CN115569202A - 一种帕金森综合征动物模型、药物筛选方法及治疗药物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于表征帕金森综合征的动物模型，并公开了基于所述模型进行药物筛选的方法，以及可用于治疗帕金森综合征的药物。本发明所述帕金森综合征动物模型，与野生型动物相比，所述帕金森综合征动物模型中细胞周期蛋白相关激酶GAK的表达量降低，或者，所述帕金森综合征动物模型中脑组织或其体液中细胞周期蛋白相关激酶GAK mRNA或mRNA片段含量降低。

Description

一种帕金森综合征动物模型、药物筛选方法及治疗药物
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于表征帕金森综合征的动物模型，并公开了基于所述模型进行药物筛选的方法，以及可用于治疗帕金森综合征的药物。
背景技术
帕金森病(PD)是老年人中常见的一种神经退行性疾病，65岁以上人群发病率1.7％以上，80岁以上发病率高达10％，是一种发病率仅次于阿尔兹海默氏症的神经系统退行性疾病。帕金森病最主要的病理改变是中脑黑质多巴胺(dopamine，DA)能神经元的变性死亡，由此而引起纹状体DA含量显著性减少而致病。PD在临床上的主要表现为运动迟缓、肌肉僵直、静止性震颤和姿势步态失稳等运动障碍，且伴有抑郁、痴呆、睡眠障碍、嗅觉失敏、疼痛、尿失禁、便秘等一系列非运动障碍，患者最终将完全丧失生活自理能力并早于预期寿命死亡，严重影响人类健康。
目前PD的临床治疗均以姑息性缓解临床症状为主(如药物治疗或深部脑刺激)，这些方法只能暂时缓解PD患者的临床症状，不能阻断其病理进程，且会导致异动症、认知障碍、抑郁、自杀等各种副作用。如目前治疗PD的临床药物主要以补充减少的多巴胺或降低多巴胺代谢为主，短期内可缓解PD的临床症状，但长期使用(大约5年后)会在大部分的病人中出现运动失稳和运动并发症，且会出现恶心、呕吐、眩晕、疲倦等毒副作用。深部脑刺激(DBS)是将一个或多个刺激电极通过外科手术的方式植入到大脑特定区域，通过脉冲电刺激调节电极植入区域的神经传导信号，这种治疗方式不但费用昂贵，还可带来手术感染和出血等风险，且可导致认知障碍、记忆缺陷、语言困难、平衡失调、吞咽困难以及运动和感觉困难等不良影响，甚至导致狂躁、忧郁、冷漠、焦虑及自杀念头等心理障碍。因此，帕金森病的病理机制与临床诊治是人类史上最重要、最艰巨的关键科学问题与世界医学难题，开发取代上述PD姑息性疗法的新的PD治疗药物一直都是科研人员努力追求的终极目标。
PD最初被认为是散发性疾病，随着全基因组关联分析(GWAS)及全基因组、全外显子测序等技术的出现，人们发现了包括PARK1(SNCA)、PARK2(Parkin)、PARK6(Pink1)、PARK7(DJ-1)和PARK8(LRRK2)等在内的30多种PD关联/致病基因，由此奠定了PD的遗传机制。而且在散发性PD中也存在相应基因的突变或表达发生改变，这就为PD的基因治疗提供了可能。通过基因治疗的方式以致病基因作为靶点，矫正致病基因的突变或表达可以恢复多巴胺神经元的活性，达到从根源上对PD进行治疗的目的。因此，以致病基因作为PD治疗靶点，开发矫正致病基因突变或表达的药物是对PD进行根治的理想方式。
发明内容
为此，本发明所要解决的技术问题在于公开了一种帕金森综合征动物模型，所述动物模型可用于进行治疗帕金森药物的筛选；
本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种筛选用于治疗帕金森综合征的药物的方法；
本发明所要解决的第三个技术问题在于提供一种预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法；
本发明所要解决的第四个技术问题在于提供一种预防和/或治疗帕金森综合征的药物；
本发明所要解决的第四个技术问题在于提供了可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK基因表达或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK含量或活性的物质，或者，细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段，用于制备帕金森相关药物或产品的用途。
为解决上述技术问题，本发明公开了一种帕金森综合征动物模型，与野生型动物相比，所述帕金森综合征动物模型中细胞周期蛋白相关激酶GAK的表达量降低，或者，所述帕金森综合征动物模型中脑组织或其体液中细胞周期蛋白相关激酶GAK mRNA或mRNA片段含量降低。
具体的，所述动物选自小鼠、大鼠或者灵长类动物中的至少一种。
本发明还公开了所述帕金森综合征动物模型在治疗帕金森综合征药物筛选中的应用。
本发明还公开了一种筛选用于治疗帕金森综合征的药物的方法，包括：将候选药物施用于所述动物模型的步骤；以及，筛选可使得细胞周期蛋白相关激酶GAK表达量增加或者可使得帕金森综合征减轻的候选药物的步骤，作为所需用于治疗帕金森综合征的药物。
本发明还公开了一种预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，包括利用蛋白和/或表达cDNA或cDNA片段制备所需药物的步骤；
所述蛋白是以细胞周期蛋白相关激酶GAK基因cDNA或cDNA片段的表达产物；
所述cDNA或cDNA片段来源于细胞周期蛋白相关激酶GAK基因。
