CN115521903A - 体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法 - Google Patents
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-
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- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Abstract
本发明提供了一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，包括：中脑腹侧神经前体诱导阶段：诱导人多能干细胞分化为中脑腹侧神经前体细胞，其中使用多种小分子通路调控剂以及白藜芦醇促进中脑腹侧神经前体分化；多巴胺能神经元分化阶段：诱导中脑腹侧神经前体细胞分化为多巴胺能神经元，其中利用香胶甾酮促进多巴胺能神经元的分化成熟。本发明还提供了体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及发育生物学与细胞生物学交叉技术领域，具体涉及体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法及试剂盒。
背景技术
多巴胺能神经元主要存在于中脑的黑质致密部和腹侧被盖区。多巴胺能神经元在中枢神经系统中起着非常重要的作用，负责控制自主运动、奖励刺激，对环境刺激做出响应以及调节情绪等。大脑中多巴胺能神经元的异常则可能导致多种神经疾病，如帕金森疾病、药物成瘾、精神分裂症和自闭症。由于高度分化、成熟的神经元增殖能力很弱，极难在体外扩大培养，这就导致了无论是在再生医学研究、疾病研究、药物筛选还是毒理学研究中，获得大量的、高纯度的人源多巴胺能神经元一直是这些领域研究中面临的难题。而人多能干细胞具有近乎无限的自我更新能力，能在体外不断扩大培养。同时，人多能干细胞还具有广泛的分化能力，在适当的诱导条件下能分化成成体所有组织类型的细胞，包括神经元。因此，通过诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元细胞具有广阔的应用前景。
然而，当前诱导人多能干细胞向多巴胺能神经元分化的方法效率不高，并且严重依赖于昂贵的蛋白诱导剂，导致获得多巴胺能神经元的成本高的问题。此外，蛋白诱导剂来源渠道单一，获取存在一定难度。
发明内容
有鉴于此，本发明主要目的在于提供一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法及试剂盒，以期至少部分地解决上述提及的技术问题之一。
作为本发明的一方面，提供了一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，包括：
中脑腹侧神经前体诱导阶段：诱导人多能干细胞分化为中脑腹侧神经前体细胞，其中使用多种小分子通路调控剂以及白藜芦醇促进中脑腹侧神经前体分化；
多巴胺能神经元分化阶段：诱导中脑腹侧神经前体细胞分化为多巴胺能神经元，其中利用香胶甾酮促进多巴胺能神经元的分化成熟。
根据本发明的实施例，多种小分子通路调控剂包括：TGF-β通路抑制剂、BMP通路抑制剂、WNT通路激活剂以及Hedegehog通路小分子激动剂。
根据本发明的实施例，Hedegehog通路小分子激动剂包括嘌吗啡胺。
根据本发明的实施例，Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为0.1～1.5μM；优选地，Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为1.0μM
根据本发明的实施例，白藜芦醇的浓度为0.1～1.5μM；优选地，白藜芦醇的浓度为0.5μM。
根据本发明的实施例，香胶甾酮的浓度为1.0～5.0μM；优选地，香胶甾酮的浓度为2.5μM。
根据本发明的实施例，中脑腹侧神经前体诱导阶段包括：
采用第一培养基，对人诱导多能干细胞进行培养，得到第一中间培养细胞，其中，第一培养基包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第一基础培养基；第一基础培养基包括48.5％DMEM/F-12培养基和加入1％N2补充剂以及2％B27补充剂的48.5％NeuroBasal培养基；
