CN115595267A - 细胞治疗用生物芯片及其制造方法 - Google Patents

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Abstract

一种细胞治疗用生物芯片，其包含：一载体；一第一细胞组织培养区，其自该载体顶面向凹设于该载体中；以及一第二细胞组织培养区，其自该第一细胞组织培养区底面向下凹设于该载体中；该细胞治疗用生物芯片可作为体外测试模块，改善既有细胞测试、动物实验所面临的不准确或限制，且应用于癌症细胞治疗测试、药物筛检的用途。

Description

细胞治疗用生物芯片及其制造方法
技术领域
本发明涉及一种生物芯片，特别是一种细胞治疗用的生物芯片以及其制造方法。
本发明所提供的细胞治疗用生物芯片以下将首要以癌症治疗为实施例进行说明与解析，唯本发明所提供的生物芯片除癌症单一应用外，其余适应症或应用也应涵盖于本发明所宣称的范围内。
背景技术
生物芯片近年来飞快崛起，许多科学家或开发业者投身研究。生物芯片的设计理念主要是以半导体加工方法为核心的微流控技术搭配细胞生物学的概念，作为体外解析人类生命现象，探究人体生理活动以及疾病过程，并寻求有效治疗的方案。
尽管近百年来生物学的发展已经大幅改善并促进了人类的生命健康福祉，但是目前大量的生物科学实验仍停留在相当简易的细胞培养与检测方式。开发研究人员将细胞接种培养借此研究与观察细胞的型态与行为。这种过于简化的研究方式，不仅难以反映人体内复杂的组织器官功能特点，更难以反映人体组织器官对外界刺激产生的真实情况。
动物性实验虽然可提供较为全面的细胞、组织与器官间的体内运作信息，但是仍存在实验动物与人体间种属差异，以及对实际人体反应预测能力较差等显著不足问题，又随着美国、欧盟等先进国家逐渐禁止动物性实验的法规禁令上路，这些迫切需求催生了人体生物芯片这一新兴技术的出现，同时也为解决上述瓶颈问题提供了一种基于组织和器官水平的创新研究体系和系统解决方案。
通过生物芯片上的器官生理微系统，科学家们已经可在体外仿真人体不同组织器官的主要结构功能特征与复杂的器官间的联系，用以预测人体对药物或外界不同刺激产生的反应，这在生命科学、医学研究、新药研发、药物预测、美容化妆品检测和生物防御等领域具有广泛的应用前景。
另一方面，生物芯片目前并未有任何技术应用于细胞治疗或细胞疗法的癌症医疗技术，此种技术主要是通过自体特定的健康细胞修补的方式，让受损的组织恢复部分或甚至是全部功能，例如干细胞疗法、免疫细胞疗法已经应用在中风、癌症、脊椎损伤、烧烫伤美容等的治疗上，但细胞治疗技术仰赖前端的免疫细胞培养，搭配生物芯片的体外仿真效能，该如何将生物芯片技术导入细胞治疗中是一项急待解决的问题。
发明内容
为了解决既有的细胞培养、动物性实验等检测方式的技术瓶颈与受限于各国法令不同而无法实施于各国之间的问题，本发明提供一种细胞治疗用的生物芯片以解决或至少提出一种有效的替代方案。
所述的细胞治疗用生物芯片，其包含：一载体；一第一细胞组织培养区，其自该载体顶面向凹设于该载体中；以及一第二细胞组织培养区，其自该第一细胞组织培养区底面向下凹设于该载体中。
其中，该第一细胞组织培养区包含与外界相通的一通孔。
其中，该第二细胞组织培养区下设有另一第一细胞组织培养区。
其中，一第二细胞设置于该第二细胞组织培养区；一中介细胞设于该第一细胞组织培养区表面；以及一第一细胞设置于该第一细胞组织培养区。
其中：该第二细胞包含癌症细胞、该中介细胞包含内皮细胞以及该第一细胞包含自体免疫细胞。
其中：该第二细胞包含以癌症细胞、细胞培养质形成的液体、胶体或块体；以及该第一细胞包含以自体免疫细胞、细胞培养质形成的液体、胶体或块体。
