CN115504967A - 作为axl抑制剂的1,2,4-三唑化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及作为AXL抑制剂的1,2,4‑三唑化合物。这些化合物适用于治疗或预防AXL受体酪氨酸激酶诱发的病症。

Description

作为AXL抑制剂的1,2,4-三唑化合物
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及作为AXL抑制剂化合物的1,2,4-三唑化合物，这些化合物可用于治疗AXL介导的疾病和病况。
背景技术
AXL(也称为UFO、ARK和Tyro7或JTK11)，是受体酪氨酸激酶(RTKs)中的TAM家族成员之一。AXL由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外配体结合区域包括两个免疫球蛋白(Ig)样重复序列和两个纤维连接蛋白III型样重复序列。胞内段对于自身磷酸化和随后的激酶活性至关重要(Zhu C,Wei Y,Wei X.Mol Cancer.2019Nov 4；18(1):153.)。AXL和其他TMA家族成员一样，通过与维生素K依赖性蛋白配体生长停滞特异性蛋白6((Gas6))的相互作用而被部分激活。AXL蛋白在正常组织中表达，特别是在骨髓基质和骨髓细胞，以及肿瘤细胞和肿瘤血管系统(Gay CM,Balaji K,Byers LA.Br J Cancer.2017Feb 14；116(4):415-423.)。
AXL信号刺激细胞反应，包括磷酸肌醇3-激酶-Akt的激活、细胞外信号调节激酶(ERK)和p38丝裂原活化蛋白激酶级联、NF-κB通路以及信号转导和转录激活因子(STAT)信号传导(3).此外，AXL信号传导是驱动入侵、迁移、存活信号传导、血管生成、对化疗和靶向药物的抗性、细胞转化和增殖的重要途径。在许多人类肿瘤中观察到高AXL表达，并且该表达与癌症患者的肿瘤进展相关。因此，AXL可以作为癌症治疗的潜在靶点。第一个针对AXL激酶的选择性抑制剂是化合物R428(BGB-324)。其作用机制是抑制AXL的磷酸化，打破膜上AXL激酶的稳态调控，从而下调AXL膜上的表达量。(Apatira A,Chua J,等.CancerRes.2010Feb 15；70(4):1544-54.)。BGB-324是BerGenBio公司研发的同类首创、高选择性、生物可用的口服AXL小分子抑制剂，其结构如下：
Figure BDA0003127961540000011
专利文献WO2008083356A1，WO2008083367A2，WO2009054864A1以及WO2010005876A2均披露了作为AXL抑制剂用的化合物。
发明内容
一方面，本发明提供化合物I或其药学上可接受的盐:
Figure BDA0003127961540000021
其中，
X选自C或N；
R1、R5各自独立地选自氢、C1-C3烷基、氰基或卤素；R2选自氢或C1-C3烷基；
R3和R4各自独立地选自氢或烷基；
环A选自
Figure BDA0003127961540000022
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、C1-C6烷基、(C1-C3烷基)-O-、氰基、氧代、硫代或硝基；
其中，B、C、D、E各自独立地选自C或O；
a为0、1、2、3或4；b为0、1、2、3或4；条件是，a和b不能同时为0；c为0、1、2、3或4；d为0、1、2、3或4；e为0、1、2、3或4；f为0、1、2、3或4；g为0、1、2、3或4；h为0、1、2、3或4；i为0、1、2、3或4；j为0、1、2、3或4；k为1或2；m为0、1、2、3或4。
在一些实施方案中，X为C。
在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5均为氢。
在一些实施方案中，a为0、1或2，b为0、1或2，条件是，a和b不能同时为0。
在一些实施方案中，c为1。
在一些实施方案中，d为0、1或2。
在一些实施方案中，e为1。
在一些实施方案中，f为0、1或2。
在一些实施方案中，g为0、1或2。
在一些实施方案中，h为0或1。
在一些实施方案中，i为0或1。
在一些实施方案中，j为0或1。
在一些实施方案中，m为0或1。
在一些实施方案中，环A为
Figure BDA0003127961540000031
Figure BDA0003127961540000032
Figure BDA0003127961540000033
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6定义如前述。
在一些实施方案中，环A为
Figure BDA0003127961540000034
Figure BDA0003127961540000041
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、C1-C6烷基、(C1-C3烷基)-O-、氰基、氧代、硫代或硝基；优选地，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基。
在一些实施方案中，环A为
Figure BDA0003127961540000042
Figure BDA0003127961540000043
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基。
在一些实施方案中，环A为
Figure BDA0003127961540000044
Figure BDA0003127961540000045
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基。
在一些实施方案中，环A为
Figure BDA0003127961540000046
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基。
在一些典型的实施方案中，环A为
Figure BDA0003127961540000051
在一些实施方案中，前述化合物I具有如化合物II所示的结构，
Figure BDA0003127961540000052
其中，环A的定义如化合物I中所定义的。
在一些实施方案中，前述化合物I具有如化合物III所示的结构，
Figure BDA0003127961540000053
其中，环A的定义如化合物I中所定义的。
另一方面，本发明提供下列化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003127961540000054
Figure BDA0003127961540000061
在一些实施方案中，本发明提供下列化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003127961540000071
Figure BDA0003127961540000081
Figure BDA0003127961540000091
在一些实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的化合物I、II或III或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
在一些实施方案中，本发明提供了化合物I、II或III或其药学上可接受的盐，其在制备用于治疗和/或预防AXL受体酪氨酸激酶诱发的病症的药物中的应用。
在一些实施方案中，所述AXL受体酪氨酸激酶诱发的病症是由AXL激酶功能亢进引起、与AXL激酶功能亢进相关和/或伴随AXL激酶功能亢进的病症。
在一些实施方案中，所述AXL受体酪氨酸激酶诱发的病症选自乳癌、结肠癌、前列腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、子宫内膜癌、肾癌、肝细胞癌、甲状腺癌、子宫癌、食道癌、鳞状细胞癌、白血病、骨肉瘤、黑素瘤、成胶质细胞瘤及成神经细胞瘤。
另一方面，本发明提供一种制备化合物I、II或III的方法，化合物b-5与化合物V或其盐在一定溶剂、碱、还原剂和任选的添加剂的条件下发生反应，得到异构体混合物，再将异构体混合物分离,
Figure BDA0003127961540000092
其中环A、X、R1、R2、R3、R4和R5定义如前述。
相关定义
除非有特定说明，下列用在说明书和权利要求书中的术语具有下述含义：
