CN115591016B - 一种具有取向微通道的神经移植物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有取向微通道的神经移植物及其制备方法。所述的神经移植物，通过在壳聚糖基导管中预置取向的静电纺丝高分子纤维，导管成型后洗去纤维制备而成。本发明制备的神经移植物具有直径可控的取向微通道，不仅能够为神经细胞的生长提供营养输送的通道和生长的空间，还起到了良好的诱导作用。
Description
技术领域
本发明属于神经移植物技术领域，具体涉及一种用于桥接缺损神经的具有取向微通道的神经移植物及其制备方法。
背景技术：
周围神经缺损是临床上常见疾病，其预后差、致残率高，严重影响了患者的生活质量。目前自体移植仍然是周围神经缺损修复的“金标准”，然而神经供体来源有限、供体部位神经功能的缺失、供体神经与受体神经尺寸不匹配、神经功能束错对等问题，限制了自体神经移植的临床应用。组织工程支架材料具有结构尺寸可调、材料来源丰富、可加工性良好等优点，为损伤神经的恢复提供了新的治疗方法。虽然随着组织工程学的快速发展，目前众多的神经移植物材料，包括已经商品化的材料大多已具备良好的生物相容性、通透性、可降解性和机械性能，却仍然无法达到自体神经移植的修复效果，且难以修复较长距离的缺损神经。造成这个现象的原因之一是生物材料构建的神经移植物微观结构与天然神经组织的微观差别较大、缺乏有效的神经导向信号。近20年来，在神经移植物的构建过程中，大量研究工作表明，具有定向微观结构的神经组织工程支架，能够诱导神经细胞的定向排列和生长[Rao Feng等Theranostics,2020,10(4):1590-1603.]。目前神经移植物中制备定向微观通道的方法主要有定向结晶—热致相分离法、表面图案化法和纤维导向法。定向结晶-热致相分离法的工艺较为复杂，对微通道结构与尺寸的可控性略差。表面图案法尺寸可控性较强但只能在导管内壁表面形成定向微通道(专利文献CN206612862U)。纤维导向最常用的是首先采用纺丝技术制备取向纤维膜，再将其卷曲制备成中空的纤维导管(如专利CN102525689A)或将取向纤维束作为填充物置于导管内芯(如专利CN103751839A)。也有研究是在导管中预置细丝或者多根直径较细的内芯，在导管构建完成后抽出细丝或内芯。然而直接抽出细丝或者内芯的方法存在难以抽出或者损毁导管的缺陷。因此，构建一种含有取向微通道的神经移植物，对于解决现有技术中存在问题具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种含有取向微通道的神经移植物及其制备方法。且产品使用效果好，具有良好的生物相容性和生物降解性。
实现本发明目的技术解决方案为：
一种具有取向微通道的神经移植物的制备方法，所述神经移植物为多孔管状结构，管壁表面及内部均含有取向的微通道，在天然高分子材料导管中预置取向的合成高分子纤维，导管成型后使用有机溶剂洗去纤维制备而成，所述天然高分子材料为壳聚糖和其他天然生物材料的混合物，其中壳聚糖与其他天然生物材料的质量比为(30-99)：(70-1)，合成高分子纤维材料为左旋聚乳酸和/或者聚己内酯，合成高分子纤维材料与天然高分子的质量比为1：1～19，有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、丙酮中的一种或几种。
所述其他天然生物材料选自明胶、胶原、细胞基质、透明质酸、丝素和丝胶中一种或几种。优选的，其他天然生物材料为明胶、胶原或细胞基质中的一种或几种，壳聚糖与其他天然生物材料的质量比为(99.9～80)：(0.1～20)，更优选壳聚糖与其他天然生物材料的质量比为(99.9～90)：(0.1～10)。