采用第二培养基，对第一中间培养细胞进行培养，得到中脑腹侧神经前体细胞；其中，第二培养基包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第二基础培养基；第二基础培养基包括49.25％DMEM/F-12培养基和加入0.5％N2补充剂以及1％B27补充剂的49.25％NeuroBasal培养基。
根据本发明的实施例，多巴胺能神经元分化阶段包括：
采用第二基础培养基，对中脑腹侧神经前体细胞进行培养，得到第二中间培养细胞；
采用第三培养基，对第二中间培养细胞进行培养，得到多巴胺能神经元；其中，第三培养基包括：加入2％B27补充剂的NeuroBasal培养基、香胶甾酮以及抗坏血酸。
根据本发明的实施例，采用第一培养基，对人诱导多能干细胞进行培养，得到第一中间培养细胞的时间为3～6天；
采用第二培养基，对第一中间培养细胞进行培养，得到中脑腹侧神经前体细胞的时间为3～8天。
根据本发明的实施例，采用第二基础培养基，对中脑腹侧神经前体细胞进行培养，得到第二中间培养细胞的时间为1～4天；
采用第三培养基，对第二中间培养细胞进行培养，得到多巴胺能神经元的时间根据多巴胺能神经元的用途确定。
作为本发明的另一个方面，还提供了一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的试剂盒，包括：第一培养基、第二培养基、第二基础培养基以及第三培养基；
其中，第一培养基包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第一基础培养基；第一基础培养基包括48.5％DMEM/F-12培养基和加入1％N2补充剂以及2％B27补充剂的48.5％NeuroBasal培养基；
第二基础培养基包括49.25％DMEM/F-12培养基和加入0.5％N2补充剂以及1％B27补充剂的49.25％NeuroBasal培养基；
第二培养基包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第二基础培养基；
第三培养基包括：加入2％B27补充剂的NeuroBasal培养基、香胶甾酮以及抗坏血酸。
根据本发明的实施例，白藜芦醇的浓度为0.1～1.5μM；优选地，白藜芦醇的浓度为0.5μM。
根据本发明的实施例，多种小分子通路调控剂包括：TGF-β通路抑制剂、BMP通路抑制剂、WNT通路激活剂以及Hedegehog通路小分子激动剂。
根据本发明的实施例，Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为0.1～1.5μM；优选地，Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为1.0μM。
根据本发明的实施例，香胶甾酮的浓度为1.0～5.0μM；优选地，香胶甾酮的浓度为2.5μM。
根据本发明的实施例，抗坏血酸浓度为50～300μM；优选地，抗坏血酸浓度为200μM。
基于上述技术方案可知，本发明的体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法及试剂盒与现有技术相比至少具有以下有益效果的其中之一或其中一部分：
(1)本发明利用Hedgehog通路小分子激动剂替代音猬因子和成纤维细胞生长因子8促进神经前体细胞分化过程中的腹侧命运，诱导所得神经前体细胞高效表达腹侧底板标志物；
(2)本发明在中脑腹侧神经前体分化过程中加入一种具有神经保护作用的小分子白藜芦醇，有效提高中脑腹侧相关生物标志物的表达水平；
(3)本发明在中脑腹侧神经前体向多巴胺能神经元分化的过程中，使用小分子香胶甾酮，有效代替脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子促进多巴胺能神经元的分化成熟。分化所得多巴胺能神经元转化产率高，并高水平表达多巴胺能神经元生物标志物；
(4)本发明涉及的体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，通过诱导人多能干细胞向多巴胺能神经元分化，可以为药物筛选、毒理学研究和疾病相关研究提供充足的细胞来源。而且通过人多能干细胞分化所得的多巴胺能神经元具有正常的核型和遗传背景，更贴近人健康的生理状况。
附图说明
图1示出了根据本发明实施例的中脑腹侧神经前体细胞形态图；
图2示出了根据本发明实施例的多巴胺能神经元细胞形态图；
图3(a)示出了根据本发明实施例的嘌吗啡胺诱导作用下腹侧底板标志物CORIN表达的统计图；
图3(b)示出了根据本发明实施例的嘌吗啡胺诱导作用下腹侧底板标志物FOXA2表达的统计图；
图4(a)示出了根据本发明实施例的白藜芦醇作用下腹侧底板标志物CORIN表达的统计图；
