸收层20和22优选由顶层支持，顶层在图中没有显示。吸收层20和22优选在膜的底端(超出虚线A和B)以吸收比设定所需的过量血液样品。测定时的样品量必须能足够提供到每个检测区和计时区(如果有的话)。一般来说，检测区越少的试纸不需要太多的样品，但葡萄糖测定值的范围也越窄且/或越不精确。图2所示的9个吸水区，相当于8个检测区(标示1-8)和一个计时区(T)，在不需要不可接受的大样品量的情况下，就可提供足够的测试范围和精度。中间层24有一个凹口28，它与底层26上的样品孔30对齐。样品由样品孔30加入后通过毛细作用直接沿着中间层24上的中心通道32到达每个检测区和计时区，任何过量的样品都会被吸收层20和22吸收。样品在任选的透明窗口34和35中的出现可确保已提供了足够的样品用于测定。优选的是，中间层24与膜的样品面12之间形成一个密封区，以便样品不能在相邻的两个检测区之间直接流动。

图3是一个放大的片断透视图，图中表示有透过底层26可见的3个检测区6、7和8，它们被中间层24的指状突出部分分隔开。任何粘合剂层24A把中间层24和底层26及膜10粘结在一起。在层26上有一个通风孔40以有助于样品在试纸上流动。在顶层36上对准吸水区的孔如38，使得在吸水区的任何颜色变化都是可见的，并可使显色反应所需的氧进入。任何粘合剂层36A将顶层36与膜10的测试面粘结在一起。

图4是沿着图2中的线4-4所做的截面图，除了显示有在图2中显示的层外，还显示了顶层36。底层26上的通网孔如40与检测区及计时区对准以帮助样品填充到每个区的周围。填充的样品被限制在膜10、中间层24和底层26之中。注意，检测区3的底部与底层26之间的间隙大约只有12微米，但为了清楚起见，图中显示了较大的尺度。

图5是本发明中试纸的底平面图，显示了样品孔30和使用者直接通过此孔进样的图示。当通过透明窗口34和35看到样品时，就确认有足够的样品已被点到试纸上。

图6是试纸顶层36的平面图，与葡萄糖浓度有关的检测区已被校正过。

图7所示为血液样品被点到图6的试纸的孔30(图2)中后，样品沿着中心通道32扩展，样品中的葡萄糖与检测区中的试剂发生反应。由于最下面的检测区中的抑制剂最少，它将首先改变颜色。然后，第二个，第三个分析区变色。因为样品中的葡萄糖太少，上面的检测区没有变色。由于使计时区42变色的足够时间已经过去，所以可读取结果。因此，在图7中表示的结果显示了样品葡萄糖浓度至少为120mg/dL，但小于150mg/mL。在计时区42变色后的任何时间内都可读数。注意，在图7中显示的由试剂与葡萄糖反应引起的颜色变化是从无色变为有色。然而，系统也可改变对被葡萄糖诱导氧化而破坏的染料指示剂的处理方式，与之相对应的颜色变化是从有色变为无色。

为了更好地理解本发明，下面的实施例将进一步说明本发明的各种不同的方案。但实施例并非是以任何方式对本发明进行限定的。

       实施例1-BPR指示剂制备下列溶液：

蒸馏水                  83.5g

1％(W/W)EDTA Na₂       23.8g

乌头酸                   6.0g

NaOH(固体)               2.2g

Crotein SPA              4.2g

咪唑                     0.6g

甘露糖醇                 3.0g

5％(W/W)Surfactol Q1     3.0g

调PH值到4.80

乙醇                    40.0g

PPG-410                  5.6g

酶溶液                  28.0g酶溶液：

0.2M乌头酸              27.0g

葡萄糖氧化酶         165,000U

HRPO                 340,000U

把Memtec BTSH 55膜浸入上述溶液中进行涂敷并用玻璃棒除去过量试剂。在180F及中速气流条件下把涂敷后的膜在浮选干燥器中进行干燥，以使织物在20秒内充分干燥。把织物卷起进行下文所述的第二次涂敷。制备下列溶液：