具体的，所述预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，所述cDNA或cDNA片段未经修饰，或者包含至少含有1个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物；其中，被修饰的核苷酸或核苷酸类似物的修饰位点可以在核糖核苷酸的糖基、主链或碱基上；
所述核苷酸类似物包括硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸、肌苷或三苯甲基化碱基。
本发明还公开了一种预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，包括利用可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK的cDNA或cDNA片段的表达病毒制备所需药物的步骤；
所述促进细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的表达病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中得到至少一种。
具体的，所述预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，所述cDNA或cDNA片段表达病毒由以下方法制得：将细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段插入表达载体多克隆位点区构建cDNA或cDNA片段表达质粒；将cDNA或cDNA片段表达质粒与辅助质粒共转染细胞，产生病毒颗粒，回收浓缩后制得。
本发明还公开了一种预防和/或治疗帕金森综合征的药物，所述药物包括细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段；和/或，含有细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段基因的表达病毒；
或者，
所述药物的活性成分包括可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK表达的物质，和/或，使细胞周期蛋白相关激酶GAK的生理活性增加的物质。
优选的，所述细胞周期蛋白相关激酶GAK为人中脑组织或体液中的细胞周期蛋白相关激酶GAK；可选的，所述体液选自血液、脑积液和尿液中的一种或几种；所述血液为离体或在体血液；人中脑组织为离体或在体人脑组织。
优选的，所述病毒包括腺病毒、慢病毒腺相关病毒载体中至少一种。
本发明中，涉及的帕金森治疗对象包括帕金森综合症患者、帕金森综合症疑似患者、帕金森综合症高风险人群或帕金森综合症患者直系亲属；帕金森综合症患者为散发性帕金森综合症患者或家族遗传性帕金森综合症患者。
可选的，所述帕金森综合征的患者为具有家族遗传史，或散发性帕金森综合症患者。
本发明还公开了一种可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK基因表达或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK含量或活性的物质，或者，细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段，用于制备具有如下(1)-(4)中至少一项功效的药物或产品的用途：
(1)治疗帕金森综合征；
(2)治疗或缓解帕金森综合征运动障碍；
(3)治疗或缓解帕金森综合征非运动症状；
(4)增加多巴胺分泌的产品；优选的，所述多巴胺包括纹状体中多巴胺。
具体的，所述促进细胞周期蛋白相关激酶GAK基因表达或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK含量或活性的方式为：通过基因编辑的方法增强细胞周期蛋白相关激酶GAK基因的转录和翻译水平，或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK mRNA的稳定性，或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白的稳定性，或减少细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白的降解水平。
具体的，所述细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA或cDNA片段输送到帕金森病变累及脑区的方式包括：
(1)通过脑立体定位注射的方式将细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA或cDNA片段的病毒颗粒注射到帕金森病变累及脑区；
(2)通过脑立体定位注射的方式将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的质粒注射到帕金森病变累及脑区，并通过电转的方式将质粒转入到细胞中；
(3)通过脑立体定位注射的方式将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的质粒和脂质体注射到帕金森病变累及脑区；
(4)通过蛛网膜下隙将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的病毒颗粒进行注射对帕金森病进行治疗。
具体的，所述药物或产品的功能包括：
(1)所述药物使细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA的表达水平提高；
