CN115575364A - 基于光学显微成像的离子束加工方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于光学显微成像的离子束加工方法，涉及光学显微成像、离子束加工、扫描电子显微成像、电子断层扫描三维重构成像等技术领域，包括：利用离子束对样品表面进行标记，得到配准基准图形；对样品进行三维光学成像，得到第一三维光镜图像；将第一三维光镜图像投影到离子束的切割角度，基于配准基准图形确定待研究目标在第一三维光镜图像中的第一位置；对样品进行离子束成像，得到离子束激发的图像，并根据第一位置确定待研究目标在离子束激发的图像中的第二位置；根据第二位置对样品进行减薄，得到包含研究目标的第一切片。该离子束加工方法操作简单，可重复性强且定位精度高。
Description
技术领域
本发明涉及光学显微成像、离子束加工、扫描电子显微成像、电子断层扫描三维重构成像等技术领域，尤其涉及一种基于光学显微成像的离子束加工方法。
背景技术
冷冻电子断层扫描三维重构成像技术（cryo-electron tomography，cryo-ET）是目前研究原位生物结构前沿的技术。该技术通过快速冷冻或高压冷冻，将细胞、组织固定在几近天然生理状态下的非晶冰中，再对样品进行冷冻减薄，然后对超薄切片进行cryo-ET成像，通过图像重构得到样品高精度原位三维结构。由于cryo-ET成像中，电子穿透深度优先，因此进行cryo-ET实验的一个重要前提是将样品减薄至几百纳米厚度的薄片。
离子束切割是一项源于半导体加工的技术，最早由Marko等人在2006年应用到冷冻生物样品的减薄中。该技术使用高能粒子（通常为镓离子、氦离子、氙离子、氖离子、氧离子、氩例子等）轰击样品表面，移除不需要的部分以实现减薄，可以避免传统切片中的样品损伤，切割的薄片表面十分平整，逐渐成为制备cryo-ET样品的主流减薄手段。但离子束减薄过程存在一个重要缺陷，利用离子束对样品进行的电子成像只能勾勒出样品浅表的形貌信息，但无法识别样品种类以及包埋在样品内部的研究目标，因此，减薄过程通常为“盲切”，很难保证加工的薄片中含有要研究的兴趣目标，因此无法针对特定研究目标进行“定点”精准减薄。
光学显微成像，特别是荧光显微成像，是生命科学研究的重要手段。其中的三维荧光成像技术，例如共聚焦成像（confocal microscopy）、结构光成像(structuredillumination microscopy)、光片成像(light sheet microscopy)、三维单分子定位成像（3D single molecule localization microscopy）等，具有百纳米至几十纳米的分辨率，可对荧光标记的细胞器和亚细胞结构进行纳米级成像，从而获得被研究对象的种类以及其在三维空间中的定位、分布等多种重要信息。
近年来，光电关联成像技术（correlative light and electron microscopy），即将光学显微成像与电子显微成像相结合使用的技术，被用来引导离子束的切割。光学显微成像可以识别、定位样品中的研究目标，通过将光镜图像与电镜图像相配准，可以定位研究目标在电镜图像中的位置，从而确定离子束的切割位点。这项技术的核心是光电图像的高精度配准。目前主流的配准方法是在样品中添加基准标记物（fiducial marker），或者利用样品中天然的特殊结构作为配准基准，通过坐标变换将光镜图像和电镜图像进行配准。这种方法受到基准点选取和坐标转换误差的影响，精度较低，重复性较差，通常无法满足纳米尺度细胞器的定位切割；此外，且向样品中添加基准标记物的制样过程，增加了实验的复杂度。
综上所述，现有利用光电关联技术引导离子束切割的工作流程存在以下缺陷：其一，向样品中添加基准标记物的制样过程复杂。其二，利用基准标记物的坐标变换进行光电图像配准的误差较大，且选取不同基准点得到的配准结果不同，重复精度较差，难以对纳米尺度的细胞器进行定位切割。
发明内容
针对现有技术问题，本发明提出一种基于光学显微成像的离子束加工方法，用于至少部分解决上述技术问题。
本发明提供一种基于光学显微成像的离子束加工方法，包括：利用离子束对样品表面进行标记，得到配准基准图形；对样品进行三维光学成像，得到第一三维光镜图像；将第一三维光镜图像投影到离子束的切割角度，基于配准基准图形确定待研究目标在第一三维光镜图像中的第一位置；对样品进行离子束成像，得到离子束激发的图像，并根据第一位置确定待研究目标在离子束激发的图像中的第二位置；根据第二位置对样品进行减薄，得到包含研究目标的第一切片。
根据本发明的实施例，方法还包括：根据第二位置对样品进行减薄，得到包含研究目标的第二切片，对第二切片进行三维光学成像，得到第二三维光镜图像，其中，对第二切片进行三维光学成像的放大倍数可高于对样品进行三维光学成像的放大倍数；将第二三维光镜图像投影到离子束的切割角度，得到二维投影图像，基于该二维投影图像确定待研究目标在第二切片中的第三位置；根据第三位置对样品进行减薄，得到包含待研究目标的第三切片。
