CN115595323A - 一种环状转座子复合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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曹张磊
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Abstract

本发明公开了一种环状转座子复合物及其制备方法与应用。所述环状转座子复合物包括转座酶和接头序列，所述接头序列包括转座子结合序列、barcode序列、环状序列、barcode反向互补序列、转座子反向互补结合序列；其中所述接头序列中两端分别为转座子结合序列和转座子反向互补结合序列，所述barcode序列、barcode反向互补序列分别与转座子结合序列、转座子反向互补结合序列连接，所述环状序列位于barcode序列、barcode反向互补序列之间。本发明使用环状转座子复合物构建文库的方法，操作简便，且节省时间，为新一代测序的发展与其广泛应用奠定基础。

Description

一种环状转座子复合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于测序技术领域，具体涉及一种环状转座子复合物及其制备方法与应用。
背景技术
DNA测序技术作为一种重要的实验技术，在生物研究中有着广泛的应用。自从Sanger发明DNA双脱氧链终止法测序，并应用其测定了第一个噬菌体基因组序列，由此开始，生命科学的研究便进入了基因组学的时代。测序技术经过长期不断地改进，已取得了令人瞩目的进展，为生命科学领域开辟了新的视角，使科研水平达到了新的高度。然而随着科技的发展，传统的第一代测序耗时长、成本高的特点已经不能满足日常科研的需求，第二代测序克服一代测序的缺点，凭借其费用低、通量高、速度快的优势被大规模地商业化使用，但是读长短、扩增引碱基错配等缺点也制约其进一步发展，随着大数据时代的到来，逐渐出现了第三代单分子测序，第三代单分子测序凭借其无需PCR扩增、超长读长、无碱基偏好性、表观遗传学检测等优势，彻底改变了分子生物学和基因组学的研究，使商业化测序逐步改变为“2+3”的模式。
Pacbio第三代测序技术基于边合成边测序的原理，以SMRT芯片为载体进行测序反应，其基本原理为：通过基因组机械随机打断成长片段，碱基修复后，与单链环状接头相连接，制成哑铃状文库，所制备的环状文库分散到不同的ZMW(Zero-mode waveguides，零模波导孔)纳米孔底部，与测序引物、DNA聚合酶、四色荧光标记四种dNTP发生聚合反应，在碱基配对时，根据荧光信号种类和荧光信号持续时间来确定所测碱基类型。Pacbio平台标准的文库制备(如图2所示)通常采用打断仪(如Covaris公司)等对靶基因进行机械打断，文库制备操作为：(1)DNA片段化；(2)DNA末端修复；(3)连接接头；(4)文库片段纯化。虽然机械打断的片段随机性较好，但是该方法后续要单独进行末端处理、加接头以及纯化等操作，步骤较多，操作繁琐，耗时费力，并且对核酸片段有损伤，前期为了获得高质量的长片段DNA，需要依赖Covaris公司的g-Tube剪切管耗材，并且需要配备相应的仪器，成本较高，这在很大程度上限制了其广泛应用。因此，需要开发操作简单、高效且成本较低的适合Pacbio平台的第三代测序基因文库构建技术。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种环状转座子复合物及其制备方法与应用，以克服现有技术的不足。
为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：
本发明实施例提供了一种环状转座子复合物，其包括转座酶和接头序列，所述接头序列包括转座子结合序列、barcode序列、环状序列、barcode反向互补序列、转座子反向互补结合序列；其中所述接头序列中两端分别为转座子结合序列和转座子反向互补结合序列，所述barcode序列、barcode反向互补序列分别与转座子结合序列、转座子反向互补结合序列连接，所述环状序列位于barcode序列、barcode反向互补序列之间。
