CN115491354A - 一种nk细胞分化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种NK细胞分化的方法，生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在与人源的间质样细胞共培养的条件下分化成NK细胞。本发明方法的优势在于：在NK细胞分化早期规避了异种基质细胞的使用，大大提高了NK细胞的产率，使单个多能干细胞产生NK细胞的数量平均能达到1500个左右，相比现有分化体系提高15～150倍，从而在后期无需再使用工程化的K562肿瘤细胞对NK细胞进行进一步扩增来满足使用数量。不使用异种基质细胞，使整个操作简便，可重复性强，规避了动物源性污染风险。此外，相比传统的NK细胞分化需要2～3个月的时间，本方法缩短分化时间至1个月左右。

Description

一种NK细胞分化的方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种NK细胞分化的方法。
背景技术
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体参与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节的一种重要免疫细胞。与异体T细胞不同，异基因NK细胞对于过继性细胞治疗是安全的，它们通常不会发生移植物抗宿主病(GVHD)。此外，NK细胞仅分泌少量的IFN-γ和GM-CSF，不分泌IL-1和IL-6，因此无高级别的细胞因子风暴或神经毒性等副作用。其次，NK细胞具有天然的广谱的杀伤机制，不依赖于特定靶点，可以克服实体肿瘤靶点异质性的难题。因此，近些年来，关于利用NK细胞进行抗肿瘤治疗的基础研究和临床试验也越来越多，如何大量生成NK细胞也成为目前研究的热点。
现有技术中基于人多能干细胞制备NK细胞的方法主要有2D培养法和3D培养法。基于拟胚体(EB)形成的3D培养法是现在最常用的NK诱导分化方法。近些年，一种基于类器官(Organoid)培养的3D分化方案也逐步被用于人多能干细胞造血分化。但是，现有技术中的NK细胞分化体系存在以下缺点：1)离不开异种的基质细胞或异源性的肿瘤细胞共培养，例如，在早期造血诱导阶段需要与小鼠的OP9等细胞共培养来支持造血祖细胞分化，再例如，在分化后期利用工程化的K562肿瘤细胞对NK细胞进行扩增，等等；2)整个NK细胞的分化周期长，大约2～3个月才能完成分化；产率低，单个hPSC产生的NK细胞数量仅为10～100个。上述问题的存在极大地阻碍了NK细胞的大规模生产和应用，因此，解决上述问题成为当务之急。
发明内容
发明概述：
本发明的一个方面，是针对现有技术中NK细胞分化方法需要异种细胞或肿瘤细胞支持，并且周期长，产率低的缺点，提供了一种NK细胞分化的方法。
具体地，本发明的目的是在NK细胞分化过程中利用间质样细胞替代异种基质细胞和工程化的K562肿瘤细胞，缩短整个NK细胞的分化周期并提高NK细胞产率。
本发明提供的技术方案为：
一种NK细胞分化的方法，生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在与人源的间质样细胞共培养的条件下分化成NK细胞。
在本发明的某些实施方式中，上述人源的间质样细胞可以来源于同种异体，也可以来源于需要使用该NK细胞的受试者/患者自体。当所述人源的间质样细胞来源于异体时，可以有效地实现间质样细胞生产的工业化。例如，通过本发明方法制备、富集、分选或筛选所述间质样细胞。
为了更好地实现本发明的目的，作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在只与自体间质样细胞共培养的条件下分化成NK细胞。
上述“只与自体间质样细胞共培养”可以理解为共培养体系中仅包含所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)和所述自体间质样细胞，以及必要的培养基。而不包含，例如，异种基质细胞，肿瘤细胞，以及其他起到支持、促进作用的细胞。
在本发明中，所述间质样细胞可以具有以下标志物的特征：
i)表面标记物CD34为阴性，且表达选自以下基因或蛋白(间质相关基因)中的一种或几种：ACTA2、SNAI2、HAND1、COL1A1、IGF2、BMP4、PDGFRB、ITGAV、ACTC1、COL3A1、COL11A1、HMGA2、BASP1、LOXL2、MSX1、GLIPR2、THY1(CD90)或ENG(CD105)；和
ii)表面标记物CD34为阴性，不表达以下基因或蛋白(血管内皮相关基因)：PECAM1(CD31)、CDH5、SOX18、TIE1、HEY2、GJA4、NOTCH1或GJA5；和
iii)表面标记物CD34为阴性，不表达以下基因或蛋白(造血相关基因)：CD40、RUNX1、PTPRC(CD45)、SPN(CD43)或TAL1。
可以通过分选、筛选具有以上特征的细胞或其他现有技术中合适的方法来获得所述间质样细胞。同样地，在本发明中，所述间质样细胞还可以通过以下方法获得：对多能干细胞进行造血分化，当细胞分化至产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)时，在全部细胞中分选出CD34阴性的细胞，该细胞即为所述间质样细胞。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述多能干细胞为人多能干细胞。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述细胞分化至产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)时为开始分化后的第4～10天。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述人胚胎干细胞为商业化的人胚胎干细胞。例如，来源于商业化的人胚胎干细胞库。
进一步优选地，在本发明的一个实施方式中，所述人胚胎干细胞为H1细胞。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述间质样细胞为间充质干细胞(MSC)。本发明人发现，在上述方法获得的间质样细胞中也包含了所述间充质干细胞(MSC)，同时，所述间充质干细胞(MSC)也具有上述标志物的特征。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述间充质干细胞(MSC)为自体或异体的间充质干细胞。