根据本发明的实施例，对样品进行三维光学成像或对第二切片进行三维光学成像，具体包括：将样品或第二切片装载至电镜真空腔室内的光镜成像位上，使样品保持水平；在垂直于样品的方向，利用三维光学成像技术对样品或第二切片进行多通道三维成像。
根据本发明的实施例，三维光学成像技术包括共聚焦成像方法或者结构光照明成像方法或者三维单分子定位成像方法或者光片成像方法。
根据本发明的实施例，利用明场成像得到配准基准图形的图像，利用荧光成像得到待研究目标的图像。
根据本发明的实施例，将第一三维光镜图像投影到离子束的切割角度或将第二三维光镜图像投影到离子束的切割角度，具体包括：将第一三维光镜图像和第二三维光镜图像投影和离子束同一视角的二维投影图像。
根据本发明的实施例，基于配准基准图形确定待研究目标在第一三维光镜图像中的第一位置，具体包括：测量二维投影图像中待研究目标到配准基准图形中心的二维像素距离；基于预先校准的光学成像像素点大小，将二维像素距离转换为真实距离；根据真实距离确定第一位置。
根据本发明的实施例，第一切片和第三切片的厚度为百纳米级，可适用于透射电子成像或电子断层扫描成像，第二切片的厚度为微米级。
根据本发明的实施例，方法还包括：对第一切片或第三切片进行三维光学成像，得到第三三维光镜图像；对第三三维光镜图像进行分析，提取第一切片或第三切片内待研究目标的种类和分布信息；根据待研究目标的种类和分布信息指导和辅助冷冻电子断层扫描成像数据的收集和分析。
根据本发明的实施例，根据待研究目标的种类和分布信息指导和辅助冷冻电子断层扫描成像数据的收集和分析，具体包括：对第一切片或第三切片进行透射电子成像，得到透射电镜图像；根据第三三维光镜图像中待研究目标的种类和分布信息定位透射电镜图像中待研究目标的第四位置；基于第四位置在透射电镜图像中划定冷冻电子断层扫描成像数据的收集范围；对于三维重构后的冷冻电子断层扫描图像，也可与对应的第一切片或第三切片的第三三维光镜图像相关联，利用荧光信息判别研究目标种类与位置，辅助冷冻电子断层扫描图像分析。
根据本发明实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法，至少包括以下有益效果：
配准过程采用的是光电关联配准，可以直接利用离子束对样品表面进行刻蚀获取配准基准图形进行配准，不需要额外添加基准标记物，降低实验的复杂度，操作简便且可重复性强。利用三维光镜图像投影和离子束刻蚀的配准基准图形进行光电关联配准，进一步降低复杂度，增强配准结果可重复性。
进一步地，利用三维光镜图像投影确定目标在切片中的位置，定位精度高，可实现纳米精度的定点切割。
此外，利用最终切片的三维光镜图像，可识别目标种类，并确定目标在切片中的位置，利用这些信息可以辅助冷冻电子断层扫描成像数据收集和数据分析。
附图说明
图1示意性示出了本发明一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法的流程图；
图2示意性示出了本发明另一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法的流程图；
图3A~图3F示意性示出了本发明实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法执行的操作对应的图像；
图4示意性示出了本发明又一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法以及利用光学显微成像辅助冷冻电子断层扫描成像方法的流程图；
图5示意性示出了本发明再一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法以及利用光学显微成像辅助冷冻电子断层扫描成像方法的流程图；
图6示意性示出了本发明实施例提供的实现上述离子束加工方法的嵌入式三维光电关联成像装置的结构图。
附图标记
1-离子束模块；2-扫描电镜模块；3-光学物镜模块；4-光学窗口；5-光学激发成像模块；6-电镜成像切割位；7-光镜成像位；8-真空腔室。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在此使用的术语仅仅是为了描述具体实施例，而并非意在限制本发明。在此使用的术语“包括”、“包含”等表明了所述特征、步骤、操作和/或部件的存在，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、步骤、操作或部件。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或可以互相通讯；可以是直接连接，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“纵向”、“长度”、“周向”、“前”、“后”、“左”、“右”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的子系统或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