本发明实施例还提供了前述的环状转座子复合物的制备方法，其包括：将接头序列与转座酶进行孵育获得环状转座子复合物。
本发明实施例还提供了前述的环状转座子复合物于构建基因测序文库中的用途。
本发明实施例还提供了一种基因测序文库的构建方法，其包括：
采用前述方法制备环状转座子复合物；
将所述环状转座子复合物与靶DNA混合进行酶切处理，获得酶切产物；
以及，对所述酶切产物进行修补连接处理，获得哑铃环状DNA文库。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：传统的Pacbio测序文库构建方法步骤较多，操作繁琐，成本昂贵，耗时费力，完成建库需要至少6h，所需DNA模板量较大，通常需要5.0μg作为建库模板。本发明利用转座酶进行文库构建，在片段化目的序列的同时，两端连接上环状接头序列，方法操作简便，建库效率高，仅需2h即可完成全部文库构建，所需基因组量也大幅下降，200.0ng基因组足以建库，并且该方法省去前期机械打断所需的仪器及耗材费用，该方法成本显著低于Pacbio公司的商品化试剂盒，对实验设备和反应条件的要求较低，除此之外，本发明还适用于其他长链单分子滚环测序文库的制备，有利于新一代测序技术在生命科学与精准医疗产业的广泛推广应用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一典型实施方案中设计的Tn5转座酶接头序列结构示意图；
图2为现有技术中Pacbio文库构建示意图；
图3为本发明一典型实施方案中文库构建示意图；
图4为本发明实施例1中Tn5转座子复合物酶切基因组序列的DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图5为本发明实施例1中利用phi 29DNA聚合酶扩增验证的DNA琼脂糖凝胶电泳图；
图6为本发明实施例2中利用phi 29DNA聚合酶扩增验证的DNA琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
鉴于现有技术的缺陷，本案发明人经长期研究和大量实践，得以提出本发明的技术方案，本发明采用Tn5转座酶在片段化目的基因的同时在其两端加上测序接头，提高了文库构建效率。不仅如此，本发明还可适用于其他长链单分子滚环测序文库的制备，为生物科研与精准医疗行业的发展奠定基础。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例的一个方面提供了一种环状转座子复合物，其包括转座酶和接头序列，所述接头序列包括转座子结合序列、barcode序列、环状序列、barcode反向互补序列、转座子反向互补结合序列；其中所述接头序列中两端分别为转座子结合序列和转座子反向互补结合序列，所述barcode序列、barcode反向互补序列分别与转座子结合序列、转座子反向互补结合序列连接，所述环状序列位于barcode序列、barcode反向互补序列之间。
进一步的，所述转座子结合序列为转座子特异性结合的双链核苷酸序列。
进一步的，所述barcode序列为具有10～20个碱基的特异性双链核苷酸引物，至少用于识别测序数据。
进一步的，所述环状序列为具有25～35个碱基的特异性单链核苷酸引物，至少用于测序引物的匹配识别。
具体的，所述接头序列的结构可以如图1所示，所述每个转座子结合序列为转座子特异性结合的双链核苷酸序列，以Tn5转座酶为例，所述转座子结合序列为5’-CTGTCTCTTATACACATCT；所述每个barcode序列具有10～20个碱基的特异性双链核苷酸引物，用于识别测序数据；所述每个环状序列具有25～35个碱基的特异性单链核苷酸引物，用于测序引物匹配识别。
更为具体的，所述接头的序列可以如SEQ ID NO.1所示，引物为：5’P-CTGTCTCTTATACACATCTATCTCTCTCTTTTCCTCCTCCTCCGTTGTTGTTGTTGAGAGAGATAGATGTGTATAAGAGACAG，如图1所示。
