CN115602318A - 一种基于色散的显微成像方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于色散的显微成像方法,涉及光学领域,特别涉及显微成像领域,其包括训练网络模型和计算重建三个部分。其中训练网络模型部分包括使用显微成像系统采集训练样本的不同轴向位置的色散强度叠加像和计算相位真值,获得训练样本的相位图,将训练样本的色散强度叠加像作为输入值,将相位图作为标准进行训练;计算重建部分包括采集待测样品的不间断视频帧,将其输入训练好的网络模型,获得待测样本的相位图。该方法优势在于,利用色散元件构建的不同轴向位置的叠加像,包含求解相位所需的完整信息,重建过程保真度高。
Description
技术领域
本发明涉及光学领域,特别涉及显微成像领域。
背景技术
病理诊断领域可分为组织病理、细胞病理、免疫组化病理和分子病理诊断。细胞病理诊断通过对病变部位获取或脱落的细胞进行成像,并从成像结果中提取形态学、结构、体积和位置等信息,有助于对多种器官和组织的病变进行定性观测,在术中检测等方面具有广泛的应用。
在具有高动态、高透明度和微形变等特点的细胞病理诊断领域,常用的成像方式大多以如下两种方式之一进行:第一,有标记(荧光)成像。即采用特定的染料或探针标记活细胞的待观察结构,以提高其成像对比度。这种方法特异性较强,但对细胞有较强光毒性,可能导致可观测时程下降,不利于长期检查。第二,无标记成像,其中常用的方法为定量相位成像,即利用细胞和介质中折射率的非均匀三维分布表征活体样本的相位信息,从而与背景产生较强的对比度,同时具有较强的轴向分辨能力。这种方法很大程度上缓解了光毒性对细胞的影响。此类无标记成像方法可被进一步细分为基于相干照明的方法和部分相干照明的方法。前者对光源的时间相关性要求较高,具有昂贵的成本和较高的系统实现难度。后者的经典实现方式为采集离焦图像计算轴向的强度微分,通过求解强度传输方程获得相位,该方法成本较低、实现复杂度较低,但是需要采集多张图像,在高动态性的活细胞成像中降低了采集的速率,甚至可能在重建中引入运动伪影,不利于生物活动的观测。此外,需要考虑微分方程求解的边界条件。为了解决这一问题,目前已有专利(CN109685745A)建议通过神经网络进行基于单次采集的相位成像,即,采集多张不同轴向位置的静态样本图像,用传统的强度传输方程求解相位,将该训练样本的在焦图和相应的相位图作为输入和真值对神经网络进行训练。之后采集样本的在焦图,输入训练好的网络以重建相位图像。根据衍射原理,该方法中仅依据在焦图像作为输入,其本身无法包含全面的相位信息,该求解过程存在较强的病态性,因此需要神经网络学习样本本身与相位成像原理无关的先验特征,因而对于不同的细胞或不同的采集环境需要重新采集大批静态样本数据进行训练,否则,算法的输出未知性很强,在实际操作中复杂性较高。
因此,现有的技术很难以简单、低成本的系统和简易的预/后处理流程,在单次拍摄中采集动态、高对比度的无标记活细胞图像用于术中检测。
因鉴于此,特提出此发明。
发明内容
本发明的第一部分,提供了一种基于色散的显微成像方法,其包含训练神经网络模型和计算重建两个过程,其中,
第一过程:训练神经网络模型,其包括:
S1.1采集相干光源或部分相干光源下的训练样本的色散强度叠加像(以下简称为叠加像);
S1.2获得训练样本的相位图像,其包括:
S1.2.1在特定波长λ的光源下,确定最佳焦平面,将焦平面移动到最佳焦平面两侧对称位置的离焦面,采集离焦图像I 1n (r)和I 2n (r),n=1 ,2 ,3 ,4,…,k,I 1n (r)和I 2n (r)表示第n个离焦图像中,位置为r点处的强度,离焦面与焦平面的距离均为;λ是S1.1中光源的波长范围内的任一值;
S1.2训练神经网络模型,将S1.1获得的色散强度叠加像,和S1.2获得的相位图像作为神经网络模型的输入,通过训练获得神经网络模型;