(2)所述药物使细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA的稳定性提高；
(3)所述药物提高细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA的生理功能；
(4)所述药物使细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA在核糖体上的翻译水平提高；
(5)用于治疗帕金森综合征。
具体的，所述使细胞周期蛋白相关激酶GAK的正常表达水平升高的方式为如下任意一种或几种：
(1)提高细胞周期蛋白相关激酶GAK编码基因转录水平；
(2)提高细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白翻译水平；
(3)降低细胞周期蛋白相关激酶GAK的降解速度；
具体的，所述药物提高细胞周期蛋白相关激酶GAK的生理功能具体为所述药物通过加速囊泡脱包被、加速囊泡循环等方式增加多巴胺分泌。
可选的，所述帕金森综合征的患者为具有家族遗传史，或散发性帕金森综合症患者。
本发明还公开了GAK蛋白和/或GAK mRNA及其片段作为帕金森治疗靶点的用途。
本发明所述帕金森综合征动物模型，通过表征细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK mRNA的情况进行帕金森综合征动物模型构建，与野生型动物相比，所述帕金森综合征动物模型中细胞周期蛋白相关激酶GAK的表达量降低，或者，所述帕金森综合征动物模型中脑组织或其体液中细胞周期蛋白相关激酶GAK mRNA或mRNA片段含量降低，可以用于模拟帕金森综合征的表征，进行用于药物筛选或药效验证。
本发明所述筛选用于治疗帕金森综合征的药物的方法，利用所述动物模型进行候选药物的筛选，筛选可使得细胞周期蛋白相关激酶GAK表达量增加或者可使得帕金森综合征减轻的候选药物作为所需用于治疗帕金森综合征的药物。本发明所述药物筛选方法，基于细胞周期蛋白相关激酶GAK相关表达量为指标，可筛选用于治疗帕金森综合征的有效药物。
本发明所述防和/或治疗帕金森综合征的药物，以细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA为靶点进行作用，可以有效预防、缓解或治疗帕金森综合征。本发明所述药物包括细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段；和/或，含有细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段基因的表达病毒；或者，所述药物的活性成分包括可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK表达的物质，和/或，使细胞周期蛋白相关激酶GAK的生理活性增加的物质，通过对细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA为靶点进行作用，对帕金森综合征作用效果较好。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中，
图1为MPTP诱导PD小鼠模型的运动能力测试和中脑黑质GAK蛋白表达水平检测；其中，
图1中a和b显示MPTP处理后的小鼠在旷场实验中表现出运动能力障碍；
图1中c显示MPTP处理后小鼠在悬线实验中表现出运动能力障碍；
图1中d为盐水(Saline)和MPTP处理后小鼠中脑黑质GAK蛋白表达水平的统计分析；
图2为通过脑立体定位方式注射GAK-shRNA病毒，降低中脑黑质区的GAK基因表达；其中，
图2中a为病毒注射模式图；
图2中b为小鼠中脑黑质未注射GAK shRNA病毒侧和注射GAK shRNA病毒侧GAK表达水平的western blot代表性条带；contra表示未注射GAK shRNA病毒侧，ipsi表示注射GAKshRNA病毒侧；
图2中c为未注射GAK shRNA病毒侧和注射GAK shRNA病毒侧小鼠中脑黑质GAK蛋白表达水平的统计分析；contra表示未注射GAK shRNA病毒侧，ipsi表示注射GAK shRNA病毒侧；
图2中d表示通过免疫荧光染色法确定注射位置的准确性；
图3为实施例中单侧中脑黑质区注射GAK-shRNA病毒，注射侧多巴胺神经元数量显著降低；contra表示未注射GAK shRNA病毒侧，ipsi表示注射GAK shRNA病毒侧；其中，
图3中a-c为GAK-shRNA病毒注射后，注射侧和未注射侧多巴胺神经元的免疫荧光图；
图3中d为未注射侧和注射侧多巴胺神经元数量的统计分析；
图4为实施例中小鼠GAK敲降和敲降后过表达GAK，PD非运动症状的改变；Ctrl表示注射对照病毒即空病毒载体组，GAK KD表示注射GAK shRNA组，rescue表示注射GAK shRNA后再次注射GAK过表达病毒组；其中，
图4中a为旷场实验中三种小鼠运动轨迹图；
图4中b为对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠在旷场中心时间和角落时间的统计分析；
图4中c为十字高架实验中三种小鼠在十字高架上的运动轨迹图；
图4中d对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠在十字高架实验开放臂和闭合臂停留时间的统计分析；