本发明“化合物”可以是不对称的，例如，具有一个或多个手性中心。除非另有说明，本发明的“化合物”指的是任意一种立体异构体或两种以上的立体异构体的混合物。立体异构体包括但不限于对映异构体和非对映异构体。本发明的含有不对称碳原子的化合物可以以光学活性纯的形式或两种以上的立体异体的混合物的形式被分离得到。光学活性纯的形式可以从两种以上的立体异构体的混合物中进行拆分，或通过使用手性原料或手性试剂合成。
术语“氰基”是指-CN基团；术语“硝基”是指-NO2基；术语“氧代”是指＝O基团；术语“硫代”是指＝S基团。
术语“卤素”指氟、氯、溴和碘。
术语“烷基”指饱和的脂族烃基团，包括直链的或支链的饱和烃基，所述烃基具有所示出的碳原子数。如术语“C1-C6烷基”包括C1烷基、C2烷基、C3烷基、C4烷基、C5烷基、C6烷基，实例包括，但不限于，甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、2-戊基、3-戊基、正己基、2-己基和3-己基等。
术语“(C1-C3烷基)-O-”指具有烷基-O-结构的基团，烷基为包括直链的或支链的饱和一价烃基。包括但不限于甲氧基、乙氧基、正丙氧基或异丙氧基。
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。
本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如，“C1-C3”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子或3个碳原子；“C1-C6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
术语“被取代”是指特定基团上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。例如，“被卤素取代”是指特定基团上的任意一个或多个氢原子被卤素取代，只要特定基团的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。
Figure BDA0003127961540000101
中的
Figure BDA0003127961540000102
是指化学键连接处。
术语“药学上可接受的盐”是指保留了特定化合物的游离酸和碱的生物学效力而没有生物学不良作用的盐。例如酸(包括有机酸和无机酸)加成盐或碱加成盐(包括有机碱和无机碱)。
本发明的药学上可接受的盐可由含有酸根或碱基的母体化合物通过常规化学方法合成。一般情况下，这样的盐的制备方法是：在水或有机溶剂或两者的混合物中，经由游离酸或碱形式的这些化合物与化学计量的适当的碱或酸反应来制备。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指无毒的但能达到预期效果的药物或药剂的足够用量。
术语“药学上可接受的载体”是指对机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些载体。包括但不限于国家食品药品监督管理局许可的可用于人或动物的任何稀释剂、崩解剂、粘合剂、助流剂、润湿剂。
权利要求书和说明书中所使用的简称其含义如下：
“w/w”是指重量比；“v/v”和“v/v/v”是指重量比；M:mol/L；mM：mmol/L；μM：μmol/L；nM：nmol/L；TEA：三乙胺；DCM：二氯甲烷；DMSO：二甲基亚砜；rpm:转/分；min:分钟
具体实施方式
下面更具体地描述本发明的化合物的制备方法，但这些具体的制备方法不对本发明的范围构成任何限制。此外，反应条件如反应物、溶剂、碱、所用化合物的量、反应温度、反应时间等不限于下面的实例。
本发明的化合物还可以任选地将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便制得，这样的组合可由本领域的技术人员容易地进行。
制备例1 3-肼基-6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚三烯[1,2-c]哒嗪(a-1)
Figure BDA0003127961540000111
在室温下向乙醇(60.00mL)中加入3-氯-6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚三烯[1,2-c]哒嗪(4.00g)，搅拌下加入一水合肼(20.00mL，80％w/w)，70℃反应16小时。然后减压浓缩反应混合物并过滤，滤饼用水(3x30mL)洗涤得到标题产物a-1(3.5g)。MS(ESI+):227.1(M+H).
制备例2 2-((5-氨基-1-(6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚[1,2-c]哒嗪-3-基)-1H-1,2,4-三唑-3-基)氨基)-5,6,8,9-四氢-7H-苯并[7]环烯-7-酮(b-5)
Figure BDA0003127961540000121
a)2-硝基-5,6,8,9-四氢螺环[苯并[7]环烯-7,2'-[1,3]二氧戊环](b-1)
向甲苯(90.00mL)中加入2-硝基-5,6,8,9-四氢苯并[7]环烯-7-酮(3.00g)、乙二醇(4.54g)、对甲苯磺酸一水合物(0.76g)，90℃搅拌反应12小时。然后减压浓缩反应混合物，所得混合物用乙酸乙酯(300mL)稀释，再依次用饱和碳酸氢钠水溶液(1x100 mL)、水(1x100mL)、饱和食盐水(1x100 mL)洗涤有机层。有机层用无水硫酸钠干燥。过滤后将滤液减压浓缩，得到标题产物(3.4g)。1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.06–7.98(m,2H),7.30(d,J＝8.1Hz,1H),4.05(s,4H),2.93(dd,J＝7.8,3.7Hz,4H),1.93–1.77(m,4H).
b)5,6,8,9-四氢螺环[苯并[7]环烯-7,2-[1,3]二氧戊环]-2-胺(b-2)
氮气气氛下向甲醇(50.00mL)中加入化合物b-1(3.40g)，搅拌下加钯碳(340.00mg，10％w/w)，然后氢气置换，在35℃下搅拌5小时。过滤反应液，用甲醇(2x30 mL)洗涤滤饼。滤液减压浓缩。残渣通过硅胶柱层析纯化(甲醇/二氯甲烷＝1：10v/v)洗脱，得到标题产物b-2(2.9g)。MS(ESI+):220.1(M+H).
c)(Z)-N'-氰基-N-(5,6,8,9-四氢螺环[苯并[7]环烯-7,2'-[1,3]二氧戊环]-2-基)氨基甲酸酯(b-3)
在氮气气氛下向异丙醇(45.00mL)中加入氰基(二苯氧基亚甲基)胺(3.15g)、化合物b-2(2.90g)，室温下搅拌16小时。然后向反应液中添加石油醚(45mL)，析出固体，过滤并用石油醚/异丙醇(10ml/10ml)洗涤滤饼，滤饼烘干得到标题产物b-3(4.5g)。MS(ESI+):364.1(M+H).
d)1-(6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚[1,2-c]哒嗪-3-基)-N3-(5,6,8,9-四氢螺环[苯并[7]环烯-7,2'-[1,3]二氧戊环]-2-基)-1H-1,2,4-三唑-3,5-二胺(b-4)
向甲苯(90.00mL)中加入化合物b-3(4.50g)、3-肼基-6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚三烯[1,2-c]哒嗪(3.36g)，90℃搅拌12小时。然后将反应混合物冷却至室温并减压浓缩。残留物通过硅胶柱层析纯化(乙酸乙酯/石油醚＝1：5v/v)洗脱，得到标题产物b-4(5g)。MS(ESI+):496.2(M+H).
e)2-((5-氨基-1-(6,7-二氢-5H-苯并[6,7]环庚[1,2-c]哒嗪-3-基)-1H-1,2,4-三唑-3-基)氨基)-5,6,8,9-四氢-7H-苯并[7]环烯-7-酮(b-5)
向四氢呋喃(40ml)中加入化合物b-4(2.00g)，浓盐酸(10.00mL，12N),在室温下搅拌5小时。然后减压浓缩反应混合物，所得混合物用二氯甲烷(100mL)稀释，在0℃下向混合物中加入三乙胺(2mL)。接着用水(2x50 mL)洗涤所得混合物。用盐水(2x50 mL)洗涤有机层，有机层无水硫酸钠干燥。过滤后减压浓缩滤液得到标题产物b-5(1.5g)。MS(ESI+):452.2(M+H).
