CN115536466B - 一种甘草的根瘤菌肥及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种甘草的根瘤菌肥及其制备方法，涉及作物专用肥技术领域，以解决现有技术中甘草生长需要施加化肥，导致甘草中化学物质残留，环境污染，同时伴随甘草高生物量的是甘草中有效成分含量降低的问题。所述甘草的根瘤菌肥，以重量份计，包括：根瘤菌菌液50～60份，载体基质200～250份，促结瘤物质1～1.5份，包衣剂50～60份；所述促结瘤物质包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素。上述促结瘤物质的协同作用具有诱导根瘤菌侵入根毛和促进结瘤的作用。将其用于甘草种植中，可以提高甘草的产量和品质。

Description

一种甘草的根瘤菌肥及其制备方法
技术领域
本发明涉及作物专用肥技术领域，尤其涉及一种甘草的根瘤菌肥及其制备方法。
背景技术
甘草为(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)多年生豆科植物，其干燥根和根茎入药，具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和诸药等功效，是常用的大宗药材。现代研究表明，甘草具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、降血糖、调血脂、抗动脉粥样硬化等多种作用，被广泛应用于医药、食品、日化等行业。目前野生甘草已成为国家二级保护植物，甘草资源供求矛盾日益突出，人工种植甘草成为缓解供求矛盾的有效途径。目前多数地区的人工甘草销路不畅，主要原因是有效成分(甘草酸)含量低。
肥料作为作物的“粮食”，对作物的产量及品质有十分重要的影响。目前甘草人工种植多大量施用化肥，不仅浪费人力、物力，导致化学物质残留，环境污染，同时伴随甘草高生物量的是甘草中有效成分含量降低，尤其是甘草酸的含量。根瘤菌肥是促进豆科作物结瘤、固氮的接种剂。我国较广泛应用根瘤菌肥料的作物主要有花生、大豆、苕子、紫云英等，合适的根瘤菌剂能使作物获得显著而稳定的增产效果。甘草作为豆科植物也具有结瘤特性，因此，能否通过研究一种适合甘草生长及有效成分积累的根瘤菌肥，在保证人工甘草产量的同时提高人工甘草的品质，减少化肥的使用，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种甘草的根瘤菌肥及其制备方法，用于提高人工甘草的品质，减少化肥的使用。
为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种甘草的根瘤菌肥，以重量份计，包括：根瘤菌菌液50～60份，载体基质200～250份，促结瘤物质1～1.5份，包衣剂50～60份；
所述促结瘤物质包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素。
与现有技术相比，本发明提供的甘草的根瘤菌肥中，促结瘤物质包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素，其中，水解酪素与异甘草素和金雀异黄酮协同作用，能够提高甘草在高盐环境下的生存能力，进而提高促结瘤的效果。巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌均属于菌粉，两者与根瘤菌有协同增效的作用，选巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌作为土壤益生菌，能帮助改良土壤、促进营养吸收。上述各组分协同作用，具有诱导根瘤菌侵入根毛和促进结瘤的作用。将其用于甘草种植中，可以大大提高甘草的产量和品质。经验证，施用本发明实施例中制备得到的根瘤菌肥对甘草单株根重和甘草中甘草酸、甘草苷含量均有大幅提升。
进一步地，以促结瘤物质的添加量计，所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素的添加重量比为(1.5～2.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5): (0.5～1.5):(40～60)。
进一步地，以促结瘤物质的添加量计，所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素的添加重量比为(1.8～2):(0.9～1.1):(0.9～1.1): (0.9～1.1):(45～55)。
进一步地，所述根瘤菌菌液为由中慢生型天山根瘤菌制备而成的菌液；和/ 或，所述载体基质包括稻壳炭、发酵羊粪，所述稻壳炭、发酵羊粪的添加重量比为(0.5～1.5):(2.5～3.5)；和/或，所述包衣剂为钠基膨润土。