在本发明中，所述造血干祖细胞(HSPC)包括造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)，其中，造血祖细胞是造血干细胞(HSC)在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，称造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPC)，它也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，故也称定向干细胞(committed stem cell)。人造血干细胞和造血祖细胞通常表达CD34表面标记。
在本发明中，可以使用常规方法分离、纯化、富集CD34+细胞。例如，Wenetal.Effective control of large deletions after double-strand breaksbyhomology-directed repair and dsODN insertion.Genome Biology，2021中记载的利用MicroBead Kit(MiltenyiBiotec)进行CD34+细胞的获得。
在本发明中，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)(CD34+细胞)可以有多种不同来源。例如，在本发明的某些实施方式中，所述造血干祖细胞可以来源于外周血或脐带血，所述造血干祖细胞还可以来源于骨髓。在本发明的另一些实施方式中，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)可以为经诱导分化得到的生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)。例如，由诱导多能性干细胞(iPSC)经分化得到生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)。在本发明的另一些实施方式中，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)还可以为由某些特定细胞经重编程后产生的生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)为多能干细胞来源。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述多能干细胞为人多能干细胞。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述人胚胎干细胞为商业化的人胚胎干细胞。
进一步优选地，在本发明的一个实施方式中，所述人胚胎干细胞为H1细胞。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，多能干细胞来源的所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)的获得方法可以包括：
i)将多能干细胞在含有Rho激酶抑制剂和/或Wnt信号通路激活剂的培养基中培养，以获得中胚层细胞；
ii)将i)中获得的中胚层细胞在含有bFGF和VEGF的培养基中培养，以获得所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)。
更优选地，在本发明的某些实施方式中，i)中所述的培养基中还包含组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。
在本发明中，所述Rho激酶抑制剂可以为现有技术中任意合适的Rho激酶抑制剂。但作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述Rho激酶抑制剂为选自Y-27632、Y-230141、Y-39983、GSK429286A、GSK269962、RKI-1447、Thiazovivin、ZINC00881524、KD025、Fasudil、Hydroxyfasudil、Netarsudil或Ripasudil hydrochloride dihydrate中的一种或几种。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述Rho激酶抑制剂为Y-27632。
在本发明中，所述Wnt信号通路激活剂可以包括GSK-3β抑制剂。作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述GSK-3β抑制剂为选自CHIR99021、LY2090314、SB216763、SB415286中的一种或几种。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述GSK-3β抑制剂为CHIR99021。
在本发明中，所述组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂是一类重要的抗肿瘤化合物。它能引起细胞周期的阻断和肿瘤细胞选择性凋亡，在体外细胞培养和动物中都被证明具有明显抗肿瘤作用。所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂包括但不限于，例如，曲古抑菌霉素A、Vorinostat、trapoxin B、MS-275、valproic、romidepsin、Pracinostat、Resminostate。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为选自Vorinostat或其衍生物、Pracinostat或其衍生物、Resminostate或其衍生物中的一种或几种。更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述组蛋白去乙酰化酶抑制剂为Vorinostat或其衍生物。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，i)中所述的培养基为：基础培养基为STEMdiff APEL 2(STEMCELL Technologies)，外加2～10ng/ml Activin A，10～40ng/mlBMP4，2～10μM Wnt信号通路激活剂CHIR99021和10μM Y-27632。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，ii)中所述的培养基为：在STEMdiffAPEL2基础培养基上添加10～100ng/ml VEGF和10～100ng/mlbFGF。
可以利用现有技术中的某些方法对富集得到的或者经分化后得到的CD34+细胞进行扩增。在本发明的某些实施方式中，扩增培养基所使用的基础培养基可以为，例如，SFEM2(StemCellTechnologies,09655)。另外，可以在基础培养基中添加细胞因子、细胞分化动员剂等其他物质，例如，包括但不限于，SCF、TPO、IGF-2、FGF-1、FLT-3L、IL-6、SR1、UM171、IL-3、Notch配体、其他芳烃受体拮抗剂家族的小分子化合物、G-CSF、GM-CSF、LIF、MIP-1α，或其组合。作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述扩增培养基包括SFEM2(StemCellTechnologies,09655)+100ng/mlTPO+100ng/ml SCF+100ng/ml FLT-3L+50ng/mlIL-6+750nMSR1+50nM UM171。