本发明一个具体的方案，所述合成高分子纤维材料为左旋聚乳酸，有机溶剂为二氯甲烷。
本发明所述的制备方法，所述合成高分子纤维直径为100nm～2μm。所述的神经移植物为多孔管状结构，内径为1～4mm，长度为1cm～6cm。
本发明所述的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)采用静电纺丝法制备合成高分子取向纤维；
(2)将取向纤维置入壳聚糖基共混溶液中，通过固化、清洗制备含取向纤维的壳聚糖基导管；(3)采用有机溶剂清洗步骤(2)制备的导管，洗去取向纤维，清洗干燥后获得具有取向微通道的神经导管。
其中，步骤(2)中的具体步骤为：
(a)将脱乙酰度80～96％的壳聚糖溶于1～3％醋酸溶液中，壳聚糖浓度为3wt％～7wt％；
(b)在不低于室温的条件下，将其他天然生物材料的水溶液，滴入壳聚糖溶液中，搅拌不少于30min，配制壳聚糖共混溶液，其中其他天然生物材料与壳聚糖质量比为(1～20)：(99～80)；
(c)在管状模具内芯与外套之间，垂直预置取向纤维，纤维层厚度为20μm～1000μm；
(d)将配置好的壳聚糖基共混溶液注入管状模具中；
(e)将注有共混溶液的模具放入冰箱冷冻，冷冻温度低于0℃；
(f)将冷冻成型的导管放入碱性溶液中凝固定型，成型后用水清洗，干燥后获得含取向纤维的壳聚糖基导管。
其中，步骤(3)中的有机溶剂的清洗时间为3～12h；有机溶剂清洗后自然风干，再用乙醇浸泡不少于2h，最后用清水清洗，冷冻或室温干燥，获得具有取向微通道的神经导管。
本发明另一目的在于提供一种具有取向微通道的神经移植物，采用本发明所述的方法制备而成。
本发明的含有取向微通道的神经移植物及其制备方法与现有技术相比，具有以下优点：
(1)采用静电纺丝技术制备取向微纤维，纤维直径厚度尺寸可调控，且取向度较高。
(2)制备纤维选用的合成高分子PLLA和PCL的成本低廉，可纺性较强，无毒且生物相容性良好。
(3)通过预置取向纤维再清洗去除的方形成取向微通道，操作简单且不会损毁导管，形成的微通道不仅具有良好的取向性，还具有良好的贯通性。
(4)本发明所制备的含有取向微通道的神经移植物具有显著的仿生结构特征。在传统多孔神经导管的基础上，构建了取向的微通道，不仅为神经再生营养物质的传送提供了足够的空间，还有利于神经细胞的定向排列与生长。
(5)本发明在有机溶剂洗脱法制备取向的微通道的基础上，通过对神经移植物导管材料、取向纤维材料以及洗脱有机溶剂的筛选，确定了特定的材料种类和洗脱溶剂。当合成高分子纤维材料为左旋聚乳酸，有机溶剂为二氯甲烷时，能够在较短的时间内洗脱合成高分子纤维材料，缩短制备时长。当神经移植物导管材料壳聚糖的质量百分比不低于80％，更优选不低于90％时，在使用有机溶剂时，神经移植物导管具有较好的稳定性，保持导管的形状和结构。
附图说明
图1实施例1中取向PLLA纤维。
图2实施例2中取向PLLA纤维。
图3实施例3中取向PLLA纤维。
图4实施例3中洗脱PLLA纤维前的神经移植物的SEM图。
图5实施例3中洗脱PLLA纤维后，含有取向微通道的神经移植物的SEM图。
图6实施例4中神经移植物修复大鼠10mm坐骨神经缺损后3周获得的再生神经纵切片(OCS：含有取向微通道的壳聚糖导管组；OCS/ECM：含有取向微通道的壳聚糖/细胞基质导管组；AUTO：自体神经组，下同)。
图7实施例4中术后12周再生神经远端轴突密度。
图8实施例4中术后12周CatWalk步态分析图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