进一步地，以重量份计，还包括营养元素15～20份，土壤改良剂2～3份。
进一步地，所述营养元素包括尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾，所述尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾的添加重量比为(1.5～2.5):(1.5～2.5):(0.5～1.5)；和/或，所述土壤改良剂为施地佳土壤调理剂。
与现有技术相比，所述营养元素中包括尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾，其可以为甘草提供氮、磷、钾，能减少甘草根施肥用量，降低生产成本，减少环境污染。本发明原料中多种营养元素，既能提高甘草产量，又能提高其中甘草酸含量，提高经济效益。
第二方面，本发明还提供一种甘草的根瘤菌肥的制备方法，用于制备上述根瘤菌肥，包括以下步骤：
(1)根瘤菌活化：将-80℃冰箱冻存的根瘤菌在室温下溶解后，均匀涂布于酵母菌形态琼脂固体培养基上，于27～29℃培养箱内进行活化3～5d；
(2)根瘤菌菌液制备：将步骤(1)中活化的根瘤菌接种于酵母菌形态琼脂液体培养基中，在24～26℃、160～180r/min摇床培养46～50h，培养至根瘤菌菌液OD620值为0.4～0.8，得根瘤菌菌液；
(3)按以上配比，先将载体基质、促结瘤物质混合均匀后，加入步骤(2) 得到的根瘤菌菌液，搅拌均匀，再加入包衣剂包裹均匀，即得成品。
与现有技术相比，本发明提供的甘草的根瘤菌肥的制备方法的有益效果，与上述技术方案所述甘草的根瘤菌肥的有益效果相同，此处不做赘述。
进一步地，所述酵母菌形态琼脂固体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，琼脂15.0g，甜菜碱10g，水1000mL，调节pH值至6.8～7.5。
进一步地，所述酵母菌形态琼脂液体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，甜菜碱0.1g，水1000mL，调节pH值至6.8～7.5。
进一步地，步骤(1)中所述冻存的根瘤菌为根瘤菌菌液于OD620值为0.4～0.8 时，与甘油1:1混合后冻存；所述涂布的涂布量为每25mL培养基200μL菌液；
步骤(2)中所述接种的接种量为每200mL培养基50接种环。
具体实施方式
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供一种甘草的根瘤菌肥，以根瘤菌肥重量份计，包括：由中慢生型天山根瘤菌制备而成的根瘤菌菌液58份，载体基质240份，促结瘤物质1.4份，钠基膨润土57份；
其中，载体基质由稻壳炭40份、发酵羊粪200份组成；
促结瘤物质由巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素按添加重量比为2.0:0.9:1.1:1.1:55组成。
上述甘草的根瘤菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)根瘤菌活化：将-80℃冰箱冻存的中慢生型天山根瘤菌在室温下溶解后，均匀涂布于酵母菌形态琼脂固体培养基上，涂布量为每25mL培养基200μL菌液，于27℃培养箱内进行活化5d；其中，冻存的根瘤菌为中慢生型天山根瘤菌菌液于OD620值为0.4时，与甘油1:1混合后冻存；所述酵母菌形态琼脂固体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g， CaCl2 0.1g，琼脂15.0g，甜菜碱10g，水1000mL，调节pH值至6.8。
(2)根瘤菌菌液制备：将步骤(1)中活化的根瘤菌接种于酵母菌形态琼脂液体培养基中，在24℃、180r/min摇床培养50h，培养至根瘤菌菌液OD620值为0.4，得根瘤菌菌液；其中，酵母菌形态琼脂液体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，甜菜碱0.1g，水1000mL，调节pH值至6.8。
(3)按以上配比，先将载体基质、促结瘤物质混合均匀后，加入步骤(2) 得到的根瘤菌菌液，搅拌均匀，再加入包衣剂包裹均匀，即得成品。
实施例2
本发明实施例提供一种甘草的根瘤菌肥，以根瘤菌肥重量份计，包括：由中慢生型天山根瘤菌制备而成的根瘤菌菌液50份，载体基质200份，促结瘤物质1份，钠基膨润土50份；
其中，载体基质由稻壳炭25份、发酵羊粪175份组成；