图4(b)示出了根据本发明实施例的白藜芦醇作用下腹侧底板标志物FOXA2表达的统计图；
图4(c)示出了根据本发明实施例的白藜芦醇作用下中脑标志物LMX1A表达的统计图；
图4(d)示出了根据本发明实施例的白藜芦醇作用下中脑标志物EN1表达的统计图；
图5(a)示出了根据本发明实施例的香胶甾酮或BDNF/GDNF诱导作用下多巴胺能神经元标志物TH表达的统计图；
图5(b)示出了根据本发明实施例的香胶甾酮或BDNF/GDNF诱导作用下多巴胺能神经元标志物LMX1B表达的统计图；
图5(c)示出了根据本发明实施例的香胶甾酮或BDNF/GDNF诱导作用下多巴胺能神经元标志物NURR1表达的统计图；
图5(d)示出了根据本发明实施例的香胶甾酮或BDNF/GDNF诱导作用下多巴胺能神经元标志物TUBB3表达的统计图；
图6示出了根据本发明实施例的中脑腹侧神经前体细胞中底板标志物FOXA2的免疫荧光图；
图7示意性示出了根据本发明实施例的多巴胺能神经元标志物TH和β3-TUBULIN的免疫荧光图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
相关研究表明，在人多能干细胞向多巴胺能神经元分化的过程中，可以使用音猬因子(Sonic hedgehog,SHH)或者成纤维细胞生长因子8(FGF8)激活Hedgehog信号通路促进神经模式化中的腹侧命运。而在多巴胺能神经元的分化阶段中，可以使用脑源性神经营养因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)和胶质细胞源性神经营养因子(Glialcell derived neurotrophic factor，GDNF)诱导多巴胺能神经元的成熟。
在实施本发明的过程中发现，当前诱导人多能干细胞向多巴胺能神经元分化的方法，不仅存在依赖于昂贵的蛋白诱导剂，如SHH、FGF8、BDNF、GDNF等，而且还存在效率低的问题。此外，蛋白诱导剂来源渠道单一，如依赖进口，获取存在一定难度。
基于此，本发明提供了一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法及试剂盒。能够利用Hedgehog通路小分子激动剂替代音猬因子和成纤维细胞生长因子8促进神经前体细胞分化过程中的腹侧命运，诱导所得神经前体细胞高效表达腹侧底板标志物。在中脑腹侧神经前体分化过程中还加入一种具有神经保护作用的小分子白藜芦醇，有效提高中脑腹侧相关生物标志物的表达水平。在中脑腹侧神经前体向多巴胺能神经元分化的过程中，使用小分子香胶甾酮，有效代替脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子促进多巴胺能神经元的分化成熟。分化所得多巴胺能神经元转化产率高，并高水平表达多巴胺能神经元生物标志物。
下面示意性举例说明体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法及试剂盒。需要说明的是，该举例说明只是本发明的具体实施例，并不能限制本发明的保护范围。
本发明提供了一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，包括：
中脑腹侧神经前体诱导阶段：诱导人多能干细胞分化为中脑腹侧神经前体细胞，其中使用多种小分子通路调控剂以及白藜芦醇促进中脑腹侧神经前体分化；
多巴胺能神经元分化阶段：诱导中脑腹侧神经前体细胞分化为多巴胺能神经元，其中利用香胶甾酮促进多巴胺能神经元的分化成熟。
根据本发明的实施例，多种小分子通路调控剂可以包括：TGF-β通路抑制剂、BMP通路抑制剂、WNT通路激活剂以及Hedegehog通路小分子激动剂。TGF-β通路抑制剂和BMP通路抑制剂分别调控TGF-β通路和BMP通路，用于促进神经分化命运。WNT通路激活剂调控WNT通路，用于促进中脑分化。Hedegehog通路小分子激动剂调控Hedegehog通路，用于促进腹侧分化。
其中，Hedegehog通路小分子激动剂可以包括嘌吗啡胺(Purmorphamine)。TGF-β通路抑制剂可以包括SB431542(CAS:301836-41-9)。BMP通路抑制剂可以包括LDN193189(CAS：1062368-24-4)。WNT通路激活剂可以包括CHIR99021(CAS：252917-06-9)。
Hedegehog通路小分子激动剂嘌吗啡胺(CAS：483367-10-8)的浓度可以为0.1～1.5μM，例如可以为但不限于：0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.75μM、1.0μM、1.25μM、1.5μM。优选地，Hedegehog通路小分子激动剂嘌吗啡胺的浓度可以为1.0μM。