称取1.47g PLLA溶解于10mL二氯甲烷中，磁力搅拌3h使其充分溶解，制得静电纺丝液。用静电纺丝装置对静电纺丝液在室温下进行静电纺丝，设置电压为20kV，纺丝液推进速度为0.5mL/h，接收距离为15cm，采用转速为2800rmp的滚筒接收装置接收，制得取向PLLA静电纺丝纤维膜(如图1所示)。将脱乙酰度90％的壳聚糖溶于2％醋酸溶液中，室温下将10％的明胶水溶液滴入壳聚糖溶液中，搅拌30min，溶液浓度为3wt％，壳聚糖、明胶质量比为95:5；取下静电纺丝纤维膜，垂直于纤维膜的取向方向将其缠绕于管状模具的内芯上，将配置好的壳聚糖/明胶溶液注入管状模具中，其中纤维膜质量为壳聚糖与明胶总质量的5％；将注有共混溶液的模具放入-20℃冰箱冷冻，将冷冻成型的导管放入20％NaOH溶液中凝固定型3h，成型后用水清洗，冷冻干燥后获得含取向纤维的多孔壳聚糖/明胶导管。将含有取向纤维的多孔壳聚糖/明胶导管浸入二氯甲烷中3h后，自然风干，再用无水乙醇清洗三次，每次10min,最后用清水清洗，冷冻干燥后即得含有取向微通道的神经移植物。
实施例2
称取1.8g PLLA溶解于10mL二氯甲烷中，磁力搅拌3h使其充分溶解，制得静电纺丝液。用静电纺丝装置对静电纺丝液在室温下进行静电纺丝，设置电压为15KV，纺丝液推进速度为0.8mL/h，接收距离为20cm，采用转速为3000rmp的滚筒接收装置接收，制得取向PLLA静电纺丝纤维膜(如图2所示)。将脱乙酰度95％的壳聚糖溶于3％醋酸溶液中，室温下将20％的明胶水溶液滴入壳聚糖溶液中，搅拌30min，溶液浓度为3wt％，壳聚糖、明胶质量比为90:10；取下静电纺丝纤维膜，垂直于纤维膜的取向方向将其缠绕于管状模具的内芯上，将配置好的壳聚糖/明胶溶液注入管状模具中，其中纤维膜质量为壳聚糖与明胶总质量的50％；将注有共混溶液的模具放入-25℃冰箱冷冻，将冷冻成型的导管放入10％NaOH溶液中室温下凝固定型12h，成型后用水清洗，冷冻干燥后获得含取向纤维的多孔壳聚糖/明胶导管。将含有取向纤维的多孔壳聚糖/明胶导管浸入丙酮中24h后，自然风干，再用无水乙醇清洗三次，每次30min,最后用清水清洗，冷冻干燥后即得含有取向微通道的神经移植物。
实施例3
称取1.35g PLLA溶解于10mL二氯甲烷/六氟异丙醇共混溶液(溶液体积比为9:1)中，磁力搅拌2h使其充分溶解，制得静电纺丝液。室温下采用静电纺丝装置对静电纺丝液进行静电纺丝，设置电压为22KV，纺丝液推进速度为0.5mL/h，接收距离为17cm，采用转速为3000rmp的滚筒接收装置接收，制得取向PLLA静电纺丝纤维膜(如图3所示)。将脱乙酰度85％的壳聚糖溶于1％醋酸溶液中，室温下将10％的胶原水溶液滴入壳聚糖溶液中，搅拌1h，溶液浓度为5wt％，壳聚糖、明胶质量比为98:2；取下静电纺丝纤维膜，垂直于纤维膜的取向方向将其缠绕于管状模具的内芯上，将配置好的壳聚糖/明胶溶液注入管状模具中，其中纤维膜质量为壳聚糖与明胶总质量的25％；将注有共混溶液的模具放入-80℃冰箱冷冻，将冷冻成型的导管放入5％NaOH溶液中室温下凝固定型12h，成型后用水清洗，冷冻干燥后获得含取向纤维的多孔壳聚糖/胶原导管(如图4所示)。将含有取向纤维的多孔壳聚糖/胶原导管浸入二氯甲烷中12h后，自然风干，再用无水乙醇清洗三次，每次10min,最后用清水清洗，冷冻干燥后即得含有取向微通道的神经移植物(如图5所示)。
实施例4
