CN115552032A - 用于连续监测、合成和检测生物化学的方法 - Google Patents

用于连续监测、合成和检测生物化学的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用微物体和电磁辐射调节和连续监测化学合成反应的方法，包括：将微物体引至反应混合物，基于微物体的特性确定微物体的等离子体激元共振，和施加与微物体的等离子体激元共振波长匹配的电磁辐射。

Description

用于连续监测、合成和检测生物化学的方法
对相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年2月24日提交的题为“Methods for ContinuousMonitoring,Synthesis,and Detection of Biochemistry”的美国临时专利申请No.62/980,636的优先权，将其内容全部通过引用引入本文中。
背景技术
大多数合成化学是作为一系列不连续的被允许平衡的反应进行的。只有少数影响化学反应平衡的条件可被操纵，包括试剂和反应物的浓度、以及温度。温度和试剂/反应物的浓度两者影响反应复合物(混合物，complex)的扩散时间、平均自由路径和相关时间。然而，仅温度就调节化学反应的平均动能，从而调节化学反应可用的活化能。在不输入比所需更多的能量的情况下达到化学合成反应的必要温度，对于今天的技术来说仍然是一个问题。
例如，聚合酶链式反应或者说“PCR”是在反应混合物中用核酸聚合酶和引物对特定核酸目标进行指数扩增的方法。标准的PCR反应是通过连续的温度循环来调整(调制，modulate)的，所述温度循环可促进或抑制双链核酸段的形成。反应通常通过接触焦耳加热和对流冷却来调节。由于反应室和热源的热质量，温度点之间的转换花费长的时间。因此，反应往往被允许在每个温度步骤有超过足够的时间来平衡。本文中所述的技术以允许对给定化学合成反应输入较少能量的方式来优化温度调节，并因此改善反应的整体信噪比。
发明内容
本文中公开的技术针对用于调节和连续监测化学合成反应的方法和系统。在实施方式中，用于调节化学合成反应的方法可包括使用金属微物体(微米物体，micro-object)和电磁辐射。例如，在实施方式中，用于调节化学合成反应的方法可包括将金属微物体引至反应混合物，基于金属微物体的特性确定金属微物体的等离子体激元(plasmon)共振，和用电磁辐射源向反应混合物施加电磁辐射。电磁辐射与金属微物体的等离子体激元共振是波长匹配的，使得对金属微物体施加电磁辐射激发金属微物体内的原子，使这些原子在反应混合物内以声子形式释放能量，从而增加反应混合物的平均动能。
在一些实施例中，所述方法还包括使用与电磁辐射源相匹配的光电二极管测量背景照明。在一些实施例中，金属微物体的特征可包括形状、金属和电容率(介电常数，permittivity)中的一种或多种。金属微物体的形状可以是球体、杆体、圆柱体或立方体。在一些实施例中，金属微物体的直径可在约100nm到约10μm之间。在一些实施例中，电磁辐射可为红外辐射。可在反应混合物中加入超过一个(种)的微物体。在一些实施例中，金属微物体可由金、银、钛、镍、钢、锡、铂、铜、铝、铅或铁制成。在一些实施例中，电磁辐射源可包括激光二极管。反应混合物可包括缓冲剂、试剂、热稳定的聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸酯中的一种或多种。
在实施方式中，调节化学合成反应的方法可包括将金属微物体引至反应混合物，基于金属微物体的特性确定金属微物体的等离子体激元共振，和用电磁辐射源向反应混合物施加电磁辐射。在实施例中，反应混合物可包括生物样本、扩增低聚物、脱氧核苷酸三磷酸酯和热稳定的聚合酶。电磁辐射与金属微物体的等离子体激元共振可为波长匹配的，使得对金属微物体施加电磁辐射激发金属微物体内的原子，使这些原子在反应混合物内以声子形式释放能量，从而增加反应混合物的平均动能。在一些实施方式中，所述方法还可包括使用与电磁辐射源匹配的光电二极管测量背景照明。
在一些实施方式中，生物样本可包括基因组DNA。反应混合物还可包括检测探针。在实施例中，检测探针可包括荧光标签。在一些实施例中，扩增低聚物(implicationoligomer)可包括正向扩增低聚物和反向扩增低聚物。
在实施方式，提供用于调节化学合成反应的系统。例如，用于调节化学合成反应的系统可包括电磁辐射源，容纳包括金属微物体的反应混合物的接收单元，和被编程为用电磁辐射源向反应混合物施加电磁辐射的计算机部件。电磁辐射与金属微物体的等离子体激元共振是波长匹配的，使得对金属微物体施加电磁辐射激发金属微物体内的原子，使这些原子在反应混合物内以声子形式释放能量，从而增加反应混合物的平均动能。
在实施方式中，提供用于调节化学合成反应的套件(kit)。例如，用于调节化学合成反应的套件可包括电磁辐射源、金属微物体、扩增低聚物、脱氧核苷酸三磷酸酯、热稳定的聚合酶和毛细管。在一些实施方式中，套件可包括一个(种)或多个(种)金属微物体。在一些实施方式中，金属微物体是金微球。在一些实施方式中，扩增低聚物可包括正向扩增低聚物和反向扩增低聚物。在一些实施例中，套件可包括检测探针。