实施例1化合物1-1、1-2的制备
Figure BDA0003127961540000131
向二氯甲烷(1.00mL)中加入2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐(39.73mg)，搅拌下加入三乙胺(56.03mg)，室温下在氮气气氛下保持10min。室温下，向上述混合物中加入式b-5化合物(50.00mg)，硫酸镁(15.00mg),在35℃下将所得混合物再搅拌1h。然后在0℃下向混合物中添加氰基硼氢化钠(20.88mg)，在室温下再搅拌1h。过滤所得混合物，用二氯甲烷(3X5mL)洗涤滤饼。滤液减压浓缩。粗品经高效液相制备色谱纯化，色谱条件为：XBridge-Prep-OBD-C18柱，30x150mm 5um；流动相A：水(10mmoL/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在0min～8min内，流动相B比例在25％～65％呈线性变化；检测波长：220nm；柱温：25℃)，得到标题产物消旋体(31mg)。
标题产物消旋体采用手性高效液相制备色谱(色谱柱：CHIRALPAK IC，2x25cm，5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mM胺-甲醇溶液)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在0min～35min内，流动相B以5％的比例等度洗脱；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)纯化得到标题产物。
化合物1-1(11.4mg,保留时间为15.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.52–7.43(m,3H),7.43–7.35(m,1H),7.30(d,J＝2.3Hz,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,1H),3.77(s,1H),2.88(s,2H),2.81–2.69(m,3H),2.62(t,J＝7.0Hz,4H),2.56(d,J＝7.1Hz,3H),2.26(q,J＝7.0Hz,2H),2.04(d,J＝24.1Hz,2H),1.67(s,2H),1.37(d,J＝4.5Hz,4H).MS(ESI+):519.2(M+H).
化合物1-2(11.8mg,保留时间为29.3min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.04(s,1H),7.95(s,1H),7.86(s,2H),7.79–7.70(m,1H),7.52–7.42(m,3H),7.42–7.35(m,1H),7.31(d,J＝2.3Hz,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,1H),2.80(s,5H),2.74(s,2H),2.63(t,J＝7.0Hz,3H),2.56(t,J＝7.0Hz,3H),2.27(q,J＝7.0Hz,2H),2.05(d,J＝24.7Hz,2H),1.69(s,2H),1.54–1.28(m,4H).MS(ESI+):519.2(M+H).
实施例2化合物2-1、2-2的制备
Figure BDA0003127961540000141
向二氯甲烷(1.00mL)中加入双(2-氧代-6-氮杂螺环[3.4]辛烷)草酸盐(52.96mg)，搅拌下加入三乙胺(44.98mg)，室温下在氮气气氛下保持10min。室温下，向上述混合物中加入式b-5化合物(50.00mg)，在35℃下将所得混合物再搅拌5h。然后在0℃下向混合物中添加氰基硼氢化钠(20.90mg)，在室温下再搅拌2h。过滤所得混合物，用二氯甲烷(3x5 mL)洗涤滤饼。滤液减压浓缩。粗品经高效液相制备色谱纯化，色谱条件为：XBridge-Prep-OBD-C18柱，30x150mm 5um；流动相A：水(10mmoL/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在0min～8min内，流动相B比例在5％～95％呈线性变化；检测波长：220nm；柱温：25℃)，得到消旋体式2化合物。
消旋体采用手性高效液相制备色谱(色谱柱：CHIRALPAK IA，2x25cm，5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:甲醇；流速：20mL/分钟；梯度：在0min～21min内，流动相B以10％的比例等度洗脱；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)纯化得到标题产物。化合物2-1(12.0mg,保留时间为12.9min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.00(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.76–7.71(m,1H),7.52–7.36(m,4H),7.28(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),4.48(s,4H),2.88(d,J＝22.6Hz,4H),2.63(d,J＝7.0Hz,2H),2.57(q,J＝7.8,6.9Hz,4H),2.46(s,3H),2.26(q,J＝7.0Hz,2H),2.09–1.98(m,2H),1.85(s,2H),1.52(s,2H).MS(ESI+):549.3(M+H).
化合物2-2(13.0mg,保留时间为18.3min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.00(s,1H),7.94(s,1H),7.84(s,2H),7.76–7.70(m,1H),7.51–7.36(m,4H),7.28(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),4.48(s,4H),2.85(s,4H),2.62(t,J＝7.0Hz,2H),2.55(t,J＝6.8Hz,4H),2.45(s,3H),2.26(q,J＝7.0Hz,2H),2.08–1.98(m,2H),1.85(s,2H),1.52(s,2H).MS(ESI+):549.3(M+H).
实施例3化合物3-1、3-2的制备
Figure BDA0003127961540000151
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成3-氮杂双环[3.1.0]己烷盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：Xselect CSH-OBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在0min～8min内，流动相B比例在25％～57％呈线性变化；波长：220nm)得到2个异构体混合物。
2个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IE，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L胺-甲醇溶液)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在31分钟内15％B等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到标题化合物。
化合物3-1(8.0mg,保留时间为24.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.78–7.70(m,1H),7.52–7.43(m,3H),7.42–7.37(m,1H),7.27(s,1H),7.00(d,J＝8.1Hz,1H),2.93(d,J＝34.8Hz,4H),2.62(t,J＝7.0Hz,2H),2.40(s,2H),2.26(q,J＝7.3,6.8Hz,2H),1.77(d,J＝57.3Hz,2H),1.68–1.44(m,3H),1.37(d,J＝21.2Hz,2H),1.31–1.18(m,4H),0.60(d,J＝3.9Hz,1H),0.33(s,1H).MS(ESI+):519.2(M+H).
化合物3-2(7.0mg,保留时间为28.3min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.78–7.67(m,1H),7.53–7.35(m,4H),7.27(s,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),2.93(d,J＝33.3Hz,4H),2.63(t,J＝7.0Hz,2H),2.56(m,2H),2.43(t,J＝7.0Hz,5H),2.26(q,J＝6.9Hz,2H),2.00–1.66(m,2H),1.52(s,2H),1.39(s,2H),0.67–0.52(m,1H),0.33(s,1H).MS(ESI+):519.2(M+H).
实施例4化合物4-1、4-2的制备
Figure BDA0003127961540000152
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成5-氮杂螺环[2.4]庚烷盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：Xselect CSH-OBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内55％B～95％B(线性变化)；波长：220nm；)得到2个异构体混合物。
2个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IF，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L胺-甲醇溶液)，流动相B:乙醇；流速：18ml/min；梯度：在12分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到标题化合物。
化合物4-1(11.9mg,保留时间为6.7min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.93(s,1H),7.88–7.82(m,1H),7.51–7.43(m,2H),7.38(dd,J＝8.1,2.4Hz,1H),7.35–7.31(m,1H),7.23(d,J＝2.4Hz,1H),7.12(d,J＝8.1Hz,1H),6.97–6.82(m,2H),6.58(s,1H),3.14(s,2H),2.94(m,4H),2.81–2.66(m,4H),2.63(t,J＝7.1Hz,2H),2.36(p,J＝7.1Hz,4H),1.92(s,2H),1.60–1.48(m,3H),0.66(s,4H).MS(ESI+):533.2(M+H).