抗坏血酸(抑制剂)原料溶液          稀释剂

蒸馏水            190g            370g

1％EDTA Na₂       55g            107g

BPR              0.36g           0.71g

Poly Quart^H      6g           11.8g

PPG-410          14.2g           27.8g

抗坏血酸         1.37g            -

乙醇              243g           477g计时剂溶液：

稀释剂(根据上述配方)      120g

抗坏血酸                0.885g

葡萄糖溶液^*            17.25g

^*该葡萄糖溶液为16.0g/dL的葡萄糖水溶液，并使其变旋24小时，冷冻保藏。

按下列比例将原料溶液稀释：0.0405∶1，0.108∶1，0.236∶1，0.369∶1，0.569∶1，1.260∶1。这些逐渐升高的抑制剂浓度对应于检测区反应的逐渐加大的葡萄糖浓度。把这些溶液和计时剂溶液一齐涂敷到含有酶的膜的大孔面上，并使其以每平方毫米的1.2×10^-4ml的速度沉积到膜上。在把膜进行与上酶涂层相同条件下的干燥之前先将其润湿约15秒。结果显示：计时剂反应变色时间在64秒到79秒之间，其中约95％是在约70秒。

      实施例2-MBTHSB-ANS指示剂制备下列溶液：

HPLC水                  1500ml

柠檬酸                  16.92g

柠檬酸钠                20.88g

甘露糖醇                   15g

EDTA Na₂                1.26g

Gantrez S95              6.75g

Crotein SPA                36g

葡萄糖氧化酶           1.6g MU

HRPO                     1.5MU

Carbopol 910^*            75ml

柠檬酸二钠^**            225ml

*11％的乙腈溶液

**0.1M，PH5.0

在一个长槽中涂敷Memtec BTS 35膜以使其大孔面接触涂层溶液，过量的溶液用玻璃棒去除。同实施例1，把膜干燥后卷起。

制备下列溶液：

溶液A(指示剂)                     溶液B(润湿剂)

70％(V/V)乙醇        2819ml       Maphos^60A    41g

MBTHSB               2.98g        70％(V/V)乙醇       205ml

(NH₄)ANS            25.83g

溶液B                205ml

2％DTPA              51.25ml

溶液(抗坏血酸盐原料)

水                   115ml

抗坏血酸             4.58g

乙醇                 267ml

溶液D(计时剂)

水                   53ml

抗坏血酸             8.75g

乙醇                 123ml

用70％乙醇调体积到175ml

葡萄糖溶液           40.5ml

对于每份抑制剂溶液而言，溶液A的体积都固定为263ml。对于不同的检测区，70％EtOH与溶液C的体积比从58.9变化为0.200，对所有抑制剂溶液来说，把70％EtOH+溶液C加入溶液A后的体积为87.5ml。这样仅有效地改变每份溶液中抑制剂的浓度。把含有浓度逐渐升高的抑制剂溶液和计时剂溶液(溶液D)一齐涂敷到膜的大孔面。调节沉积速率使每平方毫米膜上沉积～8×10^-5ml抑制剂。按上述方法将膜干燥，但在涂敷与干燥间停留约1.6分钟。结果表明计时剂约在60秒内与血液中30％到55％的血细胞比容或78到420mg/dL的葡萄糖对此几乎没有影响。

本领域普通技术人员应当明白以上描述和实施例是用来说明本发明的实施，但不是以任何方式对本发明进行限定的。在本发明的构思及保护范围内仍可作出本文所述的各种详细的实施方式。

Claims (25)