附图说明
本文中公开的技术，根据一种或多种不同的实施方式，将参照以下附图进行详细描述。附图只是为了说明的目的而提供的，并且只是描述了所公开的技术的典型或示例性实施方式。提供这些附图是为了方便读者理解所公开的技术，而不应视为对其广度、范围或适用性的限制。应该注意的是，为了清晰和便于说明，这些图不一定是按比例绘制的。
图1是操作流程图，其说明根据本公开内容的实施方式使用电磁辐射源调节化学合成反应的示例性方法。
图2以举例的方式说明根据本文中公开的各种实施方式使用微物体的反应化学。
图3以举例的方式说明根据本文中公开的各种实施方式对化学合成反应的实时监测。
图4通过示意图说明可根据本公开内容的实施方式使用的用于调节和监测化学合成反应的系统。
图5说明可用于实施根据本公开内容的各种实施方式的架构和方法的计算机部件。
这些附图并不意味着详尽无遗或将本发明限制在所公开的精确形式上。应该理解的是，本发明可通过修改和变更来实施，而且所公开的技术仅受权利要求书及其等同物的限制。
具体实施方式
下面的描述提供了具体的细节，以全面了解技术的各种实施方式，并对其实现进行描述。其目的是，使用的术语应以其最广泛的合理方式进行解释，即使在与某些实施方式的详细描述一起使用时也是如此。
本文中公开的技术涉及使用由导电材料制成的单分散微物体和电磁辐射来调节和连续监测化学合成反应的方法和系统。导电材料，如金属，表现出集体电子共振或振荡，其是不可压缩和非旋转的。这些集体电子共振被称为等离子体激元。在微观金属(例如，小于光的波长的金属)中产生的等离子体激元可通过施加电磁辐射直接激发，这使电子云内的电子振荡。随着受激等离子体激元衰变，它们可以声子和振动的形式释放能量。在本文中公开的一些实施方式中，这种能量的释放被利用来调整化学合成反应。
本文中提供用于调节和连续监测化学合成反应的方法。在某些实施方式中，本文中所述的方法可应用于PCR检测的情形中，以更好地调整反应的合成速率。例如，在实施方式中，可将单分散的微物体加入到反应混合物中。然后可通过电磁辐射源将与微物体的等离子体激元共振为波长匹配的电磁辐射(包括例如红外辐射)施加到反应混合物中，从而引起等离子体激元的衰变。随着等离子体激元衰变，能量的释放增加反应混合物的平均动能。该过程可通过限制所施加的辐射量来逆转。在一些实施方式中，可通过使用例如光电二极管或其他光电转换器测量电磁辐射源处的背景照明来监测反应。在一些实施方式中，可使用其他光学报告分子(如荧光团)连续地实时监测合成反应。
图1是流程图，其说明使用电磁辐射调节化学合成反应的示例性方法。根据本公开内容的各种实施方式，可以高的水平执行方法100来调节化学合成反应的速率。在一些实施方式中，方法100使用如下提供用于控制化学合成反应(例如PCR检测)速率的手段：单分散的微物体和对反应混合物施加电磁辐射的电磁辐射源。在一些实施方式中，电磁辐射以红外波长(即波长在约760nm至100,000nm之间)产生。在一些实施方式中，方法100还容许对化学合成反应进行连续监测。这里描述的各种方法的操作不一定局限于图中描述或显示的顺序，并且本领域的技术人员在研究本公开内容后将理解在本公开内容的精神和范围内的这里描述的操作的顺序的变化。在一些实施方式中，方法100的操作可被重复多次。
在操作110，将微物体引至反应混合物。在实施方式中，可将超过一个(种)的微物体引至反应混合物。微物体可由导电材料制成。在一些实施方式中，导电材料为金属。在一些实施方式中，微物体可由金、银、铂、钢、锡、锌、钨、汞、铟、铝、钛、铜、镍、钯、铍、铅、铁、其他导电材料或其混合物制成。在实施方式中，微物体可根据应用情况形成为各种形状。例如，微物体可形成为球体和/或基本球形的形状。在一些实施方式中，微物体可形成为圆柱体、椭圆体、卵形、棒、棱柱、立方体或多面体，或其他三维形状。微物体的尺寸也可根据微物体的形状、用于激发微物体上的等离子体激元的电磁能量的波长和/或使用其的应用而变化。例如，被塑造成球体的微物体的尺寸在直径方面可在约100nm至约10μm之间。在一些实施例中，被塑造成棒的微物体的尺寸在长度方面可在约100nm至约10μm的范围内、在宽度方面在约100nm至约10μm的范围内，和/或在高度方面在约100nm至约10μm的范围内。在一些实施方式中，引至反应混合物的微物体是均匀的(即，是相同的尺寸和形状的)。在一些实施方式中，引至反应混合物的微物体是不均匀的，并且因此在其尺寸和形状上有所不同。在一些实施方式中，微物体被添加到反应混合物中，并可均匀地分散在整个反应混合物中。在一些实施方式中，微物体以非均匀的方式分散在整个反应混合物中。
在一些实施方式中，可执行方法100以调节化学合成反应。在一些实施方式中，化学合成反应可在反应混合物中进行，所述反应混合物本身可包括各种生化要素，如扩增基因组DNA或RNA所需的组分。例如，在一些实施方式中，反应混合物可包括缓冲剂、试剂、热稳定的聚合酶、脱氧核苷酸三磷酸酯、扩增低聚物或引物以及检测探针中的一种或多种。