促结瘤物质由巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素按添加重量比为1.5:1.5:0.5:0.5:40。
上述甘草的根瘤菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)根瘤菌活化：将-80℃冰箱冻存的根瘤菌在室温下溶解后，均匀涂布于酵母菌形态琼脂固体培养基上，涂布量为每25mL培养基200μL菌液，于29℃培养箱内进行活化3d；其中，冻存的根瘤菌为中慢生型天山根瘤菌菌液于OD620值为0.6时，与甘油1:1混合后冻存；所述酵母菌形态琼脂固体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，琼脂15.0g，甜菜碱10g，水1000mL，调节pH值至7.0。
(2)根瘤菌菌液制备：将步骤(1)中活化的根瘤菌接种于酵母菌形态琼脂液体培养基中，在24～26℃、160～180r/min摇床培养46～50h，培养至根瘤菌菌液OD620值为0.6，得根瘤菌菌液；所述酵母菌形态琼脂液体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，甜菜碱0.1g，水1000mL，调节pH值至7.0。
(3)按以上配比，先将载体基质、促结瘤物质混合均匀后，加入步骤(2) 得到的根瘤菌菌液，搅拌均匀，再加入包衣剂包裹均匀，即得成品。
实施例3
本发明实施例提供一种甘草的根瘤菌肥，以根瘤菌肥重量份计，包括：由中慢生型天山根瘤菌制备而成的根瘤菌菌液60份，载体基质250份，促结瘤物质1.5份，钠基膨润土60份；
其中，载体基质由稻壳炭75份，发酵羊粪175份组成；
促结瘤物质由巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素按添加重量比为2.5:0.5:1.5:1.5:60组成。
上述甘草的根瘤菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)根瘤菌活化：将-80℃冰箱冻存的中慢生型天山根瘤菌在室温下溶解后，均匀涂布于酵母菌形态琼脂固体培养基上，涂布量为每25mL培养基200μL菌液，于28℃培养箱内进行活化4d；其中，冻存的根瘤菌为中慢生型天山根瘤菌菌液于OD620值为0.5时，与甘油1:1混合后冻存；所述酵母菌形态琼脂固体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g， CaCl2 0.1g，琼脂15.0g，甜菜碱10g，水1000mL，调节pH值至7.1。
(2)根瘤菌菌液制备：将步骤(1)中活化的根瘤菌接种于酵母菌形态琼脂液体培养基中，在24℃、170r/min摇床培养49h，培养至根瘤菌菌液OD620值为0.5，得根瘤菌菌液；所述酵母菌形态琼脂液体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl0.1g，CaCl2 0.1g，甜菜碱0.1g，水1000mL，调节pH值至7.1。
(3)按以上配比，先将载体基质、促结瘤物质混合均匀后，加入步骤(2) 得到的根瘤菌菌液，搅拌均匀，再加入包衣剂包裹均匀，即得成品。
实施例4
本发明实施例提供一种甘草的根瘤菌肥，以根瘤菌肥重量份计，包括：由中慢生型天山根瘤菌制备而成的根瘤菌菌液54份，载体基质220份，促结瘤物质1.4份，钠基膨润土56份，营养元素20、施地佳土壤调理剂3份；
其中，载体基质由稻壳炭82.5份，发酵羊粪137.5份组成；
促结瘤物质由巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素按添加重量比为1.9:1.0:1.0:1.0:50组成；
营养元素由尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾组成，所述尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾的添加重量比为1.5:2.5:0.5。
上述甘草的根瘤菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)根瘤菌活化：将-80℃冰箱冻存的中慢生型天山根瘤菌在室温下溶解后，均匀涂布于酵母菌形态琼脂固体培养基上，于27℃培养箱内进行活化5d；其中，冻存的根瘤菌为中慢生型天山根瘤菌菌液于OD620值为0.7时，与甘油1:1混合后冻存；所述酵母菌形态琼脂固体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl20.1g，琼脂15.0g，甜菜碱10g，水1000mL，调节pH值至7.2。