化合物4-2(11.6mg,保留时间为10.8min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.78–7.69(m,1H),7.54–7.36(m,4H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),2.93(s,2H),2.75(d,J＝7.2Hz,2H),2.63(t,J＝7.0Hz,2H),2.56(d,J＝8.4Hz,5H),2.45(s,2H),2.26(q,J＝7.0Hz,2H),1.89(d,J＝20.1Hz,2H),1.74(t,J＝6.8Hz,2H),1.48(m,2H),0.51(dt,J＝10.8,2.0Hz,4H).MS(ESI+):533.2(M+H).
实施例5化合物5-1、5-2的制备
Figure BDA0003127961540000161
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成5-氮杂螺环[2.3]己烷盐酸盐即可。粗品经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IC，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L胺-甲醇溶液)，流动相B:乙醇/甲醇＝1：1；流速：20ml/min；梯度：在12分钟内20％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物5-1和化合物5-2。
化合物5-1(14.7mg,保留时间为6.8min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.77–7.69(m,1H),7.52–7.34(m,4H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),3.24(s,4H),2.81(td,J＝15.2,8.8Hz,2H),2.61(q,J＝8.1,7.7Hz,3H),2.55(t,J＝6.9Hz,3H),2.40(d,J＝9.2Hz,1H),2.25(p,J＝7.1Hz,2H),1.87–1.70(m,2H),1.15(s,2H),0.49(s,4H).MS(ESI+):519.2(M+H).化合物5-2(15.7mg,保留时间为9.6min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.77–7.69(m,1H),7.53–7.41(m,3H),7.41–7.34(m,1H),7.29(d,J＝2.4Hz,1H),7.00(d,J＝8.1Hz,1H),3.27(s,4H),2.81(q,J＝14.2Hz,2H),2.62(t,J＝7.0Hz,3H),2.55(t,J＝6.8Hz,3H),2.25(p,J＝7.2Hz,2H),2.08(s,1H),1.88–1.71(m,2H),1.13(m,2H),0.50(s,4H).MS(ESI+):519.2(M+H).
实施例6化合物6-1、6-2、6-3、6-4的制备
Figure BDA0003127961540000171
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成2-氮杂双环[3.1.0]己烷盐酸盐烷即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：XBridge Prep OBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内40％B～80％B(线性变化)；波长：220nm)得到4个异构体混合物(70mg)。
4个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IA，2x25 cm，填料5um；流动相A:正己烷/甲基叔丁基醚＝1:1(10mmol/L胺-甲醇溶液)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在30分钟内20％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到异构体6-1和6-2的混合物(30mg,保留时间为14.2min)和异构体6-3和6-4的混合物(30mg,保留时间为26.5min)。
异构体6-1和6-2的混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK ARTCellulose-SB，2x25cm，填料5um)；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L二乙胺)，流动相B:异丙醇；流速：20ml/min；梯度：在27分钟内5％B，等梯度；检测波长：220/254nm柱温：25℃)得到异构体6-1和6-2。
化合物6-1(8.7mg,保留时间为23.2min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.42(m,3H),7.42–7.35(m,1H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,1H),3.05–2.84(m,4H),2.74(s,2H),2.62(t,J＝7.0Hz,2H),2.55(t,J＝7.1Hz,2H),2.25(p,J＝7.0Hz,2H),2.09–1.73(m,6H),1.49–1.30(m,2H),1.30–1.25(m,2H),0.65(s,1H),0.13(s,1H).MS(ESI+):519.2(M+H).
化合物6-2(8.1mg,保留时间为18.8min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.76–7.70(m,1H),7.51–7.42(m,3H),7.41–7.37(m,1H),7.32(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),2.94(d,J＝10.9Hz,4H),2.74(s,2H),2.63(t,J＝7.0Hz,2H),2.55(t,J＝7.0Hz,2H),2.25(p,J＝7.0Hz,2H),2.13–1.76(m,6H),1.40(d,J＝23.7Hz,2H),1.24(s,1H),0.65(s,1H),0.10(d,J＝21.7Hz,1H).MS(ESI+):519.2(M+H).
异构体3,4的混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IC，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L氨-甲醇溶液)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在19分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到。
化合物6-3(6.9mg,保留时间为13.2min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.71(m,1H),7.53–7.36(m,4H),7.31(d,J＝2.4Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),2.93(t,J＝8.5Hz,4H),2.72(s,2H),2.63(t,J＝6.9Hz,2H),2.60–2.54(m,2H),2.45(s,1H),2.25(t,J＝7.0Hz,2H),2.06–1.76(m,5H),1.56–1.30(m,2H),1.24(s,1H),0.63(q,J＝4.3Hz,1H),0.14–0.04(m,1H).MS(ESI+):519.2(M+H).
化合物6-4(6.5mg,保留时间为17.2min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.00(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.78–7.70(m,1H),7.46(qt,J＝8.1,3.8Hz,3H),7.41–7.37(m,1H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,1H),2.92(d,J＝8.8Hz,4H),2.69(s,2H),2.62(t,J＝7.0Hz,2H),2.55(t,J＝7.0Hz,2H),2.46(s,1H),2.26(q,J＝7.0Hz,2H),2.05–1.75(m,5H),1.51(s,2H),1.35(s,1H),0.63(d,J＝6.8Hz,1H),0.09(q,J＝5.8Hz,1H).MS(ESI+):519.2(M+H).
实施例7化合物7-1、7-2的制备
Figure BDA0003127961540000181
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：XBridgePrep OBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内25％B～90％B(线性变化)；波长：220nm；)得到2个异构体的混合物(45mg)。
2个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IA，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:甲醇/乙醇＝1:1；流速：20ml/min；梯度：在14分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到标题化合物。
化合物7-1(9.4mg,保留时间为9.6min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.79–7.68(m,1H),7.53–7.35(m,4H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),3.58(d,J＝10.1Hz,2H),3.45(d,J＝10.1Hz,2H),3.08(s,2H),2.63(t,J＝7.0Hz,2H),2.56(t,J＝7.1Hz,5H),2.49-2.40(m,2H),2.26(p,J＝7.1Hz,2H),1.77(s,8H).MS(ESI+):549.3(M+H).
化合物7-2(8.5mg,保留时间为12.6min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.78–7.71(m,1H),7.52–7.36(m,4H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),δ3.58(d,J＝10.1Hz,2H),3.51–3.39(m,2H),3.08(s,2H),2.63(t,J＝7.0Hz,2H),2.56(t,J＝7.1Hz,4H),2.50-2.36(m,3H),2.26(q,J＝7.0Hz,2H),1.89–1.17(m,8H).MS(ESI+):549.3(M+H).