在本发明的某些实施方式中，所述扩增培养基还可以包含肝素，优选为低分子量肝素(LMHW)。所述肝素可以是被修饰的，例如，酰化、脱硫或磷酸化。
在本发明的某些实施方式中，所述扩增还可以在固相组织培养基质中进行，所述固相组织培养基质预涂有Notch配体和/或玻连蛋白或其片段。
在本发明中，上述扩增的过程通常可以持续多天，例如，至少1天、至少2天、至少3天、至少4天、至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天或至少10天。
在本发明中，上述扩增结束后，可以将细胞转移至新的培养瓶、培养皿或培养板等培养容器准备进行NK细胞分化阶段。
在本发明的实施方式中，所述NK细胞分化阶段，即所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在与人源的间质样细胞共培养的条件下分化成NK细胞的过程可以为二维或三维的细胞培养方式。作为本发明的优点，该共培养可以不在异种基质细胞或肿瘤细胞等细胞的支持下进行。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述共培养为三维的细胞培养方式。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述共培养为三维类器官的细胞培养方式。
在本发明的某些实施方式中，上述共培养以获得NK细胞可以利用现有技术中的细胞分化条件进行，例如，中国专利公开CN114621920A中记载的条件进行。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述共培养以获得NK细胞的培养基可包含选自SCF、FLT3L、VEGF、IL2、IL3、IL6、IL7、IL15、BMP激活剂或Rho激酶抑制剂中的一种或几种。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述间质样细胞与所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)的共培养的细胞数比例为0.5:1～4:1。例如，0.5:1、0.7:1、0.9:1、1.1:1、1.3:1、1.5:1、1.7:1、1.9:1、2.1:1、2.3:1、2.5:1、2.7:1、2.9:1、3.1:1、3.3:1、3.5:1、3.7:1、3.9:1或4.0:1。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述细胞数比例为1:1～2:1。
更优选地，在本发明的一个实施方式中，所述细胞数比例为1:1。
为了实现连续化操作和/或缩短获得NK细胞的时间，在本发明的一个实施方式中，可以利用以下方法由多能干细胞直接分化为NK细胞。所述方法包括：对多能干细胞进行造血分化，当细胞分化至同时产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)，以及间质样细胞时对分化后的细胞直接聚团并进行三维类器官分化培养，培养体系中不加入其他支持细胞，以获得所述NK细胞。
在本发明中，所述同时为当细胞分化至同时产生生血内皮细胞(HEC)和间质样细胞时；或为当细胞分化至同时产生生血内皮祖细胞(HEPC)和间质样细胞时；或为当细胞分化至同时产生造血干祖细胞(HSPC)和间质样细胞时。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述多能干细胞为人多能干细胞。
更优选地，在本发明的某些实施方式中，所述多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述人胚胎干细胞为商业化的人胚胎干细胞。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述人胚胎干细胞为H1细胞。
进一步优选地，在本发明的某些实施方式中，所述细胞分化至产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)时为开始分化后的第4～10天。
具体地，在本发明的一个实施方式中，所述三维类器官分化培养的方法可以包括：
i)将所述分化后的细胞用第一NK分化培养基按1×106～3×106每6～10μl的密度重悬；
ii)取i)中获得的细胞悬液滴至事先放置在盛有所述第一NK分化培养基的细胞培养容器中，继续培养至开始分化后的第11天；
iii)第11天后将ii)中的培养基更换为第二NK分化培养基，继续培养至开始分化后的第25天；
iv)将iii)中获得的三维类器官细胞团消化成单细胞后接种至新的细胞培养容器中，在第二NK分化培养基中继续培养至开始分化后的第32天，收集所述NK细胞。
作为优选，在本发明的一个实施方式中，所述第一NK分化培养基的基础培养液为EGM2(Lonza)，外加10μM SB431542，20-100ng/ml SCF,5-20ng/ml FLT3L和5-20ng/ml TPO；所述第二NK分化培养基的基础培养液为X-VIVO15(Lonza)，外加20ng/ml SCF,10ng/mlFLT3L，30ng/ml IL-7，20ng/ml IL15和20ng/ml IL3。
在本发明的某些实施方式中，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)可以为经过修饰的生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)；所述多能干细胞可以为经过修饰的多能干细胞。
在本发明的某些实施方式中，上述修饰可以在NK细胞分化阶段前进行。作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述修饰为向细胞中引入表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的多核苷酸。所述CAR或TCR可以特异性结合病毒抗原、细菌抗原或肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。所述病毒抗原包括，例如，人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒(HSV)、肝炎病毒、寨卡病毒、流感病毒或冠状病毒。所述单纯疱疹病毒(HSV)包括HSV1、HSV2；所述肝炎病毒包括甲型、乙型或丙型肝炎病毒；所述冠状病毒包括SARS-CoV或SARS-CoV-2。所述肿瘤特异性抗原包括血液肿瘤表面抗原，例如，CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD34、BCMA、CD123；还包括实体肿瘤表面抗原，例如，Her2、PSMA、PSCA、GPC3、EGFRvIII、IL13Rα2、L1CAM。