(2)根瘤菌菌液制备：将步骤(1)中活化的根瘤菌接种于酵母菌形态琼脂液体培养基中，在26℃、180r/min摇床培养46h，培养至根瘤菌菌液OD620值为0.7，得根瘤菌菌液；所述酵母菌形态琼脂液体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl0.1g，CaCl2 0.1g，甜菜碱0.1g，水1000mL，调节pH值至7.2。
(3)按以上配比，先将载体基质、促结瘤物质、营养元素混合均匀后，加入步骤(2)得到的根瘤菌菌液，搅拌均匀，再加入包衣剂包裹均匀，即得成品。
实施例5
本发明实施例提供一种甘草的根瘤菌肥，以根瘤菌肥重量份计，包括：由中慢生型天山根瘤菌制备而成的根瘤菌菌液52份，载体基质200份，促结瘤物质1.1份，钠基膨润土52份，营养元素15、施地佳土壤调理剂2份；
其中，载体基质由稻壳炭50份，发酵羊粪150份，
促结瘤物质由巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素按添加重量比为1.8:1.1:0.9:0.9:45组成；
营养元素由尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾组成，所述尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾的添加重量比为2.5:1.5:1.5。
上述甘草的根瘤菌肥的制备方法，包括以下步骤：
(1)根瘤菌活化：将-80℃冰箱冻存的根瘤菌在室温下溶解后，均匀涂布于酵母菌形态琼脂固体培养基上，涂布量为每25mL培养基200μL菌液，于27℃培养箱内进行活化5d；其中，冻存的根瘤菌为中慢生型天山根瘤菌菌液于OD620值为0.5时，与甘油1:1混合后冻存；所述酵母菌形态琼脂固体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，琼脂15.0g，甜菜碱10g，水1000mL，调节pH值至7.5。
(2)根瘤菌菌液制备：将步骤(1)中活化的根瘤菌接种于酵母菌形态琼脂液体培养基中，在26℃、160r/min摇床培养46h，培养至根瘤菌菌液OD620值为0.5，得根瘤菌菌液；所述酵母菌形态琼脂液体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl0.1g，CaCl2 0.1g，甜菜碱0.1g，水1000mL，调节pH值至7.5。
(3)按以上配比，先将载体基质、营养元素、促结瘤物质混合均匀后，加入步骤(2)得到的根瘤菌菌液，搅拌均匀，再加入包衣剂包裹均匀，即得成品。
对比例1
与实施例4相比，仅将实施例4的促结瘤物质中水解酪素去除，其他组分不变。
对比例2
与实施例4相比，仅将实施例4的促结瘤物质中金雀异黄酮去除，其他组分不变。
进一步地，本发明还采用上述实施例1～5，以及对比例1～2中制得的根瘤菌肥进行试验，具体为：选择盐池移栽两年生甘草和呼和浩特直播两年生甘草进行根瘤菌肥肥效试验，低G施用根瘤菌肥200g/m2，中G施用根瘤菌肥400g/m2，高G施用根瘤菌肥800g/m2。试验结果见表1、表2。
表1盐池移栽两年生甘草生物量和有效成分含量
表2呼和浩特直播两年生甘草生物量和有效成分含量
由表1、表2试验结果可知，(1)施用本发明实施例中制备得到的根瘤菌肥可以提高甘草单株根重和甘草酸、甘草苷含量。(2)促结瘤物质中，水解酪素、金雀异黄酮与异甘草素共同作用，与其他物质共同组成的根瘤菌肥用于甘草种植时，可以大幅提高甘草中甘草苷和甘草酸的含量。(3)促结瘤物质中，仅含有金雀异黄酮和异甘草素，或仅含有水解酪素和异甘草素，与其他物质共同组成的根瘤菌肥用于甘草种植时，由于缺少必要组成物质，仅表现为促进甘草根重增加，从而导致甘草中甘草苷和甘草酸的相对含量降低。
此外，本发明还设置了对比例3、对比例4和对比例5，具体如下：
对比例3
对比例3与实施例4的区别为：对比例3中，将实施例4中的促结瘤物质中的巨大芽孢杆菌去除，其他组分不变。
对比例4
对比例4与实施例4的区别为：对比例4中，将实施例4中的促结瘤物质中的枯草芽孢杆菌去除，其他组分不变。
对比例5
对比例5采用现有技术中市售的根瘤菌菌剂，本对比例5采用甘肃鸿远生物科技有限公司生产的苜蓿专用根瘤菌液，将其同期施用于土壤。
进一步地，本发明还采用上述试验例方式继续对比例3～5中制得的根瘤菌肥进行试验，具体为：选择盐池移栽两年生甘草和呼和浩特直播两年生甘草进行根瘤菌肥肥效试验，低G施用根瘤菌肥200g/m2，中G施用根瘤菌肥400g/m2，高G施用根瘤菌肥800g/m2。试验结果见表3、表4。
表3盐池移栽两年生甘草生物量和有效成分含量
表4呼和浩特直播两年生甘草生物量和有效成分含量