图5为对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠在旷场、悬线和圆筒实验中行为学表现；Ctrl表示注射对照病毒即空病毒载体组，GAK KD表示注射GAK shRNA敲降GAK组，rescue表示注射GAK shRNA后再次注射GAK过表达病毒组；其中，
图5中a和b分别表示对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠在旷场中运动的总路程与最大运动速度的统计图；
图5中c为对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠在悬线实验中铜线上停留时间的统计图；
图5中d为对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠在15min圆筒实验中前肢接触筒壁次数的统计图；
图6为对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠在步态行为学测试中的表现；其中，
图6中a为单侧注射对照病毒后，小鼠注射侧与未注射侧步幅分布散点图，contra代表未注射侧，ipsi代表注射侧；
图6中b为注射侧和未注射侧步长范围和步长变异度统计图；
图6中c为注射及未注射侧前后脚掌重合统计图；
图6中d为单侧注射GAK shRNA病毒后，小鼠注射侧与未注射侧步幅分布散点图；
图6中e为注射侧和未注射侧步长范围和步长变异度统计图；
图6中f为注射侧及未注射侧前后脚掌重合统计图；
图6中g为单侧注射GAK shRNA病毒后再过表达GAK，小鼠注射侧与未注射侧步幅分布散点图；
图6中h为注射侧和未注射侧步长范围和步长变异度统计图；
图6中i为注射侧及未注射侧前后脚掌重合统计图；
图7为实施例中小鼠纹状体脑片中多巴胺记录；其中，
图7中a为对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠的纹状体脑片上记录到的多巴胺分泌图；E-stim表示电刺激，Iamp表示电流，Qamp电荷数；
图7中b所记录的纹状体脑片切片位置示意图；
图7中c为对照小鼠、GAK敲降小鼠和敲降后GAK过表达小鼠的纹状体脑片上记录到的多巴胺分泌统计图。
具体实施方式
实施例1构建表达载体
根据现有GAK的相关报道，确定在GAK shRNA病毒中，shRNA的序列包括：
GAKsh-1：GCAAAGGGTGATCTGGACATA；
GAKsh-2：GCATTAAAGCGATTACTATCC；
GAKsh-3：GAGTATGCATTAAAGCGATTA。
根据上述序列结构，由汉恒生物科技有限公司制备得到的腺相关病毒(AAV)。
本实施例中，所需过表达病毒为将GAK cDNA或GAK cDNA片段序列插入pFUGW载体多克隆位点得到。将慢病毒表达载体(GAK-expressing and control pFUGW)和辅助质粒(pRSV-REV，pMDLg-pRRE，and vesicular stomatitis virus G protein-expressingplasmid)分别按4μg、2μg、2μg，and 2μg，每25cm2培养面积的剂量转染HEK293T细胞，转染试剂为polyethylenimine“Max”(Mw 40000，Cat 24765-2，Polysciences)，转染方法参照试剂指导说明进行。转染48h后，收集培养液并于4℃以3000g离心5min，将上清再以50000g离心120min，以冰冷的1‰培养液体积的PBS缓冲液重悬沉淀得浓缩病毒。
实施例2 MPTP诱导PD小鼠模型运动功能测试
PD小鼠造模
以25mg/kg/天腹腔注射MPTP，连续5天注射制作小鼠PD模型。
旷场实验
将实验动物从饲养笼中轻轻取出，并迅速放置于旷场实验装置(50cm×50cm×40cm)的中央区域，使用Anymaze分析软件自动记录动物在旷场内的活动，实验时间为30min。软件自动统计实验动物的活动路程、平均速度、最大速度等，用以指征小鼠的运动能力，结果如附图1中a和b所示。
附图1中a和b显示，与注射生理盐水组(Saline)相比，注射MPTP组的运动总路程和运动最大速度均显著性降低，表明MPTP注射导致小鼠运动能力降低。同时，采用软件自动统计实验动物在中央区域(20cm×20cm)的停留时间和进入次数，和外围区域(离箱壁5cm的位置)的停留时间和进入次数，用以指征小鼠的焦虑状况。
悬线实验
在一个大的填满垫料的饲养盒上方60cm处悬挂一条紧绷的铜线。将小鼠轻轻放置在铜线上，小鼠会保持一个倒挂姿势，在小鼠力量不足时会掉落到饲养盒中，记录小鼠在铜线上的停留时间可以反应小鼠的运动能力。结果如附图1中c所示，与注射生理盐水组(Saline)相比，注射MPTP组小鼠在铜线的停留时间显著减少(p＜0.05)，表明MPTP注射导致小鼠运动能力下降。
实施例3 MPTP诱导PD小鼠模型的中脑黑质中GAK蛋白表达水平显著下降
MPTP诱导PD小鼠模型同实施例2
脑组织蛋白提取
实验鼠麻醉后，用10ml冰冷的人工脑脊液进行心脏灌流，迅速断头取出脑组织，并在Leica VT1200S切片机上将脑组织水平切片，分离出脑切片中的黑质并将其进行组织匀浆，匀浆后的组织在4℃以12000g离心15min。取上清，加1/4上清体积的5X SDS-PAGE上样缓冲液，95-100℃煮沸10min，即得蛋白样品，用于Western blot分析。
Western杂交