在一些较为具体的实施方案中，所述转座酶包括Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn5转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn9转座酶、Tn10转座酶、Tgf2转座酶、To12转座酶、Tc1转座酶、Tgm9转座酶、PiggyBac转座酶、Sleeping Beauty转座酶、Mos1转座酶、Himar1转座酶、Hsmar1转座酶、AcTPase转座酶、Gal4DBD转座酶、P转座酶中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述转座酶包括Tn5转座酶，且不限于此。
进一步的，所述Tn5转座酶可以将核酸打断成片段，同时在序列两端连接上接头序列。
进一步的，所述转座酶包括Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn5转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn9转座酶、Tn10转座酶、Tgf2转座酶、Tol2转座酶、Tc1转座酶、Tgm9转座酶、PiggyBac转座酶、Sleeping Beauty转座酶、Mos1转座酶、Himar1转座酶、Hsmar1转座酶、AcTPase转座酶、Gal4DBD转座酶、P转座酶中的任意一种突变改造后的转座酶，且不限于此。
具体的，本发明中接头序列结构为“Tn5转座子结合序列-barcode序列-测序引物单链序列-barcode反向互补序列-Tn5转座子反向互补结合序列”，其中barcode序列和测序引物单链序列可以不唯一，组成顺序固定。因此，当barcode序列不同时，这种结构的每个转座子所能提供的，是两个不同的完全精确的接头序列，确保了断裂片段两端的接头种类不同，使靶基因利用率得到最大化。
本发明实施例的一个方面还提供了前述的环状转座子复合物的制备方法，其包括：将接头序列与转座酶进行孵育获得环状转座子复合物。
在一些较为具体的实施方案中，所述制备方法包括：将所述接头序列与转座酶进行混合，并于20～25℃下振荡处理30～60min，获得所述环状转座子复合物，其中，所述接头序列与转座酶的摩尔比为2∶1～1∶2，所述振荡处理的速度为100～200r/min。
进一步的，所述接头序列与转座酶的摩尔比为2∶1、1∶1、1∶2中的任一者，优选为1∶2。
进一步的，所述振荡处理的温度为24℃。
进一步的，振荡处理的速度为120r/min，时间为60min。
本发明实施例的一个方面还提供了前述的环状转座子复合物于构建基因测序文库中的用途。
进一步的，所述基因测序文库包括长链单分子滚环测序文库。
例如，所述基因测序文库包括Pacbio文库和/或Nanojet文库，且不限于此。
本发明实施例的另一个方面还提供了一种基因测序文库的构建方法，其包括：
采用前述的环状转座子复合物；
将所述环状转座子复合物与靶DNA混合进行酶切处理，获得酶切产物；
以及，对所述酶切产物进行修补连接处理，获得哑铃环状DNA文库。
具体的，所述基因测序文库的构建方法可以包括：
(1)将接头DNA序列与转座子孵育结合，制备环状转座子复合物；
(2)将获得的环状转座子复合物与靶DNA作用，获得酶切产物；
(3)将修补酶和连接酶与上述酶切产物作用，也可直接采用5’磷酸化的9bp碱基随机引物进行连接，修补连接后获得完整的哑铃环状DNA文库。
在一些较为具体的实施方案中，所述环状转座子复合物制备方法具体包括：将所述接头序列与转座酶按照摩尔比2∶1，1∶1，1∶2进行混合，于20～25℃温度下，振荡速度为100～200r/min和振荡时间为30～60min条件下进行，获得所述环状转座子复合物。
进一步的，所述接头序列与转座酶摩尔比为1∶2，振荡温度为24℃，振荡速度为120r/min，孵育时间为60min。
在一些较为具体的实施方案中，所述构建方法具体包括：将所述环状转座子复合物与靶DNA混合，并于53～57℃酶切处理4～6min，获得所述酶切产物。