第二过程:计算重建,步骤包括:
S2.1在S1.1的条件下采集待测样本的不间断视频帧图;
S2.2将待测样本的不间断视频帧图输入训练好的神经网络模型,得到待测样本的相位图像;
所述采集是通过显微成像系统进行的。
进一步的,S1.1中所采用的光源可以是相干光源或部分相干光源,其中部分相干光源可以通过由具有光谱滤波器的明场光源、特定谱线的光源或激光合束提供;在一个具体实施方式中,采集叠加像时,轴向位置应选取在特定的光谱滤波器透过的波长范围对应的轴向位置范围内。
优选的,S1.1中采集至少1000张训练样本的叠加像,例如在一些实施方式中,可以采集1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或者更多张训练样本的叠加像。
在一些实施方式中,所述显微成像系统为色散显微镜,比如物镜和样本间设置有色散元件的显微镜或者物镜为色散物镜的显微镜;在一些实施方式中,所述显微成像系统为普通的光学显微镜,需要在采集图像部分开始前在样本和物镜之间安装色散元件。进一步的,所述色散显微镜或者色散元件能够分离不同不长对应的成像平面。通过色散显微镜或者色散元件的作用,使得明场照明中不同波长的组分在传感器上形成的像对应于不同的轴向像平面。
以普通的商用倒置显微镜为例,光源选用明场,首先在明场光源前侧加入特定的光谱滤波器,从而确定在传感器上形成的叠加像中所包含的波长和权重。其次,在物镜和样品之间加入具有低阿贝系数的光学玻璃,通过其色散能力实现分离不同波长对应的成像平面,其原理如图2所示。具体表现为:在传感器的同一点,在波长 和 下成像的实际轴向位置的最大距离可计算为
在另一个具体实施方式中,训练样本的色散强度叠加像是在以下条件下采集得到的:假设特定的光谱滤波器透过的波长范围的下限为λ1,上限为λ2,可以将光谱滤波器替换为透过波长为λ1的单带通滤光片,确定此时的最佳对焦轴向位置,然后向波长为λ2的最佳对焦轴向位置调整∆z/2,在该轴向位置进行叠加像的采集。
在一个具体实施方式中,所述色散元件为一种光学玻璃。
在一些实施方式中,所述显微成像系统为光学显微镜,其光源包含明场光源和光谱滤波器,在S1.1结束之后S1.2.1开始之前,将光谱滤波器替换为具有特定透过波长λ的带通滤光装置,或者将光路切换至具有特定波长λ的光路,其中,λ是S1.1中所使用的光源的波长范围内的任一值。
优选的,S1.2.中k≥1000,例如在一些实施方式中,k可以为1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或者更多。
进一步的,S1.2.2中相位真值的求取方法选自基于多轴向平面的算法、基于不对称照明、全息和空间光调制的方法或微分干涉相衬(DIC)成像模态的方法。
在一些具体实施方式中,S1.2.2中相位真值的求取方法为基于多轴向平面的算法,其强度传输方程为 ,其中, 为波数, 为在位置 处的强度, 为在位置 处的相位, 为轴向坐标, 为梯度算子, 是强度沿轴向的偏导数;将 和焦平面的强度分布 代入强度传输方程,通过求解该方程即获取相位真值 ;可以在S1.2时采集或者用理想的平场图像代替,所述理想的平场图像为所有元素都是1的矩阵。
进一步的,第一部分中的训练样本可以是任何可用于成像的样本,原则上尽可能增加待测样本的种类和数量。
进一步的,第二部分中的神经网络模型可以是任何用于图像转换的神经网络模型。
本发明的第二部分,提供了一种本发明第一部分的基于色散的显微成像方法在无标记的活细胞、组织或材料成像中的应用。
在一些实施方式中,所述应用为在术中的无标记活细胞成像中的应用。
本发明所采用的成像平台亦可采用商用或非商用显微成像系统,该显微成像系统可以是正置的或倒置的系统。可以对明场显微成像系统进行简单改进,每次仅需对活细胞样本按照常规采集流程采集一张图像,即可通过神经网络重建相位图像,从而实现对活细胞的动态无标记病理诊断。