编码CAR的多核苷酸还可以编码跨膜区、胞内信号转导区共刺激分子。所述跨膜区可以为选自以下蛋白质的跨膜结构域或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列：T细胞受体的α、β或ζ链、CD2、CD3ε、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD48、CD49a、CD49d、CD49f、CD66a、CD66b、CD66c、CD66d、CD66e、CD69、CD79A、CD79B、CD84、CD96、CD100、CD103、CD134、CD137、CD150、CD158A、CD158B1、CD158B2、CD158C、CD158D、CD158F1、CD158F2、CD158K、CD160、CD162、CD226、CD229、CD244、CD247、CD258、CD268、CD270、CD272、CD276、CD279、CD314、CD319、CD335、CD336、CD337、CD352、CD353、CD355、CD357、LFA-1、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80、IL-2R beta、IL-2Rgamma、IL-7R alpha、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS、SLP-76、PAG1/CBP、CD83配体、Fc gamma受体、整联蛋白、激活性NK细胞受体或Toll配体受体，或其组合。所述胞内信号转导区可以为选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列：4-1BB、B7-H3、BAFFR、BLAME、BTLA、CD100、CD103、CD160、CD18、CD19、CD19a、CD2、CD247、CD27、CD276、CD28、CD29、CD3ζ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8alpha、CD8beta、CD96、CDS、CEACAM1、CRTAM、DAP-10、DNAM1、Fc gamma受体、GADS、GITR、HVEM、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Ig alpha、IL2R beta、IL2Rgamma、IL7R alpha、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80、OX-40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG、SLAMF4、SLAMF6、SLAMF7、SLP-76、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或其组合。所述共刺激分子可以为通过选自以下蛋白质或与所述蛋白质具有90％以上同一性且与其具有相同生物学功能的序列获得的功能性信号结构域的一种或几种：整联蛋白、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1、4-1BB、B7-H3、CD278、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM、KIRDS2、SLAMF7、NKp80、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49α、IA4、CD49D、ITGA6、VLA6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11α、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、CD29、ITGB1、ITGB2、CD18、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、CD226、CD84、CD96、CEACAM1、CRTAM、CD229、CD160、PSGL1、CD100、CD69、SLAMF6、SLAM、BLAME、CD162、LTBR、LAT、GADS或SLP-76。
本发明的另一个方面，是提供了一种NK细胞，所述NK细胞由上述方法制备。本发明中制备的所述NK细胞可以用于任意合适的场合。例如，包括但不限于，肿瘤治疗、抗感染治疗、科学研究，等。
本发明的另一个方面，是提供了一种组合物，所述组合物可以包括：i)如上述间质样细胞，所述间质样细胞为人源异体间质样细胞或人源自体间质样细胞；和ii)培养基。
在本发明的某些实施方式中，所述组合物中还可以包括冷冻保护剂。并且所述组合物可以被冷冻以长期保存。
本发明的另一个方面，是提供了所述组合物在制备NK细胞中的用途。
本发明的另一个方面，是提供了一种向受试者施用NK细胞的方法，包括：
i)利用上述方法制备NK细胞；
ii)向受试者施用有效剂量的NK细胞。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，在ii)之前还包括对i)所制备的NK细胞进行修饰的过程。作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述修饰为向细胞中引入表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的多核苷酸。
本发明的另一个方面，是提供了一种NK细胞分化的方法，生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在与人源的间充质干细胞(MSC)共培养的条件下分化成NK细胞。
优选地，在本发明的某些实施方式中，所述间充质干细胞为人源自体或异体的间充质干细胞。
更优选地，在本发明的某些实施方式中，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在只与所述间充质干细胞共培养的条件下分化成NK细胞。
作为优选，在本发明的某些实施方式中，所述共培养为二维或三维的细胞培养方式。
优选地，在本发明的某些实施方式中，所述共培养为三维的细胞培养方式。
更优选地，在本发明的某些实施方式中，所述共培养为三维类器官的细胞培养方式。
本发明的有益效果为：