在一些实施方式中，反应混合物可包括生物样本。应该理解，该生物样本可包括DNA和/或cDNA。生物样本可来自多于一个的有机体。在一些实施方式中，生物样本可来自血液、汗液、尿液、眼泪或任何其他身体分泌物。此外，在一些实施方式中，生物样本可从人类或其他一些动物获得。在一些实施方式中，生物样本可在执行方法100之前被消化(吸收)。
在实施方式中，一旦形成反应混合物，可将反应混合物分隔成反应体积(例如，毛细管、孔(井，well)、微孔(微井)、液滴等)。例如，在一些实施方式中，方法100可在毛细管中进行，其中毛细管的半径可小于反应混合物的德拜长度。在一些实施方式中，方法100可在微孔中进行。在一些实施方式中，反应混合物可分隔成多个反应体积。在一些实施方式中，反应混合物可在引入微物体之前分隔成反应体积。在一些实施方式中，反应混合物可分隔成反应体积，并且之后可进行PCR扩增。在一些实施方式中，可同时扩增多于一个的反应体积。
在操作120，可确定微物体的等离子体激元共振。在实施方式中，可基于微物体的一个或多个特性来确定微物体的等离子体激元共振。可能影响微物体的等离子体激元共振的微物体的特性包括，例如，其形状、温度、尺寸、材料组成和/或其电容率。所述特性的一个或多个可影响用于激发微物体中的等离子体激元的入射波长的选择。
例如，金属微物体中的等离子体激元共振频率ωsp可用以下公式来解释，其中ωp是本体(bulk)等离子体频率，εb是束缚电子对金属的电容率的贡献，且εm是环境的电容率：
Figure BDA0003901500810000061
在实施方式中，温度的增加可导致本体等离子体频率ωp的降低。这可能是例如微物体的热膨胀的结果。例如，微物体的体积取决于温度，即V(T)＝V0(l+βΔT)，其中V0是微物体在室温下的体积，ΔT＝T-T0是温度变化，以及β是体积热膨胀系数。在实施方式中，金属的本体等离子体频率可能与温度有关，并表示为以下公式：
Figure BDA0003901500810000062
其中ωp0＝(4πn0e2/m*)的平方根，其是等离子体频率，n0是金属的自由电子(elections)的浓度，m*是有效电子质量，以及e是电子电荷。
在操作130，电磁辐射被引导(例如泵送)至反应混合物(包括一个或多个微物体)。在一些实施方式中，入射电磁辐射的波长被选择为红外线的。在其他实施方式中，入射辐射的波长可选自微波、可见光、紫外线、X射线、伽马射线、其他波长或其混合物，其被选择成激发导电微物体和/或纳米物体中的等离子体激元。在实施方式中，施加至反应混合物的辐射与微物体的等离子体激元共振是波长匹配的。在一些实施方式中，对微物体施加电磁辐射激发微物体内的原子，使这些原子在反应混合物内以声子的形式释放能量。在实施方式中，由等离子体激元释放能量(即等离子体激元衰变)增加了反应混合物的整体动能。在实施方式中，等离子体激元能量可用于调节化学合成反应。例如，向反应混合物施加波长匹配的电磁辐射升高反应混合物的温度。相反，当电磁辐射被抑制(withheld)时，反应混合物的温度可降低。在实施方式中，温度升高可导致金属中声子群(population)的增加，这继而又可导致声子上自由电子散射速率增加。例如，电子-光子散射速率的温度依赖性可由以下公式解释：
Figure BDA0003901500810000071
其中T0是温度，θ是金属的德拜温度，且S是常数。
在一些实施方式中，操作130可使用电磁辐射源(例如，激光二极管)进行。然而，也可使用发射其他波长的电磁辐射的其他类型的二极管。在一些实施方式中，也可使用将电子能量转换为光的其他半导体设备(例如，发光二极管)。在一些实施方式中，操作130可使用超过一个的激光二极管进行。在一些实施方式中，通过使与悬浮在反应混合物中的微物体的等离子体激元共振波长匹配的红外激光二极管闪烁，将电磁辐射，例如红外辐射，施加至反应混合物。这些分子的等离子体激元共振的衰减被用来调整反应混合物的温度。在实施方式中，通过激光二极管的闪烁施加电磁辐射来调节反应混合物的内部温度。
在一些实施方式中，通过使用匹配成与电磁辐射源相同波长的光电二极管或其他光电转换器测量电磁辐射源处的背景照明，可监测被传送至反应混合物中的微物体的电磁辐射，例如红外辐射。例如，一个或多个P/N光电二极管可连接在电磁辐射源上，或靠近电磁辐射源，并可检测从反应混合物反射回来的电磁辐射，并将电磁辐射转化为可测量的电流。例如，这样的测量可被用作反馈机制以调节反应混合物的温度。在实施方式中，电磁辐射源和测量光电二极管两者都可制造成以超过10GHz工作。例如，当方法100在PCR扩增的背景下使用时，例如电磁辐射源和测量光电二极管的运行速率远高于聚合酶的单碱基延伸控制所需的速率。
在一些实施方式中，可执行方法100以调节和监测化学合成反应。例如，方法100可被执行以调节和监测PCR检测，从而扩增核酸。这样的反应混合物可包括扩增核酸所需的组分，包括扩增低聚物(即引物)、热稳定的聚合酶、DNA或RNA模板、脱氧核苷酸三磷酸酯、检测探针以及一种或多种缓冲剂和调节剂。