本发明对应上述细胞治疗生物芯片提出其制造方法，步骤包含：以三维打印、翻模成型、雷射加工、计算机数值控制机(Computer Numerical Control,CNC)加工或射出成型方式加工成型包含如上述细胞治疗用生物芯片；以及将一第二细胞、一中介细胞以及一第一细胞依序分别生物打印于该第二细胞组织培养区以及该第一细胞组织培养区间。
通过上述说明可知，本发明具有以下有益功效与优点：
1.本发明所设计的细胞治疗用生物芯片经测试，成功将癌症细胞、内皮细胞与T细胞培养其上，且观测T细胞经过内皮细胞并迁徙至癌症细胞中，足证有效抑制癌细胞生长与达成抑制毒杀的效果。
2.本发明所提供的细胞治疗用生物芯片可作为体外测试模块，改善既有细胞测试、动物实验所面临的不准确或限制，且应用于癌症细胞治疗测试、药物筛检的用途。
附图说明
图1为本发明第一较佳实施例示意图。
图2为本发明第一较佳实施例承载相关细胞配置示意图。
图3为本发明第二较佳实施例示意图。
图4A、4B为本发明第一较佳实施例制造初时细胞荧光染色图。
图5、6A、6B为本发明第一较佳实施例经培养后的细胞荧光染色图。
图7为本发明第二较佳实施例制造初时细胞荧光染色图。
图8A本发明第二较佳实施例经培养后的细胞荧光染色图。
图8B、8C、8D分别为本发明12-48小时的T细胞、癌细胞与重叠后的细胞荧光染色图。
图9为本发明培养时间与距离造成缺氧细胞产生差异直方图。
图10A为本发明以动态灌流或静态培养下T细胞活性状态图。
图10B为本发明以动态灌流或静态培养下癌细胞活性状态图。
图11为本发明以动态灌流或静态培养下T细胞产生的动态毒杀成分含量图。
图12A、12B本发明以动态灌流较长时间T细胞产生的动态毒杀成分含量图。
符号说明：
10 生物芯片
11 载体
13 第一细胞组织培养区
131 通孔
15 第二细胞组织培养区
20 第二细胞
30 中介细胞
40 第一细胞
AA’ 虚线
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本发明应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
应当理解，本文使用的“系统”、“装置”、“单元”和/或“模块”是用于区分不同级别的不同组件、组件、部件、部分或装配的一种方法。然而，如果其他词语可实现相同的目的，则可通过其他表达来替换所述词语。
如本发明所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本发明中使用了流程图用来说明根据本发明的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
<实施例1>
请参考图1，本发明细胞治疗用生物芯片10具体的第一较佳实施范例，包含于一载体11上设置一第一细胞组织培养区13以及一第二细胞组织培养区15，该第一细胞组织培养区13与该第二细胞组织培养区15间可以相互液体连通，且在该第一细胞组织培养区13中设有与外界相通的一通孔131。
详细而言，该细胞治疗用的生物芯片10如图1所示，该载体11上定义凹设两阶段空间，自该载体11顶面开始向下定义所凹设的第一空间即为该第一细胞组织培养区13，而于该第一细胞组织培养区13的壁上设有二该通孔131，较佳的是对称设置。接着，自该第一细胞组织培养区13底部局部或全部向下定义凹设的第二空间为至少一个的该第二细胞组织培养区15。于本实施例如图1示例般，该载体11为一长型块体，并自顶面向下至块体内部凹设有长型的该第一细胞组织培养区13，接着自该第一细胞组织培养区13的底面向下凹设有3*3数组摆置的9个该第二细胞组织培养区15。但应当理解的是，此该第一与第二细胞组织培养区13、15的数量于本发明中并不限定，可以是1个、2个或甚至数个。