进一步的，所述环状转座子复合物与靶DNA酶切处理的温度为55℃，时间为5min。
进一步的，所述酶切产物包括酶切核酸。
进一步的，所述酶切核酸的长度为5～30kbp。
在一些较为具体的实施方案中，所述构建方法具体包括：将修补酶与所述酶切产物混合，并于20～30℃修补处理20～60min，之后加入连接酶并于16～25℃连接处理2～8h，获得所述哑铃环状DNA文库。
进一步的，所述修补处理的温度为25℃，时间为30min。
进一步的，所述连接处理的温度为16℃，时间为4h。
进一步的，所述修补酶为聚合酶与T4多聚核苷酸激酶的混合物，且不限于此。
进一步的，所述聚合酶包括T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、Sulfolobus DNA聚合酶IV、Bst DNA聚合酶中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述修补酶为T4 DNA聚合酶与T4多聚核苷酸激酶的混合物，且不限于此。
进一步的，所述连接酶包括Taq DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、9°NTM DNA连接酶、
Figure BDA0003155713760000051
连接酶、RtcB连接酶中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述连接酶为T4 DNA连接酶。
在一些较为具体的实施方案中，所述构建方法还具体包括：采用5’磷酸化的9bp碱基随机引物对所述酶切产物进行修补连接处理，获得所述哑铃环状DNA文库。
在一些较为具体的实施方案中，所述构建方法还包括：在所述修补连接处理完成后，对所获产物进行磁珠纯化处理。
在一些较为具体的实施方案中，所述构建方法还包括：在所述修补连接处理完成后，采用核酸酶降解所获产物中未环化线性的核酸片段。
进一步的，所述核酸酶包括λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶V、核酸外切酶VII、核酸外切酶VIII、Lambda核酸外切酶、核酸外切酶T、RecJ核酸外切酶、BAL-31核酸酶、绿豆核酸酶、微球菌核酸酶、T7核酸内切酶I、DNase I中的任意一种或两种以上的组合，且不限于此。
进一步的，所述核酸酶包括核酸外切酶I，且不限于此。
在一些较为具体的实施方案中，所述构建方法还包括：采用phi29DNA聚合酶对所获哑铃环状DNA文库进行置换扩增，从而检测基因测序文库是否构建成功。
在一些较为具体的实施方案中，所述靶DNA的来源包括菌体、细胞、组织或微量DNA样品。
具体的，本发明通过上述环状转座子复合物“先插入、再切断”，一步完成“片段化、加标签”的全过程，随后通过修补酶进行缺口的修复与连接酶的连接，提高文库构建效率，使操作更加简便。
在一些更为具体的实施方案中，所述基因测序文库的构建方法可以包括：
(1)获取接头序列；
(2)获取环状Tn5转座子复合物；
(3)将环状Tn5转座子复合物与基因组进行酶切；
(4)利用修补酶进行缺口的修复，并用连接酶进行连接；
(5)使用消化酶降解未环化线性的核酸片段；
(6)对修补后的环状核酸文库进行磁珠纯化，最终获得哑铃环状DNA文库。
本发明使用Tn5转座酶与接头序列一端有转座子结合序列所组成的环状转座子复合物，并将其与核酸序列进行孵育酶切。此时，核酸序列随机断裂，同时接头序列连接至断裂序列两端，并在序列两侧产生9bp碱基缺口。酶切断裂后的序列片段并未形成封闭环状，需要用修补酶对酶切后的缺口进行修复，随后用连接酶进行连接，也可直接采用5’磷酸化的9bp碱基随机引物进行连接。修复连接后的序列片段需要进行核酸酶的酶解反应，降解未环化的线性核酸片段，为后续序列纯化实验奠定基础。
作为优选技术方案，所述转座酶优选为转座酶Tn5，其它这类转座酶也适用于本发明。