在一些实施方式中，反应混合物可包括一组扩增低聚物(即，正向引物和反向引物)，其被配置为扩增特定核酸。扩增低聚物可使用特定的序列来扩增特定的序列。扩增低聚物可通过与引物的上游和下游序列杂交来扩增特定的序列，并导致在上游和下游引物之间的序列全部扩增。扩增低聚物可以是正向引物。扩增低聚物可以是反向引物。扩增低聚物的长度可在约5至约50个核苷酸之间。扩增低聚物的长度可以在5到50个碱基对之间。在一些实施例中，扩增低聚物的长度可超过50个碱基对。在一些实施例中，扩增低聚物的长度可在5-50个碱基对之间。在实施方式中，扩增低聚物的长度可为约5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或约50个碱基对。
不同的扩增低聚物组可被配置为扩增不同的核酸目标序列。例如，第一组扩增低聚物可被配置为扩增给定长度的第一核酸序列，并且第二组扩增低聚物可被配置为扩增比第一核酸序列长度短的第二核酸序列。在另一实施例中，第一组扩增低聚物被配置为扩增给定长度的第一核酸序列，并且第二组扩增低聚物可被配置为扩增比第一核酸序列长度长的第二核酸序列。
在一些实施方式中，反应混合物可包括热稳定的聚合酶，包括例如DNA聚合酶。可使用任何合适的DNA聚合酶，包括市售可获得的DNA聚合酶。热稳定的聚合酶一般是指能够以模板结合的方式将核苷酸整合到DNA链上的酶。热稳定的聚合酶可包括Taq聚合酶或其变体。
在一些实施方式中，反应混合物可包括使用核苷酸三磷酸酯试剂。核苷酸三磷酸酯试剂可包括使用脱氧核苷酸三磷酸酯(dNTPs)。dNTPs可包括天然或非天然的dNTPs，例如包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP及其变体。核苷酸三磷酸酯试剂可用作被扩增的核酸的前体。
在一些实施方式中，反应混合物可包括检测探针，其可被配置为退火到核酸的特定区域。在一些实施方式中，检测探针可包括分子信标(beacon)、分子火炬和/或可检测标签。在一些实施方式中，可检测标签可包括化学发光标签。在一些实施方式中，可检测的标签可包括荧光标签。在一些实施方式中，检测探针可包括淬灭剂。在一些实施方式中，检测探针可包括市售可获得的检测探针，包括例如TaqMan探针。
在实施方式中，探针可为相同的或可为不同的。检测探针的长度可在5到30个核苷酸之间。在一些实施例中，检测探针的长度可超过30个核苷酸。在一些实施例中，混合物包括第一检测探针和一个或多个额外的检测探针。检测探针的长度可在2到50个核苷酸之间，或更多。在一些实施例中，检测探针的长度可为2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40或50个核苷酸。
在一些实施例中，可使用2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20个或更多个不同的检测探针。每个检测探针可对应于(例如，能够结合至)生物样本中的核酸目标(例如，染色体)的特定区域。在一个实施例中，第一检测探针对第一核酸目标的第一区域是特异性的，第二检测探针对第一核酸目标的第二区域是特异性的。每个检测探针可包括具有大约相等的发射波长的信号标记(tag)。在一些实施例中，每个检测探针包括相同的荧光团。在一些实施例中，每个检测探针包括不同的荧光团。在某些情况下，每个荧光团能够在单一的光学通道中被检测。在一些实施例中，荧光团可在多个通道中被检测。
在一些实施方式中，反应混合物可包括一种或多种试剂和/或缓冲剂。在某些情况下，适当的缓冲剂条件可以是在扩增过程中使用的缓冲剂中存在适当的盐类。适当的盐类可包括镁盐、钾盐、铵盐。适当的缓冲条件可以是适当的盐类以适当的浓度存在。
图2以举例的方式说明了根据本文中公开的各种实施方式使用微物体和电磁辐射的化学合成反应。例如，可以制备反应混合物，其包括模板DNA或RNA、热稳定的聚合酶、引物以及一种或多种试剂、缓冲剂和核苷酸。在实施方式中，一个或多个微物体可被引至反应混合物并均匀地散布在整个反应混合物中。图2中以举例的方式所示的微物体是金微球。然而，可理解的是，可使用其他金属和/或形状来制备微物体。在实施方式中，一旦反应混合物已被制备，就可将电磁辐射施加至反应混合物。在图2的化学合成反应中，将电磁辐射施加至反应混合物可调整DNA聚合酶的活性。例如，通过将金微球以其等离子体激元共振进行泵送，等离子体激元的衰减以非相干频率在反应混合物内以声子的形式释放能量，并增加反应的整体平均动能。以这种方式，反应混合物可被热调节并且DNA合成反应可发生。
在一些实施方式中，反应混合物的热调节可包括一个或多个热循环。例如，可将电磁辐射以一个或多个循环施加至反应混合物，从而施加电磁辐射和然后停止。在一些实施方式中，这种方式的热循环可酌情进行以扩增模板核酸。模板核酸的扩增可能需要扩增低聚物结合到或退火到模板核酸。在某些情况下，适当的温度条件可为每个热循环在所需的退火温度下进行。所需的退火温度可足以使扩增低聚物或引物退火到核酸目标。
在实施方式中，使用电磁辐射源的热循环使引物延伸反应发生，以产生扩增产物。引物延伸反应通常包括将反应混合物在变性温度下孵育(培育)一段变性时间和将反应混合物在延伸温度下孵育一段延伸时间的循环。在各方面中的任何者中，可通过监测施加至反应混合物的电磁辐射的量来进行引物延伸反应的多个循环。可进行任何适当数量的循环。例如，进行的循环数可在约5个循环到约100个循环之间。所进行的循环数可取决于，例如，用于获得可检测的扩增产物(例如，可检测的扩增DNA产物的量，其表明核酸样本中存在目标DNA)的循环数(例如，循环阈值(Ct))。