接着，请同时搭配参考图1、2，本发明较佳实施例使用的方式是首先将一第二细胞20，较佳是连同该第二细胞20的培养质形成的包含培养液、凝胶或细胞积木等置于该第二细胞组织培养区15中，且若该第二细胞组织培养区15为数个时，该第二细胞20至于每一该第二细胞组织培养区15的种类可以不同；接着将一中介细胞30培养或是披覆于该第一细胞组织培养区13底部并覆盖该第二细胞20所处的该第二细胞组织培养区15表面，再将一第一细胞40，较佳连同其培养质形成的包含培养液、凝胶或细胞积木，以灌流或置放的形式处于该第一细胞组织培养区13中成为具有细胞治疗用的检测模块，而二该通孔131则分别作为一进流孔与一出流孔，将该第一细胞40连同其培养质或药物等具有治疗效能的成分在培养期间持续自该进流孔进入，同时也可以使该第一细胞40所产生的废物或代谢物自另一端的该出流孔排出。
值得注意的是，本发明的该第一细胞40至于该第一细胞组织培养区13的形式，可以是以二该通孔131以灌流形式使该第一细胞40持续动态地地流动于该第一细胞组织培养区13，或也可以是单纯将该第一细胞静态地放置于该第一细胞组织培养区13。此二种型态虽后续培养效果不同，但皆可以达成本发明所宣称的功效。
其中，上述该第二细胞20于上述较佳实施例中包含癌症细胞，该中介细胞20为内皮细胞(或上皮细胞、Endothelial Cells)，该第一细胞40为细胞治疗用的例如自体免疫细胞，如NK细胞、T细胞等。如此的检测模块可以评估该自体免疫细是否有抑制该癌症细胞的功效。本发明的该细胞治疗用生物芯片较佳是利用3D打印制程所制得，具备客制化的生产弹性与高精准度，且上述所有细胞皆可以生物打印机将细胞投放至所属位置。
以上述第一较佳实施例而言，其作为细胞治疗用的生物芯片的作用机理是以该中介细胞20的内皮细胞拟为人体血管，而在血管两旁分别为该第二细胞20的癌症细胞以及该第一细胞40的治疗细胞(如NK细胞、T细胞)，如此经过一段时间的培养，即可确认该第一细胞40是否经过该中介细胞20(即由血管通透)并到达该第二细胞20作用，形成一个体外仿真测试的模块。当然以此一前提下，可以在该第一细胞40与其培养质内另外添加有助于消除癌症细胞的药品或相关成分，具有检测癌症标靶药物的功能。
<实施例2>
本发明该细胞治疗用生物芯片10的第二较佳实施范例，与上述该第一较佳实施例为基础下，以如图3剖面图所示虚线AA’形成类似于上下对称的结构，而于此实施例中该通孔131上下对称结构形成连通，使得该第一细胞组织培养区13形成通道状态，接着，于该第一细胞组织培养区13的上对称位置设置有另一第二细胞组织培养区15，两该第二细胞组织培养区15将该第一组织细胞培养区13夹置于其中成为通道以及两端该通孔131连通外部，并于两第二细胞组织培养区13中同样放置该第二细胞20，同时也将该中介细胞20分别培养/披覆于该第一细胞组织培养区13与两该第二细胞组织培养区15间，同样将培养质或药物等具有治疗效能的成分的流体自二该通孔131灌流于该第一细胞组织培养区13间。另外，此第二实施例在各种细胞选用上与上述第一较佳实施例相同，于此不再次赘述相关内容。
<制造方法>
本发明上述两种芯片模块制造的方式，较佳包含：
步骤一：将该载体11以三维打印、翻模成型、雷射加工、计算机数值控制机(Computer Numerical Control,CNC)加工或射出成型方式加工成型；
步骤二：至少将该第二细胞20以及该中介细胞30依序分别放置于该第二细胞组织培养区15以及其表面。
步骤三：可选择地，将该第一细胞40灌流或放置于该第一细胞组织培养区13中。
上述步骤二中放置该第二细胞及该中介细胞，以及步骤三中放置该第一细胞40的方式较佳是以手动放置，或也可以以自动化机械手臂充以所需细胞与基质以类似于三维打印或生物打印的方式挤至或放置于相应位置。
另外，上述步骤一中所述的三维打印方式，较佳可以是以热融沈积或光固化三维打印方式，以该芯片成品为三维结构图进行打印制造，而雷射加工、CNC加工则是取该载体11原型以上述方式加以销切出所需要的凹陷区域与结构，而该射出成型的方式则是以射出机与相应模具将适宜的树脂材料射出成型。