实施例8化合物8-1、8-2的制备
Figure BDA0003127961540000191
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成3-氧代-6-氮杂双环[3.1.1]盐酸庚烷即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：XBridge PrepOBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内30％B～60％B(线性变化)；波长：220nm；)得到2个异构体混合物(40mg)。
2个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IA，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在42分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到标题化合物。
化合物8-1(3.5mg,保留时间为22.5min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.94(s,1H),7.89–7.81(m,1H),7.52–7.42(m,3H),7.37–7.29(m,1H),7.16(d,J＝2.4Hz,1H),7.11(d,J＝8.1Hz,1H),6.95(s,2H),6.72(s,1H),4.33(d,J＝10.9Hz,2H),3.79–3.73(m,4H),3.26(tt,J＝10.2,3.2Hz,1H),2.89–2.72(m,4H),2.64(dd,J＝22.3,7.0Hz,5H),2.34(p,J＝7.1Hz,2H),1.89(d,J＝8.4Hz,3H),1.36(tt,J＝25.3,12.8Hz,2H).MS(ESI+):535.3(M+H).
化合物8-2(6.2mg,保留时间为34.5min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ7.94(s,1H),7.90–7.81(m,1H),7.53–7.43(m,3H),7.36–7.24(m,1H),7.16(d,J＝2.4Hz,1H),7.11(d,J＝8.1Hz,1H),6.91(s,2H),6.61(s,1H),4.36(d,J＝11.1Hz,2H),3.86(d,J＝11.5Hz,4H),3.31(s,1H),2.85(ddd,J＝28.5,15.8,9.4Hz,5H),2.68(t,J＝7.0Hz,4H),2.35(p,J＝6.9Hz,2H),1.93(d,J＝8.7Hz,3H),1.50(dt,J＝18.8,11.3Hz,2H).MS(ESI+):535.3(M+H).
实施例9化合物9-1、9-2的制备
Figure BDA0003127961540000201
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成4-氧代-7-氮杂螺环[2.5]辛烷盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：XBridge PrepOBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内20％B～60％B(线性变化)；波长：220nm；)得到2个异构体混合物(30mg)。
2个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IA，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:甲醇：乙醇＝1：1；流速：20ml/min；梯度：在14分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到标题化合物。
化合物9-1(7mg,保留时间为10.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.76–7.71(m,1H),7.47(dt,J＝4.9,3.0Hz,3H),7.40(t,J＝4.4Hz,1H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,1H),3.61(s,3H),2.77(q,J＝11.2,8.1Hz,3H),2.62(d,J＝7.0Hz,3H),2.55(d,J＝6.8Hz,4H),2.45(s,2H),2.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.97(s,2H),1.40–1.30(m,2H),0.61(d,J＝6.9Hz,2H),0.48–0.40(m,2H).MS(ESI+):549.2(M+H).
化合物9-2(7mg,保留时间为12.3min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(d,J＝2.9Hz,1H),7.85(s,2H),7.74(s,1H),7.51–7.43(m,3H),7.40(s,1H),7.29(s,1H),7.01(d,J＝8.0Hz,1H),3.61(s,4H),2.76(s,3H),2.62(s,4H),2.56(s,2H),2.45(s,2H),2.26(s,2H),1.97(s,2H),1.35(s,2H),0.61(s,2H),0.44(s,2H).MS(ESI+):549.2(M+H).
实施例10化合物10-1、10-2、10-3、10-4的制备
Figure BDA0003127961540000211
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：XselectCSH OBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内20％B～60％B(线性变化)；波长：220nm；)得到4个异构体混合物(72mg)。
4个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IF，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L二乙胺)，流动相B:甲醇；流速：15ml/min；梯度：在33分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到异构体化合物10-1(15.5mg,保留时间为17.6min)和10-2(11.8mg,保留时间为21.5min)以及异构体化合物10-3,10-4的混合物(35mg)。
化合物10-1(15.5mg,保留时间为17.6min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.36(m,4H),7.30(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),4.34(s,1H),3.91(d,J＝7.6Hz,1H),3.72(s,1H),3.54(d,J＝7.3Hz,1H),3.05–2.83(m,3H),2.71(s,1H),2.64(d,J＝6.9Hz,2H),2.62–2.55(m,4H),2.36(s,1H),2.27(q,J＝7.0Hz,2H),1.86(s,2H),1.73(d,J＝9.0Hz,1H),1.62(d,J＝9.2Hz,1H),1.46(s,2H).MS(ESI+):535.2(M+H).
化合物10-2(11.8mg,保留时间为21.5min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.51–7.34(m,4H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.01(d,J＝8.2Hz,1H),4.34(s,1H),3.91(d,J＝7.6Hz,1H),3.71(s,1H),3.54(d,J＝7.4Hz,1H),3.02(d,J＝9.4Hz,1H),2.89(s,2H),2.71(s,1H),2.65(s,2H),2.63–2.56(m,4H),2.39-2.31(m,1H),2.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.86(s,2H),1.73(d,J＝9.1Hz,1H),1.62(d,J＝9.3Hz,1H),1.42(s,2H).MS(ESI+):535.2(M+H).
化合物10-3、10-4异构体的混合物(35mg)经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IE，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L二乙胺)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在12分钟内30％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到异构体化合物10-3和10-4。
化合物10-3(7.5mg,保留时间为8.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.52–7.36(m,4H),7.29(d,J＝2.4Hz,1H),7.01(d,J＝8.2Hz,1H),4.34(s,1H),3.91(d,J＝7.5Hz,1H),3.71(s,1H),3.54(d,J＝7.4Hz,1H),3.05–2.84(m,3H),2.76-2.66(m,1H),2.63(t,J＝7.0Hz,2H),2.57(s,2H),2.55(s,2H),2.39-2.30(m,1H),2.26(t,J＝7.0Hz,2H),1.88(d,J＝25.5Hz,2H),1.73(d,J＝9.3Hz,1H),1.62(d,J＝9.4Hz,1H),1.41(s,2H).
MS(ESI+):535.2(M+H).
化合物10-4(4.5mg,保留时间为10.1min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.76–7.72(m,1H),7.52–7.36(m,4H),7.30(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),4.34(s,1H),3.91(d,J＝7.6Hz,1H),3.72(s,1H),3.54(d,J＝7.5Hz,1H),3.01(d,J＝9.0Hz,1H),2.90(s,2H),2.71(s,1H),2.64(s,2H),2.62–2.55(m,4H),2.39–2.31(m,1H),2.27(q,J＝6.9Hz,2H),1.89(d,J＝24.0Hz,2H),1.73(d,J＝9.3Hz,1H),1.62(d,J＝8.9Hz,1H),1.42(s,2H).
MS(ESI+):535.2(M+H).
实施例11化合物11-1、11-2的制备
Figure BDA0003127961540000221
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成4-氟-2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：Xselect CSHOBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(0.05％氯化氢)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：5％的B保持2分钟，然后在6分钟内5％B～85％B(线性变化)；波长：220nm；)得到2个异构体混合物(20mg)。
2个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IA，2x25cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在31分钟内50％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到标题化合物。
化合物11-1(5.3mg,保留时间为18.8min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.47–7.36(m,4H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.01(d,J＝8.2Hz,1H),3.57(d,J＝23.4Hz,1H),2.87(s,2H),2.71(s,2H),2.59(dt,J＝27.7,6.9Hz,3H),2.48(s,4H),2.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.91(d,J＝59.3Hz,6H),1.34(s,2H).MS(ESI+):537.2(M+H).