在一些实施方式中，化学合成反应可在毛细管中进行，所述毛细管的半径小于反应混合物的德拜长度。因此，波长筛选的影响可被忽略到一阶。
图3以举例的方式说明了根据本文中公开的各种实施方式对化学合成反应的实时检测和监测。例如，如果化学合成反应是核酸扩增，一旦制备了包含微物体的反应混合物并施加与微物体的等离子体激元共振波长匹配的电磁辐射，就可发生核酸的扩增。在一些实施方式中，可对核酸扩增进行实时连续监测。实时监测化学合成反应可包括使用与电磁辐射源相匹配的P/N光电二极管测量电磁辐射的背景照明。在一些实施方式中，实时监测化学合成反应可包括使用由反应混合物中的检测探针产生的荧光信号。例如，检测探针可被配置为退火到反应混合物中核酸的特定区域，并且当该区域被扩增时，探针产生可被观察到的信号。检测探针可包括分子信标、分子火炬和/或可检测标签。在一些实施方式中，可检测标签可包括化学发光标签或荧光标签。在一些实施方式中，检测探针可包括淬灭剂。在一些实施方式中，检测探针可包括市售可获得的检测探针，包括例如
Figure BDA0003901500810000101
探针。例如，检测探针(如
Figure BDA0003901500810000102
探针)可在寡核苷酸探针与核酸杂交并随后被聚合酶降解(如在扩增期间，如PCR扩增)后产生信号。寡核苷酸探针可通过核酸酶的外切酶活性降解。应理解的是，反应混合物中可以有超过一个(种)的检测探针。此外，应理解的是，给定的反应混合物的检测探针可具有不同的目标。
在一些实施方式中，反应混合物中核酸的扩增导致产生来自第一组检测探针的第一信号和来自第二组检测探针的第二信号。在一些实施方式中，第一和第二信号每一个可各自包括由包含来自第一和第二复数的核酸中的每一个的扩增子的扩增反应体积总数产生的累积信号测量。在一些实施方式中，第一和第二信号各自可包括由第一和第二复数的核酸中的每一个产生的累积信号测量，其中反应体积未被量化。在一些实施方式中，来自各自检测探针的信号可用于确定比率。在实施方式中，比率可包括来自第一信号的第一值对来自第二信号的第二值。在一些实施方式中，比率可包括来自第一信号的第一值对来自第二信号的第二值，其中来自各信号的值不包括由扩增反应体积总数产生的量化总和。
在实施方式中，第一信号可在单一荧光通道中产生。在一些实施方式中，第一信号可在超过一个的荧光通道中产生。在一些实施方式中，第二信号可在单一荧光通道中产生。在一些实施方式中，第二信号可在超过一个的荧光通道中产生。在一些实施方式中，第一和第二信号可在单一荧光通道中产生。在一些实施方式中，第一和第二信号可在超过一个的荧光通道中产生。
在其中使用检测探针的实施方式中，可通过监测由反应混合物中的探针产生的信号来观察实时合成。例如，可通过使用与检测探针的荧光响应相匹配的快速响应LED和光电二极管来监测由荧光性
Figure BDA0003901500810000111
检测探针产生的信号。事实上，通过仔细地选择荧光探针，红外泵送可与荧光测量同时运行。在这样的实施例中，有可能观察到其速率大于聚合酶的速率的荧光信号的演变。
本文中所述的方法和系统可用于扩增核酸目标。在实施方式中，核酸目标可来自生物样本。生物样本可以是来自受试者的样本。生物样本可包括任何数量的大分子，例如，细胞大分子。生物样本可来自另一个样本。生物样本可以是组织样本，如活检、核心活检、针吸或细针吸。生物样本可以是流体样本，如血液样本、尿液样本或唾液样本。生物样本可以是皮肤样本。生物样本可以是脸颊拭子。生物样本可以是血浆或血清样本。生物样本可包括一个或多个细胞。生物样本可以是，例如，血液、血浆、血清、尿液、唾液、粘膜排泄物、痰、粪便或眼泪。
在一些实施方式中，核酸目标可来自一个或多个细胞。核酸目标可包括脱氧核糖核酸(DNA)。DNA可以是任何种类的DNA，包括基因组DNA。核酸目标可以是病毒DNA。核酸目标可包括核糖核酸(RNA)。RNA可以是任何种类的RNA，包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA和微RNA。RNA可以是病毒RNA。
在实施方式中，核酸目标可包括一个或多个成员。成员可以是核酸目标的任何区域。成员可以是任何长度的。例如，成员可以是高达约1至约100000个核苷酸，或更多。在某些情况下，成员可以是基因。核酸目标可包括如下的基因，其检测可有助于诊断一种或多种疾病。基因可以是病毒基因或细菌基因，其检测可用于确定受试者中是否存在病原体。在某些情况下，本公开内容的方法可用于检测受试者中存在或不存在或一种或多种感染性物质(如病毒、细菌、真菌)。核酸目标可以是人类基因。在某些情况下，本公开内容的方法可用于识别或检测受试者的基因异常，例如，胎儿非整倍体(如21号三体症、18号三体症等)。