1.一种用于测量点在其上的生物体液样品中被分析物浓度的延长多层试纸，它包括：

a)一个底层，上有接受样品的直通孔；

b)一个膜层，上有正对底层的样品面，相反的另一面为检测面，膜层含\有能与被分析物反应发出变色的试剂，该试剂包括：

i)第一种成份，和被分析物作用形成过氧化氢；

ii)第二种成份，和过氧化氢作用发生颜色变化；和

iii)第三种成份，抑制第二种成份的变色；

c)介于膜层和底层之间的中间层；和

d)沿试纸分布样品的测量系统，它包括：

i)膜层中的非吸水区；和

ii)在中间层形成的液体输送通道，引导样品从非吸水区的表面流向沿膜层长度排列的多个分散的吸水检测区；抑制剂浓度以一种预定方式从试纸点样端开始增加，所以，如果影响变色的话，在样品必须含有相应增加的分析物的浓度；当样品点到试纸上时，一个或多个检测区可以改变颜色，而离点样端最远的变色区显示了样品中被分析物的浓度。

2.根据权利要求1的试纸，所述的被分析物是葡萄糖。

3.根据权利要求1的试纸，所述的生物体液是血液。

4.根据权利要求1的试纸，所述的底层包括热塑片。

5.根据权利要求4的试纸，所述的底层包括聚酯。

6.根据权利要求1的试纸，所述的底层还包括大量呈线性排列在检测区的直通孔。

7.根据权利要求1的试纸，所述的底层有一层透明部分，它位于离样品接受孔预定距离的位置，以保证适当的样品量。

8.根据权利要求1的试纸，所述的膜层是由一各向异性的多孔膜组成，膜的样品面附近的微孔稍大，在检测面附近为微孔稍小。

9.根据权利要求8的试纸，所述的微孔选用了一定的孔径，以使全血样品的红细胞在膜中诱离。

10.根据权利要求8的试纸，所述的膜是由聚砜组成的。

11.根据权利要求1的试纸，所述第一种成分是由葡萄糖氧化酶组成的。

12.根据权利要求1的试纸，所述的第二种成分是由一种过氧化酶和一种被氧化后变色的染料或染料对指示剂组成的。

13.根据权利要求12的试纸，所述的过氧化酶是辣根过氧化酶。

14.根据权利要求12的试纸，所述的染料或染料对指示剂是MBTHSB-ANS。

15.根据权利要求1的试纸，所述的第三种成分是由抗坏血酸组成的。

16.根据权利要求1的试纸，所述的试剂中还包括一种分离成份，它选自聚乙二醇，聚(甲基乙烯基醚/马来)酸酐，聚丙二醇，聚苯乙烯磺酸、聚丙烯酸、聚乙烯醇和聚乙烯磺酸。

17.根据权利要求1的试纸，所述的中间层是由一种热塑片组成的。

18.根据权利要求1的试纸，所述的中间层是由聚酯组成。

19.根据权利要求1的试纸，所述的吸水和非吸水区分别由膜层有非粉碎区和粉碎区组成。

20.根据权利要求1的试纸，还包括一个顶层，该顶层和膜层的上表面接触，上有呈线性排列在检测区的直通孔。

21.根据权利要求20的试纸，所述膜层粘附到顶层。

22.根据权利要求21的试纸，所述的膜层用一种粘合剂粘附到顶层，该顶层被限制在膜层的非吸水区。

23.根据权利要求1的试纸，它还包括吸收层，该吸收层与膜的各端连接。

24.根据权利要求1的试纸，它还包括一种计时剂成份，该成份组成一种检测区，该检测区除这种试剂外还包括一定量的葡萄糖，在样品点到试纸上的预定时间后，使检测区变色。

25.一种测量生物体液样品中被分析物浓度的方法，它由下列步骤组成：

a)在一种试纸上点样，该试纸包括：

i)多个吸水检测区，该检测区和至少含有一种预定量的被分析物接触时，每个检测区都会变色，体液中被分析物的预定量要大于靠近试纸点样端的检测区变色所需的被分析物的量，和

ii)测量系统，该测量系统会使样品沿着一种预定的非吸水区路径分布到每个检测区，和

b)观察远离试纸点样端的检测区的颜色变化。

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