贯穿附图，相同的元素由相同或相近的附图标记来表示。可能导致本发明的理解造成混淆时，将省略常规结构或构造。并且图中各部件的形状、尺寸、位置关系不反映真实大小、比例和实际位置关系。
类似地，为了精简本发明并帮助理解各个公开方面中的一个或多个，在上面对本发明示例性实施例的描述中，本发明的各个特征有时被一起分到单个实施例、图或者对其描述中。参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或者多个实施例或示例中以合适的方式结合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。因此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个、三个等，除非另有明确具体的限定。
图1示意性示出了本发明一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法的流程图。
如图1所示，该基于光学显微成像的离子束加工方法例如可以包括操作S100~操作S140。
在操作S100，利用离子束对样品表面进行标记，得到配准基准图形。
在本发明一实施例中，可以预先将样品装载至电镜腔室内的电镜成像位上，并将样品倾斜至切割角度，再利用离子束对样品表面进行标记，得到配准基准图形。其中，标记的手段例如可以是刻蚀。离子束可以采用聚焦离子束、等离子束或亚离子束等，具体离子束的类型可以根据实际需求选择，本发明不做限制。切割的角度可以为电镜系统所允许的任意值，可以根据实际应用需求设定，本发明不做限制。
在本发明实施例中，配准基准图形的形状可以为多种形状，能够很好地起到基准的作用即可，本发明不做限制。
图3A示意性示出了本发明实施例提供的对样品表面进行标记后的图像。
如图3A所示，将配准基准图形刻蚀为“十字”型，该“十字”型配准基准图能够很好地起到基准作用。
在操作S110，对样品进行三维光学成像，得到第一三维光镜图像。
在本发明一实施例中，首先，将装载到电镜真空腔室内的样品置于光镜成像位，使样品保持水平。然后，在垂直于样品的方向，利用三维光学成像技术进行多通道三维成像，成像区域覆盖所刻蚀的配准基准图形和待研究目标。
图3B示意性示出了本发明实施例提供的对样品进行三维光学成像后的图像。
如图3B所示，五角星形状表示待研究目标，由于通过离子束对样品进行标记，得到“十字”型配准基准图，便可以根据“十字”型配准基准图确定待研究目标的位置范围。
应当理解，三维光学成像技术可以是任意能够实现三维成像的光学成像技术。
在本发明一实施例中，三维光学成像技术可以包括共聚焦成像方法或者结构光照明成像方法或者三维单分子定位成像方法或者光片成像方法。例如，三维成像过程中，可以基于嵌入式共聚焦显微镜对样品不同层面扫描后得到的明场和荧光信号进行探测，利用明场成像得到配准基准图形的图像，利用荧光成像得到待研究目标的图像。
在操作S120，将第一三维光镜图像投影到离子束的切割角度，基于配准基准图形确定待研究目标在第一三维光镜图像中的第一位置。
在本发明实施例中，可以将垂直于样品的方向拍摄的第一三维光镜图像通过计算投影到离子束切割角度，得到和离子束同一视角的二维投影图像。
图3C示意性示出了本发明实施例提供的对第一三维光镜图像投影后的二维投影图像。
如图3C所示，基于该二维投影图像，在该投影图像的荧光通道中，选取待研究目标，测量该待研究目标对应的点位到配准基准图形中心的二维像素距离，基于预先校准的光学成像像素点大小，将二维像素距离转换为真实距离。
在操作S130，对样品进行离子束成像，得到离子束激发的图像，并根据第一位置确定待研究目标在离子束激发的图像中的第二位置。
在本发明一实施例中，先将装载到电镜真空腔室内的样品从光镜成像位移动到电镜成像位，将样品倾斜至切割角度，对样品进行离子束成像，成像区域覆盖配准基准图形和研究目标。
图3D示意性示出了本发明实施例提供的聚焦离子束激发的图像。
如图3D所示，在得到聚焦离子束激发的电子图像后，利用电镜自带的测距功能，按照操作S120中测量的目标到基准图形中心的距离，在离子束激发的电子图像中以同一基准图像的中心为基点，测量出相同的距离，以此确定目标在离子束激发的图像中的第二位置。
在操作S140，根据第二位置对样品进行减薄，得到包含研究目标的第一切片。
在本发明一实施例中，将样品倾斜至切割角度，根据操作S130确定的待研究目标在离子束激发的电子图像中的第二位置对样品进行减薄，最终获得含有研究目标的第一切片。该第一切片可适用于透射电子成像和电子断层扫描成像。
图3E示意性示出了本发明实施例提供的第一切片图像。
如图3E所示，基于上述操作，便可以准确地获取包含待研究目标的切片。