作为优选技术方案，所述转座酶结合序列为转座酶Tn5识别的19bp的嵌合端转座子末端，环状接头序列并不局限于本案例序列，除了转座子结合序列固定外，barcode序列和测序引物序列以及它们前后或者之间还可以有若干附加的碱基序列或连接序列。
作为优选技术方案，所述修补方式采用修补酶和连接酶作用的方式进行修补连接。修补酶优选T4 DNA聚合酶和T4多核苷酸激酶，连接酶优选T4 DNA连接酶。其他类似聚合酶和连接酶也适用于本发明。此外，修补方式还包括5’磷酸化的9bp碱基随机引物对缺口的连接修补。
作为优选技术方案，所述核酸酶优选Exonuclease I，对未修补连接环化的文库进行消化，其他类似的核酸酶也适用于本发明。
本发明利用环状转座子复合物与酶解反应相结合，随机酶切基因组的同时，在断裂形成的DNA末端引入接头序列的技术。通过调整反应体系中环状转座子与基因组浓度、体外转座反应的具体条件，可以控制酶切片段的长度分布，可制备长度为5～30kbp的核酸文库。
本发明在优选条件下，在形成环状转座子复合物后，可对其进行纯化操作，去除未与接头序列结合的Tn5转座酶，获得纯度较高的环状转座子提高转座效率，使得酶切效果更好，实验结果更加稳定。
本发明中基因测序文库的构建原理示意图如图3所示，本发明利用Tn5转座酶一步完成DNA打断和测序接头连接的原理为：Tn5转座酶结合序列与其互补序列退火形成接头序列，然后将接头序列与Tn5转座酶孵育形成转座酶复合物，再将该复合物与靶基因进行转座打断获得两端带有环状接头序列的DNA片段，通过修补连接后得到哑铃环状DNA文库，核酸酶去除未环化片段后，磁珠回收核酸文库。
下面结合若干优选实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，本实施例在以发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
下面所用的实施例中所采用的实验材料，如无特殊说明，均可由常规的生化试剂公司购买得到。
实施例1通过dNTP修补缺口构建哑铃型环状测序文库
(1)全基因组的提取
选择已被全基因组测序的细菌基因组Escherichia coliDH5α作为样本。将其培养至最佳状态(OD600约为0.8)，收集菌体，提取全基因组，并用Nanodrop分光光度计和Qubit高灵敏DNA测试试剂(Thermo Fisher Scientific公司)做DNA定量定性检测。
取200.0ng的gDNA来完成本发明Tn5转座酶文库构建。
(2)接头序列准备
本案例设计的接头序列为：
Figure BDA0003155713760000081
将合成的单链DNA粉末用1×TE溶液溶解，终浓度为100μM，退火反应体系如下：
Pac-Me序列 10.0μL
10×TE buffer 4.0μL
ddH<sub>2</sub>O 26.0μL
退火产物条件为：95℃，10min，缓慢过夜冷却至室温。反应后取1.0μL于2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，其余的置于-20℃保存。
(3)环状转座子复合物的制备
Tn5 mix配置反应体系如下：
Pac-Me退火溶液 1.0μL
2×Mixing buffer 25.0μL
Tn5 ase 2.0μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 50.0μL
Tn5转座酶mix反应缓冲液为转座酶配套试剂，均为Lucigen公司生产。将上述反应成分混匀后，所述接头序列与转座酶摩尔比按照1∶2混加，孵育温度为24℃，振荡速度为120r/min，振荡孵育1h，形成环状转座子复合物，该复合物于-20℃保存备用。
(4)DNA的酶切及终止
于冰上解冻转座反应缓冲液，混匀后备用。
配置反应体系如下：
gDNA(50ng/μL) 1.0μL
5×Tag buffer 4.0μL
Tn5 mix 2.0μL
ddH<sub>2</sub>O 13.0μL
5×Tag buffer：20mMTris-Ac，20mMMgAc，50％DMF，pH＝7.6.