化合物11-2(6.4mg,保留时间为26min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.51–7.36(m,4H),7.29(s,1H),7.01(d,J＝8.3Hz,1H),3.44(s,1H),2.86(s,2H),2.78–2.65(m,2H),2.62(d,J＝7.0Hz,3H),2.58–2.52(m,4H),2.30–2.22(m,2H),1.91(d,J＝59.3Hz,6H),1.33(s,2H).MS(ESI+):537.2(M+H).
实施例12化合物12-1、12-2、12-3、12-4的制备
Figure BDA0003127961540000231
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成1-氧代-6-氮杂螺环[3.4]辛烷草酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：Xselect CSHOBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内5％B～35％B(线性变化)；波长：220nm；)得到4个异构体混合物(90mg)。
4个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IG，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:异丙醇；流速：20ml/min；梯度：在37分钟内30％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物12-1和另外3个异构体混合物(化合物12-2、12-3、12-4)。
化合物12-1(16mg,保留时间为20.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.03(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.43(m,3H),7.40-7.38(m,1H),7.29(d,J＝4.0Hz,1H),7.02(s,1H),4.33(s,2H),2.99-2.83(m,3H),2.79(s,1H),2.77(s,1H),2.65(d,J＝11.0Hz,3H),2.63(d,J＝7.3Hz,4H),2.58(m,3H)2.30–2.22(m,2H),2.05(m,2H),1.87(s,2H),1.48(s,2H).MS(ESI+):549.2(M+H).
化合物12-2、12-3、12-4的混合物(68mg)经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAKIG，2x25cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(10mmol/L氨-甲醇溶液)，流动相B:异丙醇；流速：20ml/min；梯度：在36分钟内15％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物12-2和另外两个异构体的混合物(化合物12-3、12-4)。
化合物12-2(12mg,保留时间为25.8min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.03(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.43(m,3H),7.40-7.38(m,1H),7.29(d,J＝4.0Hz,1H),7.02(s,1H),4.33(s,2H),2.99-2.83(m,3H),2.79(s,1H),2.77-2.65(m,4H),2.63(d,J＝7.3Hz,5H),2.58(m,2H),2.30–2.22(m,2H),2.05(m,2H),1.87(s,2H),1.48(s,2H),1.24(s,1H).MS(ESI+):549.2(M+H).
化合物12-3和12-4的混合物(31mg,保留时间为32.2min)经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IC，2x25 cm，填料5um；流动相A:正己烷：二氯甲烷＝3：1v/v(10mmol/L氨-甲醇溶液)，流动相B:异丙醇；流速：20ml/min；梯度：在18分钟内40％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物12-3和化合物12-4。
化合物12-3(7.9mg,保留时间为11.6min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.03(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.36(m,4H),7.30(s,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,1H),4.33(s,2H),2.87(s,4H),2.67(d,J＝11.2Hz,4H),2.62(d,J＝7.3Hz,4H),2.58(t,J＝6.3Hz,3H)2.30–2.22(m,2H),2.05(s,2H),1.87(s,2H),1.48(s,2H),1.24(s,1H).MS(ESI+):549.2(M+H).
化合物12-4(8.6mg,保留时间为15.0min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.03(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.36(m,5H),7.02(s,1H),4.33(s,2H),2.87(s,5H),2.69-2.61(m,4H),2.58(t,J＝6.3Hz,4H)2.30–2.22(m,2H),2.05(s,2H),1.87(s,4H),1.48(s,2H),1.24(s,1H).MS(ESI+):549.2(M+H).
实施例13化合物13-1、13-2、13-3、13-4的制备
Figure BDA0003127961540000241
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成5-氮杂螺环[2.4]庚烷-1-碳腈盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：YMC-ActusTriart C18柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内45％B～85％B(线性变化)；波长：220nm；)得到4个异构体混合物(85mg)。
4个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IE，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在23分钟内8％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物13-1、13-2的混合物(29.9mg，保留时间为16.3min)和化合物13-3、13-4的混合物(32.5mg，保留时间为19.6min)。
化合物13-1、13-2的混合物(29.9mg)经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAKIE，2x25cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚：正己烷＝1:1(10mmol/L氨-甲醇溶液)，流动相B:甲醇(0.1％二乙胺)；流速：20ml/min；梯度：在61分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物13-1和化合物13-2。
化合物13-1(5.4mg，保留时间为50.7min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.95(s,1H),7.85(s,2H),7.75–7.72(m,1H),7.51–7.37(m,4H),7.30(s,1H),7.02(d,J＝8.1Hz,1H),2.95(s,3H),2.82(s,1H),2.76–2.70(m,4H),2.68(s,2H),2.62(d,J＝7.0Hz,2H),2.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(s,5H),1.56(s,2H),1.35–1.15(m,3H).MS(ESI+):558.2(M+H).
化合物13-2(6.7mg，保留时间为57.9min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.95(s,1H),7.85(s,2H),7.75–7.72(m,1H),7.51–7.37(m,4H),7.30(s,1H),7.02(d,J＝8.1Hz,1H),2.95(s,2H),2.82(m,1H),2.76–2.70(m,3H),2.68(t,J＝4.0Hz,3H),2.62(s,3H),2.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(s,5H),1.56(s,2H),1.35–1.15(m,3H).MS(ESI+):558.2(M+H).
化合物13-3、13-4的混合物(40mg)经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK ID，5x25cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:乙醇；流速：20ml/min；梯度：在26分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物13-3和化合物13-4。
化合物13-3(10.9mg,保留时间为17.7min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.95(s,1H),7.85(s,2H),7.75–7.72(m,1H),7.51–7.43(m,3H),7.41-7.37(m,1H),7.30(s,1H),7.02(d,J＝8.1Hz,1H),2.95(s,2H),2.82(s,1H),2.76–2.70(s,4H),2.68(t,J＝4.0Hz,3H),2.62(d,J＝8.0Hz,2H),2.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(s,5H),1.56(s,2H),1.35–1.15(m,3H).MS(ESI+):558.2(M+H).
化合物13-4(8.7mg,保留时间为22.2min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.02(s,1H),7.95(s,1H),7.85(s,2H),7.75–7.72(m,1H),7.51–7.43(m,3H),7.41-7.37(m,1H),7.30(s,1H),7.02(d,J＝8.1Hz,1H),2.95(s,3H),2.82(s,2H),2.76–2.70(d,J＝21.2Hz,2H),2.68(t,J＝7.7Hz,3H),2.62(m,2H),2.26(t,J＝7.1Hz,2H),1.84(s,5H),1.56(s,2H),1.35–1.15(m,3H).MS(ESI+):558.2(M+H).