根据本发明的实施例，操作S100~操作S140阐述的基于光学显微成像的离子束加工方法的定位精度适用于尺寸较大的研究目标。
图2示意性示出了本发明另一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法的流程图。
如图2所示，该基于光学显微成像的离子束加工方法与图1所示的离子束加工方法相比，采用的是两步定位方法，定位精度进一步提升。例如可以包括操作S200~操作S270，其中，操作S200~操作S230与操作S100~操作S130相同，此处不再赘述。
在操作S240，根据第二位置对样品进行减薄，得到包含研究目标的第二切片。
在本发明一实施例中，将样品倾斜至切割角度，根据操作S240确定的待研究目标在离子束激发的图像中的第二位置对样品进行减薄，获得含有研究目标的第二切片。操作S240为粗减薄，因此，第二切片的厚度可以为微米级，以便后续进一步进行精减薄。
图3F示意性示出了本发明实施例提供的第二切片图像。
如图3F所示，与图3E所示的第一切片图像相比，可以明显看出操作S240为粗减薄，减薄后第二切片的厚度远大于第一切片。
在操作S250，对第二切片进行三维光学成像，得到第二三维光镜图像。
在本发明一实施例中，首先，将第二切片装载到电镜真空腔室内的光镜成像位，使样品保持水平。然后，在垂直于样品的方向，利用三维光学成像技术对第二切片进行多通道三维成像。其中，对第二切片进行三维光学成像的放大倍数可高于对样品进行三维光学成像的放大倍数，成像范围不需要包含配准基准图形，可使第二切片几乎充满成像区域，这样有利用提高成像精度和成像速度。
在本发明一实施例中，三维光学成像技术可以包括共聚焦成像方法或者结构光照明成像方法或者三维单分子定位成像方法或者光片成像方法。例如，三维成像过程中，可以基于嵌入式共聚焦显微镜对样品不同层面扫描后得到的明场和荧光信号进行探测，利用明场成像得到切片表面形貌信息，利用荧光成像得到待研究目标的图像。
在操作S260，将第二三维光镜图像投影到离子束的切割角度，得到二维投影图像，基于二维投影图像确定待研究目标在第二切片中的第三位置。
在本发明一实施例中，将第二三维光镜图像投影到离子束切割角度后得到的二维投影图像也会包含有明场成像得到的第二切片表面形貌信息，可以根据二维投影图像中包含第二切片的表面形貌信息，通过人工识别、图像拟合等方法，确定待研究目标在第二切片中的第三位置。操作S260的定位精度高于操作S130的定位精度，可精确定位细胞器、亚细胞结构等纳米级目标。
在操作S270，根据第三位置对样品进行减薄，得到包含待研究目标的第三切片。
在本发明一实施例中，将样品倾斜至切割角度，根据操作S260确定的待研究目标在第二切片中的第三位置对样品进行减薄，最终获得含有研究目标的第三切片，得到的第三切片的图像与图3E所示第一切片图像类似，切片的厚度为纳米级，远小于图3F所示第二切片的厚度。该第三切片可适用于透射电子成像和电子断层扫描成像。
根据本发明的实施例，操作S200~操作S270阐述的基于光学显微成像的离子束加工方法，适用于尺寸较小的研究目标，例如细胞器、亚细胞结构等纳米级研究目标。
图4示意性示出了本发明又一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法的流程图。
如图4所示，该基于光学显微成像的离子束加工方法在操作S100~操作S140的基础上，进一步包括操作S150~操作S160。
在操作S150，对第一切片进行三维光学成像，得到第三三维光镜图像，对第三三维光镜图像进行分析，提取第一切片内待研究目标的种类和分布信息。
本发明一实施例中，将第一切片置于电镜真空腔室内的光镜成像位，在垂直于样品的方向，利用三维光学成像技术对第一切片进行三维多通道光学成像，可以得到第一切片内待研究目标的种类、分布等信息。其中，三维光学成像技术可以包括共聚焦成像方法或者结构光照明成像方法或者三维单分子定位成像方法或者光片成像方法。
在操作S160，根据第三三维光镜图像中待研究目标的种类和分布信息指导和辅助冷冻电子断层扫描成像数据的收集和分析。
在本发明一实施例中，将第一切片转移至透射电镜中进行透射电子成像，再将透射电镜图像与对应的第三三维光镜图像相关联，即可通过光镜信息定位透射电镜图像中研究目标的第四位置，基于第四位置在透射电镜图像中划定冷冻电子断层扫描成像数据的收集范围。对于三维重构后的冷冻电子断层扫描图像，也可与对应的第一切片的第三三维光镜图像相关联，利用荧光信息判别研究目标种类与位置，辅助冷冻电子断层扫描图像分析。
图5示意性示出了本发明再一实施例提供的基于光学显微成像的离子束加工方法的流程图。
如图5所示，该基于光学显微成像的离子束加工方法在操作S200~操作S270的基础上，进一步包括操作S280~操作S290。
在操作S280，对第三切片进行三维光学成像，得到第三三维光镜图像，对第三三维光镜图像进行分析，提取第三切片内待研究目标的种类和分布信息。