充分混匀后置于PCR仪上按如下程序进行反应。
Figure BDA0003155713760000082
反应完成后，65℃加热失活20min，随后，用1.2倍体积的Ampure XP Beads进行纯化，溶于30.0μL的TE。所选用的磁珠均为Beckman公司生产。酶切产物的凝胶电泳图4所示。
(5)缺口修补
本案例选用T4 DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶作为修补酶，为上海生工生物工程有限公司生产，采用两种酶同时修补的方式进行修补。在PCR管中配置如下反应体系。
sheared dsDNA 1.0-5.0μg
10×End Repair Buffer 10.0μL
End Repair Enzyme Mix 1.0μL
ddH2O Up to 100.0μL
KAPA End Repair Enzyme Mix：3,000U/mL T4 DNA Polymerase和10,000U/mLT4Polynucleotide Kinase按照体积比1∶1混匀。
10×End Repair Buffer：50mMTris-HCl，100mM MgCl2，100mM DTT，8mM ATP，5mMdNTPs.
充分混匀后，置于PCR仪上，20℃反应30min。
完成后，用1.2倍体积的Ampure XP Beads进行纯化，溶于30.0μL的TE。
(6)连接反应
本案例选用T4 DNA ligase进行连接反应，为New England Biolabs公司生产。PCR管中配置如下反应体系。
片段模板 40.0ng
10×T4 DNA ligation Buffer 2.0μL
T4 DNA ligase 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 20.0μL
充分混匀后，置于PCR仪上，16℃反应2h。
(7)酶切验证
本案例选用Exonuclease I进行酶切验证，为New England Biolabs公司生产。在PCR管中配置如下反应体系。
修补后样本 100.0ng
10×Exonuclease I buffer 2.0μL
Exonuclease I 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 20.0μL
10×Exonuclease I buffer：670mM Glycine-KOH，10mM DTT，67mM MgCl2。
在37℃下反应30min，随后用磁珠进行核酸片段回收。
(8)扩增验证
取上述1.0μL样本作为模板，用phi 29polymerase进行扩增验证，DNA琼脂糖凝胶电泳图，如图5所示。本案例设计测序验证引物序列为P验：AACGGAGGAGGAGGA，引物序列由上海生工生物工程有限公司生产。
在PCR管中配置如下反应体系。
模板 1.0μg
10×phi 29polymerase buffer 2.0μL
ddH2O Up to 19.0μL
充分混匀后，置于PCR仪上，95℃反应5min，立即至于冰上冷却3min，加1.0μLphi29polymerase，30℃反应4h，随后取5.0μL进行凝胶电泳，如图5所示。
实施例2通过9bp随机引物修补缺口构建哑铃型环状测序文库
(1)全基因组的提取
选择已被全基因组测序的真菌基因组Aspergillusniger CBS 513.88作为样本。将其培养至最佳状态，收集菌丝，提取全基因组，并用Nanodrop分光光度计和Qubit高灵敏DNA测试试剂(Thermo Fisher Scientific公司)做DNA定量定性检测。
取200.0ng的gDNA来完成本发明Tn5转座酶文库构建。
(2)接头序列准备
本案例设计的接头序列为：
Figure BDA0003155713760000101
将合成的单链DNA粉末用1×TE溶液溶解，终浓度为100μM，退火反应体系如下：
Pac-Me序列 10.0μL
10×TE buffer 4.0μL
ddH<sub>2</sub>O 26.0μL
退火产物条件为：95℃，10min，缓慢过夜冷却至室温。反应后取1.0μL于2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，其余的置于-20℃保存。
(3)环状转座子复合物的制备
Tn5 mix配置反应体系如下：
Figure BDA0003155713760000102
Figure BDA0003155713760000111
Tn5转座酶mix反应缓冲液为转座酶配套试剂，均为Lucigen公司生产。将上述反应成分混匀后，所述接头序列与转座酶摩尔比按照2∶1混加，孵育温度为20℃，振荡速度为200r/min，振荡孵育30min，形成环状转座子复合物，该复合物于-20℃保存备用。
(4)DNA的酶切及终止
于冰上解冻转座反应缓冲液，混匀后备用。
配置反应体系如下：
gDNA(50ng/μL) 1.0μL
5×Tag buffer 4.0μL
Tn5 mix 2.0μL
ddH<sub>2</sub>O 13.0μL
5×Tag buffer：20mMTris-Ac，20mMMgAc，50％DMF，pH＝7.6.