将所得蛋白溶液进行电泳，并电转至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭1-1.5h，洗膜3次，在含GAK一抗(Abcam，ab186120)的2％BSA TBST溶液中4℃孵育过夜，用TBST洗膜5次后再与相应二抗(111-035-003兔抗，Jackson ImmunoResearch)室温孵育1.5-2h，TBTS洗膜5次后在clinx chemicapture成像系统中进行扫描，统计结果如附图1中d所示。与盐水(Saline)处理组相比，MPTP处理组的中脑黑质GAK的表达水平显著下降。
实施例4通过脑立体定位方式注射GAK-shRNA病毒，降低中脑黑质区GAK蛋白的表达。
GAK shRNA病毒注射
附图2中a为病毒注射模式图。小鼠腹腔注射1.5g/kg乌拉坦进行麻醉，采用加热毯维持其体温在37℃，同时使用氧气面罩提供氧气保持小鼠状态良好。将小鼠固定在脑立体定位仪上，保持前、后囟点在同一平面。利用坐标(AP：-3mm，ML：1.25mm)找到黑质所在的平面位置，利用颅骨钻打孔，将安装32G针头的注射器以颅骨为平面插入脑中4mm，以100nl/min的速度缓慢注入0.3μl GAK shRNA AAV病毒浓缩液(滴度：1012-1013/ml)，注射结束后停留15-20min，缓慢拔出注射器，缝合头皮后，小鼠置于37℃加热毯上复苏。将上述GAK shRNAAAV病毒浓缩液替换为空病毒载体后作为对照。如附图2中d所示，病毒精准注射到小鼠的黑质区域中。
脑组织蛋白提取
同实施例3，取得蛋白样品后用于Western blot分析。如附图2中b和c所示，结果表明GAK shRNA病毒注射后，多巴胺神经元胞体区所在的黑质中GAK蛋白的表达水平显著下调。
实施例5检测GAK shRNA病毒注射后多巴胺神经元的感染效率
GAK shRNA病毒注射同实施例4
组织切片：实验鼠采用乌拉坦(1.5g/kg，i.p.)进行麻醉，用20ml生理盐水进行心脏灌流，后采用4％多聚甲醛进行预固定。将脑组织取出，放入4％的多聚甲醛中4℃过夜。再分别用质量体积分数为10％、20％和30％的蔗糖进行梯度脱水。将脱水后的脑组织进行修整。采用OCT胶进行包埋，在冰冻切片机上切片，每片厚度为30μm。用于免疫荧光染色。
免疫荧光：将切好的脑片用PBS洗3遍，再用含0.3％Triton X-100的PBS溶液在室温下打孔5min，然后在含2％BSA的PBS溶液1中封闭1h。将脑片在含有TH一抗(SYSY，213111)的2％BSA-PBS溶液中室温孵育1h(或4℃过夜)，用含2％BSA的PBS洗3遍，而后与相应荧光的二抗(Invitrogen，A21203)温孵育1h，用PBS洗3遍后，用Dako封片剂进行封片。使用LSM710倒置荧光显微镜进行图像采集。
附图3中a-c为病毒注射1个月后脑的免疫荧光染色图片。TH阳性的为多巴胺神经元，GFP阳性的为病毒感染的细胞，比例尺：500μm。TH阳性且GFP阳性的细胞即为病毒转染成功的多巴胺神经元。结果表明，GAK shRNA病毒成功注射至单侧黑质区，并且对本脑区的多巴胺神经元有较高的感染效率。
实施例6 GAK-shRNA病毒注射到中脑黑质区导致多巴胺神经元数量显著减少
本实施例中，GAK shRNA病毒注射同实施例4，组织切片及免疫荧光同实施例5。对组织进行连续切片，每5片取1片进行免疫荧光染色，染色后对多巴胺神经元进行手动计数，将所得到的数值相加，所得数值总和乘以5即为单侧黑质区多巴胺的数量。如附图3中d所示，GAK shRNA病毒注射侧，多巴胺神经元的数目较对照侧显著降低(p＜0.05)。
实施例7小鼠GAK敲降和敲降后过表达GAK。GAK敲降导致小鼠出现PD非运动症状，敲降后再过表达GAK可以减轻非运动症状。
旷场实验
实验过程同实施例2。
附图4中a和b所示结果表明，与注射对照病毒即空病毒载体组小鼠相比，注射GAKshRNA的小鼠在旷场中心停留的时间显著缩短，在旷场角落停留的时间显著增加，说明注射GAK shRNA的小鼠具有明显的焦虑样行为，表现出PD的非运动症状。在这种PD小鼠模型中过表达GAK，与GAK敲降小鼠相比，敲降后再过表达GAK能够显著增加小鼠在旷场中央的时间和减少在旷场角落的时间，说明能够缓解PD小鼠的焦虑样行为。GAK过表达对PD小鼠的非运动症状具有治疗作用。
十字高架实验
首先将实验动物在安静的环境中适应30min，十字高架的高度设置为75cm，用75％酒精消毒十字高架，并拿吸水纸擦干。将老鼠头朝前放置在十字高架的开臂上，让老鼠自由探索10min。以老鼠的前两爪进入作为判断标准。录制视频10min。统计10min内老鼠在开放臂、闭合臂停留的时间，及进入开放臂、闭合臂的次数。
附图4中c和d所示结果表明，与注射对照病毒即空病毒载体组小鼠相比，注射GAKshRNA组小鼠在十字高架开放臂停留的时间显著缩短，在十字高架闭合臂停留的时间显著增加，说明注射GAK shRNA的小鼠具有明显的焦虑样行为，表现出PD的非运动症状。在这种PD小鼠模型中过表达GAK，与GAK敲降小鼠相比，敲降后再过表达GAK能够显著增加小鼠在十字高架开放臂时间和减少在十字高架闭合臂的时间，说明能够缓解PD小鼠的焦虑样行为。GAK过表达对PD小鼠的非运动症状具有治疗作用。实施例8小鼠GAK敲降和敲降后过表达GAK，旷场、吊线和圆筒实验行为学的变化
旷场实验
实验过程同实施例2。
附图5中a和b所示结果表明，与注射对照病毒即空病毒载体组相比，注射GAKshRNA组(即GAK KD)无论在运动最大速度还是在运动总路程上均显著性降低(p＜0.05)，小鼠表现运动能力下降，出现PD运动症状。而在PD小鼠上GAK过表达进行“拯救(rescue)”，能够恢复PD小鼠的最大运动速度和运动路程。表明GAK过表达可以改善PD小鼠的运动症状。
吊线实验
实验过程同实施例2。