本发明一实施例中，将第三切片置于电镜真空腔室内的光镜成像位，在垂直于样品的方向，利用三维光学成像技术对第三切片进行三维多通道光学成像，可以得到第三切片内待研究目标的种类、分布等信息。其中，三维光学成像技术可以包括共聚焦成像方法或者结构光照明成像方法或者三维单分子定位成像方法或者光片成像方法。
在操作S290，根据第三三维光镜图像中待研究目标的种类和分布信息指导和辅助冷冻电子断层扫描成像数据的收集和分析。
在本发明一实施例中，将第三切片转移至透射电镜中进行透射电子成像，再将透射电镜图像与对应的第三三维光镜图像相关联，即可通过光镜信息定位透射电镜图像中研究目标的第四位置，基于第四位置在透射电镜图像中划定冷冻电子断层扫描成像数据的收集范围。对于三维重构后的冷冻电子断层扫描图像，也可与对应的第三切片的第三三维光镜图像相关联，利用荧光信息判别研究目标种类与位置，辅助冷冻电子断层扫描图像分析。
图6示意性示出了本发明实施例提供的实现上述离子束加工方法的嵌入式三维光电关联成像装置的结构图。
如图6所示，该嵌入式三维光电关联成像装置可以包括：
离子束模块1、扫描电镜模块2、光学物镜模块3、光学窗口4、光学激发成像模块5、电镜成像切割位6、光镜成像位7、真空腔室8。
离子束模块1、扫描电镜模块2和光学物镜模块3可以设置于同一真空腔室8内部，光学窗口4开设在真空腔室8的侧壁，并与光学物镜模块3和光学激发成像模块5实现光路连通。电镜成像切割位6设于离子束模块1和扫描电镜模块2的下方，光镜成像位7设于光学物镜模块3的下方，样品可在电镜成像切割位6和光镜成像位7之间切换。
离子束模块1用于对样品进行离子束切割，扫描电镜模块2用于对样品进行扫描电镜成像，光学窗口4用于连接真空腔室8内外的光路，光学激发成像模块5用于提供共聚焦成像的扫描激发光，并将激发光通过光学物镜模块3透射到样品上，通过对样品不同层面进行扫描实现三维成像，同时光学激发成像模块5还用于探测光学物镜模块3收集到的明场信号和荧光信号，并通过计算机采集图像。
需要说明的是，上述结构的嵌入式三维光电关联成像装置只是能够实现本发明实施例提供的离子束加工方法的一种结构，并不用于限制本发明提供的离子束加工方法。
综上所述，本发明实施例提供的配准过程采用的是光电关联配准，可以直接利用离子束对样品表面进行刻蚀获取配准基准图形进行配准，不需要额外添加基准标记物，降低实验的复杂度，操作简便且可重复性强。利用三维光镜图像投影和离子束刻蚀的配准基准图形进行光电关联配准，进一步降低复杂度，增强配准结果可重复性。进一步地，利用三维光镜图像投影确定目标在切片中的位置，定位精度高，可实现纳米精度的定点切割。此外，利用最终切片的三维光镜图像，可识别目标种类，并确定目标在切片中的位置，利用这些信息可以辅助冷冻电子断层扫描成像数据收集和数据分析。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于光学显微成像的离子束加工方法，其特征在于，包括：
利用离子束对样品表面进行标记，得到配准基准图形；
对所述样品进行三维光学成像，得到第一三维光镜图像；
将所述第一三维光镜图像投影到离子束的切割角度，基于所述配准基准图形确定待研究目标在所述第一三维光镜图像中的第一位置；
对所述样品进行离子束成像，得到离子束激发的图像，并根据所述第一位置确定待研究目标在所述离子束激发的图像中的第二位置；
根据所述第二位置对所述样品进行减薄，得到包含所述研究目标的第一切片。
2.根据权利要求1所述的离子束加工方法，其特征在于，所述方法还包括：
根据所述第二位置对所述样品进行减薄，得到包含所述研究目标的第二切片；
对所述第二切片进行三维光学成像，得到第二三维光镜图像，其中，对所述第二切片进行三维光学成像的放大倍数高于对所述样品进行三维光学成像的放大倍数；
将所述第二三维光镜图像投影到离子束的切割角度，得到二维投影图像；
基于所述二维投影图像确定所述待研究目标在所述第二切片中的第三位置；
根据所述第三位置对所述样品进行减薄，得到包含所述待研究目标的第三切片。
3.根据权利要求2所述的离子束加工方法，其特征在于，对所述样品进行三维光学成像或对所述第二切片进行三维光学成像，具体包括：
将所述样品或所述第二切片装载至电镜真空腔室内的光镜成像位上，使样品保持水平；
在垂直于所述样品的方向，利用三维光学成像技术对样品或所述第二切片进行多通道三维成像。
4.根据权利要求3所述的离子束加工方法，其特征在于，所述三维光学成像技术包括共聚焦成像方法或者结构光照明成像方法或者三维单分子定位成像方法或者光片成像方法。
5.根据权利要求3所述的离子束加工方法，其特征在于，利用明场成像得到配准基准图形的图像或切片表面形貌信息，利用荧光成像得到待研究目标的图像。
6.根据权利要求2所述的离子束加工方法，其特征在于，将所述第一三维光镜图像投影到离子束的切割角度或将所述第二三维光镜图像投影到离子束的切割角度，得到二维投影图像具体包括：