本发明提供的基于间质样细胞介导的NK细胞分化方法的优势在于：在NK细胞分化早期规避了异种基质细胞的使用，从而大大提高了NK的产率，使得单个多能干细胞产生NK细胞的数量平均能达到1500个左右，相比现有的体系在NK细胞的产量上提高了15～150倍，这导致的直接结果是在后期无需再使用工程化的K562肿瘤细胞来对NK细胞进行进一步扩增来满足使用数量。
不使用异种基质细胞，能使整个操作简便，可重复性强，规避了动物源性污染风险，利于将来的临床转化。此外，相比传统的NK细胞分化需要2～3个月的时间，该方法缩短分化时间至1个月左右，较高的NK细胞产率也使得无需再额外使用异源性的K562肿瘤细胞，消除了潜在的致瘤性等安全隐患。
附图说明
图1A为本发明实施例中间质样细胞及生血内皮祖细胞的分化流程图；
图1B和图1C为本发明实施例中间质样细胞及生血内皮祖细胞在分化第4天的占比情况结果图；
图1D和图1E为本发明实施例中对间质样细胞及生血内皮祖细胞在分化第4天的单细胞转录组鉴定情况结果图；
图1F为本发明实施例中对间质样细胞在分化第5天的表型鉴定情况结果图；
图2A为本发明实施例中CD34-细胞、CD34+细胞、CD34-细胞与CD34+细胞混合后的NK细胞分化能力比较图；
图2B为本发明实施例中CD34-细胞、CD43+CD45+细胞、CD34-细胞与CD43+CD45+细胞混合后的NK细胞分化能力比较图；
图3A为本发明实施例中不同比例的间质样细胞对NK细胞分化的影响结果图；
图3B为本发明实施例中是否分离间质样细胞对NK细胞分化的影响结果图；
图4A为本发明实施例中NK细胞分化的流程图；
图4B和图4C为本发明实施例中制备的NK细胞鉴定结果图；
图4D为本发明实施例中制备的NK细胞其他表型的鉴定结果图；
图4E为本发明实施例中制备的NK细胞产量计数结果图；
图5A和图5B为本发明实施例中制备的NK细胞的肿瘤杀伤能力鉴定结果图；
图6为本发明实施例中人间充质干细胞支持NK细胞分化的结果图。
具体实施方式
本发明公开了一种NK细胞分化的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。需要特别指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明，并且相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围的基础上对本文所述内容进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。术语“如”、“例如”等旨在指示例性实施方案，而不意图限制本公开的范围。
定义：
术语“NK细胞”即指自然杀伤细胞，是指具有CD16+CD56+和/或CD57+TCR-表型的分化淋巴细胞。NK细胞的特征在于其能够给通过活化特异性溶细胞酶来结合并杀死不能表达“自身”MHC/HLA抗原的细胞，能够杀死表达NK活化受体的配体的肿瘤细胞或其他患病细胞，并且能够释放称为刺激或抑制免疫应答的细胞因子的蛋白质分子。
术语“生血内皮细胞”或“生血内皮祖细胞”是指一群具有生血潜能的内皮细胞或其前体细胞，在特定条件下生血内皮细胞能逐渐的转变成造血细胞。生血内皮细胞或生血内皮祖细胞既具有内皮细胞相关的分子特征也具有造血细胞相关的分子特征。生血内皮细胞或生血内皮祖细胞通常表达CD34和CD144表面标记，同时表达RUNX1和/或GATA2，不表达CD43和/或CD45。
术语“造血干祖细胞”(HSPC)即造血干细胞(HSC)和/或造血祖细胞(HPC)。其中，造血祖细胞是造血干细胞在一定的微环境和某些因素的调节下，增殖分化为各类血细胞的祖细胞，称造血祖细胞(hematopoietic progenitor cells，HPC)，它也是一种相当原始的具有增殖能力的细胞，但已失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化，故也称定向干细胞(committed stem cell)。人造血干细胞和造血干祖细胞通常表达CD34表面标记。
术语“细胞分化”(cell differentiation)或“分化”是指同一来源的细胞逐渐产生出形态结构、功能特征各不相同的细胞类群的过程，其结果是在空间上细胞产生差异，在时间上同一细胞与其从前的状态有所不同。细胞分化的本质是基因组在时间和空间上的选择性表达，通过不同基因表达的开启或关闭，最终产生标志性蛋白质。
术语“多能”是指在不同条件下具有分化为一种以上分化细胞类型能力的细胞，并且优选分化为具有所有三种生殖细胞层特征的细胞类型。多能干细胞的主要特征是其使用例如裸鼠畸胎瘤形成试验分化为多种细胞类型，优选分化为所有三个胚层的能力。这类细胞包括人胚胎干细胞(hESC)、人诱导多能干细胞(hiPSC)、人胚胎源性细胞(hEDC)和成人源性干细胞。多能干细胞可以是经遗传修饰的。在一些实施方式中，所述多能干细胞是未经遗传修饰的。遗传修饰的细胞可以包括标志物，诸如荧光蛋白，以便于其识别。多能性还通过胚胎干细胞(ESC)标志物的表达证明。
术语“iPSC”或“诱导多能干细胞”可互换地使用并且是指例如通过诱导一个或多个基因的强制表达由非多能干细胞(通常是成体体细胞)人工衍生的(例如，诱导的或通过完全逆转的)多能干细胞。
术语“自体”是指来源于同一个体的任何材料，随后将其重新引入该个体。
术语“类器官”属于三维(3D)细胞培养物，包含其代表器官的一些关键特性。此类体外培养系统包括一个自我更新干细胞群，可分化为多个器官特异性的细胞类型，与对应的器官拥有类似的空间组织并能够重现对应器官的部分功能，从而提供一个高度生理相关系统。
术语“聚团”是指利用自然重力或细胞间亲和力使多个单细胞聚集在一起形成细胞小团，也包括使用细胞支架或微载体等材料使多个单细胞聚集在一起形成细胞小团。
术语“嵌合抗原受体”或缩写形式“CAR”是指人工受体蛋白或嵌合免疫受体，并且包含将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的工程化受体。CAR可用于将单克隆抗体的特异性赋予NK细胞，从而可以产生大量的特异性NK细胞，例如用于过继细胞疗法。CAR通常包括细胞内激活结构域、跨膜结构域和包含抗原结合区的细胞外结构域。CAR可以将基于抗体的对所需抗原的特异性与激活NK细胞受体的细胞内结构域相结合，以产生具有特定细胞免疫活性(例如抗肿瘤细胞免疫活性)的嵌合蛋白。在一些情况下，分子可以与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像的报告基因、在添加前药后有条件地清除NK细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
术语“有效剂量”是指在向有需要的受试者施用时足以产生期望活性的化合物或药物组合物的量。需注意，当施用活性成分的组合时，该组合的有效量可包括或可不包括如果单独施用的话能够有效的每种成分的量。取决于受试者的物种、年龄和一般状况、所治疗病症的严重程度、所采用的特定药物、施用模式等，所需的确切量将因受试者而异。