接着，以下将针对本发明上述所提供的两实施例进行确效性说明。
<确效性测试>
请参考图4A、4B、5，其利用上述第一较佳实施例所提供的芯片模块结构，以该第二细胞20为肺癌细胞(A549)、该中介细胞20为内皮细胞(HUVEC)、该第一细胞40为T细胞为例，图4为模型初制造时的该第一细胞组织培养区13与该第二细胞组织培养区15的界面细胞荧光染色图，图5则为培养周期后相同界面的细胞荧光染色图。自图4A、B看出，此时下层较亮区块的癌症细胞分布于上层略暗区块的内皮细胞下，而自图5看出较亮光点的该T细胞已经成功穿越略暗光点的内皮细胞并分布于的该癌症细胞中，证实本发明所提供的生物芯片模块确实具有仿真人体组织细胞流通的功能。而随着培养时间演进，进一步自图6A、6B的该第二细胞组织培养区15细胞荧光染色图显示大量的略暗色光点该T细胞分布于亮色光点的癌症细胞中。
接着请参考图7，其利用上述第二较佳实施例所提供的芯片模块结构，以该第二细胞20为乳癌细胞(MDA-MB-231)、该中介细胞20为内皮细胞(HUVEC)、该第一细胞40为T细胞(GDT)为例，图7中同样是模型初制造时的该第一细胞组织培养区13与该第二细胞组织培养区15的界面细胞荧光染色图，底层团块的癌症细胞分布于内皮细胞(HUVEC)下，
接着将该第一细胞40的T细胞持续灌流于该第一细胞组织培养区13，如图8A培养第一天间40分钟、45分钟、1.5小时以及2.5小时状态来看，明显可看出横向部分有较亮色(该第一细胞40的T细胞)的出现，且随着时间增加该第一细胞40的T细胞逐渐沾覆于略成球型较暗色的该第二细胞20的乳癌细胞上。
继续以长时间灌流该第一细胞40的T细胞，结果如图8B-8D，其为分别灌流12、24、48小时后的细胞状态，图8B是单纯以灌流T细胞而言，12小时至48小时后，可明显看出亮色点逐渐增加且明显，表示T细胞确实附着于癌细胞上；图8C则是单纯观的该癌细胞状态，明显从12小时至48小时后，略微暗色球状该癌细胞的密度逐渐下降且空洞。图8D则是将图8B、8C重叠合并(Merge)后所成的状态，可看出较亮光点的T细胞分布于略暗球状光团状癌细胞数量增加，甚至图8D中间图发现右上侧亮点的缺氧死癌细胞数量也增加，显见该T细胞具有毒杀消灭癌细胞的功用。
图9中则显示所著培养时间的增加以及距离该内皮细胞远近会产生不同的黄颜色的缺氧细胞量。图10A分别显示以灌流T细胞的动态培养，以及静置T细胞的静态培养，随着培养时间的增加，动态培养的T存活率较高，而静态培养的T细胞则细胞存活率略微下降，但仍维持可用状态。图10B同样分别显示了以灌流或静置T细胞的动态、静态培养模式下，癌细胞活性状态，自图10B可看出动态培养的癌细胞在长时间(3、5天)灌流T细胞下，因着持续供给新鲜活力的T细胞而有着更为长效且明显的癌细胞消灭能力，而静态培养的T细胞虽然在短时间培养(例如1天)下因为静置密度与浓度较高的原因，具有较高的癌细胞毒杀率，但长时间培养下T细胞因为逐渐沈降的关系，堆栈压迫而逐渐失去活力与效用，也导致癌细胞毒杀能力的下降，但以本发明所提供的模块而言，不论是静态或动态培养都依然具备所宣称的效用与能力。
图11则显示动态(Dynamic)与静态(Static)培养下，T细胞所产生的二大毒杀成分(例如Perforin、Granzyme B等穿孔素)含量，同样两种培养模式都会产生相应的癌细胞毒杀成分，但其中又以动态培养的模式具有更好的癌细胞抑制功能。图12A与12B则显示以动态培养长时间的穿孔素含量上升情形。