实施例14化合物14-1、14-2的制备
Figure BDA0003127961540000261
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成5-氟-2-氮杂双环[2.1.1]己烷即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：Xselect CSH OBD柱30x140mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mM/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：然后在8分钟内40％B～78％B(线性变化)；波长：220nm；)得到2个异构体混合物(90mg)。
2个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IF，2x25cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:乙醇；流速：18ml/min；梯度：在20分钟内15％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到标题化合物。
化合物14-1(5.3mg,保留时间为11.1min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.03(s,1H),7.94(d,J＝1.4Hz,1H),7.86(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.35(m,4H),7.29(s,1H),7.01(d,J＝8.1Hz,1H),4.92(dd,J＝8,64Hz,1H),3.68(d,J＝6.8Hz,1H),2.86(m,4H),2.74–2.59(m,4H),2.56(t,J＝7.0Hz,3H),2.40(s,1H),2.26(p,J＝7.6,6.9Hz,2H),1.92(s,2H),1.72(s,1H),1.32(d,J＝14.8Hz,2H),1.25(d,J＝9.5Hz,1H).MS(ESI+):537.2(M+H).
化合物14-2(14.1mg,保留时间为15.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δδ9.03(s,1H),7.94(d,J＝1.4Hz,1H),7.86(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.53–7.35(m,4H),7.29(s,1H),7.01(d,J＝8.1Hz,1H),4.92(dd,J＝8,64Hz,1H),3.68(d,J＝6.8Hz,1H),2.86(m,4H),2.74–2.59(m,4H),2.56(t,J＝7.0Hz,3H),2.40(s,1H),2.26(p,J＝7.6,6.9Hz,2H),1.92(s,2H),1.72(s,1H),1.58-1.16(m,3H).MS(ESI+):537.2(M+H).
实施例15化合物15-1、15-2、15-3、15-4的制备
Figure BDA0003127961540000262
参照实施例1的制备方法制备，将2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐替换成5-甲氧基-2-氮杂双环[2.1.1]己烷盐酸盐即可。粗品经制备高效液相纯化，条件如下(柱：XselectCSH OBD柱30x150mm，填料粒径5um；流动相A：水(10mmol/L碳酸氢铵)，流动相B:乙腈；流速：60ml/min；梯度：在8分钟内35％B～85％B(线性变化)；波长：220nm；)得到4个异构体混合物(95mg)。
4个异构体混合物经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IG，2x25 cm，填料5um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺)，流动相B:甲醇；流速：20ml/min；梯度：在29分钟内10％B，等梯度；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物16-1、16-2混合物(35mg，保留时间为18.6min)和化合物16-3、16-4混合物(36mg，保留时间为24.9min)。
化合物16-1、16-2的混合物(35mg)经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALCellulose-SB，4.6*100mm，填料3um；流动相A:甲基叔丁基醚(0.1％二乙胺):异丙醇＝95:5，流动相B:无；流速：1ml/min；梯度：10分钟，等梯度，0％B；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物15-1和化合物15-2。
化合物15-1(8.1mg,保留时间为5.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.03(s,1H),7.95(s,1H),7.86(s,2H),7.77–7.70(m,1H),7.52–7.42(m,3H),7.41–7.36(m,1H),7.29(d,J＝2.3Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),3.65(d,J＝6.6Hz,1H),3.58(s,1H),3.25(s,3H),2.88(s,3H),2.78–2.54(m,3H),2.51(d,J＝1.8Hz,4H),2.50(s,2H),2.36–2.22(m,3H),1.56(s,2H),1.43(s,1H),1.35(s,2H).MS(ESI+):549.2(M+H).
化合物15-2(11.9mg,保留时间为6.4min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.03(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.78–7.67(m,1H),7.51–7.42(m,3H),7.39(dd,J＝6.5,2.5Hz,1H),7.29(s,1H),7.01(d,J＝8.1Hz,1H),3.66(d,J＝6.6Hz,1H),3.59(s,1H),3.25(s,3H),2.87(s,3H),2.71–2.59(m,3H),2.58–2.52(m,4H),2.50(d,J＝1.9Hz,2H),2.35–2.18(m,3H),2.12(s,2H),1.56(s,1H),1.30(s,2H).MS(ESI+):549.2(M+H).
化合物15-3、15-4的混合物(36mg)经手性高效液相色谱纯化(柱：CHIRALPAK IA，4.6x50mm，填料5um；流动相A:(正己烷：二氯甲烷＝3：1，0.1％二乙胺):甲醇＝50:50，流动相B:无；流速：1ml/min；梯度：10分钟，等梯度，0％B；检测波长：220/254nm；柱温：25℃)得到化合物15-3和化合物15-4。
化合物15-3(9.5mg,保留时间为2.5min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.86(s,2H),7.77–7.69(m,1H),7.49–7.42(m,3H),7.39(dd,J＝6.5,2.5Hz,1H),7.29(d,J＝2.4Hz,1H),7.00(d,J＝8.2Hz,1H),3.65(d,J＝6.7Hz,1H),3.60–3.56(m,1H),3.25(s,3H),2.87(d,J＝8.0Hz,3H),2.69–2.53(m,4H),2.52(s,4H),2.50(s,1H),2.36–2.21(m,3H),1.91(s,2H),1.56(t,J＝6.9Hz,1H),1.36(s,2H).MS(ESI+):549.2(M+H).
化合物15-4(7.8mg,保留时间为3.3min)
1H NMR(400MHz,DMSO-d6,ppm):δ9.01(s,1H),7.94(s,1H),7.85(s,2H),7.78–7.70(m,1H),7.47(qt,J＝8.2,3.8Hz,4H),7.42–7.36(m,1H),7.29(d,J＝2.4Hz,1H),7.01(d,J＝8.2Hz,1H),3.66(d,J＝6.7Hz,1H),3.59(d,J＝6.8Hz,1H),3.25(s,3H),2.87(d,J＝8.8Hz,3H),2.71–2.60(m,2H),2.52(s,3H),2.51–2.50(m,2H),2.50(s,2H),2.36–2.17(m,3H),1.91(s,2H),1.56(t,J＝6.9Hz,1H),1.35(s,2H).MS(ESI+):549.2(M+H).