白藜芦醇(CAS：501-36-0)的浓度可以为0.1～1.5μM，例如可以为但不限于：0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.75μM、1.0μM、1.25μM、1.5μM。优选地，白藜芦醇的浓度为0.5μM。
香胶甾酮(CAS：95975-55-6)的浓度可以为1.0～5.0μM，例如可以为但不限于：1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、4.0μM、5.0μM。优选地，香胶甾酮的浓度为2.5μM。
根据本发明的实施例，人多能干细胞可以培养在Vitronectin(STEMCELLTechnologies，7180)包被的培养皿中，并使用mTeSR Plus(STEMCELL Technologies，100-0276)培养基维持培养。
根据本发明的实施例，中脑腹侧神经前体诱导阶段可以包括：
采用第一培养基，对人诱导多能干细胞进行培养，得到第一中间培养细胞，其中，第一培养基可以包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第一基础培养基；第一基础培养基可以包括48.5％DMEM/F-12培养基和加入1％N2补充剂以及2％B27补充剂的48.5％NeuroBasal培养基；
采用第二培养基，对第一中间培养细胞进行培养，得到中脑腹侧神经前体细胞；其中，第二培养基可以包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第二基础培养基；第二基础培养基可以包括49.25％DMEM/F-12培养基和加入0.5％N2补充剂以及1％B27补充剂的49.25％NeuroBasal培养基。
例如，第一培养基可以包括：0.1～1.5μM白藜芦醇、0.1～1.5μM Hedegehog通路小分子激动剂、10μM TGF-β通路抑制剂、500nM BMP通路抑制剂、700nM WNT通路激活剂以及第一基础培养基。
第二培养基可以包括：0.1～1.5μM白藜芦醇、0.1～1.5μM Hedegehog通路小分子激动剂、10μM TGF-β通路抑制剂、500nM BMP通路抑制剂、700nM WNT通路激活剂以及第二基础培养基。
根据本发明的实施例，采用第一培养基，对人诱导多能干细胞进行培养，得到第一中间培养细胞的时间可以为3～6天，例如可以但不限于：3天、4天、5天、6天。采用第二培养基，对第一中间培养细胞进行培养，得到中脑腹侧神经前体细胞的时间为3～8天，例如可以但不限于：3天、4天、5天、6天、7天、8天。
需要说明的是，本发明中实施例涉及的人诱导多能干细胞(Induced pluripotentstem cells，iPSCs)系来源于中国科学院细胞库干细胞技术平台。
根据本发明的实施例，人诱导多能干细胞培养于37℃，5％二氧化碳的恒温细胞培养箱中。
根据本发明的实施例，人诱导多能干细胞生长至覆盖约70％-80％培养皿底面积时，消化并重悬为单细胞悬液，并可以以1.5×105cells/mL的密度接种在Geltrex(Gibco，A14133-02)包被的培养板中。在接种的第二天可以开始中脑腹侧神经前体诱导阶段的诱导分化。
根据本发明的实施例，多巴胺能神经元分化阶段可以包括：
采用第二基础培养基，对中脑腹侧神经前体细胞进行培养，得到第二中间培养细胞；
采用第三培养基，对第二中间培养细胞进行培养，得到多巴胺能神经元；其中，第三培养基可以包括：加入2％B27补充剂的NeuroBasal培养基、香胶甾酮以及抗坏血酸。
例如，第三培养基可以包括：加入2％B27补充剂的NeuroBasal培养基、1.0～5.0μM香胶甾酮以及50～300μM抗坏血酸。
根据本发明的实施例，采用第二基础培养基，对中脑腹侧神经前体细胞进行培养，得到第二中间培养细胞的时间为1～4天，例如可以但不限于：1天、2天、3天、4天。采用第三培养基，对第二中间培养细胞进行培养，得到多巴胺能神经元的时间根据多巴胺能神经元的用途确定，例如可以为为20～45天。
本发明基于上述提供的一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，还提供了一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的试剂盒。