由表3、表4试验结果可知，(1)施用本发明实施例中制备得到的根瘤菌肥可以提高甘草单株根重和甘草酸、甘草苷含量。(2)促结瘤物质中，巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌共同作用，与其他物质共同组成的根瘤菌肥用于甘草种植时，可以提高甘草中甘草苷和甘草酸的含量。(3)促结瘤物质中，仅含有巨大芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌，与其他物质共同组成的根瘤菌肥用于甘草种植时，由于缺少必要的组成物质的协同作用，导致甘草中甘草苷和甘草酸的含量均有所降低。(4)目前市售无甘草专用根瘤菌肥，市售根瘤菌液用于甘草种植，对甘草的甘草的单株根重、甘草苷含量和甘草酸含量提高效果有限。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种甘草的根瘤菌肥，其特征在于，以根瘤菌肥重量份计，包括：根瘤菌菌液50~60份，载体基质200~250份，促结瘤物质1~1.5份，包衣剂50~60份；其中，所述根瘤菌菌液为由中慢生型天山根瘤菌制备而成的菌液；
所述促结瘤物质包括巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素；以促结瘤物质的添加量计，所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素的添加重量比为（1.5~2.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（0.5~1.5）:（40~60）。
2.根据权利要求1所述的甘草的根瘤菌肥，其特征在于，以促结瘤物质的添加量计，所述巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、异甘草素、金雀异黄酮、水解酪素的添加重量比为（1.8~2）:（0.9~1.1）:（0.9~1.1）:（0.9~1.1）:（45~55）。
3.根据权利要求1~2任一所述的甘草的根瘤菌肥，其特征在于，所述载体基质包括稻壳炭、发酵羊粪，以所述载体基质的添加量计，所述稻壳炭、发酵羊粪的添加重量比为（0.5~1.5）:（2.5~3.5）；和/或，所述包衣剂为钠基膨润土。
4.根据权利要求1所述的甘草的根瘤菌肥，其特征在于，以根瘤菌肥的重量份计，还包括营养元素15~20份，土壤改良剂2~3份。
5.根据权利要求4所述的甘草的根瘤菌肥，其特征在于，所述营养元素包括尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾，所述尿素、磷酸二氢钾、硫酸钾的添加重量比为（1.5~2.5）:（1.5~2.5）:（0.5~1.5）。
6.一种甘草的根瘤菌肥的制备方法，其特征在于，用于制备权利要求1~5任一所述的根瘤菌肥，包括以下步骤：
（1）根瘤菌活化：将-80℃冰箱冻存的根瘤菌在室温下溶解后，均匀涂布于酵母菌形态琼脂固体培养基上，于27~29℃培养箱内进行活化3~5d；
（2）根瘤菌菌液制备：将步骤（1）中活化的根瘤菌接种于酵母菌形态琼脂液体培养基中，在24~26℃、160~180r/min摇床培养46~50h，培养至根瘤菌菌液OD620值为0.4~0.8，得根瘤菌菌液；
（3）按以上配比，先将载体基质、促结瘤物质混合均匀后，加入步骤（2）得到的根瘤菌菌液，搅拌均匀，再加入包衣剂包裹均匀，即得成品。
7.根据权利要求6所述的甘草的根瘤菌肥的制备方法，其特征在于，所述酵母菌形态琼脂固体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl20.1g，琼脂15.0g，甜菜碱10g，水1000mL，调节pH值至6.8~7.5。
8.根据权利要求6所述的甘草的根瘤菌肥的制备方法，所述酵母菌形态琼脂液体培养基包括酵母粉1.0g，甘露醇10.0g，K2HPO4 0.5g，MgSO4 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl2 0.1g，甜菜碱0.1g，水1000mL，调节pH值至6.8~7.5。
9.根据权利要求6所述的甘草的根瘤菌肥的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述冻存的根瘤菌为根瘤菌菌液于OD620值为0.4~0.8时，与甘油1:1混合后冻存；所述涂布的涂布量为每25mL培养基200μL菌液；
步骤（2）中所述接种的接种量为每200mL培养基50接种环。
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