将所述第一三维光镜图像和所述第二三维光镜图像投影到和离子束同一视角的二维投影图像。
7.根据权利要求6所述的离子束加工方法，其特征在于，基于所述配准基准图形确定待研究目标在所述第一三维光镜图像中的第一位置，具体包括：
测量所述二维投影图像中待研究目标到所述配准基准图形中心的二维像素距离；
基于预先校准的光学成像像素点大小，将所述二维像素距离转换为真实距离；
根据所述真实距离确定所述第一位置。
8.根据权利要求2所述的离子束加工方法，其特征在于，所述第一切片和所述第三切片的厚度为百纳米级，可适用于透射电子成像或电子断层扫描成像，所述第二切片的厚度为微米级。
9.根据权利要求2所述的离子束加工方法，其特征在于，所述方法还包括：
对所述第一切片或所述第三切片进行三维光学成像，得到第三三维光镜图像；
对所述第三三维光镜图像进行分析，提取所述第一切片或所述第三切片内所述待研究目标的种类和分布信息；
根据所述待研究目标的种类和分布信息指导和辅助冷冻电子断层扫描成像数据的收集和分析。
10.根据权利要求9所述的离子束加工方法，其特征在于，根据所述待研究目标的种类和分布信息指导和辅助冷冻电子断层扫描成像数据的收集和分析，具体包括：
对所述第一切片或所述第三切片进行透射电子成像，得到透射电镜图像；
根据所述待研究目标的种类和分布信息定位所述透射电镜图像中所述待研究目标的第四位置；
基于所述第四位置在所述透射电镜图像中划定冷冻电子断层扫描成像数据的收集范围；
对于三维重构后的冷冻电子断层扫描图像，与对应的第一切片或第三切片的第三三维光镜图像相关联，利用荧光信息判别研究目标种类与位置，辅助冷冻电子断层扫描图像分析。
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Citations (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080029714A1 (en) * | 2005-08-25 | 2008-02-07 | Newport Imaging Corporation | Digital camera with integrated infrared (IR) response |
| CN103308496A (zh) * | 2012-03-16 | 2013-09-18 | 徐涛 | 一种新型的超高分辨光电融合显微成像系统 |
| US8754384B1 (en) * | 2013-02-08 | 2014-06-17 | Fei Company | Sample preparation stage |
| CN104142302A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-11-12 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种光镜电镜关联成像用光学真空冷台 |
| CN104198242A (zh) * | 2014-08-28 | 2014-12-10 | 中国科学院生物物理研究所 | 聚焦离子束法制备冷冻含水切片的样品夹持工具和转移盒子 |
| CN104215580A (zh) * | 2014-09-23 | 2014-12-17 | 中国科学技术大学 | 用于冷冻光电关联显微成像的方法和装置 |
| US9741532B1 (en) * | 2016-06-17 | 2017-08-22 | International Business Machines Corporation | Multi-beam electron microscope for electron channeling contrast imaging of semiconductor material |
| CN108956562A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-12-07 | 浙江大学 | 一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置 |
| CN110057851A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-07-26 | 中国科学院地球化学研究所 | 一种原位制备微米级的单颗粒多个tem薄片样品的方法 |
| CN110108690A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-09 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种超低温可换样显微成像系统及其工作方法 |