根据本发明的实施例，该体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的试剂盒，可以包括：第一培养基、第二培养基、第二基础培养基以及第三培养基；
其中，第一培养基可以包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第一基础培养基；第一基础培养基包括48.5％DMEM/F-12培养基和加入1％N2补充剂以及2％B27补充剂的48.5％NeuroBasal培养基；
第二基础培养基可以包括49.25％DMEM/F-12培养基和加入0.5％N2补充剂以及1％B27补充剂的49.25％NeuroBasal培养基；
第二培养基可以包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第二基础培养基；
第三培养基可以包括：加入2％B27补充剂的NeuroBasal培养基、香胶甾酮以及抗坏血酸。
需要说明的是，本实施例中涉及到的第一培养基、第二培养基、第二基础培养基以及第三培养基可以与上述体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法中涉及到的第一培养基、第二培养基、第二基础培养基以及第三培养基相似，在此不再赘述。
下面通过更具体的实施例说明体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法。需要说明的是，该举例说明只是本发明的具体实施例，并不能限制本发明的保护范围。
实施例(外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元)：
将人诱导多能干细胞生长至覆盖约70％-80％培养皿底面积时，消化并重悬为单细胞悬液，并以1.5×105cells/mL的密度接种在Geltrex(Gibco，A14133-02)包被的培养板中。在接种的第二天开始中脑腹侧神经前体诱导阶段的诱导分化，并记为分化第0天。
在诱导分化的第0天～第3天：使用VMD-A培养基，VMD-A培养基配方为：ND Basal-A培养基中加入10μM SB413542(Selleck，S1067)、500nM LDN193189(Selleck，S7507)、700nMCHIR99021(Selleck，S2924)、1.0μM Purmorphamine(MedChem Express，HY-15108)和0.5μM白藜芦醇(Macklin，R817263)。其中ND Basal-A培养基配方为：48.5％DMEM/F-12培养基(Gibco,C11330500BT)、48.5％NeuroBasal培养基(Gibco，21103049)中加入1％N2补充剂(Gibco，17502-048)、2％B27补充剂(Gibco，17504-044)。
需要说明的是，Selleck、MedChem Express、Gibco均表示提供商；S1067、S7507、C11330500BT、21103049等上述括号内的编码均表示对应的产品信息。
在诱导分化的第4天～第8天：使用VMD-B培养基，VMD-B培养基配方为：ND Basal-B培养基中加入10μM SB413542、500nM LDN193189、700nM CHIR99021、1.0μM Purmorphamine和0.5μM白藜芦醇。其中ND Basal-B培养基配方为：49.25％DMEM/F-12培养基、49.25％NeuroBasal培养基中加入0.5％N2补充剂、1％B27补充剂。
在9天的诱导分化后即可以得到如图1所示的中脑腹侧神经前体细胞。
在诱导分化的第9天～第10天：使用ND Basal-B培养基持续培养两天。
在诱导分化的第11天～第35天：使用DAD培养基持续培养25天。DAD培养基的配方为：DA Basal培养基中加入2.5μM香胶甾酮(MedChem Express，HY-107738)和200μM抗坏血酸。其中DA Basal培养基的配方为：NeuroBasal培养基中加入2％B27补充剂。
在分化的第35天即可以得到如图2所示的多巴胺能神经元。
实施例(对中脑腹侧神经前体和多巴胺能神经元进行生物标志物表达水平检测)
在诱导分化的第9天和第35天，将诱导所得的中脑腹侧神经前体细胞用TRNzol总RNA提取试剂(天根生化科技有限公司，DP424)提取样品中的总RNA。使用FastKing RT试剂盒(天根生化科技有限公司，KR116-02)将总RNA反转录为cDNA。用SYBR green PCR mastermix预混液对反转录所得cDNA进行实时荧光定量PCR。