在实施方式中，核酸目标可以是无细胞核酸。无细胞核酸可以是，例如，无细胞肿瘤DNA、无细胞胎儿DNA、无细胞RNA等。在某些情况下，来自无细胞样本的核酸可来自受试者的血浆。例如，核酸(如母体核酸和胎儿核酸)可来自怀孕女性的血浆样本。核酸可以是胎儿核酸。核酸可以是母体核酸。核酸序列可对应于可能与非整倍体有关的核酸区域(例如，胎儿核酸的核酸序列可能与胎儿非整倍体有关)。在一些情况下，本公开内容的方法可用于识别和估计样本中的胎儿部分。在某些情况下，本公开内容的方法可用于识别样本中是否存在胎儿非整倍体。在某些情况下，本公开内容的方法可用于检测来自受试者的无细胞核酸样本中胎儿核酸的相对数量，从而诊断胎儿的一种或多种遗传异常(例如，胎儿非整倍体)。
在某些方面，通过本公开内容的方法分析的一个或多个核酸分子可对应于染色体。核酸序列可以是与胎儿非整倍体相关的染色体的区域。与胎儿非整倍体相关的染色体可包括，例如，21号染色体(例如，与21号三体症相关)、18号染色体(例如，与18号三体症相关)、13号染色体(例如，与13号三体症相关)、以及X染色体(例如，与性染色体非整倍体相关)。
在一些实施方式中，核酸目标可以是人类基因组的表明对特定疾病有倾向性的区域。特定疾病易感性的标志物可通过与较高感染率相关的特定突变或SNP来检测。例如，受试者内的特定突变或SNP可与特定病原体的感染风险增加有关。在受试者的基因组中检测到病原体核酸序列和存在SNP这两者可表明该受试者处于高风险状态。
核酸目标在反应中可以有不同的浓度。核酸样本可被稀释或浓缩以达到不同的核酸浓度。核酸样本中的核酸浓度可包括0.1纳克/微升(ng/μL)至约10000ng/μL之间。
图4说明根据本文中公开的各种实施方式的用于调节和监测化学合成反应的示例性系统。例如，在一些实施方式中，用于调节和监测化学合成反应的系统可包括一个或多个电磁辐射源或其他半导体设备，所述半导体设备被配置为向反应混合物施加电磁辐射。在一些实施方式中，电磁辐射源可包括激光二极管。在一些实施方式中，所述系统可包括接收单元，该接收单元容纳反应混合物。在一些实施方式中，反应混合物可包括一个或多个微物体。在实施方式中，反应混合物内的微物体可均匀地分布在整个反应混合物内。系统还可包括一个或多个反馈监测光电二极管或光电转换器。电磁辐射源及其反馈监测光电二极管的同步发射和测量可用于连续驱动和调节化学合成反应。在一些实施方式中，反应的热廓线(thermal profile)是通过激光二极管的闪烁来控制的，所述激光二极管与微物体的等离子体激元共振是波长匹配的。这些分子的等离子体激元共振的衰减可用来调整反应的温度。在一些实施方式中，用于调节和监测化学合成反应的系统可包括一个或多个波导管、控制器和/或接收器。在一些实施方式中，系统还可包括计算机部件，该计算机部件被编程为用电磁辐射源向反应混合物施加电磁辐射。例如，计算机部件可被编程为使用电磁辐射源向反应混合物施加电磁辐射。在一些实施方式中，计算机部件还可通过分析反馈监测光电二极管的输入来监测化学合成反应。在一些实施方式中，计算机部件还可根据来自反馈监测光电二极管的输入对反应的温度进行调整。
图5说明了示例性计算部件500。计算部件500可用于实现本文中所公开的方法和系统的实施方式的各种特征和/或功能。关于本文在参考图1至图4描述的方法和系统的背景下提出的上述实施方式，本领域技术人员将理解关于可由计算部件500执行的这些实施方式的功能的额外变化和细节。在这方面，本领域技术人员在研究本公开内容后还将理解，本文中描述的各种实施方式(例如，系统)的特征和方面可在不背离本发明精神的情况下针对本文中所述的其他实施方式(例如，方法)来实施。
如本文中所用，术语部件可描述可根据本申请的一种或多种实施方式执行的给定功能单元。如本文中所使用的，部件是指模块，和/或可利用任何形式的硬件、软件或其组合来实现。例如，一个或多个处理器、控制器、ASIC、PLA、PAL、CPLD、FPGA、逻辑部件、软件程序或其他机构可被实施以构成部件。在实施方式中，本文中所述的各种部件可作为分立的部件来实现，或者所述的功能和特性可以在一个或多个部件之间部分或全部地共享。换句话说，正如本领域普通技术人员在阅读本说明书后会明晰的那样，本文描述的各种特征和功能可在任何给定的应用中实现，并且可以在一个或多个独立或共享的部件中以各种组合和排列方式实现。即使各种特征或功能性的元件可作为单独的部件被单独描述或声称，但本领域普通技术人员在研究本公开内容后将理解，这些特征和功能可在一个或多个共同的软件和硬件元件中共享，并且这种描述不应要求或暗示单独的硬件或软件部件被用来实现这些特征或功能。
在本申请的部件全部或部分使用软件实现的情况下，在一种实施方式中，这些软件元件可被执行以用能够实施对其描述的功能的计算或处理部件进行操作。图5中显示了这样的示例性计算部件。各种实施方式以该示例性计算部件500为例进行了描述。在阅读本说明书之后，对于相关领域的技术人员来说，如何使用其他计算部件或架构来实现该应用将变得明晰。