| US20190348253A1 (en) * | 2018-05-14 | 2019-11-14 | Jeol Ltd. | Observation Method, Specimen Support, and Transmission Electron Microscope |
| CN111292310A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-06-16 | 广州再生医学与健康广东省实验室 | 获取生物组织图像的方法、装置、电子设备及存储介质 |
| CN111413356A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-14 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种冷冻超薄切片的制备方法 |
| US20200266026A1 (en) * | 2019-02-19 | 2020-08-20 | Jeol Ltd. | Observation Method, Image Processing Device, and Electron Microscope |
| US20210104375A1 (en) * | 2019-10-08 | 2021-04-08 | Fei Company | Low kev ion beam image restoration by machine learning for object localization |
| CN113358611A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-09-07 | 中国科学院生物物理研究所 | 嵌入式三维光电关联成像装置及方法 |
| CN113670956A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-19 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种高真空环境光镜电镜关联成像系统 |
| WO2021239979A1 (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. | Device for reducing ice contamination of a sample, focused ion beam milling apparatus and method for focused ion beam milling of a sample |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6876576B2 (ja) * | 2017-08-17 | 2021-05-26 | 日本電子株式会社 | 三次元像構築方法 |
-
2022
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-
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- 2023-06-14 US US18/334,995 patent/US20240112880A1/en active Pending
Patent Citations (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20080029714A1 (en) * | 2005-08-25 | 2008-02-07 | Newport Imaging Corporation | Digital camera with integrated infrared (IR) response |
| CN103308496A (zh) * | 2012-03-16 | 2013-09-18 | 徐涛 | 一种新型的超高分辨光电融合显微成像系统 |
| US8754384B1 (en) * | 2013-02-08 | 2014-06-17 | Fei Company | Sample preparation stage |
| CN104142302A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-11-12 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种光镜电镜关联成像用光学真空冷台 |
| CN104198242A (zh) * | 2014-08-28 | 2014-12-10 | 中国科学院生物物理研究所 | 聚焦离子束法制备冷冻含水切片的样品夹持工具和转移盒子 |
| CN104215580A (zh) * | 2014-09-23 | 2014-12-17 | 中国科学技术大学 | 用于冷冻光电关联显微成像的方法和装置 |