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本具体实施方式中NK细胞分化方法采取的是3D类器官培养方法。同样地，在2D和通常的3D拟胚体培养方式下，也适用本发明所述技术方案。3D类器官培养方法已被逐步用于人多能干细胞造血分化。但当前基于类器官培养的方案在分化早期离不开异种基质细胞的支持，如小鼠骨髓基质细胞OP9等。本具体实施方式中的重大改进是取代了异种基质细胞的共培养，利用人多能干细胞同步分化出间质样细胞及生血内皮祖细胞，其中间质样细胞可以替代异种基质细胞支持生血内皮祖细胞向NK细胞高效分化。本具体实施方式中采用的是将分化到生血内皮阶段的细胞取出，不需借助异种基质细胞，而是直接聚团成3D类器官进行培养。对生血内皮阶段的细胞进行分析发现，该阶段包含两种细胞成分：CD34+的生血内皮祖细胞及CD34-的间质样细胞。通过分离及再培养发现，CD34-间质样细胞能够支持并增强CD34+的生血内皮祖细胞向NK细胞分化。通过不同的搭配比例(间质样细胞：生血内皮祖细胞)发现0.5:1到4:1的搭配比例能够取得较好的NK分化效果。进一步，本具体实施方式中发现在连续分化条件下，在生血内皮阶段，间质样细胞及生血内皮祖细胞的比例维持在1:1左右。通过验证表明在具体操作上不需要先分离间质样细胞及内皮祖细胞，而是可以将生血内皮阶段细胞直接聚团培养。最后，本具体实施方式中表明间质样细胞支持下得到的NK细胞具有正常的表型及功能。进一步，本具体实施方式中除了多能干细胞来源的间质样细胞，人间充质干细胞也能支持生血内皮祖细胞向NK进行高效分化。
实施例：
实施例1：间质样细胞及生血内皮祖细胞的诱导
采用单层逐级的内皮-造血分化体系来同步诱导间质样细胞及生血内皮祖细胞的分化，该阶段诱导分化时间为4天(流程见图1A)。具体如下：造血分化的前两天(第0天～第2天)是中胚层形成阶段(见图1A)。在分化第0天，将人多能干细胞消化成单个细胞，按5000～10000个/孔种入到事先铺有玻连蛋白的12孔板中。第0天～第2天所用基础培养基为STEMdiff APEL 2(STEMCELL Technologies)，外加2～10ng/ml Activin A(PeproTech)，10～40ng/ml BMP4(PeproTech)，2～10μM Wnt信号通路激活剂CHIR99021(AppliedBiological Materials)和10μM Y27632(STEMCELL Technologies)(见图1A)。分化第2天到第4天是内皮造血特化阶段。该阶段通过在STEMdiff APEL2基础培养基上添加10-100ng/ml VEGF(PeproTech)和10-100ng/mlbFGF(PeproTech)能诱导中胚层祖细胞逐渐向内皮和造血细胞的转变(见图1A)。在分化第4天，几乎检测不到CD43和CD45的表达(流式结果见图1B)，表明该阶段未产生CD34+CD43+CD45+造血干祖细胞。该阶段能检测到50％左右的CD34+生血内皮祖细胞和50％左右的CD34-间质样细胞，CD34+细胞和CD34-细胞比例维持在1:1左右(结果见图1B和图1C)。为了进一步明确CD34+和CD34-的细胞属性，我们对分化第4天的细胞进行了单细胞转录组测序。我们发现CD34-细胞主要表达间充质细胞相关的基因,如ACTA2、SNAI2、HAND1、COL1A1、IGF2、BMP4、PDGFRB、ITGAV、ACTC1、COL3A1、COL11A1、HMGA2、BASP1、LOXL2、MSX1或GLIPR2；且不表达内皮相关基因，如PECAM1、CDH5、SOX18、TIE1、HEY2、GJA4、NOTCH1或GJA5；且不表达造血相关基因，如CD40、RUNX1或TAL1(结果见图1D)。与CD34-细胞相反的是，CD34+细胞表达内皮和造血相关的基因，而不表达间充质细胞相关的基因(结果见图1D)。进一步对CD34-细胞和CD34+细胞进行功能富集分析，我们发现CD34-细胞主要富集于间充质发育相关的通路，而CD34+细胞主要富集于血管和内皮发育相关的通路(结果见图1E)。此外，我们还对分化第5天的细胞进行了流式检测，发现CD34-细胞符合间充质细胞的表面标记，如不表达CD31，CD43和CD45,表达CD90和CD105(结果见图1F)。这些结果表明CD34-细胞属于间质样细胞，CD34+细胞属于内皮造血祖细胞，在分化第4天，两者比例维持在1:1左右。
实施例2：间质样细胞支持并增强NK细胞分化
为了探究分化出的间质样细胞是否能支持生血内皮细胞、生血内皮祖细胞向NK细胞分化，将分化第4天的CD34+和CD34-细胞分选出来后进行各自单独培养或相互共培养。我们发现，在各自单独培养的条件下，CD34-细胞不具备NK细胞分化潜能(结果见图2A)，CD34+细胞尽管具备NK细胞分化潜能，但分化效率较低，维持在20％左右(结果见图2A)。将CD34+和CD34-细胞按1:1比例混合后再培养，发现NK细胞的分化效率显著提升至80％以上(结果见图2A)。这些结果表明人多能干细胞来源的CD34-间质样细胞能有效地支持CD34+生血内皮祖细胞向NK细胞进行分化。
为了探究分化出的间质样细胞是否能支持造血干祖细胞向NK细胞分化，分别收集分化第4天的CD34-细胞及分化第8天的CD34+CD43+CD45+造血干祖细胞，然后进行各自单独培养或相互共培养。我们发现，在各自单独培养的条件下，CD34-细胞不具备NK细胞分化潜能(结果见图2B)，CD34+CD43+CD45+造血干祖细胞尽管具备NK细胞分化潜能，但分化效率较低，维持在10％左右(结果见图2B)。将CD34+和CD34+CD43+CD45+细胞按1:1比例混合再培养后，发现NK细胞的分化效率显著提升至60％左右(结果见图2B)。这些结果表明人多能干细胞来源的CD34-间质样细胞能有效地支CD34+CD43+CD45+造血干祖细胞向NK细胞进行分化。
上述实验具体操作方法如下：1，消化并收集分化第4天或第8天的所有细胞，利用流式分选仪分选出第4天的CD34+生血内皮祖细胞，第4天的CD34-间质样细胞及第8天的CD34+CD43+CD45+造血干祖细胞备用；2，将CD34+或CD34-或CD34+CD43+CD45+细胞用NK-1培养基重悬并离心。NK-1培养基的基础培养液为EGM2(Lonza)，外加10μM SB431542(SelleckChemicals)，20～100ng/ml SCF(PeproTech),5～20ng/ml FLT3L(PeproTech)和5～20ng/ml TPO(PeproTech)。3，将离心完的CD34+或CD34-或CD34+CD43+CD45+细胞按1x10^6-3x10^6/6～10微升的密度重悬，重悬液为NK-1培养基。4，取6～10微升的CD34+或CD34-或CD34+CD43+CD45+细胞液悬滴到一个0.4-mmTranswell细胞小室(EMD Millipore)上，Transwell细胞小室事先放在盛有NK-1培养基的6孔板里。