附图5中c所示结果表明，与注射对照病毒即空病毒载体组小鼠相比，注射GAKshRNA组小鼠在铜线的停留时间显著减少(p＜0.05)，表现出PD运动症状。而在这种小鼠上GAK过表达进行“拯救(rescue)”，能够恢复PD小鼠在铜线上的停留时间，说明在PD小鼠中过表达GAK对PD的运动障碍具有治疗作用。
圆筒实验
将实验小鼠放在测试房间适应30min。准备两个干净的2升玻璃烧杯，用75％的酒精消毒擦净，并放入干净的垫料厚约2cm。实验开始前3天连续进行适应性训练，每天将实验小鼠在圆筒中适应15-20min，观察其直立探索，并记录上肢接触圆筒的次数。训练3天后开展实验，实验方法与前3天相同，记录小鼠在15min内上肢接触圆筒的次数，评估小鼠的运动能力。
附图5中d所示结果表明，与注射对照病毒即空病毒载体组小鼠相比，注射GAKshRNA组小鼠接触筒壁的次数显著减少(p＜0.05)，表现出PD运动症状。而在这种小鼠上GAK过表达进行“拯救(rescue)”，能够恢复PD小鼠接触筒壁的次数，说明在PD小鼠中过表达GAK对PD运动障碍具有治疗作用。
实施例9 GAK敲降小鼠表现出步态障碍，敲降后再过表达GAK能够恢复小鼠的步态。
步态分析
在小鼠的前后脚掌分别涂上红、黑两种无毒颜料，实验小鼠每天在长100cm、宽10cm和高10cm的跑道上训练跑步三次，连续三天训练后进行步态实验与分析，统计步间距与前后脚掌的重叠情况(掌心距离)，以评估小鼠步伐的稳定性。
结果如附图6所示，其中，单侧注射对照病毒即空病毒载体组小鼠(图6中a-c)的左右侧步幅大小和前后脚掌重合度没有显著性区别；单侧注射GAK shRNA病毒的小鼠(图6中d-f)左右侧步幅大小和前后脚掌重合度出现显著性区别，且注射病毒对侧肢体步幅大小的变异度和前后脚掌的重合度明显变大(p＜0.05)，说明GAK敲降小鼠出现了步态障碍，表现出PD运动障碍。在单侧注射GAK shRNA病毒的小鼠中过表达GAK(图6中g-i)，小鼠左右肢体前后脚掌步间距的差异波动变化显著降低、前后脚掌重叠度增加，说明过表达GAK对PD运动障碍具有治疗作用。
实施例10小鼠纹状体脑片中多巴胺记录
碳纤维电极的制作
先将直径为7μm的碳纤利用负压灌注到直径为1.5mm玻璃微管中，然后使用垂直电极拉制仪(Narishige，Japan)进行拉制；最后在显微镜下将暴露的尖端剪到长200μm。
新鲜纹状体切片的制备
用乌拉坦(1.5g/kg，i.p.；Sigma-Aldrich)将大鼠麻醉后，首先通过氧饱和的含有冰水混合物的切片用人工脑脊液对大鼠进行心脏灌流。切片用人工脑脊液的成分为(单位为mM)：110C5H14ClNO，2.5KCl，0.5CaCl2，7MgCl2，1.3NaH2PO4，25NaHCO3，和25Glucose(用含95v/v％O2和5v/v％CO2的混合气体进行饱和处理)。然后在切片液中快速将脑从颅骨内剥出，将包含纹状体区域的脑组织分离出来。将包含纹状体的脑组织用胶水粘到切片载物台上，通过切片机(Leica)将纹状体切成300μm厚的水平纹状体片。将切好的纹状体在37℃用人工脑脊液中孵育30min，然后置于室温中备用。
脑片多巴胺记录
电化学记录是在脑片专用的实验台上进行的，整个碳纤电极暴露的尖端都插入到纹状体脑片中，距离刺激电极100μm的距离。电刺激是通过双极刺激电极(Plastics OneInc.，USA)给出的，而刺激信号是由Grass刺激器(Astro-Med，USA)产生的。每个脉冲的时程是0.2ms，幅度是0.6mA，每两次刺激的间隔是3mins。安培信号是用EPC9和pulse软件(HEKAElectronic，Lambrecht/Pfalz，Germany)进行采集和记录的。
如附图7中a-c所示结果表明，与未注射病毒侧相比，注射GAK shRNA侧多巴胺分泌显著降低(Iamp，p＜0.05；Qamp，p＜0.05)；注射GAK shRNA后再过表达GAK能够恢复多巴胺的分泌(Iamp，p＜0.05；Qamp，p＜0.05)。
实施例11
本实施例所述帕金森综合征动物模型，所述动物可选自小鼠、大鼠或者非人灵长类动物中的至少一种，用于筛选治疗帕金森综合征的药物。
本实施例所述帕金森综合征动物模型，与野生型动物相比，所述帕金森综合征动物模型中细胞周期蛋白相关激酶GAK的表达量降低，或者，所述帕金森综合征动物模型中脑组织或其体液中细胞周期蛋白相关激酶GAK mRNA或mRNA片段含量降低。通过上述特征可以对治疗帕金森综合征的药物进行筛选。
实施例12
本实施例所述筛选可用于治疗帕金森综合征的药物的方法，利用实施例11所述动物模型进行药物的筛选，具体操作步骤包括：将候选药物按照常规计量或梯度计量施用于实施例11所述动物模型；并筛选可使得细胞周期蛋白相关激酶GAK表达量增加或者可使得帕金森综合征减轻的候选药物的步骤，作为所需用于治疗帕金森综合征的药物，进一步进行后续验证及优化。
实施例13
本实施例所述预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，根据上述实施例12筛选所得药物的特征，可以利用蛋白和/或表达cDNA或cDNA片段制备所需药物；
具体的，所述蛋白是以细胞周期蛋白相关激酶GAK基因cDNA或cDNA片段的表达产物；
具体的，所述cDNA或cDNA片段来源于细胞周期蛋白相关激酶GAK基因。
作为可实施的方案，所述cDNA或cDNA片段未经修饰，或者包含至少含有1个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物；其中，被修饰的核苷酸或核苷酸类似物的修饰位点可以在核糖核苷酸的糖基、主链或碱基上；