生物活性测试
活性测试中所使用的阳性药(BGB-324)从上海升泓生物科技有限公司购买。
一、化合物AXL激酶抑制活性
1.实验流程
a)AXL酶(Carna，08-107)配置及加入：用1×酶缓冲液(用200μL的Enzymaticbuffer kinase 5X,10μL的500mM的MgCl2，10μL的100mM的DTT，6.26μL的2500nM的SEB，加入773.75μL的H2O，配置成1ml的1×酶缓冲液。)将AXL酶33.33ng/uL稀释到0.027ng/μL(1.67×，final conc.＝0.016ng/uL)，使用BioTek(MultiFlo FX)自动分液仪，化合物孔和阳性对照孔分别加6μL的1.67倍终浓度的酶溶液；在阴性对照孔中加6μL的1×Enzymaticbuffer。
b)化合物配制及加入：使用DMSO将实施例中制备的化合物及阳性药从10mM稀释到100μM，用化合物滴定仪(Tecan，D300e)进行滴定，滴定仪自动喷入每孔所需浓度，第1个浓度为1μM，1/2log梯度稀释，共8个浓度。2500rpm离心30秒，室温孵育15min。
c)ATP、底物配制及加入：ATP(Sigma，A7699)用1×酶缓冲液进行稀释，从10mM稀释到75μM(5×)，终浓度为15μM；底物TK Substrate 3-biotin(Cisbio，61TK0BLC)用1×酶缓冲液，从500μM稀释到5μM(5×)，终浓度为1μM,；ATP同底物等体积混合，使用BioTek自动分液仪4μL加入每孔；2500rpm离心30秒，25℃反应45min。
d)检测试剂配制及加入：Streptavidin-XL665(Cisbio，610SAXLG)用HTRFKinEASE detection buffer(cisbio)从16.67μM稀释到250nM(4×)，终浓度为62.5nM；TKAntibody-Cryptate(Cisbio)用HTRF KinEASE detection buffer(cisbio)从100×稀释到5×，终浓度为1×；XL665同Antibody等体积混合，使用BioTek自动分液仪10μL加入每孔，2500rpm离心30s，25℃反应1小时。反应结束后，用多功能读板仪HTRF进行检测。
2.数据分析
使用GraphPad Prism 5软件log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，得到化合物对AXL激酶抑制的IC50值。
抑制率计算公式如下：
Figure BDA0003127961540000291
Conversion％_sample：是样品的转化率读数；
Conversion％_min：代表没有酶活孔的转化率读数；
Conversion％_max：代表没有化合物抑制孔的转化率读数。
3.实验结果
实验结果如表1所示，表1中AXL IC50数据：A表示<10nM；B表示10～50nM；C表示>50nM；阳性药BGB-324AXL IC50：2.25nM
表1.AXL IC50数据
Figure BDA0003127961540000292
二、化合物对细胞增殖抑制检测
1.实验流程
MV-4-11(人髓性单核细胞白血病细胞株，培养基：IMDM+10％胎牛血清)购自南京科佰生物科技有限公司，置于37℃,5％CO2的培养箱中培养。取对数生长期的细胞分别以8000个/孔、6000个/孔、2000个/孔、2000个/孔和3000个/孔的细胞密度铺在96孔板中，并同时设置空白对照组。
将待测化合物以及阳性药溶解在二甲基亚砜中以制备10mM的储液，并置于-80℃冰箱中长期保存。细胞铺板24h后，用二甲基亚砜稀释10mM的化合物储液得到200倍浓度的工作液(最高浓度200或2000μM，3倍梯度，共10个浓度)，每个浓度各取3μL加入到197μL的完全培养基中，稀释得到3倍浓度的工作液，然后取50μL加入到100μL的细胞培养液中(二甲基亚砜终浓度为0.5％,v/v)，每个浓度设置两个复孔。加药处理72h后，每孔加入50μl的CellTiter-
Figure BDA0003127961540000303
(购自Promega)，按照说明书的操作流程在Envision(PerkinElmer)上测定荧光信号，使用GraphPad Prism 5软件log(inhibitor)vs.response-Variable slope拟合量效曲线，得到化合物对细胞增殖抑制的IC50值。抑制率计算公式：
Figure BDA0003127961540000301
其中：
受试物信号值：细胞+培养基+化合物组荧光信号均值；
空白组信号值：培养基组(含0.5％DMSO)荧光信号均值；
阴性对照组信号值：细胞+培养基组(含0.5％DMSO)荧光信号均值。
2.实验结果
实验结果如表2所示，其中，表2中化合物对MV4-11细胞的抗增殖活性数据：A表示<100nM；B表示100～200nM；C表示>200nM。阳性药BGB-324对MV4-11细胞的抗增殖活性活性：208.1nM
表2化合物对MV4-11细胞的抗增殖活性
Figure BDA0003127961540000302

Claims (8)

1.一种化合物I或其药学上可接受的盐:
Figure FDA0003127961530000011
其中，
X选自C或N，优选地，X为C；
R1、R5各自独立地选自氢、C1-C3烷基、氰基或卤素，R2选自氢或C1-C3烷基，
R3和R4各自独立地选自氢或烷基，优选地，R1、R2、R3、R4和R5均为氢；
环A选自
Figure FDA0003127961530000012
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、C1-C6烷基、(C1-C3烷基)-O-、氰基、氧代、硫代或硝基；
其中，B、C、D、E各自独立地选自C或O；
a为0、1、2、3或4，b为0、1、2、3或4，条件是，a和b不能同时为0，优选地，a为0、1或2；b为0、1或2；条件是，a和b不能同时为0；
c为0、1、2、3或4，优选地，c为1；
d为0、1、2、3或4，优选地，d为0、1或2；
e为0、1、2、3或4，优选地，e为1；
f为0、1、2、3或4，优选地，f为0、1或2；
g为0、1、2、3或4，优选地，g为0、1或2；
h为0、1、2、3或4，优选地，h为0或1；
i为0、1、2、3或4，优选地，i为0或1；
j为0、1、2、3或4，优选地，j为0或1；
k为1或2；
m为0、1、2、3或4，优选地，m为0或1；
优选地，化合物I具有如化合物II所示的结构，
Figure FDA0003127961530000021
其中，环A的定义如化合物I中所定义的；
更为优选地，化合物I具有如化合物III所示的结构，
Figure FDA0003127961530000022
其中，环A的定义如化合物I中所定义的。
2.如权利要求1所述的化合物，环A为
Figure FDA0003127961530000023
Figure FDA0003127961530000024
Figure FDA0003127961530000031
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6定义如前述。
3.如权利要求1所述的化合物，环A为
Figure FDA0003127961530000032
Figure FDA0003127961530000033
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、C1-C6烷基、(C1-C3烷基)-O-、氰基、氧代、硫代或硝基；优选地，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基。
4.如权利要求1所述的化合物，环A为
Figure FDA0003127961530000034
Figure FDA0003127961530000035
Figure FDA0003127961530000036
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基；优选地，环A为
Figure FDA0003127961530000037
Figure FDA0003127961530000041
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基；更为优选地，环A为
Figure FDA0003127961530000042
Figure FDA0003127961530000043
所述环A被一个或多个R6取代基任选取代，R6取代基选自下列基团：卤素、(C1-C3烷基)-O-或氰基；最为优选地，环A为
Figure FDA0003127961530000044
5.化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003127961530000045
Figure FDA0003127961530000051
6.化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003127961530000052
Figure FDA0003127961530000061
Figure FDA0003127961530000071
Figure FDA0003127961530000081
7.一种药物组合物，其包含治疗有效量的化合物I、II或III或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。
8.化合物I、II或III或其药学上可接受的盐在制备用于治疗和/或预防AXL受体酪氨酸激酶诱发的病症的药物中的应用。
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