其中，实时荧光定量PCR所使用的引物如下表1所示：
表1
荧光定量PCR的反应条件为：预变性95℃，30秒；变性95℃，5秒；退火延伸60℃，30秒，40个循环。
使用实时荧光定量PCR检测中脑腹侧神经前体阶段腹侧底板的标志物CORIN和FOXA2、中脑标志物LMX1A和EN1，以及多巴胺能神经元标志物TH、LMX1B、NURR1和TUBB3。
如图3(a)和图3(b)所示，在中脑腹侧神经前体诱导阶段，与人多能干细胞相比，Purmorphamine(图中简写为Pur)有效促进了腹侧底板标志物CORIN和FOXA2的表达，其表达水平分别上升了247.4倍和4.1倍，并与传统方法中用音猬因子(SHH)诱导的效率相当。可以说明小分子Purmorphamine能有效促进腹侧命运，分化效果良好。
如图4(a)～图4(d)所示，在中脑腹侧神经前体诱导阶段，在Purmorphamine的基础上添加白藜芦醇(图中简写为Resv)，与人多能干细胞相比，腹侧底板标志物CORIN和FOXA2的表达水平分别上升了292.5倍和5.4倍；中脑标志物LMX1A和EN1的表达水平分别上升了927.7倍和62.8倍。且均与未添加白藜芦醇相比，腹侧底板标志物CORIN和FOXA2以及中脑标志物LMX1A和EN1的表达水平均提高了。可以说明白藜芦醇的添加进一步提高了腹侧底板标志物和中脑标志物的表达水平。
如图5(a)～图5(d)所示，在多巴胺能神经元诱导阶段，与人多能干细胞相比，传统BDNF/GDNF诱导方法多巴胺能神经元标志基因TH、LMX1B、NURR1和TUBB3的表达水平分别提高了173.3倍、434.7倍、68.5倍和23.6倍，而小分子香胶甾酮诱导方法下，TH、LMX1B、NURR1和TUBB3的表达水平分别提高了396.6倍、713.4倍、153.3倍和27.9倍。多巴胺能神经元标志物TH、LMX1B、NURR1和TUBB3的表达水平的显著升高，说明相较于传统的用BDNF/GDNF诱导多巴胺能神经元的分化，小分子香胶甾酮(Guggulsterone，图中简写为Guggul)可以有效代替BDNF/GDNF诱导多巴胺能神经元的分化，香胶甾酮诱导所得的多巴胺能神经元具有更高的多巴胺能神经元标志物表达水平。小分子香胶甾酮能有效促进多巴胺能神经元分化成熟，分化效果良好。
实施例(免疫荧光法对中脑腹侧神经前体和多巴胺能神经元进行生物标志物进行检测)
将诱导分化第9天和第35天的细胞用4％甲醛固定15分钟后，用含有1％BSA(碧云天，ST023)和0.3％TritonX-100的DPBS封闭液孵育细胞1h。一抗用含有1％BSA和0.3％TritonX-100的DPBS溶液稀释至工作浓度，并在4℃过夜孵育。二抗用同样的溶液稀释至工作浓度，并于室温孵育1-2h。细胞核使用DAPI(索莱宝，C0065)进行染色，于室温孵育5min。
其中，所用抗体信息如下表2所示：
表2
如图6所示，在分化的第9天所得的中脑腹侧神经前体细胞中底板标志物FOXA2的免疫荧光图中可知，有73.5％FOXA2表达，高效表达腹侧底板标志物FOXA2，分化效果良好。
如图7所示，在分化的第35天所得的多巴胺能神经元标志物TH和β3-TUBULIN的免疫荧光图中可知，有76.0％TH表达以及76.0％β3-TUBULIN表达，高效表达多巴胺能神经元标志物TH和β3-TUBULIN，诱导多巴胺能神经元诱导效果良好。
需要说明的是，图6与图7中DAPI是对细胞的染色。
根据本发明的实施例，本发明涉及的诱导分化方法，在中脑腹侧神经前体诱导阶段通过使用Hedgehog通路小分子激活剂Purmorphamine代替音猬因子和成纤维细胞生长因子8促进腹侧命运发生，并加入白藜芦醇这一有神经保护作用的分子促进中脑腹侧神经前体分化；在多巴胺能神经元分化阶段使用香胶甾酮代替脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子促进多巴胺能神经元的分化成熟，并且具有较高的分化效率。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，其特征在于，包括：
中脑腹侧神经前体诱导阶段：诱导人多能干细胞分化为中脑腹侧神经前体细胞，其中使用多种小分子通路调控剂以及白藜芦醇促进所述中脑腹侧神经前体分化；
多巴胺能神经元分化阶段：诱导所述中脑腹侧神经前体细胞分化为多巴胺能神经元，其中利用香胶甾酮促进所述多巴胺能神经元的分化成熟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多种小分子通路调控剂包括：TGF-β通路抑制剂、BMP通路抑制剂、WNT通路激活剂以及Hedegehog通路小分子激动剂。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述Hedegehog通路小分子激动剂包括嘌吗啡胺；