称取1.35g PLLA溶解于10mL二氯甲烷/六氟异丙醇共混溶液(溶液体积比为9:1)中，磁力搅拌2h使其充分溶解，制得静电纺丝液。室温下采用静电纺丝装置对静电纺丝液进行静电纺丝，设置电压为22KV，纺丝液推进速度为0.5mL/h，接收距离为17cm，采用转速为3000rmp的滚筒接收装置接收，制得取向PLLA静电纺丝纤维膜。将脱乙酰度95％的壳聚糖溶于1％醋酸溶液中，室温下将10％的细胞基质分散液滴入壳聚糖溶液中，搅拌1h，溶液浓度为5wt％，壳聚糖、细胞基质质量比为99:1；取下静电纺丝纤维膜，垂直于纤维膜的取向方向将其缠绕于管状模具的内芯上，将配置好的壳聚糖/细胞基质共混溶液注入管状模具中，其中纤维膜质量为壳聚糖与明胶总质量的25％；将注有共混溶液的模具放入-20℃冰箱冷冻，将冷冻成型的导管放入5％NaOH溶液中室温下凝固定型12h，成型后用水清洗，冷冻干燥后获得含取向纤维的多孔壳聚糖/细胞基质导管(图4)。将含有取向纤维的多孔壳聚糖/胶原导管浸入二氯甲烷中12h后，自然风干，再用无水乙醇清洗三次，每次10min,最后用清水清洗，冷冻干燥后即得含有取向微通道的神经移植物。
将本实施例制备的仿生神经移植物用于修复大鼠坐骨神经10mm缺损。术后3周的再生神经纵切片免疫荧光图片(如图6所示)显示，该神经移植物具有良好的促进神经再生的功能，其促神经再生效果与自体神经相当。术后12周再生神经密度(如图7所示)和功能测试(如图8所示)表明，仿生神经对损伤神经具有良好的修复效果，其修复效果与自体神经相似。
Claims (5)
1.一种具有取向微通道的神经移植物的制备方法，所述神经移植物为多孔管状结构，管壁表面及内部均含有取向的微通道，其特征在于在天然高分子材料导管中预置取向的合成高分子纤维，导管成型后使用有机溶剂洗去纤维制备而成，所述天然高分子材料为壳聚糖和其他天然生物材料的混合物，其中壳聚糖与其他天然生物材料的质量比为（99.9~80）：（0.1~20），合成高分子纤维材料与天然高分子的质量比为1：1~19，有机溶剂选自氯仿、二氯甲烷、丙酮中的一种或几种，所述合成高分子纤维直径为100 nm~2μm，所述的神经移植物内径为1~4 mm，长度为1cm~6cm，所述其他天然生物材料为明胶、胶原或细胞基质中的一种或几种，所述合成高分子纤维材料为左旋聚乳酸，有机溶剂为二氯甲烷。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）采用静电纺丝法制备合成高分子取向纤维；
（2）将取向纤维置入壳聚糖基共混溶液中，通过固化、清洗制备含取向纤维的壳聚糖基导管；
（3）采用有机溶剂清洗步骤（2）制备的导管，洗去取向纤维，清洗干燥后获得具有取向微通道的神经导管。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中的具体步骤为：
（a）将脱乙酰度80~96%的壳聚糖溶于1~3%醋酸溶液中，壳聚糖浓度为3 wt%~7 wt%；
（b）在不低于室温的条件下，将其他天然生物材料的水溶液，滴入壳聚糖溶液中，搅拌不少于30min，配制壳聚糖共混溶液，其中其他天然生物材料与壳聚糖质量比为（1~20）：（99~80）；
（c）在管状模具内芯与外套之间，垂直预置取向纤维，纤维层厚度为20μm~1000μm；
（d）将配置好的壳聚糖基共混溶液注入管状模具中；
（e）将注有共混溶液的模具放入冰箱冷冻，冷冻温度低于0℃；
（f）将冷冻成型的导管放入碱性溶液中凝固定型，成型后用水清洗，干燥后获得含取向纤维的壳聚糖基导管。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中的有机溶剂的清洗时间为3~12h；有机溶剂清洗后自然风干，再用乙醇浸泡不少于2 h，最后用清水清洗，冷冻或室温干燥，获得具有取向微通道的神经导管。
5.一种具有取向微通道的神经移植物，其特征在于采用权利要求1-4任一项所述的方法制备而成。
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