| US9741532B1 (en) * | 2016-06-17 | 2017-08-22 | International Business Machines Corporation | Multi-beam electron microscope for electron channeling contrast imaging of semiconductor material |
| US20190348253A1 (en) * | 2018-05-14 | 2019-11-14 | Jeol Ltd. | Observation Method, Specimen Support, and Transmission Electron Microscope |
| CN108956562A (zh) * | 2018-06-11 | 2018-12-07 | 浙江大学 | 一种基于重定位的光切片荧光显微成像方法和装置 |
| US20200266026A1 (en) * | 2019-02-19 | 2020-08-20 | Jeol Ltd. | Observation Method, Image Processing Device, and Electron Microscope |
| CN110057851A (zh) * | 2019-05-17 | 2019-07-26 | 中国科学院地球化学研究所 | 一种原位制备微米级的单颗粒多个tem薄片样品的方法 |
| CN110108690A (zh) * | 2019-06-10 | 2019-08-09 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种超低温可换样显微成像系统及其工作方法 |
| US20210104375A1 (en) * | 2019-10-08 | 2021-04-08 | Fei Company | Low kev ion beam image restoration by machine learning for object localization |
| CN111292310A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-06-16 | 广州再生医学与健康广东省实验室 | 获取生物组织图像的方法、装置、电子设备及存储介质 |
| CN111413356A (zh) * | 2020-04-07 | 2020-07-14 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种冷冻超薄切片的制备方法 |
| WO2021239979A1 (en) * | 2020-05-28 | 2021-12-02 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V. | Device for reducing ice contamination of a sample, focused ion beam milling apparatus and method for focused ion beam milling of a sample |
| CN113358611A (zh) * | 2021-04-28 | 2021-09-07 | 中国科学院生物物理研究所 | 嵌入式三维光电关联成像装置及方法 |
| CN113670956A (zh) * | 2021-08-11 | 2021-11-19 | 中国科学院生物物理研究所 | 一种高真空环境光镜电镜关联成像系统 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JAN ARNOLD ETAL.: "Site-Specific Cryo-focused Ion Beam Sample Preparation Guided by 3D Correlative Microscopy" * |
| SERGEY GORELICK ETAL.: "PIE-scope, integrated cryo-correlative light and FIB/SEM microscopy" * |
| 田步云等: "冷冻超分辨光电关联成像在膜接触点研究中的应用尝试" * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115575364B (zh) | 2023-08-04 |
| US20240112880A1 (en) | 2024-04-04 |
| EP4345440A1 (en) | 2024-04-03 |
| JP2024052505A (ja) | 2024-04-11 |
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