所述Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为0.1～1.5μM；优选地，所述Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为1.0μM；
所述白藜芦醇的浓度为0.1～1.5μM；优选地，所述白藜芦醇的浓度为0.5μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述香胶甾酮的浓度为1.0～5.0μM；优选地，所述香胶甾酮的浓度为2.5μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述中脑腹侧神经前体诱导阶段包括：
采用第一培养基，对人诱导多能干细胞进行培养，得到第一中间培养细胞，其中，所述第一培养基包括：所述白藜芦醇、所述多种小分子通路调控剂以及第一基础培养基；所述第一基础培养基包括48.5％DMEM/F-12培养基和加入1％N2补充剂以及2％B27补充剂的48.5％NeuroBasal培养基；
采用第二培养基，对所述第一中间培养细胞进行培养，得到所述中脑腹侧神经前体细胞；其中，所述第二培养基包括：所述白藜芦醇、所述多种小分子通路调控剂以及第二基础培养基；所述第二基础培养基包括49.25％DMEM/F-12培养基和加入0.5％N2补充剂以及1％B27补充剂的49.25％NeuroBasal培养基。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述多巴胺能神经元分化阶段包括：
采用所述第二基础培养基，对所述中脑腹侧神经前体细胞进行培养，得到第二中间培养细胞；
采用第三培养基，对所述第二中间培养细胞进行培养，得到所述多巴胺能神经元；其中，所述第三培养基包括：加入2％B27补充剂的NeuroBasal培养基、所述香胶甾酮以及抗坏血酸。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述采用第一培养基，对所述人诱导多能干细胞进行培养，得到第一中间培养细胞的时间为3～6天；
所述采用第二培养基，对所述第一中间培养细胞进行培养，得到所述中脑腹侧神经前体细胞的时间为3～8天。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述采用所述第二基础培养基，对所述中脑腹侧神经前体细胞进行培养，得到第二中间培养细胞的时间为1～4天；
所述采用第三培养基，对所述第二中间培养细胞进行培养，得到所述多巴胺能神经元的时间根据所述多巴胺能神经元的用途确定。
9.一种体外诱导人多能干细胞分化为多巴胺能神经元的试剂盒，其特征在于，包括：第一培养基、第二培养基、第二基础培养基以及第三培养基；
其中，所述第一培养基包括：白藜芦醇、多种小分子通路调控剂以及第一基础培养基；所述第一基础培养基包括48.5％DMEM/F-12培养基和加入1％N2补充剂以及2％B27补充剂的48.5％NeuroBasal培养基；
所述第二基础培养基包括49.25％DMEM/F-12培养基和加入0.5％N2补充剂以及1％B27补充剂的49.25％NeuroBasal培养基；
所述第二培养基包括：所述白藜芦醇、所述多种小分子通路调控剂以及所述第二基础培养基；
所述第三培养基包括：加入2％B27补充剂的NeuroBasal培养基、香胶甾酮以及抗坏血酸。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述白藜芦醇的浓度为0.1～1.5μM；优选地，所述白藜芦醇的浓度为0.5μM；
所述多种小分子通路调控剂包括：TGF-β通路抑制剂、BMP通路抑制剂、WNT通路激活剂以及Hedegehog通路小分子激动剂；
所述Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为0.1～1.5μM；优选地，所述Hedegehog通路小分子激动剂的浓度为1.0μM；
所述香胶甾酮的浓度为1.0～5.0μM；优选地，所述香胶甾酮的浓度为2.5μM；
所述抗坏血酸浓度为50～300μM；优选地，所述抗坏血酸浓度为200μM。
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