现在参照图5，计算部件500可代表，例如，在自调节性显示器、台式电脑、笔记本电脑、笔记本和平板电脑中发现的计算或处理能力；手持计算设备(平板电脑、PDA、智能手机、手机、掌上电脑等)；工作站或其他具有显示器的设备；服务器；或任何其他类型的特殊用途或通用计算设备，因为它们可能对给定的应用或环境是可取的或适合的。计算部件500也可代表嵌入在给定设备内或以其他方式提供给给定设备的计算能力。例如，计算部件可在其他电子设备中找到，例如，导航系统、便携式计算设备和其他可能包括某种形式处理能力的电子设备。
计算部件500可包括例如一个或多个处理器、控制器、控制部件或其他处理设备，例如处理器504。处理器504可使用通用或特殊用途的处理引擎来实现，例如，微处理器、控制器或其他控制逻辑。在图示的实施例中，处理器504连接至总线502，尽管任何通信介质都可用来促进与计算部件500的其他部件的互动或进行外部通信。
计算部件500还可包括一个或多个内存(存储器)部件，在此简单称为主内存508。例如，优选地随机存取内存(RAM)或其他静态或动态内存，可用于存储将由处理器504执行的信息和指令。主内存508也可用于在执行将由处理器504执行的指令期间存储临时变量或其他中间信息。计算部件500同样可包括只读内存("ROM")或其他与总线502相连的静态存储设备，用于存储处理器504的静态信息和指令。
计算部件500还可包括一个或多个各种形式的信息存储机构510，其可包括，例如，介质驱动器512和存储单元接口520。介质驱动器512可包括驱动器或其他机构，以支持固定或可移动的存储介质514。例如，可提供硬盘驱动器、固态驱动器、磁带驱动器、光盘驱动器、光盘(CD)或数字视频光盘(DVD)驱动器(R或RW)，或其他可移动或固定介质驱动器。因此，存储介质514可包括，例如，硬盘、闪存驱动器、集成电路组件、USB、磁带、磁带盒、光盘、CD或DVD，或其他固定或可移动的介质，所述固定或可移动的介质被介质驱动器512读取、写入或访问。正如这些示例所说明的，存储介质514可包括计算机可用的存储介质，其具有存储在其中的计算机软件或数据。
在备选的实施方式中，信息存储机构510可包括其他类似的工具，以允许计算机程序或其他指令或数据被加载到计算部件500中。这种工具可包括，例如，固定或可移动的存储单元522和接口520。这种存储单元522和接口520的示例可包括程序盒和程序盒接口、可移动内存(例如，闪存或其他可移动内存部件)和内存插槽、PCMCIA插槽和卡，以及其他固定或可移动存储单元522和接口520，其允许将软件和数据从存储单元522传输到计算部件500。
计算部件500还可包括通信接口524。通信接口524可用于允许软件和数据在计算部件500和外部设备之间传输。通信接口524的示例可包括调制解调器或软调制解调器、网络接口(例如以太网、网络接口卡、WiMedia、IEEE802.XX或其他接口)、通信端口(例如USB端口、红外端口、RS232端口
Figure BDA0003901500810000151
接口或其他端口)或其他通信接口。通过通信接口524传输的软件和数据通常可被携带在信号上，所述信号可以是电子、电磁(其中包括光学)或其他能够被给定的通信接口524交换的信号。这些信号可通过信道528提供给通信接口524。该信道528可携带信号并且可使用有线或无线通信介质来实现。信道的一些示例可包括电话线、手机链路、射频链路、光链路、网络接口、局域或广域网，以及其他有线或无线通信通道。
在本文中，术语"计算机程序介质"和"计算机可用介质"被用来泛指暂时性或非暂时性介质，例如，内存508、存储单元520、介质514和信道528。这些和其他各种形式的计算机程序介质或计算机可用介质可参与将一个或多个指令的序列携带到处理设备上执行。体现在介质上的这种指令，一般被称为"计算机程序代码"或"计算机程序产品"(其可以计算机程序或其他分组的形式进行分组)。当执行时，此类指令可使计算部件500能够执行本文中所讨论的本申请的特征或功能。
本文中所公开的各种方法和系统可通过使用套件来实现。在实施方式中，用于调节化学合成反应的套件可包括电磁辐射源，包括例如红外激光二极管。在一些实施方式中，套件可包括超过一个的红外激光二极管。在一些实施方式中，套件可包括微物体。在一些实施方式中，套件可包括超过一个的微物体。例如，在某些方面，套件可包括一个或多个金微球。在一些实施方式中，套件还可包括一套扩增低聚物，其被配置为扩增多个核酸，包括例如多个第一核酸和多个第二核酸。在一些实施方式中，扩增低聚物可包括正向扩增低聚物和反向扩增低聚物。该套件还可包括被配置为退火到核酸的检测探针，其中每个检测探针包括荧光标签。在一些实施方式中，检测探针可被配置为退火到多个第一核酸，并且第二组检测探针可被配置为退火到多个第二核酸。在一些实施方式中，该套件还可包括一种或多种脱氧核苷酸三磷酸酯。在一些实施方式中，套件还可包括一种或多种热稳定的聚合酶。在一些实施方式中，套件还可包括一个或多个毛细管。该套件还可包括一种或多种试剂和/或缓冲剂。
术语"约"，在涉及可测量的值例如量、时间长度等时，意指涵盖与指定值相比的±20％、或在某些情况下±10％、或在某些情况下±5％，或在某些情况下±1％、或在某些情况下±0.1％的变化，因为这种变化对于执行所公开的方法是合适的。此外，"约"可意指正负小于1或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30或大于30％，这取决于情况和本领域技术人员已知或可知的。约也包括确切的数量。因此，"约200nM"意指"约200nM"以及"200nM"。