作为可实施的方案，所述核苷酸类似物包括硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸、肌苷或三苯甲基化碱基。
实施例14
本实施例所述预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，根据上述实施例12筛选所得药物的特征，可以利用可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK的cDNA或cDNA片段的表达病毒制备所需药物的步骤；
所述促进细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的表达病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中得到至少一种。
作为可以实施的方案，所述cDNA或cDNA片段表达病毒由以下方法制得：将细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段插入表达载体多克隆位点区构建cDNA或cDNA片段表达质粒；将cDNA或cDNA片段表达质粒与辅助质粒共转染细胞，产生病毒颗粒，回收浓缩后制得。
实施例15
根据前述实施例13和14的方法，本实施例所述预防和/或治疗帕金森综合征的药物，所述药物包括细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段；和/或，含有细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段基因的表达病毒；
或者，
所述药物的活性成分包括可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK表达的物质，和/或，使细胞周期蛋白相关激酶GAK的生理活性增加的物质。
作为可以实施的方案，所述病毒包括腺病毒、慢病毒腺相关病毒载体中至少一种。
本实施例所述药物中，所述促进细胞周期蛋白相关激酶GAK基因表达或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK含量或活性的方式为：通过基因编辑的方法增强细胞周期蛋白相关激酶GAK基因的转录和翻译水平，或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK mRNA的稳定性，或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白的稳定性，或减少细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白的降解水平。
本实施例所述药物中，所述细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA或cDNA片段输送到帕金森病变累及脑区的方式包括：
(1)通过脑立体定位注射的方式将细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA或cDNA片段的病毒颗粒注射到帕金森病变累及脑区；
(2)通过脑立体定位注射的方式将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的质粒注射到帕金森病变累及脑区，并通过电转的方式将质粒转入到细胞中；
(3)通过脑立体定位注射的方式将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的质粒和脂质体注射到帕金森病变累及脑区；
(4)通过蛛网膜下隙将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的病毒颗粒进行注射对帕金森病进行治疗。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (15)

1.一种帕金森综合征动物模型，其特征在于，与野生型动物相比，所述帕金森综合征动物模型中细胞周期蛋白相关激酶GAK的表达量降低，或者，所述帕金森综合征动物模型中脑组织或其体液中细胞周期蛋白相关激酶GAK mRNA或mRNA片段含量降低。
2.根据权利要求1所述帕金森综合征动物模型，其特征在于，所述动物选自小鼠、大鼠或者灵长类动物中的至少一种。
3.权利要求1或2所述帕金森综合征动物模型在治疗帕金森综合征药物筛选中的应用。
4.一种筛选用于治疗帕金森综合征的药物的方法，其特征在于，包括：将候选药物施用于权利要求1或2所述动物模型的步骤；以及，筛选可使得细胞周期蛋白相关激酶GAK表达量增加或者可使得帕金森综合征减轻的候选药物的步骤，作为所需用于治疗帕金森综合征的药物。
5.一种预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，其特征在于，包括利用蛋白和/或表达cDNA或cDNA片段制备所需药物的步骤；
所述蛋白是以细胞周期蛋白相关激酶GAK基因cDNA或cDNA片段的表达产物；
所述cDNA或cDNA片段来源于细胞周期蛋白相关激酶GAK基因。
6.根据权利要求5所述预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，其特征在于，所述cDNA或cDNA片段未经修饰，或者包含至少含有1个经修饰的核苷酸或核苷酸类似物；其中，被修饰的核苷酸或核苷酸类似物的修饰位点可以在核糖核苷酸的糖基、主链或碱基上；
所述核苷酸类似物包括硫代磷酸酯基团的主链经修饰的核糖核苷酸、肌苷或三苯甲基化碱基。