5，对于CD34+或CD34+CD43+CD45+细胞和CD34-细胞的共培养，取等量的CD34+或CD34+CD43+CD45+细胞和CD34-细胞按1:1比例混合成1-3x10^6/6～10微升的密度，再以6～10微升的体积悬滴到一个0.4-mmTranswell细胞小室上，Transwell细胞小室事先放在盛有NK-1培养基的6孔板里。6，第4天到第11天培养液为NK-1培养基,第11天后培养液换成NK-2培养基。期间每2～3天换一次液。NK-2培养基的基础培养液为X-VIVO15(Lonza)，外加20ng/ml SCF(PeproTech),10ng/ml FLT3L(PeproTech)，30ng/ml IL-7(PeproTech)，20ng/ml IL15(PeproTech)和20ng/ml IL3(PeproTech)。7，在NK-2培养基培养14天后(第25天)，将形成的3D类器官消化成单细胞后接种至新的六孔板内，继续分化培养7天(第32天)，所用培养基为NK-2培养基。8，在分化的第32天收集细胞进行后续的检测。
实施例3：不同比例间质样细胞对NK细胞分化的影响
在上述分化条件下，通过调整CD34-间质样细胞和CD34+生血内皮祖细胞之间不同的搭配比例,发现间质样细胞：生血内皮祖细胞的比例维持在0.5:1～4:1，特别是1:1或2:1时能够达到最好的NK分化效果。1:1时能达到80％左右的NK分化效率，2:1时能达到60％～80％的NK分化效率，0.5:1和4:1的NK分化效率维持在20％-40％之间(结果见图3A)。
鉴于在分化第4天的全部细胞中，CD34+细胞和CD34-细胞各占50％左右，即CD34+细胞和CD34-细胞比例维持在1:1左右(结果见图1C)，因此可以不用先分离CD34-细胞和CD34+细胞，而是可以将分化第4天的全部细胞直接聚团进行3D类器官分化。实验结果进一步表明在具体操作上不需要先分离间质样细胞及生血内皮祖细胞，而是可以将分化第4天的细胞直接聚团进行类器官培养，分化效果与1:1分离的结果类似(结果见图3B)。
不经细胞分离，直接进行3D类器官培养的具体操作方法如下：1，消化并收集分化第4天的所有细胞，用NK-1培养基重悬并离心。2，将离心完的第4天细胞按1x10^6-3x10^6/6～10微升的密度重悬，重悬液为NK-1培养基。3，取6～10微升的细胞液悬滴到一个0.4-mmTranswell细胞小室(EMD Millipore)上，Transwell细胞小室事先放在盛有NK-1培养基的6孔板里。3，第4天到第11天培养液为NK-1培养基,第11天后培养液换成NK-2培养基。期间每2-3天换一次液。4,在NK-2培养基培养14天后(第25天)，将形成的3D类器官消化成单细胞后接种至新的六孔板内，继续分化培养7天(第32天)，所用培养基为NK-2培养基。5，在分化的第32天收集细胞进行后续的检测。
实施例4：NK细胞表型鉴定
分化第4天不经细胞分离，直接进行3D类器官培养。在分化的第25天和第32天分别收集细胞进行流式表型分析(结果见图4A)。分化第25天，80％左右的细胞为NK细胞，主要表型为CD3-CD45+CD56+(结果见图4B和图4C)。分化第32天，90％以上的细胞呈CD3-CD45+CD56+表型(结果见图4B和图4C)。在分化的第32天，我们还对NK细胞的其他表型进行了分析：自然杀伤受体表达上，NKP30>90％,NKP44 30％左右，NKP46 20％左右；肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL20％～60％，细胞凋亡的蛋白FasL20％～60％；颗粒酶B(Granzyme B)100％左右，穿孔素(Perforin)100％左右；抑制性受体NKG2A10％～20％，CD94 20％～30％；活化相关分子NKG2D 90％左右，CD319 60％～90％，CD69>90％,CD96>90％；CD1630％左右,CD7>90％(结果见图4D)。最后我们对NK细胞的绝对产量进行了统计：分化第25天，平均一个多能干细胞产生200左右个NK，分化第32天平均一个多能干细胞产生1500左右个NK(结果见图4E)。
实施例5：NK细胞的肿瘤杀伤能力鉴定
取上述分化第32天的NK细胞与红白血病K562细胞(带红色荧光)进行共培养，设置效靶比(NK:K562)为0:1,1:4,1:2,1:1,2:1和4:1。在与K562细胞共培养24小时后，在效靶比1:1的条件下开始产生杀伤(结果见图5A和图5B)，2:1和4:1条件下K562几乎全部被杀死(结果见图5B)。在效靶比1:4和1:2的条件下，K562细胞的增殖明显受到抑制(结果见图5B)。
实施例6：人间充质干细胞支持NK分化
考虑到脐带血间充质干细胞(MSC)的巨大临床应用价值，也对脐带血间充质干细胞是否能够支持NK细胞分化进行了测试。结果表明：单独的脐带血MSC无法分化成NK细胞；相比单独的CD34+生血内皮祖细胞，脐带血MSC共培养能支持CD34+生血内皮祖细胞更有效的向NK细胞分化(结果见图6)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (17)

1.一种NK细胞分化的方法，其特征在于，生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在与人源的间质样细胞共培养的条件下分化成NK细胞；
优选地，所述间质样细胞为人源自体间质样细胞；
更优选地，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)在只与自体间质样细胞共培养的条件下分化成NK细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间质样细胞为：
i)表面标记物CD34为阴性，且表达选自以下基因或蛋白中的一种或几种：ACTA2、SNAI2、HAND1、COL1A1、IGF2、BMP4、PDGFRB、ITGAV、ACTC1、COL3A1、COL11A1、HMGA2、BASP1、LOXL2、MSX1、GLIPR2、THY1(CD90)或ENG(CD105)；和
ii)表面标记物CD34为阴性，不表达以下基因或蛋白：PECAM1(CD31)、CDH5、SOX18、TIE1、HEY2、GJA4、NOTCH1或GJA5；和
iii)表面标记物CD34为阴性，不表达以下基因或蛋白：CD40、RUNX1、PTPRC(CD45)、SPN(CD43)或TAL1。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间质样细胞通过以下方法获得：对多能干细胞进行造血分化，当细胞分化至产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)时，在全部细胞中分选出CD34阴性的细胞，该细胞即为所述间质样细胞；
优选地，所述多能干细胞为人多能干细胞；