虽然本发明的优选的实施方式已本文中显示和描述，但对于本领域技术人员来说，显然这类实施方式仅以举例的方式提供。不意图使本发明受到说明书中所提供的具体实施例(示例)的限制。虽然本发明已经参照上述说明书进行了描述，但这里对实施方式的描述和说明并不意味着要在限制性意义上进行解释。对于本领域技术人员来说，在不偏离本发明的情况下，现在会出现许多变化、改变和替换。此外，应理解的是，本发明的所有方面并不局限于本文中所述的取决于各种条件和变量的具体描述、配置或相对比例。应理解的是，在实践本发明的过程中，可采用本文中所述的本发明实施方式的各种替代方式。因此，设想本发明也应涵盖任何此类替代方式、修改、变化或等同物。所附权利要求书旨在界定本发明的范围，这些权利要求书范围内的方法和结构以及它们的等同物将由此被涵盖。
应理解，本发明不限于这些示例的具体细节。虽然已经相当详细地示出和描述了本发明的优选的实施方式，但应理解，在不偏离本发明的精神或范围的情况下，可对结构进行许多更改。因此，不希望本发明仅限于所提供的实施例中所示和描述的确切结构。此处使用的单数形式“一种”、“一个”和“所述(该)”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，如果在说明书和/或权利要求书中使用术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”、“携带”、“例如”或其变体，则此类术语不具有限制性，并且旨在在方式上为包容性的。
如果将值描述为范围，则应理解，此类披露包括披露此类范围内所有可能的子范围，以及属于此类范围的特定数值，而不管是否明确说明了特定数值或特定子范围。

Claims (20)

1.用于调节化学合成反应的方法，该方法包括：
将金属微物体引至反应混合物，
基于金属微物体的特性确定所述金属微物体的等离子体激元共振；和
用电磁辐射源向反应混合物施加电磁辐射；
其中所述电磁辐射与所述金属微物体的等离子体激元共振是波长匹配的；
使得对所述金属微物体施加电磁辐射激发所述金属微物体内的原子，使这些原子在所述反应混合物内以声子形式释放能量，从而增加所述反应混合物的平均动能。
2.权利要求1的方法，其中所述金属微物体的特性包括形状、金属和电容率中的一种或多种。
3.权利要求2的方法，其中所述金属微物体的形状包括球体、杆体、圆柱体或立方体。
4.权利要求1的方法，其中所述电磁辐射是红外辐射。
5.权利要求1的方法，其中所述金属微物体包括金、银、钛、镍、钢、锡、铂、铜、铝、铅或铁。
6.权利要求1的方法，其中所述电磁辐射源包括激光二极管。
7.权利要求1的方法，其进一步包括使用与所述电磁辐射源匹配的光电二极管测量背景照明。
8.权利要求1的方法，其中所述反应混合物还包括缓冲剂、试剂、热稳定的聚合酶和脱氧核苷酸三磷酸酯中的一种或多种。
9.用于调节化学合成反应的方法，该方法包括：
将金属微物体引至反应混合物；
基于金属微物体的特性确定所述金属微物体的等离子体激元共振；和
用电磁辐射源向反应混合物施加电磁辐射；
其中所述反应混合物包括：
生物样本；
扩增低聚物；
脱氧核苷酸三磷酸酯；和
热稳定的聚合酶；
其中所述电磁辐射与所述金属微物体的等离子体激元共振是波长匹配的；
使得对所述金属微物体施加电磁辐射激发所述金属微物体内的原子，使这些原子在所述反应混合物内以声子形式释放能量，从而增加所述反应混合物的平均动能。
10.权利要求9的方法，其中所述金属微物体的特性包括形状、金属和电容率中的一种或多种。
11.权利要求10的方法，其中所述金属微物体的形状包括球体、杆体、圆柱体或立方体。
12.权利要求9的方法，其中所述生物样本包括基因组DNA。
13.权利要求9的方法，其中所述金属微物体的直径在约100nm到约10μm之间。
14.权利要求9的方法，其中所述金属微物体包括金、银、钛、镍、钢、锡、铂、铜、铝、铅或铁。
15.权利要求9的方法，其中所述电磁辐射源包括激光二极管。
16.权利要求9的方法，进一步包括使用与所述电磁辐射源匹配的光电二极管测量背景照明。
17.权利要求9的方法，其中所述反应混合物还包括检测探针。
18.权利要求17的方法，其中所述检测探针包括荧光标签。
19.用于调节化学合成反应的系统，该系统包括：
电磁辐射源；
容纳包括金属微物体的反应混合物的接收单元；和
计算机部件，所述计算机部件被编程用于用电磁辐射源向所述反应混合物施加电磁辐射；
其中所述电磁辐射与所述金属微物体的等离子体激元共振是波长匹配的；
使得对所述金属微物体施加电磁辐射激发所述金属微物体内的原子，使这些原子在所述反应混合物内以声子形式释放能量，从而增加所述反应混合物的平均动能。
20.权利要求19的系统，其中所述金属微物体包括金、银、钛、镍、钢、锡、铂、铜、铝、铅或铁。
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