充分混匀后置于PCR仪上按如下程序进行反应。
热盖 105℃
57℃ 6min
反应完成后，65℃加热失活20min，随后，用1.2倍体积的Ampure XP Beads进行纯化，溶于30.0μL的TE。所选用的磁珠均为Beckman公司生产。酶切产物的凝胶电泳图4所示。
(5)缺口修补
本案例选用9bp随机引物(PRandom：5’P-NNNNNNNNN)进行修补，引物由上海生工生物工程有限公司生产。在PCR管中配置如下反应体系。
sheared dsDNA 1.0-5.0μg
P<sub>Ra2dom</sub> 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 20.0μL
充分混匀后置于PCR仪上按如下程序进行反应。
热盖 105℃
95℃ 5min
85℃ 5min
75℃ 5min
65℃ 5min
55℃ 5min
45℃ 5min
35℃ 5min
25℃ 5min
反应完成后，冰上放置5min。
(6)连接反应
本案例选用TaqDNA ligase进行连接反应，为New England Biolabs公司生产。PCR管中配置如下反应体系。
片段模板 40.0ng
10×Taq DNA ligation Buffer 2.0μL
TaqDNA ligase 1.0μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 20.0μL
充分混匀后，置于PCR仪上，45℃反应30min。
(7)酶切验证
本案例选用Exonuclease I和ExonucleaseV混合进行酶切验证，两者均为NewEngland Biolabs公司生产。在PCR管中配置如下反应体系。
修补后样本 100.0ng
Exonuclease V 0.5μL
Exonuclease I 0.5μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 20.0μL
在37℃下反应60min，随后用磁珠进行核酸片段回收。
(8)扩增验证
取上述1.0μL样本作为模板，用phi 29polymerase进行扩增验证，DNA琼脂糖凝胶电泳图，如图5所示。本案例设计测序验证引物序列为P验：AACGGAGGAGGAGGA，引物序列由上海生工生物工程有限公司生产。
在PCR管中配置如下反应体系。
模板 1.0μg
10×phi 29polymerase buffer 2.0μL
ddH<sub>2</sub>O Up to 19.0μL
充分混匀后，置于PCR仪上，95℃反应5min，立即至于冰上冷却3min，加1.0μLphi29polymerase，30℃反应4h，随后取5.0μL进行凝胶电泳，如图6所示。
此外，本案发明人还参照前述实施例，以本说明书述及的其它原料、工艺操作、工艺条件进行了试验，并均获得了较为理想的结果。
应当理解，本发明的技术方案不限于上述具体实施案例的限制，凡是在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落于本发明的保护范围之内。
Figure BDA0003155713760000131
序列表
<110> 中国科学院宁波材料技术与工程研究所慈溪生物医学工程研究所，中国科学院宁波材料技术与工程研究所
<120> 一种环状转座子复合物及其制备方法与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
ctgtctctta tacacatcta tctctctctt ttcctcctcc tccgttgttg ttgttgagag 60
agatagatgt gtataagaga cag 83

Claims (10)

1.一种环状转座子复合物，其特征在于包括转座酶和接头序列，所述接头序列包括转座子结合序列、barcode序列、环状序列、barcode反向互补序列、转座子反向互补结合序列；其中所述接头序列中两端分别为转座子结合序列和转座子反向互补结合序列，所述barcode序列、barcode反向互补序列分别与转座子结合序列、转座子反向互补结合序列连接，所述环状序列位于barcode序列、barcode反向互补序列之间；
优选的，所述转座子结合序列为转座子特异性结合的双链核苷酸序列；
优选的，所述barcode序列为具有10～20个碱基的特异性双链核苷酸引物，至少用于识别测序数据；
优选的，所述环状序列为具有25～35个碱基的特异性单链核苷酸引物，至少用于测序引物的匹配识别。