此外，除非文中明确说明，本发明所述处理元素和序列的顺序、数字字母的使用、或其他名称的使用，并非用于限定本发明流程和方法的顺序。尽管上述披露中通过各种示例讨论了一些目前认为有用的发明实施例，但应当理解的是，该类细节仅起到说明的目的，附加的权利要求并不仅限于披露的实施例，相反，权利要求旨在覆盖所有符合本发明实施例实质和范围的修正和等价组合。例如，虽然以上所描述的系统组件可以通过硬设备实现，但是也可以只通过软件的解决方案得以实现，如在现有的服务器或移动设备上安装所描述的系统。
同理，应当注意的是，为了简化本发明披露的表述，从而帮助对一个或多个发明实施例的理解，前文对本发明实施例的描述中，有时会将多种特征归并至一个实施例、附图或对其的描述中。但是，这种披露方法并不意味着本发明对象所需要的特征比权利要求中提及的特征多。实际上，实施例的特征要少于上述披露的单个实施例的全部特征。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数字并采用一般位数保留的方法。尽管本发明一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
针对本发明引用的每个专利、专利申请、专利申请公开物和其他材料，如文章、书籍、说明书、出版物、文档等，特此将其全部内容并入本发明作为参考。与本发明内容不一致或产生冲突的申请历史文件除外，对本发明权利要求最广范围有限制的文件(当前或之后附加于本发明中的)也除外。需要说明的是，如果本发明附属材料中的描述、定义、和/或术语的使用与本发明所述内容有不一致或冲突的地方，以本发明的描述、定义和/或术语的使用为准。
最后，应当理解的是，本发明中所述实施例仅用以说明本发明实施例的原则。其他的变形也可能属本发明的范围。因此，作为示例而非限制，本发明实施例的替代配置可视为与本发明的教导一致。相应地，本发明的实施例不仅限于本发明明确介绍和描述的实施例。

Claims (10)

1.一种细胞治疗用生物芯片，其特征在于，其包含：
一载体；
一第一细胞组织培养区，其自该载体顶面向凹设于该载体中；以及
一第二细胞组织培养区，其自该第一细胞组织培养区底面向下凹设于该载体中。
2.如权利要求1所述的细胞治疗用生物芯片，其特征在于：该第一细胞组织培养区包含与外界相通的一通孔。
3.如权利要求1所述的细胞治疗用生物芯片，其特征在于：该第二细胞组织培养区下设有另一第一细胞组织培养区。
4.如权利要求1、2或3所述的细胞治疗用生物芯片，其特征在于：
一第二细胞设置于该第二细胞组织培养区；
一中介细胞设于该第一细胞组织培养区表面；以及
一第一细胞设置于该第一细胞组织培养区。
5.如权利要求4所述的细胞治疗用生物芯片，其特征在于：该第二细胞包含癌症细胞、该中介细胞包含内皮细胞以及该第一细胞包含自体免疫细胞。
6.如权利要求4所述的细胞治疗用生物芯片，其特征在于：该第二细胞包含以癌症细胞、细胞培养质形成的液体、胶体或块体；以及该第一细胞包含以自体免疫细胞、细胞培养质形成的液体、胶体或块体。
7.一种细胞治疗用生物芯片的制造方法，其特征在于，其步骤包含：
将包含如权利要求1～3任一项所述的细胞治疗用生物芯片以三维打印、翻模成型、雷射加工、CNC加工或射出成型方式加工成型；以及
至少将一第二细胞以及一中介细胞依序分别置于该第二细胞组织培养区以及其表面。
8.如权利要求7所述的细胞治疗用生物芯片的制造方法，其特征在于：进一步将一第一细胞灌流或放置于该第一细胞组织培养区。
9.如权利要求8所述的细胞治疗用生物芯片的制造方法，其特征在于：该第二细胞包含癌症细胞、该中介细胞包含内皮细胞以及该第一细胞包含自体免疫细胞。
10.如权利要求7或8所述的细胞治疗用生物芯片的制造方法，其特征在于：该第二细胞包含以癌症细胞、细胞培养质形成的液体、胶体或块体；以及该第一细胞包含以自体免疫细胞、细胞培养质形成的液体、胶体或块体。
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