本发明的优势包括:
本发明无需对活体样本进行标记,避免了复杂的预处理过程和对细胞可能的损害,在术中检查等领域应用方便。
本发明仅在网络训练阶段执行传统的多轴向位置采集,在投入实际应用后,每个观测帧只需采集一张明场图像,无需多次拍摄同一视野,即可求解图像,因此适用于对无标记活细胞进行实时视频成像,通过快速的神经网络处理,获取动态过程的相位信息,避免了对时间或空间分辨率的牺牲。
本发明只需对显微镜光源谱线进行调制,并在样本处加入基材,即可进行编码采集,进而用算法进行重建,且在相同的采集条件下,无需对不同类的活细胞样本进行网络的重新训练,且训练数据中输入与真值无需对齐,操作流程简单,成本较低,系统属轻量级,避免复杂的光路调制过程。
本发明重建的相位图像具有较高的轴向分辨能力,与明场成像相比对比度显著提高,避免了高透明度的活细胞与背景之间的混淆,便于后续对细胞形态学、体积和质量等的分析。
综上所述,本发明具有从单次拍摄中重建相位图像的能力,从而在无标记细胞病理诊断领域具有重要的意义。
本发明具有如下有益效果:
① 具有高的时间分辨率和全空间分辨率的细胞病理诊断方法,即,通过一次采集,利用色散元件的特性获取不同轴向位置的图像的叠加像,作为神经网络的输入,即可获得全视野的活细胞图像,适用于动态采集。
② 具有高的轴向分辨能力和高对比度的细胞病理诊断方法,即,采用神经网络重建的图像,是细胞的相位信息,可以表示为折射率沿特定光路的积分,从而反映细胞轴向高度的细微变化,与背景具有较明显的差异,便于与后续的细胞分割、体积计算、形态学分析等具体技术结合。
③ 具有低成本、轻量级的特点的细胞病理诊断方法,即,仅需对传统显微镜的明场成像模态做可撤销的调整,即可将其拍摄的明场图像用于重建活细胞的相位图像,无需复杂的光路调制。
④ 具有无标记、低损耗的特点的细胞病理诊断方法,即,在进行活细胞检查前,无需对细胞进行任何染色和探针标记处理,采用明场照明即可完成成像,对细胞光毒性较小。
⑤ 具有高泛化能力、高保真度的细胞病理诊断方法,即,神经网络的输入是利用色散元件构建的不同轴向位置的叠加图案,包含求解相位所需的完整信息,重建过程保真度高,因此,只需采集条件相同,对于不同类型的细胞样本无需重复训练,提高了方法的灵活性。
本发明创造有如下有益效果:
本发明提供了一个对用于细胞诊断的明场显微成像系统的简单改进,每次仅需对活细胞样本按照常规采集流程采集一张图像,即可通过神经网络重建相位图像,从而实现对活细胞的动态无标记病理诊断。
附图说明
图1是本发明的技术实现流程示意图。
图2是色散元件分离不同焦平面图案的原理示意图。
图3是训练网络模型所需的成对数据例。
图4是基于超分辨率卷积神经网络(SRCNN)结构的相位重建网络模型结构示意图。
具体实施方式
为更清楚的对本发明技术方案予以阐述,下面将结合具体实施方式对本发明的技术方案进行进一步阐述:
实施例1
显微镜:Nikon研究级倒置生物显微镜Eclipse Ti-E;
光谱滤波器:Semrock FF505/606-Di01-25x36;
色散玻璃:Schott N-SF66 厚度1.2mm;
训练样品:Hela细胞复苏后置于载玻片或培养皿中进行固定,然后采集;
待测样品:Hela细胞复苏后,置于活细胞培养皿中培养,进行采集;
其他未具体说明的材料和设备均通过常规市售途径获得。
训练神经网络模型过程:将色散玻璃放置在Nikon研究级倒置生物显微镜EclipseTi-E的物镜和训练样本之间,采集1000个训练样本的色散强度叠加像;将光谱滤波器替换为透过波长为λ(光谱滤波器波长范围内的任一值)的带通滤光片,确定最佳焦平面,将焦平面移动到最佳焦平面两侧对称位置的离焦面,采集1000张在焦图I(r)、离焦图像I 1 (r)和I 2 (r)。将上述数值和代入强度传输方程 ,通过求解该方程即获取相位真值 ,从而获得1000张训练样本的相位图像。