更优选地，所述细胞分化至产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)时为开始分化后的第4～10天。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)；
优选地，所述人胚胎干细胞为商业化的人胚胎干细胞；
更优选地，所述人胚胎干细胞为H1细胞。
5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，所述间质样细胞为间充质干细胞(MSC)；
优选地，所述间充质干细胞为自体或异体的间充质干细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述共培养为二维或三维的细胞培养方式；
优选地，所述共培养为三维的细胞培养方式；
更优选地，所述共培养为三维类器官的细胞培养方式。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述间质样细胞与所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)的共培养的细胞数比例为0.5:1～4:1；
优选地，所述细胞数比例为1:1～2:1；
更优选地，所述细胞数比例为1:1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)来源于多能干细胞、外周血、脐带血、骨髓或经重编程的细胞，优选为来源于多能干细胞；
优选地，所述多能干细胞为人多能干细胞；
更优选地，所述人多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)；
进一步优选地，所述人胚胎干细胞为商业化的人胚胎干细胞；
进一步优选地，所述人胚胎干细胞为H1细胞；
进一步优选地，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)的获得方法包括：
i)将多能干细胞在含有Rho激酶抑制剂和/或Wnt信号通路激活剂的培养基中培养，以获得中胚层细胞；
ii)将i)中获得的中胚层细胞在含有bFGF和VEGF的培养基中培养，以获得所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)；
进一步优选地，i)中所述的培养基中还包含组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Rho激酶抑制剂为选自Y-27632、Y-230141、Y-39983、GSK429286A、GSK269962、RKI-1447、Thiazovivin、ZINC00881524、KD025、Fasudil、Hydroxyfasudil、Netarsudil或Ripasudil hydrochloride dihydrate中的一种或几种；
优选地，所述Rho激酶抑制剂为Y-27632。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述Wnt信号通路激活剂包括GSK-3β抑制剂；
优选地，所述GSK-3β抑制剂为选自CHIR99021、LY2090314、SB216763、SB415286中的一种或几种；
更优选地，所述GSK-3β抑制剂为CHIR99021。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：对多能干细胞进行造血分化，当细胞分化至同时产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)，以及间质样细胞时对分化后的所有细胞直接聚团并进行三维类器官分化培养，培养体系中不加入其他支持细胞，以获得所述NK细胞；
优选地，所述多能干细胞为人多能干细胞；
更优选地，所述多能干细胞为人胚胎干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)；
进一步优选地，所述人胚胎干细胞为商业化的人胚胎干细胞；
进一步优选地，所述人胚胎干细胞为H1细胞；
进一步优选地，所述细胞分化至同时产生生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)，以及间质样细胞时为开始分化后的第4～10天。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述三维类器官分化培养的方法包括：
i)将所述分化后的细胞用第一NK分化培养基按1×106～3×106每6～10μl的密度重悬；
ii)取i)中获得的细胞悬液滴至事先放置在盛有所述第一NK分化培养基的细胞培养容器中，继续培养至开始分化后的第11天；
iii)第11天后将ii)中的培养基更换为第二NK分化培养基，继续培养至开始分化后的第25天；
iv)将iii)中获得的三维类器官细胞团消化成单细胞后接种至新的细胞培养容器中，在第二NK分化培养基中继续培养至开始分化后的第32天，收集所述NK细胞；
优选地，所述第一NK分化培养基的基础培养液为EGM2，外加10μM SB431542，20-100ng/ml SCF,5-20ng/ml FLT3L和5-20ng/ml TPO；所述第二NK分化培养基的基础培养液为X-VIVO15，外加20ng/ml SCF,10ng/ml FLT3L，30ng/ml IL-7，20ng/ml IL15和20ng/ml IL3。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)为经过修饰的生血内皮细胞(HEC)、生血内皮祖细胞(HEPC)或造血干祖细胞(HSPC)；
优选地，所述经过修饰为向细胞中引入表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的多核苷酸。
14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多能干细胞为经过修饰的多能干细胞；
优选地，所述经过修饰为向细胞中引入表达嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)的多核苷酸。
15.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括：i)如权利要求2或3中所述的间质样细胞，所述间质样细胞为人源异体间质样细胞或人源自体间质样细胞；和ii)培养基。
16.如权利要求15所述的组合物在制备NK细胞中的用途。
17.一种向受试者施用NK细胞的方法，其特征在于，包括：
i)利用如权利要求1～12任意一项所述的方法制备NK细胞；
ii)向受试者施用有效剂量的NK细胞；
优选地，在ii)之前还包括对i)所制备的NK细胞进行修饰的过程。
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