2.根据权利要求1所述的环状转座子复合物，其特征在于：所述转座酶包括Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn5转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn9转座酶、Tn10转座酶、Tgf2转座酶、Tol2转座酶、Tc1转座酶、Tgm9转座酶、PiggyBac转座酶、SleepingBeauty转座酶、Mos1转座酶、Himar1转座酶、Hsmar1转座酶、AcTPase转座酶、Gal4DBD转座酶、P转座酶中的任意一种或两种以上的组合；
和/或，所述转座酶包括Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn5转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn9转座酶、Tn10转座酶、Tgf2转座酶、Tol2转座酶、Tc1转座酶、Tgm9转座酶、PiggyBac转座酶、Sleeping Beauty转座酶、Mos1转座酶、Himar1转座酶、Hsmar1转座酶、AcTPase转座酶、Gal4DBD转座酶、P转座酶中的任意一种突变改造后的转座酶。
3.权利要求1或2所述的环状转座子复合物的制备方法，其特征在于包括：将接头序列与转座酶进行孵育获得环状转座子复合物；
优选的，所述制备方法具体包括：将所述接头序列与转座酶进行混合，并于20～25℃下振荡处理30～60min，获得所述环状转座子复合物，其中，所述接头序列与转座酶的摩尔比为2∶1～1∶2，所述振荡处理的速度为100～200r/min。
4.权利要求1或2所述的环状转座子复合物于构建基因测序文库中的用途；优选的，所述基因测序文库包括长链单分子滚环测序文库；尤其优选为Pacbio文库和/或Nanojet文库。
5.一种基因测序文库的构建方法，其特征在于包括：
采用权利要求1或2所述的环状转座子复合物；
将所述环状转座子复合物与靶DNA混合进行酶切处理，获得酶切产物；
以及，对所述酶切产物进行修补连接处理，获得哑铃型环状DNA文库。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于具体包括：将所述环状转座子复合物与靶DNA混合，并于53～57℃酶切处理4～6min，获得所述酶切产物。
7.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于具体包括：将修补酶与所述酶切产物混合，并于20～30℃修补处理20～60min，之后加入连接酶并于16～25℃连接处理2～8h，获得所述哑铃环状DNA文库；
和/或，采用5’磷酸化的9bp碱基随机引物对所述酶切产物进行修补连接处理，获得所述哑铃型环状DNA文库。
8.根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于：所述修补酶为聚合酶与T4多聚核苷酸激酶的混合物；优选的，所述聚合酶包括T4 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、Bsu DNA聚合酶、SulfolobusDNA聚合酶IV、Bst DNA聚合酶中的任意一种或两种以上的组合；
和/或，所述连接酶包括Taq DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T4 DNA连接酶、T7 DNA连接酶、E.coli DNA连接酶、9°NTM DNA连接酶、
Figure FDA0003155713750000021
连接酶、RtcB连接酶中的任意一种或两种以上的组合。
9.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于还包括：在所述修补连接处理完成后，对所获产物进行磁珠纯化处理；
和/或，所述构建方法还包括：在所述修补连接处理完成后，采用核酸酶降解所获产物中未环化线性的核酸片段；优选的，所述核酸酶包括λ核酸外切酶、T5核酸外切酶、T7核酸外切酶、核酸外切酶I、核酸外切酶III、核酸外切酶V、核酸外切酶VII、核酸外切酶VIII、Lambda核酸外切酶、核酸外切酶T、RecJ核酸外切酶、BAL-31核酸酶、绿豆核酸酶、微球菌核酸酶、T7核酸内切酶I、DNase I中的任意一种或两种以上的组合；
和/或，所述构建方法还包括：采用phi29 DNA聚合酶对所获哑铃环状DNA文库进行置换扩增，从而检测基因测序文库是否构建成功。
10.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：所述靶DNA的来源包括菌体、细胞、组织或微量DNA样品。
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