获得的色散强度叠加像和相应的相位图像作为神经网络模型的输入,通过训练获得神经网络模型;采用的网络结构如图4所示,其具有已被广泛使用的超分辨率卷积神经网络(SRCNN)结构,包含3个卷积层,其卷积核尺寸依次设置为[9,9,1,128]、[1,1,128,32]和[5,5,32,1]。输入网络的图像块大小为32×32像素,学习率为0.001,衰减率为0.995,每批数据训练1000次,采用的优化器为随机梯度优化算法(Stochastic Gradient Descent,SGD),在型号为NVIDIA GTX 1080Ti的图形处理单元(GPU)上,训练时间约为4小时。
计算重建过程:在采集色散强度叠加像的条件下采集待测样本的不间断视频帧图;将待测样本的不间断视频帧图输入训练好的神经网络模型,得到待测样本的相位图像。在对活细胞图像进行处理时,对256×256个像素的图像,重建时间仅需约0.012秒。
Claims (10)
1.一种基于色散的显微成像方法,其特征在于,其包含训练神经网络模型和计算重建两个过程,其中,
第一过程:训练神经网络模型,其包括:
S1.1采集相干光源或部分相干光源下的训练样本的色散强度叠加像;
S1.2获得训练样本的相位图像,其包括:
S1.2.1在特定波长λ的光源下,确定最佳焦平面,将焦平面移动到最佳焦平面两侧对称位置的离焦面,采集离焦图像I 1n (r)和I 2n (r),n=1 ,2 ,3 ,4,…,k,I 1n (r)和I 2n (r)表示第n个离焦图像中,位置为r点处的强度,离焦面与焦平面的距离均为;λ是S1.1中光源的波长范围内的任一值;
S1.3训练神经网络模型,将S1.1获得的色散强度叠加像和S1.2获得的相位图像作为神经网络模型的输入,通过训练获得神经网络模型;
第二过程:计算重建,步骤包括:
S2.1在S1.1的条件下采集待测样本的不间断视频帧图;
S2.2将待测样本的不间断视频帧图输入训练好的神经网络模型,得到待测样本的相位图像;
所述采集是通过显微成像系统进行的。
2.根据权利要求1所述的基于色散的显微成像方法,其特征在于,S1.1中部分相干光源由设置了光谱滤波器的明场光源、特定波长的光源或激光合束提供,所述光谱滤波器的波长范围在λ1和λ2之间,所述特定波长的值是λ1和λ2,所述λ是λ1和λ2之间的任一值。
3.根据权利要求2所述的基于色散的显微成像方法,其特征在于,所述部分相干光源由特定谱线λ1和λ2的光源提供时,先分别确定波长为λ1和λ2时的最佳对焦轴向位置,然后在两个最佳对焦轴向位置的中间点进行色散强度叠加像的采集。
4.根据权利要求1所述的基于色散的显微成像方法,其特征在于,该方法中使用的显微成像系统为光学显微镜。
5.根据权利要求4所述的基于色散的显微成像方法,其特征在于,所述光学显微镜为色散显微镜或者非色散显微镜,当所述光学显微镜为非色散显微镜时,在采集开始前在样本和物镜之间放置色散元件,所述色散显微镜或色散元件能够分离不同波长对应的成像平面。
6.根据权利要求5所述的基于色散的显微成像方法,其特征在于,所述色散元件为一种光学玻璃。
7.根据权利要求1所述的基于色散的显微成像方法,其特征在于,S1.2.2中相位真值的求取方法为基于多轴向平面的算法、基于不对称照明、全息和空间光调制的方法或微分干涉相衬成像模态的方法中的一种。
9.权利要求1-8任一项所述基于色散的显微成像方法在无标记的活细胞、组织或材料成像中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于,其为在术中无标记活细胞成像中的应用。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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