7.一种预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，其特征在于，包括利用可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK的cDNA或cDNA片段的表达病毒制备所需药物的步骤；
所述促进细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的表达病毒包括慢病毒、腺病毒、腺相关病毒中得到至少一种。
8.根据权利要求7所述预防和/或治疗帕金森综合征药物的制备方法，其特征在于，所述cDNA或cDNA片段表达病毒由以下方法制得：将细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段插入表达载体多克隆位点区构建cDNA或cDNA片段表达质粒；将cDNA或cDNA片段表达质粒与辅助质粒共转染细胞，产生病毒颗粒，回收浓缩后制得。
9.一种预防和/或治疗帕金森综合征的药物，其特征在于，所述药物包括细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段；和/或，含有细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAKcDNA或cDNA片段基因的表达病毒；
或者，
所述药物的活性成分包括可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK表达的物质，和/或，使细胞周期蛋白相关激酶GAK的生理活性增加的物质；
优选的，所述病毒包括腺病毒、慢病毒腺相关病毒载体中至少一种。
10.一种可促进细胞周期蛋白相关激酶GAK基因表达或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK含量或活性的物质，或者，细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白、GAK cDNA或cDNA片段，用于制备具有如下(1)-(4)中至少一项功效的药物或产品的用途：
(1)治疗帕金森综合征；
(2)治疗或缓解帕金森综合征运动障碍；
(3)治疗或缓解帕金森综合征非运动症状；
(4)增加多巴胺分泌的产品。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述促进细胞周期蛋白相关激酶GAK基因表达或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK含量或活性的方式为：通过基因编辑的方法增强细胞周期蛋白相关激酶GAK基因的转录和翻译水平，或增加细胞周期蛋白相关激酶GAKmRNA的稳定性，或增加细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白的稳定性，或减少细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白的降解水平。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA或cDNA片段输送到帕金森病变累及脑区的方式包括：
(1)通过脑立体定位注射的方式将细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白或GAK cDNA或cDNA片段的病毒颗粒注射到帕金森病变累及脑区；
(2)通过脑立体定位注射的方式将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的质粒注射到帕金森病变累及脑区，并通过电转的方式将质粒转入到细胞中；
(3)通过脑立体定位注射的方式将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的质粒和脂质体注射到帕金森病变累及脑区；
(4)通过蛛网膜下隙将包含细胞周期蛋白相关激酶GAK cDNA或cDNA片段的病毒颗粒进行注射对帕金森病进行治疗。
13.根据权利要求10-12任一项所述的用途，其特征在于，所述药物或产品的功能包括：
(1)所述药物使细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA的表达水平提高；
(2)所述药物使细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA的稳定性提高；
(3)所述药物提高细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA的生理功能；
(4)所述药物使细胞周期蛋白相关激酶GAK或GAK mRNA在核糖体上的翻译水平提高；
(5)用于治疗帕金森综合征。
14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于：
所述使细胞周期蛋白相关激酶GAK的正常表达水平升高的方式为如下任意一种或几种：
(1)提高细胞周期蛋白相关激酶GAK编码基因转录水平；
(2)提高细胞周期蛋白相关激酶GAK蛋白翻译水平；
(3)降低细胞周期蛋白相关激酶GAK的降解速度；
所述药物提高细胞周期蛋白相关激酶GAK的生理功能具体为所述药物通过加速囊泡脱包被、加速囊泡循环等方式增加多巴胺分泌。
15.GAK蛋白和/或GAK mRNA及其片段作为帕金森治疗靶点的用途。
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